Prélèvements d'environnement dans les établissements

de santé : Modes opératoires

Juin 2001

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AVANT PROPOS

Malgré l’absence d’indicateur permettant de mesurer le rôle de l’environnement hospitalier dans la

survenue des infections nosocomiales, il est établi que la biocontamination à l’hôpital constitue un
risque majeur pour les patients fragilisés ainsi que pour certains lieux où sont pratiqués des soins ou
actes invasifs. La maîtrise de cette contamination dont dépend la sécurité des patients a donc été
élevée au rang de « vigilance environnementale ».

Nous assistons depuis quelques années à une montée en charge de la réglementation dans ce domaine,
néanmoins les textes officiels et les recommandations restent souvent imprécis et il demeure
difficile de proposer des normes. Le guide des 100 recommandations pour la surveillance et la
prévention des infections nosocomiales (CTIN 1999) rappelle que l’hygiène de l’environnement
hospitalier s’inscrit dans un cadre préventif et qu’elle se place sous la responsabilité du CLIN de
l’établissement.

Ce guide régionalement sous l’égide de l’ARECLIN s’appuie sur une recherche bibliographique et sur
l’expérience acquise par des microbiologistes et des hygiénistes hospitaliers, il se propose d’apporter
une aide méthodologique destinée aux établissements de soins pour la surveillance environnementale.

Gilles BEAUCAIRE Christian CATTOEN Thierry LEVENT

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SOMMAIRE

Introduction…………………………………………………………………………………………………………………………………………………..1
Objet
Champ d'application
Le groupe de travail

1° Le contrôle microbiologique des surfaces

Fiche Technique n° 1 : contrôle microbiologique des surfaces………………………………………………..2-3

2° Le contrôle microbiologique du linge

Fiche Technique n° 2 : contrôle microbiologique du linge……………………………………………… …..4-5
Plan d’échantillonage : proposition d’une fiche type ………………………………………………………. ……….6

3° Le contrôle microbiologique de l'eau

Eaux et usages : typologie…………………………………………………………………………………………………………………7
Fiche Technique n° 3 : contrôle microbiologique de l'eau non filtrée……………………………………..8-9
Fiche Technique n° 4 : contrôle microbiologique de l'eau filtrée……………………………….…………….10-11
Fiche Technique n° 5 : contrôle microbiologique de la désinfection des endoscopes …….12-13
Fiche Technique n° 6 : contrôle microbiologique de l'eau des piscines de rééducation …….14-15
Fiche Technique n° 7 : recherche de Legionella dans une eau ………………………………………………….16-17
Fiche Technique n° 8 : contrôle microbiologique des eaux d'hémodialyse……………………………… 18-19
Fiche technique n° 9 : contrôle microbiologique pour la pratique de l’hémo(dia) filtration 20-21

4° Le contrôle microbiologique de l’air

Fiche technique n°10 : Le contrôle microbiologique de l’air …………………………………….. ……………. 22-23
Fiche technique n°11 : risque aspergillaire – surveillance de l’environnement ……………………….24-25-26

5° Lexique
Glossaire des milieux de culture utilisés dans les modes opératoires……………………………………..27-28-29

6° Annexe 1 : les germes de l’hospitalisme 30

Annexe 2 : Recherche d’une Legionella dans une eau selon la norme NFT 90-431 :
le mode opératoire 31

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1° Introduction

Un groupe de travail de microbiologistes issus du réseau des microbiologistes de l'ARECLIN

(Association Régionale des CLIN du Nord Pas de Calais) en partenariat avec l'Institut Pasteur de Lille
a réfléchi sur la gestion et la maîtrise du risque infectieux lié à la biocontamination de
l'environnement dans les établissements de santé.
Ce groupe a établi une liste de protocoles sous forme de fiches techniques relatives à la surveillance
microbiologique de l'environnement hospitalier.
Un des objectifs est de proposer une standardisation des techniques de prélèvement et d'analyses,
rendant possible l'interprétation des résultats de chaque établissement au sein d'un observatoire
régional d'hygiène hospitalière.

2° Objet :

Chaque protocole précise les modalités de prélèvement, les aspects méthodologiques et les critères
d'interprétation.
Le prélèvement est effectué hors présence humaine, si possible.
Chaque protocole sera actualisé régulièrement, en fonction de l'évolution du cadre réglementaire et
des éventuelles réflexions du réseau des microbiologistes.

3° Champ d'application :

Le protocole est à appliquer par toute personne impliquée dans la surveillance microbiologique de
l'environnement hospitalier.

4° Circuit de diffusion :

• Microbiologistes
• Médecins hygiènistes
• Infirmier(e)s hygiènistes
• Techniciens de laboratoire
• Président du CLIN
• ARIH (Association Régionale des Infirmières Hygiénistes)
• ARECLIN Pharmacien

5° Groupe de travail

Laurence BOUILLET Biologiste - CH de VALENCIENNES

Michèle CAILLAUX Biologiste - CH de TOURCOING
Sylvie HENDRICX Biologiste - CH de DOUAI
Christiane KREMBEL Médecin Hygièniste - ULIN CHRU de LILLE et Institut Pasteur de Lille
Thierry LEVENT Médecin Hygièniste - CH de MAUBEUGE
Françoise MARSY Institut Pasteur de LILLE
Betty MORIN Institut Pasteur de LILLE
Jean Gabriel PAUL Biologiste - CH de BOULOGNE SUR MER
Dominique TRIVIER Médecin Hygièniste - CH de LENS et Groupe AHNAC
Anne VACHEE Biologiste - CH de ROUBAIX

Avec la participation de : Sylvie MEMBRE Pharmacien - CH de DUNKERQUE

Colette SAVAGE, Biologiste, CHRU de LILLE
Catherine COIGNARD, Biologiste, CH de Tourcoing
Edith MAZARS, Biologiste, CH de Valenciennes
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 N° de Fiche :1
Version :1
CONTROLE MICROBIOLOGIQUE DES SURFACES Date : Juin 2001
Pagination :1/2

1° Objet :

Quantifier voire qualifier la flore microbienne pour une surface donnée.

2° Champ d'application :

¾ Surfaces des zones à risque (risque 4 éventuellement 3, hors activité ou en activité)

¾ Surfaces des autres zones, en situation épidémique ou en situation particulière

3° Prélèvements :

¾ Etablir une liste des points critiques (points les plus

salissables, les plus manipulés, les plus proches du patient)
Le plan d'échantillonnage
¾ A titre indicatif, 8 points pour une salle de bloc opératoire, 5
points pour une chambre
¾ Zone à haut risque : 4 fois par an
La fréquence
¾ Autre zone : fréquence à discuter
Préciser le secteur, le local, la date et l'heure du prélèvement ainsi que le
nom du préleveur.
Les modalités Indiquer s'il s'agit d'un secteur en activité ou non, la date et l'heure du
nettoyage, le type de nettoyage (courant ou après sortie) et le type de
produit utilisé.
¾ gélose contact contenant 4 neutralisants (Lecithine,
Polysorbate, Thiosulfate de sodium, L-Histidine).
Le matériel
¾ Applicateur ou poids de 500 grammes
¾ Ecouvillon stérile humidifié
Par contact :
¾ A l'aide de Gélose contact maintenue sous une pression de
500 grammes pendant 10 secondes (à l'aide d'un applicateur
ou d'un poids de 500 grammes)
¾ Après avoir réalisé le prélèvement, ne pas oublier de
nettoyer la surface afin d'éliminer les traces de géloses
résiduelles
Indirect (écouvillon) :
Le mode de prélèvement
¾ non recommandé si on peut utiliser la méthode précédente.
Cette technique est réservée aux petites surfaces ne
permettant pas l’utilisation de gélose contact ou les
surfaces absorbantes ou irrégulières
¾ écouvillonner approximativement 10 cm2.

Dans les deux cas, transmettre les prélèvements au laboratoire dans les
meilleurs délais.

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4° Le mode opératoire :

Celui-ci consiste à rechercher les germes de l'hospitalisme et à dénombrer la flore totale selon la
technique suivante :

¾ Les boîtes de contact sont ensemencées sur site.

¾ Si l'on utilise des écouvillons, les décharger dans 1 ml d'une solution neutralisante
contenant au moins 3 des 4 inhibiteurs cités dans le tableau ci-dessus.
Ensemencer 0,1 ml sur une gélose d'un milieu équivalent à celui de la boîte de contact
(PCA, TCS ou TS…).
¾ Incuber 24 h à 37°C et relever la présence ou l'absence de germe de l'hospitalisme.
Incuber à nouveau 2 jours à température ambiante de façon à dénombrer la flore totale.
¾ Dénombrer le nombre total de colonies sur les 16 cm2 centraux de la boîte de contact.
¾ Pour les écouvillons, dénombrer le nombre total de colonies et le ramener en densité
pour 16cm2.
¾ Identifier les germes de l'hospitalisme par les méthodes standards.

5° La restitution des résultats et leur interprétation :

5.1 La restitution des résultats :

Rendre les résultats en UFC/16cm2. Si plus de 100 colonies ont été comptabilisées, rendre le résultat
sous l'intitulé suivant : > 100 UFC/16 cm2. Rendre l'identification des germes de l'hospitalisme
accompagnée d'une appréciation semi quantitative.

5.2 Interprétation :

L'interprétation de la bio-contamination des surfaces doit être réalisée au regard des valeurs
indicatives définies dans le tableau ci-dessous [1] :

Hors activité : bio-contamination des surfaces après nettoyage et désinfection : valeurs indicatives
Secteurs 1 2 3 4
Surfaces < 5 UFC /cm2 < 2 UFC/cm2 < 0,2 UFC/cm2 < 0,2 UFC/cm2

Alors que les modes opératoires, des prélèvements en activité sont les mêmes qu’hors activité, les
critères d’interprétation restent à définir.

Annexe : proposition de sectorisation

Secteur 1 Risques minimes :
Maison de retraite, bureau …
Secteur 2 Risques moyens :
maternité, psychiatrie, service de long et moyen séjour, consultation externe…
Risques sévères :
Pédiatrie, soins intensifs, urgences, salles de travail, médecine, radiologie,
Secteur 3 hémodialyse, réanimation, exploration fonctionnelle, hématologie,
chimiothérapie, bloc opératoire septique et obstétrical, stérilisation centrale,
salles d'eau, toilettes, cuisines, biberonnerie…
Très haut risques :
Secteur 4 Néonatologie, bloc opératoire aseptique, service de brûlés, immunodéprimés,
service de greffe, chimiothérapie, oncologie, onco-hématologie…

Bibliographie :

[1] Bio-décontamination des surfaces après nettoyage et désinfection. Guide du bio-nettoyage n°5670.
[2] Décontamination, bio-nettoyage, désinfection, stérilisation. Guide pratique 2e édition. Editions hospitalières 1995.
2 [3] Contrôles de l’environnement dans les zones à haut et très haut risque infectieux. ASPEC juin 1999

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 N° de Fiche :2
Version :1
CONTROLE MICROBIOLOGIQUE DU LINGE
Date : juin 2001
(articles textiles traités en blanchisserie)
Pagination :1/2

1° Objet :

Quantifier voire qualifier la flore microbienne pour une unité de surface donnée d'un article textile.

2° Champ d'application :

¾ En blanchisserie, en secteur de finition au niveau de l’expédition

¾ Dans les services, pendant l'activité.

3° Prélèvements :

¾ Exemples : Les articles textiles compris dans le plan

d'échantillonnage sont les suivants :
• Grand plat : draps….
• Petit plat : alèses, champs opératoires, torchons…..
• Linge en forme : tenues personnelles, tenues cuisines,
Tenues de bloc
• Linge séché : éponges, linge personnel, couches,
couvertures….
Le plan d'échantillonnage
¾ La proportion d'échantillons de chacune des quatre
Catégories citées est fonction de la proportion de chacune
d'elle traitée en blanchisserie (en %). Associer au plus petit
pourcentage le prélèvement de deux boites.
¾ Associer un facteur de multiplication 2 pour le linge souillé et
pour le linge fragile lavé à basse température ( < 60°)
Un exemple d’un plan d’échantillonnage vous est proposé dans le tableau 1,
page 6.
Elle est fonction du niveau de maîtrise des process et des bonnes pratiques
La fréquence
d'hygiène en blanchisserie.
¾ Préciser le type d'article textile concerné, la date et l'heure
du prélèvement, le nom du préleveur.
Les modalités
¾ Utiliser de préférence 2 boîtes par article textile, et
Prélever sur la surface externe du linge.
¾ Boîte de contact contenant 4 neutralisants (Lecithine,
Polysorbate, Thiosulfate de sodium, L-Histidine).
Le matériel
¾ Applicateur ou poids de 500 grammes

¾ A l'aide de la boîte de contact maintenue sous une pression

de 500 grammes pendant 10 secondes (à l'aide d'un
applicateur ou d'un poids de 500 grammes).
Le mode de prélèvement ¾ Tout linge analysé doit être relavé.
Transmettre les prélèvements au laboratoire dans les
meilleurs délais

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4° Mode opératoire

Celui-ci consiste à rechercher les germes de l'hospitalisme et à réaliser un dénombrement de la flore

totale selon la procédure définie ci-dessous :

¾ Incuber 24 h à 37°C, relever la présence ou l'absence de germes de l'hospitalisme, puis

incuber à nouveau 2 jours à température ambiante de façon à dénombrer la flore totale.
¾ Dénombrer le nombre total de colonies sur les 16 cm2 centraux de la boîte contact.
¾ Identifier les germes de l'hospitalisme par les méthodes standards.

5° La restitution des résultats et leur interprétation

5.1 La restitution des résultats

Rendre les résultats en UFC par 16 cm2. Si plus de 100 colonies ont été comptabilisées, rendre le
résultat sous l'intitulé suivant : > 100 UFC/16 cm2.
Rendre l'identification des germes de l'hospitalisme accompagnée d'une appréciation semi-
quantitative.

5.2 Interprétation

En fin de traitement, et immédiatement avant expédition : < 8 UFC /16 cm2

Cette valeur doit être préservée jusqu’à utilisation (notamment dans les services à haut risque).

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Proposition d’une fiche de contrôle microbiologique des articles textiles

Plan d’échantillonnage

Articles % Nombre de Linge souillé Linge fragile Total

Pvts (excrétats) Lavage < 60°C
Grand plat
Draps
Petit plat
Aléses
Champs opératoires
Torchons
Linge en forme
Tenues personnel
Tenues cuisine
Tenues de bloc
Linge séché
Eponges
Linge personnel
Couches
Couvertures
TOTAL

Aide au remplissage de la fiche

Ö considérer la répartition des articles textiles
Ö associer au plus petit pourcentage le prélèvement de 2 boites
Ö ajuster approximativement le nombre de prélèvements des autres articles au prorata du
nombre d’articles
Ö associer un facteur de multiplication 2 pour le linge souillé
Ö associer un facteur de multiplication 2 pour le linge fragile lavé à basse température

Exemple de contrôles microbiologiques des articles textiles

Nbre de Linge souillé Linge fragile Total

Articles % boites x2 X2
Grand plat 37 20 20
Petit plat 8 4 8 8
(alèses, torchons)
Linge en forme 10.7 6 6
Linge séché 20
Eponges 5 2 2
Linge personnel 11 6 12 24 24
Couches 3.2 2 2
Couvertures 4.2 2 4 4
TOTAL 66

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 EAUX ET USAGES : TYPOLOGIE

Typologie Utilisation Dénomination

Eaux destinées à ¾ Eau du réseau d'adduction
l'alimentation humaine ¾ Eau embouteillée
Eaux potables
répondant aux normes ¾ Eau des fontaines réfrigérées
en vigueur
Eaux Eaux destinées aux ¾ Eau "propre"
bactériologiquement soins ¾ Eau "ultra propre"
maitrisées
Eaux exemptes de ¾ Eau purifiée stérile
micro-organismes ¾ Eau stérilisée pour préparation injectable
Eaux stériles
vivants, répondant aux
conditionnées
normes de la
pharmacopée
¾ Eau pour hémodialyse
Autres eaux à usage
¾ Eau des piscines de rééducation ou de
de soins
balnéothérapie
¾ Eau chaude sanitaire
Les eaux techniques ¾ Eau de la climatisation
¾ Eau pour la production de la glace

Bibliographie

[1] L'eau dans les établissements de Santé COTEREHOS. DRASS Rhône Alpes mars 1995.

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 N° de Fiche : 3
CONTROLE MICROBIOLOGIQUE DE L'EAU NON Version : 1
FILTREE AUX POINTS D’EAU Date : juin 2001
Pagination :1/2

1° Objet :

Quantifier voire qualifier la flore microbienne dans l'eau délivrée par le point d’eau.
Cette eau doit respecter les critères microbiologiques de l’eau d’adduction publique dans le cadre d’un
usage courant et ne pas contenir de germes de l’hospitalisme.

2° Champ d'application :

Point d'eau des salles de soins et des postes infirmiers des unités de soins, ainsi que les chambres
des patients. Consultations externes, points de lavage des mains, biberonneries…

3° Prélèvements :

¾ Etablir un plan d'échantillonnage représentatif des points

Le plan d'échantillonnage
et la fréquence
d'eau non filtrée du réseau de l'établissement.
¾ Intervenir au moins une fois par an dans les unités suivantes :
chirurgie viscérale, traumatologie, urologie, pneumologie,
néonatologie, réanimation et soins intensifs …
¾ Réaliser en outre un écouvillonnage des siphons et des
robinets une fois par trimestre. Ces prélèvements sont des
indicateurs de la contamination par les germes de
l’hospitalisme

Préciser le secteur, le local, la date et l'heure du prélèvement ainsi que le

Les modalités
nom du préleveur.
Le matériel Flacon stérile contenant du thiosulfate de sodium (10 à 50 mg/ 500 ml)
Siphons et robinets (indicateur de la contamination par les germes de
l’hospitalisme) :
Utiliser un écouvillon sec.
Eau non filtrée (vérification de l’eau du réseau) :
¾ Détartrer la robinetterie par grattage et désinfection de
Celle-ci à l'aide d'une compresse imbibée d'alcool à 95° ou
d'eau de Javel ou d'un détergent désinfectant. Le temps de
Le mode de prélèvement
désinfection est d'au minimum 30 secondes.
¾ Laisser couler l'eau pendant au minimum une minute.
¾ Recueillir 500 ml d'eau dans le flacon stérile contenant du
Thiosulfate de sodium.
¾ Si l'analyse est différée, il est impératif de garder le
prélèvement à basse température (2 à 8°C). Dans tous les
cas, le délai d'acheminement doit être le plus court possible

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4° Le mode opératoire :

Celui-ci consiste à rechercher la présence des germes de l'hospitalisme dans l'eau du réseau non
filtrée selon la technique suivante :

¾ Filtrer 100 ml sur membrane à 0,45 microns et la déposer sur PCA ou à défaut BCP
¾ Déposer la membrane sur le milieu. Incuber 24 heures à 37°C puis 48 heures à
température ambiante
¾ Lecture et dénombrement des germes après 24 heures d’incubation à 37°C puis
48 heures d’incubation à température ambiante
¾ Identifier les germes de l'hospitalisme par les méthodes standards.

5° La restitution des résultats et leur interprétation :

5.1 La restitution des résultats :

Celle-ci se fera en UFC/100 ml.

5.2 L'interprétation :

Les germes de l'hospitalisme doivent être inférieurs à 1/100ml.

Annexe : contenu des analyses microbiologiques des échantillons d’eau potable distribuée par un réseau collectif ou privé

Réduite B1 Sommaire B2 Complète B3

• Coliformes • Coliformes thermotolérants • Coliformes totaux et
thermotolérants • Streptocoques fécaux thermotolérants
• Streptocoques fécaux • Dénombrement des bactéries • Streptocoques fécaux
aérobies revivifiables à 22°et à • Dénombrement des bactéries
37° C aérobies revivifiables à 22°et à
37° C
• Spores de bactéries anaérobies
sulfito-réductrices

Bibliographie :
Décret 89-3 du 3 janvier 1989 modifié relatif aux eaux destinées à la consommation humaine à l'exclusion
des eaux minérales naturelles.

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 N° de Fiche : 4
Version : 1
CONTROLE MICROBIOLOGIQUE DE L'EAU FILTREE Date : juin 2001
Pagination : 1/2

1° Objet :

Quantifier voire qualifier la flore microbiologique de l'eau filtrée.

2° Champ d'application :

Nous retiendrons ici l'eau dite de niveau 2 c'est à dire obtenue par microfiltration terminale à 0,2
microns absolu. (typologie : cf page n°7)

3° Prélèvements :

¾ Etablir la liste exhaustive des points d’eau filtrée pour les

services à risques suivants : bloc opératoire, chambre stérile,
réanimation, stérilisation et service de brûlés.
Le plan d'échantillonnage ¾ Avant toute chose, il est nécessaire :
• De contrôler si le filtre est bien adapté.
• De vérifier la fiche de traçabilité d’entretien du filtre
• De respecter les règles d'utilisation et d'entretien du filtre
¾ Une fois/trimestre ou au minimum 2 fois/an
La fréquence
¾ Ponctuellement sur intervention des services techniques.
Préciser le secteur, le local, la date et l'heure du prélèvement ainsi que le
Les modalités
nom du préleveur.
¾ Un flacon stérile par point d'eau contenant du thiosulfate de
Le matériel
sodium (10 à 50 mg/500ml)
¾ Laisser couler l'eau 3 minutes
¾ Recueillir 500 ml
Le mode de prélèvement ¾ Si l'analyse est différée, il est impératif de garder le
prélèvement à basse température (2 à 8°C). Dans tous les
cas, le délai d'acheminement doit être le plus court possible.
Il est conseillé de compléter les prélèvements d'eau par :
¾ Un écouvillonnage de la face externe du filtre avant le
Prélèvement complémentaire prélèvement d’eau si nécessaire
¾ Un écouvillonnage du siphon.
Se référer au mode opératoire défini dans la fiche précédente.

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4° Mode opératoire :

¾ Les milieux de culture utilisés seront le PCA ou à défaut le BCP

¾ Filtrer 100 ml sur une membrane à 0,45 microns et la déposer sur le milieu de culture.
¾ Incuber 24 heures à 37°C puis 48 heures à température ambiante. Le dénombrement
se fera à 24 heures et 72 heures.
¾ Une identification devra être menée en présence de plusieurs colonies identiques ou
devant toute suspicion de germes de l'hospitalisme.

5° La restitution des résultats et leur interprétation :

5.1 La restitution des résultats :

Celle ci se fera en UFC pour 100 ml.

5.2 L'interprétation :

Les critères microbiologiques retenus sont les suivants :

Absence de germes de l'hospitalisme(< 1/100ml) et moins de 10 UFC/100ml pour les germes totaux.

Annexe : Typologie de l'eau bactériologiquement maîtrisée

L'eau bactériologiquement maîtrisée à l'hôpital est une appellation instaurée par le COTEREHOS (Comité Technique Régional
de l'Environnement Hospitalier - DRASS Rhône Alpes) pour désigner l'eau à usage hospitalier, produite dans l'établissement à
partir d'eau d'adduction publique.

Dénomination Usage Exigences de qualité

Niveau 1 : "eau propre"
Niveau 2 : "eau ultra-propre"
Niveau 3 : "eau stérile"
¾ Rinçage coloscope et gastroscope
¾ Toute utilisation dans les services de
soins
¾ Secteurs protégés : unité brûlés,
greffés…
¾ Rinçage bronchoscope
¾ Lavage chirurgical des mains
¾ Rinçage arthroscope et coelioscope
¾ Humidificateur d'oxygène
¾ Aérosols
¾ Inférieur ou égal à 100 UFC/100 ml
après 24h à 37° et 72 h à 22°
¾ Absence de P. aeruginosa dans
100 ml
¾ Inférieur ou égal à 10 UFC /100 ml
après 24h à 37° et 72 h à 22°
¾ Absence de P. aeruginosa dans 100 ml
Eau exempte de micro-organismes vivants,
répondant aux normes de la pharmacopée.

Bibliographie :

[1] L'eau dans les établissements de santé. Commission technique régionale de l'environnement hospitalier. DRASS
Rhöne-Alpes mars 1995.
[2] Eau à usage médical. Définition; Interprétation pratique. Groupe eau santé. Janvier 1998

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 N° de Fiche : 5
Version : 1
CONTROLE MICROBIOLOGIQUE DE LA DESINFECTION
Date : juin 2001
DES ENDOSCOPES
Pagination :1/2

1° Objet :

Quantifier, voire qualifier la flore microbiologique de la lumière de l’endoscope après désinfection.

2°Champ d'application :

Endoscopes souples (fibroscopes) ou rigides non "stérilisables", les "laveurs-désinfecteurs".

3° Prélèvements :

¾ Etablir un plan d'échantillonnage

¾ Faire préciser le type de rinçage (eau filtrée, eau stérile, eau
Le plan d'échantillonnage d'adduction) et le produit désinfectant utilisé
¾ En cas d'utilisation d'un lave endoscope, réaliser des
prélèvements d'eau en amont de la machine.
La fréquence Une fois par trimestre
Préciser la date et l'heure du prélèvement ainsi que le nom du préleveur.
Les modalités
Indiquer l'identification de l'endoscope ou du fibroscope contrôlé.
¾ Gants stériles
¾ 1 flacon stérile (500 ml par endoscope)
¾ 3 flacons stériles par endoscope contenant une solution
neutralisante pharmacopée (DNP) disponible en flacon de
Le matériel
90ml (exemple : AES). Cette solution permet de décoller le
biofilm (support des micro-organismes) et d'inhiber les
traces éventuelles de désinfectant
¾ Une seringue de 60 ml
¾ Il s'effectue dans le local de stockage.
¾ Réaliser un lavage simple des mains, enfiler les gants
Stériles, et saisir l'endoscope.
¾ Introduire stérilement la seringue à l'extrémité du canal de
l'endoscope et y injecter les 3 fois 90 ml de la solution
Le mode de prélèvement neutralisante. Récupérer celle-ci stérilement dans le flacon
stérile en évitant que le tuyau de l'endoscope ne touche
l'intérieur du flacon.
¾ Refermer rapidement le flacon et l'adresser le plus
rapidement possible au laboratoire (sinon, le maintenir à
4°C°).

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 4° Le mode opératoire

Les germes à rechercher : ceux de l'hospitalisme et les bactéries de la cavité explorée.

La méthodologie :
¾ Filtrer 200 ml sur une membrane à 0,45µm si le rinçage de l'endoscope a été réalisé en
eau filtrée ou stérile.
¾ Filtrer 10 ml si le rinçage de l'endoscope a été réalisé en eau d'adduction.
¾ Rincer la membrane avec 3X50 ml d'eau stérile et la déposer sur PCA. Incuber
¾ à 37°C pendant 48 heures.
¾ Observer les boîtes ayant cultivé et effectuer une première lecture à 24 heures.
¾ Réaliser la lecture définitive à 48 heures.

5° La restitution des résultats et leur interprétation

5.1 La restitution des résultats :

Celle ci se fera en UFC pour 200 ml ou 10 ml selon la quantité filtrée.

5.2 L'interprétation des critères microbiologiques de l'eau de rinçage

Type d'eau de rinçage Les critères microbiologiques

Rinçage en eau filtrée ou
en eau stérile
Rinçage en eau d'adduction
¾ Germes < 20UFC/200 ml
¾ Absence de bactéries du tube digestif ou des bactéries
de la cavité explorée
¾ Absence de germes de l'hospitalisme
¾ Germes < 100UFC/10 ml
¾ Absence de bactéries du tube digestif ou des bactéries
de la cavité explorée
¾ Absence de germes de l'hospitalisme

Bibliographie

[1] Circulaire DGS/BH n°236 du 02 avril 1996 relative aux modalités de désinfection des endoscopes dans les lieux
de soins.
[2] DRASS Rhône-Alpes. COTEREHOS. L'eau dans les établissements de santé. 1995
[3] CTIN. Désinfection des dispositifs médicaux. Guide des bonnes pratiques. 1998
[4] Groupe eau-santé. Eau à usage médical. Qualité de l'eau et endoscopie. Mai 1999

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 N° de Fiche : 6
Version : 1
CONTROLE MICROBIOLOGIQUE DE L'EAU
Date : juin 2001
DES PISCINES DE REEDUCATION
Pagination : 1/2

1° Objet :

Quantifier voire qualifier l'existence de germes dans l'eau des bassins de rééducation.

2° Champ d'application :

Tous les bassins utilisés pour la rééducation ou la balnéothérapie.

3° Prélèvements :

Le plan d'échantillonnage
La fréquence Au moins une fois par mois.
Préciser la date et l'heure du prélèvement ainsi que le nom du
Les modalités
préleveur.
Un flacon de 500 ml stérile contenant du thiosulfate de sodium ( 50
Le matériel
à 60 mg/500ml ).
¾ Prélèvement des eaux de bassin dans les flacons stériles à 10 cm
sous l'eau de surface.
Le mode de prélèvement ¾ Si l'analyse est différée, il est impératif de garder le
prélèvement à basse température (2 à 8°C). Dans tous les
cas, le délai d'acheminement doit être le plus court possible.

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4°Lemode opératoire

¾ Germes viables à 37°C et à température ambiante

¾ Coliformes totaux et thermotolérants
Recherche à effectuer ¾ Staphylococcus aureus
¾ Pseudomonas aeruginosa
¾ Legionella (si nécessaire)
¾ Pour la recherche des germes totaux :
¾ filtrer 1 ml sur membrane à 0,45µm avec 50 ml d'eau stérile puis
rincer la membrane avec 50 ml d'eau stérile. Sinon, utiliser la
Méthode d'ensemencement
méthode par inclusion avec 1 ml d'eau sur PCA.
¾ Pour les autres germes :
¾ Filtrer 100 ml d'eau sur membrane à 0,45µm .
¾ Germes totaux :
Incubation à 37°C pendant 48 heures et incubation à
température ambiante
pendant 72 heures sur PCA.
¾ Coliformes totaux :
Incubation à 37°C pendant 24 heures puis 48 heures sur
milieu TTC et TERGITOL 7.
¾ Coliformes thermotolérants :
Incubation à 44°C pendant 24 heures puis 48 heures
Incubation
sur milieu TTC et TERGITOL 7.
¾ Staphylococcus aureus :
Incubation à 37°C pendant 24 heures puis 48 heures sur
milieu CHAPMAN.
¾ Pseudomonas aeruginosa :
Incubation à 37°C pendant 24 heures puis 48 heures sur
gélose cetrimide.
¾ Legionella :
Voir fiche Legionella.
¾ Germes viables :
dénombrement au bout de 24 heures à 37°C et à 72
Lecture
heures à température ambiante.
¾ Autres germes : dénombrement à 48 heures.

5° La restitution des résultats et leur interprétation

5.1 La restitution des résultats

Celle ci se fera en UFC /ml pour les germes totaux et pour 100 ml pour tous les autres (coliformes
totaux, coliformes thermotolérants..)

5.2 Les critères microbiologiques

Germes Critères retenus

Germes totaux < 100/ml
Coliformes totaux < 10 dans 100 ml
Coliformes thermotolérants < 1 dans 100 ml
Staphylococcus aureus < 1 dans 100 ml
Pseudomonas aeroginosa < 1 dans 100 ml
Legionella < 103 dans 1 litre

Bibliographie

[1] décret 1981 modifié en 1989 et 1991 : règlement des piscines publiques.
[2] normes NFT 90 401 - 402, 90 414, 90 416,90 420 , 90 421
[3] norme NF en ISO 6622 15

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 N° de Fiche : 7
Version : 1
RECHERCHE DE LEGIONELLA DANS UNE EAU
Date : juin 2001
SELON LA NORME NFT 90 431
Pagination : 1/2

1° Objet :
Quantifier voire qualifier l'existence de legionelles dans l'eau du réseau de l'établissement.

2° Champ d'application
Méthode applicable à tous les types d'eau

3° Les prélèvements :

¾ Points critiques à définir avec l'équipe technique.

¾ Prélèvement effectué dans tous les réservoirs, ballons d'eau
chaude et installations à risques.
Le plan d'échantillonnage
¾ Au niveau de deux points d'usage par tranche de 100 lits (et
au minimum 10 points d'usage pour les établissements de
moins de 500 lits).
La fréquence Au moins une fois par an.
Préciser la date, l'heure, et le site du prélèvement ainsi que le nom du
Les modalités
préleveur.
2 flacons de 500 ml contenant du thiosulfate de sodium (environ 10 à
Le matériel
50mg/500 ml).
¾ Après décontamination du robinet( flamber l'embouchure du robinet
ou désinfecter l'extrémité du robinet à l'alcool à 95°, à l'eau de Javel
ou à l'aide d'un détergent-désinfectant) , laisser couler l'eau chaude
Le mode de prélèvement pendant une minute au minimum. Prélever alors un litre d'eau.
¾ Si l'analyse est différée, il est impératif de garder le prélèvement à
basse température (2 à 8°C). Dans tous les cas, le délai d'acheminement
doit être le plus court possible

4° Le mode opératoire :

4.1 La méthode
Ensemencer par étalement 0,2 ml et 0,2 ml d'une dilution à 1/10 dans du tampon phosphate PBS de
l'eau à analyser. Filtrer un litre d'eau (le reste) sur membrane de polycarbonate. Mettre la membrane
dans 5 ml d'eau stérile, et la placer dans une cuve à ultrasons pendant 2 minutes.
Etaler 0,1 ml sur gélose BcyE + ATB + L.cysteine (GVPC).

Traitement acide Traitement thermique

¾ Prélever 2 ml du mélange ¾ Prélever 2 ml du mélange
¾ Centrifuger 10 minutes à 60 000 g ¾ Chauffer à 50°C pendant 30 minutes
¾ Enlever 1 ml du surnageant ¾ Etaler 0,1 ml sur gélose BcyE + ATB +
¾ Agiter puis ajouter 1 ml de tampon PH 2.2* (vérifier le PH L.cysteine (GVPC).
du tampon tous les 15 jours).
¾ Agiter doucement
¾ Laisser en contact 5 minutes
¾ Etaler 0,1 ml sur gélose BcyE + ATB L.cysteine (GVPC).
¾ Il est possible de ne pas centrifuger . Dans ce cas , ajouter à
2 ml d’échantillon , 2 ml de tampon acide. Après un temps de
contact de 5 min ± 0,5 min , ensemencer immédiatement 0,2 ml
sur une boite de milieu sélectif ou ensemencer 2 boites avec
0,1 ml par boite de milieu sélectif .

*Composition du tampon PH 2,2 : HCL 0,2 mol/litre …3,9 ml , KCL 0,2 mol/litre…25 . Ajuster à PH 2,2 avec KOH 1 mol/l
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D:\travail\hygiène\hh128
4.2 L'incubation

Incuber les 5 boîtes à 37°C jusqu'à 10 jours en atmosphère humide (sachet + papier type absorbant
humidifié). Surveiller après 3 jours d'incubation.

4.3 La lecture

¾ Dénombrer les colonies ayant apparu.

¾ Repiquer en quartier sur une boîte de milieu BcyE + L.cysteine,
Dénombrement de Legionella BcyE et gélose au sang.
¾ Si 1 < N < 5 : repiquer toutes les colonies
¾ Si 5 < N < 50 : repiquer 5 à 7 colonies
¾ Rechercher en fluorescence (cf. annexe 1).
¾ Les colonies ayant cultivé en milieu selectif BcyE + L.cysteine
sont mises en contact avec un sérum fluorescent polyvalent
Dénombrement de Legionella anti-Legionella pneumophila.. La réaction d’immuno-fluorescence
pneumophila est validée par un témoin positif qui est une souche de
Legionnella pneumophila de sérogroupe 1 et un témoin négatif
qui est une souche de Pseudomonas fluorescens.
Déterminer la proportion de Legionella et de Legionella pneumophila.

5° La restitution des résultats et leur interprétation

5.1 La restitution des résultats des résultats

Eau non concentrée diluée Nombre de Legionella

Eau non concentrée Eau concentrée
au 1/10 UFC / litre
N* > 4 N x 10.3/0.2 = Nx5x10.3
N* > 4 4 < N1 < 100 N +N1/0.22x10.3
N = nombre de colonies
N* non exploitable N non exploitable Nx50
confirmées le plus élevé
Absence de colonies
< 50
confirmées
N*= nombre de colonies sur boîte.

5.2 Interprétation

Rendre le nombre de Legionella dont le nombre de Legionella pneumophila. Les recommandations OMS
sont de moins 103 Legionella par litre.

Bibliographie

[1] circulaire DGS n° 98-771 du 31 décembre 1998 relative à la mise en œuvre des bonnes pratiques d'entretien des
réseaux d'eau dans les établissements de santé et aux moyens de prévention du risque lié aux Legionelles dans les
installations à risque et dans celles des bâtiments recevant du public
[2] Norme AFNOR NFT 90431
[3] qualité de l’eau – recherche et dénombrement des legionella – ISO. 11731 :1998 (F)

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D:\travail\hygiène\hh128
 N° de Fiche :8
Version : 1
CONTROLE MICROBIOLOGIQUE DES EAUX
Date : juin 2001
D'HEMODIALYSE CONVENTIONNELLE
Pagination : 1/2

1° Objet :

Quantifier voire qualifier la flore microbienne dans les eaux d'hémodialyse.

2° Champ d'application :

Eau pour hémodialyse : appellation codifiée par une monographie de la pharmacopée Européenne dont
l'intitulé exact est " eau pour dilution des solutions concentrées pour hémodialyse".
Cette eau est produite à partir d'eau potable , le plus souvent par des centrales comportant plusieurs
étapes : filtration, filtration sur charbon actif, adoucissement, osmose inverse et /ou échange d'ions,
microfiltration et ou ultra filtration….

3° Prélèvement :

¾ Points de contrôle à discuter avec l'ingénieur technique.

¾ Pour l'eau osmosée, prélever en sortie d'osmoseur, au
Le plan d'échantillonnage départ et en retour de boucle.
¾ Si appareil mobile autonome : prélever à la sortie du système
avant ajout du dialysat.
¾ Une fois par semaine au maximum ou une fois par mois au
minimum.
La fréquence
¾ Pour l'eau d'adduction, réaliser un prélèvement une fois par
trimestre et réaliser une analyse de type B2.
Préciser la date, l'heure, et le site du prélèvement ainsi que le nom du
Les modalités
préleveur.
Le matériel Flacons stériles.
¾ Le volume minimal à prélever :
• 500 ml (1 flacon par site de prélèvement)
• 30 ml (1 flacon pour la recherche d'endotoxines)
¾ Flamber l'embouchure du robinet ou désinfecter l'extrémité
du robinet à l'alcool à 95°, à l'eau de Javel ou à l'aide d'un
Le mode de prélèvement détergent-désinfectant.
¾ Laisser couler l'eau quelques minutes et recueillir le liquide
dans un flacon stérile de façon aseptique et l'étiqueter en
mentionnant le site prélevé.
¾ Prélèvement à conserver entre 4°C et 8°C pendant 2 à 4
heures maximum.

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4° Le mode opératoire :

Rechercher et dénombrer les germes aérobies viables totaux sur milieu trypticase soja et
rechercher les moisissures et levures sur milieu sabouraud 40g/litre de glucose.
¾ La méthodologie :
• Filtrer 100ml d'eau osmosée à analyser sur membrane 0,45 µm.
• Rincer avec 100ml d'eau stérile. Déposer la membrane sur la gélose.
• Eventuellement, ensemencer en parallèle 0,1 ml par étalement sur gélose.
¾ L'incubation :
• Sabouraud à température ambiante pendant 5 jours.
• TRYPTO-CASEINE SOJA à 30-35°C pendant 5 jours.
¾ La lecture :
• Lecture chaque jour jusqu'à 5 jours.
• Dénombrement pour 100ml d'eau.

5° La restitution des résultats et leur interprétation :

5.1 La restitution des résultats

Dénombrement pour 100 ml d'eau.

5.2 L'interprétation des résultats

Les germes aérobies totaux revivifiables doivent être inférieurs à 100 UFC/ml à température
ambiante et à 30°C.
Pas d'identification sauf cas particulier (ex : infection ou choc chez le dialysé, intervention
technique sur le circuit).
Contrôler l'efficacité des milieux, l'absence d'inhibiteur dans l'eau de dialyse ainsi que la validité de
la méthode de dénombrement des germes ( cf. annexe).
Les endotoxines bactériennes ne doivent pas dépasser 0,25 UI/ml .

Annexe
Ce contrôle doit être réalisé lors de chaque manipulation.
Préparer une suspension de germes : E.coli de préférence (souche ATCC) ou S.aureus.
¾ Culture de 24 heures de la souche (E. coli ou S.aureus) sur gélose TCS.
¾ Emulsionner la souche dans un tube d'eau distillée pour obtenir 108 /ml (soit une valeur Do
comprise entre 0,2 et 0,3 à la longueur d'onde 620 nm plus ou moins 20 nm). Diluer jusqu'à -6,
Méthodologie
pour obtenir 102 /ml.
¾ Filtrer 100 ml d'eau osmosée à analyser et ajouter 50 ml d'eau stérile contenant 1 ml de la
suspension à 100 germes par ml.
¾ Faire un témoin positif (1 ml de suspension à 100 germes par ml + eau stérile) et filtrer sur
membrane.
Incubation Incuber à 30 - 35°C.
¾ Dénombrer en 24 - 48 heures.
¾ Témoin positif : environ 100 colonies. L'essai est non valable si le nombre de colonies est
inférieur à 20 ou 30.
Interprétation
¾ Eau osmosée à analyser : théoriquement voisin de 100 colonies. Il faut au moins 50% de colonies
par rapport au témoin positif ; si le nombre de colonies est insuffisant, il y a présence
d'inhibiteur dans l'eau.

Bibliographie

[1] pharmacopée Européenne 1997 (paragraphes 2 , 6, 12)

[2] groupe Eau Santé - eau à usage médical définitions et interprétations pratiques Janvier 1998

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D:\travail\hygiène\hh128
 N° de Fiche :9
Version : 1
CONTROLE MICROBIOLOGIQUE POUR LA PRATIQUE DE
Date : juin 2001
L’HEMO(DIA) FILTRATION
Pagination : 1/2

1° Objet :

Quantifier voire qualifier la flore microbienne dans les eaux destinées à la pratique de
l’hémo(dia)filtration.

2° Champ d'application :

La circulaire n°2000-311 du 7 juin 2000 définit les conditions de sécurité sanitaire de pratique de
l’hémofiltration et hémodiafiltration en ligne.
Dans l’hémofiltration, le transfert des solutés est convectif et la balance volémique du patient est
maintenue en réinjectant une solution de substitution.
Dans l’hémodiafiltration , le transfert des solutés est convectif et diffusif et nécessite un dialysat
et une solution de substitution

3° Prélèvement :

Le plan d'échantillonnage Points de contrôle à discuter avec l’ingénieur technique

¾ Eau d’alimentation des générateurs de dialyse : contrôle

microbiologique et endotoxinique une fois par semaine au maximum et une
fois par mois au minimum
¾ Dialysat : contrôle microbiologique et endotoxinique, effectué à
La fréquence
l’entrée du dialyseur sur chaque générateur une fois par mois au minimum.
¾ Solution de substitution : contrôle microbiologique et endotoxinique
une fois par mois au minimum et par générateur. L’échantillon est prélevé en
dehors d’une séance d’hémo(dia) filtration.

Préciser la date, l'heure, et le site du prélèvement ainsi que le nom du

Les modalités
préleveur.
Le matériel Flacons stériles.
¾ Le volume minimal à prélever :
• 30 ml (1 flacon pour la recherche d'endotoxines)
• 1 l d’eau d’alimentation des générateurs
• 100 ml de dialysat
• 50 ml de solution de substitution
¾ Flamber l'embouchure du robinet ou désinfecter l'extrémité
Le mode de prélèvement du robinet à l'alcool à 95°, à l'eau de Javel ou à l'aide d'un
détergent-désinfectant.
¾ Laisser couler l'eau quelques minutes et recueillir le liquide
dans un flacon stérile de façon aseptique et l'étiqueter en
mentionnant le site prélevé.
¾ Prélèvement à conserver entre 4°C et 8°C pendant 2 à 4
heures maximum.

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D:\travail\hygiène\hh128
4° Le mode opératoire :

Rechercher et dénombrer les germes aérobies viables totaux sur milieu pauvre (R2A ou
PCA )
¾ La méthodologie :
• Filtrer 1 l d'eau sur membrane 0,45 µm.
• Rincer avec 100ml d'eau stérile. Déposer la membrane sur la gélose.
¾ L'incubation :
• pendant 7 jours à température ambiante
¾ La lecture :
• Lecture chaque jour jusqu'à 7 jours.
• En cas de culture positive, l’identification des germes est indispensable

5° La restitution des résultats et leur interprétation :

Eau d’alimentation des générateurs : les germes aérobies totaux revivifiables doivent être
inférieurs à 100 UFC/l .. Les endotoxines bactériennes de l’eau d’alimentation des générateurs ne
doivent pas dépasser 0.25 UI/ml (pharmacopée européenne).

Dialysat : mêmes normes que l’eau d’alimentation des générateurs .

Solution de substitution : elle ne doit contenir aucune bactérie dans l’échantillon prélevé et moins de
0,05 Ul/ml d’endotoxines.

Bibliographie

Circulaire DGS/DH/AFSSAPS n ° 2000-311 du 7 juin 2000 relative aux spécifications techniques et à la sécurité
sanitaire de la pratique de l’hémofiltration et de l’hémodiafiltration en ligne dans les établissements de santé

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D:\travail\hygiène\hh128
 N° de Fiche :10
Version :1
LES PRELEVEMENTS MICROBIOLOGIQUES DE L’AIR Date : juin 2001
Pagination :1/2

1° Objet :

Quantifier la teneur de l'air en bactéries revivifiables, voire qualifier la flore microbienne pour un
volume d'air prélevé dans une atmosphère maîtrisée.

2° Champ d'application :

L'étude de la contamination bactérienne de l’air n'a d'intérêt que dans les zones sensibles ou
protégées pour lesquelles la contamination doit être faible. Les prélèvements se limiteront donc aux
blocs opératoires, aux unités "stériles" (onco-hématologie, service de transplantation,
conditionnement et stock stériles en stérilisation…) ou tout autre secteur bénéficiant d’air
microbiologiquement maîtrisé.

3° Prélèvements :

Définir la zone préférentielle du ou de(s) prélèvement(s) près de la table

Le plan d'échantillonnage d'opération ou de radiologie interventionnelle (conditionnement et stock
stérile…
¾ une fois par trimestre, au minimum 2 fois par an
¾ après chaque opération nécessitant une interruption du traitement d'air (
La fréquence
alerte incendie avec mise en jeu du système de désenfumage, maintenance
des gaines ou des filtres….)
¾ l'opérateur doit être en tenue de bloc (pyjama, masque, charlotte) et
procédera à un lavage des mains avant tout prélèvement
¾ préciser le service, le local, la zone du local, la date et l'heure du
Les modalités
prélèvement ainsi que le nom de l'opérateur.
¾ Préciser l'heure du bio-nettoyage et/ou de la désinfection par rapport au
moment du prélèvement
¾ Le bio-collecteur : appareil à prélèvement d'air fonctionnant par impaction
(vitesse d'impaction inférieure à 20m/sec [5] ou à défaut à 100m /sec [2] ,
Le matériel
débit d'aspiration supérieur à 100l/min [5] ou à défaut 50l /min [2]
¾ Gélose trypto-caséïne soja
¾ Placer le bio-collecteur à un mètre du sol au niveau de la zone préférentielle
à prélever, fermer les portes ou le sas.
¾ L'opérateur devrait quitter la salle et déclencher le bio-collecteur à l’aide
d’une télé-commande sinon celui-ci restera immobile pendant la durée du
prélèvement. Il est souhaitable que les prélèvements soient toujours
effectués par la même personne.
Le mode de prélèvement ¾ Se munir de géloses témoins de façon à détecter des contaminations non
liées au(x) prélèvement(s)
¾ Prélever au minimum 1m3 ( 1000 l ) par salle en deux fois ou si nécessaire en
plusieurs fois
¾ Se munir de lingettes à usage unique et d'un pulvérisateur contenant un
détergent décontaminant de façon à traiter le bio-collecteur en cas de
prélèvements successifs.
22

D:\travail\hygiène\hh128
4° Le mode opératoire :

Idéalement le(s) prélèvement(s) et la phase d'analyse microbiologique devraient être

réalisés par la même personne.
Les géloses ensemencées lors du prélèvement seront incubées rapidement dans un
incubateur propre et si possible en l’absence des prélèvements cliniques en particulier pour
une recherche mycologique. En effet, la contamination est facile et peut remettre en cause
la conformité du résultat.
¾ L'incubation :
Incuber 24h à 37°C puis 48 h à température ambiante
¾ La lecture :
Dès 24h, évaluer la flore totale et identifier les levures, moisissures et
germes de l'hospitalisme.
Evaluer la flore totale accompagnée des recherches spécifiques éventuelles

5° La restitution des résultats et leur interprétation :

5.1 La restitution des résultats

¾ L'étude quantitative est réalisée par numération des colonies sur la boite gélosée,et
exprimée en PNC/m3 ou UFC/m3 (en connaissant le volume analysé)
¾ L'étude qualitative est réalisée par identification bactériologique de toute colonie
susceptible d'être incriminée dans un processus infectieux.

5.2 L'interprétation des résultats

Hors présence humaine :

haut risque* tres haut risque*

Bactéries Moisissures Bactéries Moisissures
Action 500 1 10 1
Alerte 100 1 5 1
Cible 10 <1 1 <1

En présence humaine :

haut risque* tres haut risque*

Bactéries Moisissures Bactéries Moisissures
Cible 100 <1 10 <1

*niveau à définir localement (ex : chambre d’hématologie, salle d’opération porte fermée)

Bibliographie

[1] AUDURIER A. et col./l'air à l'hôpital. part.5, chap.2, 381-402 in : Hygiène Hospitalière, presses universitaires de
Lyon 1998
[2] NFS 90.351 - procédures de réception et de contrôle des salles d'opérations. Qualité de l'air AFNOR 1987
[3] EN X 44.111-4 projet : méthodes d'analyses et de mesurage de l'aéro-contamination en zones à risques.
[4] Contrôle de l’environnement dans les établissements à hauts et très hauts risques ASPEC – 1999.
[5] ISO 14698-1 Salle propre et environnement maîtrisé apparenté. Maîtrise de la bio contamination

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 N° de Fiche :11
Version :1
RISQUE ASPERGILLAIRE : SURVEILLANCE
Date : juin 2001
DE L’ENVIRONNEMENT
Pagination :1/3

1° Objet :

Surveiller et quantifier la présence éventuelle de spores d’Aspergillus dans l’environnement immédiat

des patients considérés à haut risque d’infection aspergillaire. Les spores ou conidies, forme de
dissémination du champignon, se retrouvent aussi bien dans l’air que sur divers supports.
La surveillance associera :
• Le contrôle de l’air qui appréciera la situation instantanée (qualité de l’air ambiant ou traité)
• Le contrôle des surfaces qui est le reflet des anomalies survenues dans les jours
précédents le prélèvement.

2° Champ d'application :

La surveillance est ciblée sur les secteurs où sont hospitalisés les patients à risque d’infection
aspergillaire (neutropénie profonde et/ou prolongée, allogreffe, corticothérapie élevée et prolongée,
retransplantation d’organes..)
¾ En priorité, les secteurs bénéficiant d’un système de traitement d’air avec filtration HEPA
(flux laminaires ou flux turbulents avec hyper pression) et accueillant des patients à haut
risque d’aspergillose invasive
¾ Dans les unités sans traitement d’air ou avec qualité de filtration autre qu’HEPA, l’intérêt d’une
surveillance mycologique systématique, qui n’a plus un objectif assurance qualité n’est pas
démontrée.

3° Prélèvements :
3.1 Le contrôle des surfaces

Définir la zone préférentielle du ou de(s) prélèvement(s).

¾
Réaliser 5 à 10 prélèvements par chambre le plus près possible du patient en
¾
privilégiant les surfaces métalliques horizontales, les appareils électriques, les
rampes lumineuses et les zones humides. Les bouches d’arrivée et d’extraction
Le plan d'échantillonnage
d’air
¾ En cas de travaux ou dans un contexte d’aspergillose invasive, élargir aux zones
frontières entre chantiers et services d’hospitalisation , ainsi qu’aux secteurs
contigus accueillant les patients à risque.
Calquée sur celui de la surveillance de l’aérobiocontamination :
¾ Trimestrielle en routine
La fréquence
¾ A la demande en cas de travaux ou de survenue d’aspergillose invasive
nosocomiale
¾ L'opérateur doit être en tenue identique au service (si nécessaire pyjama,
masque, charlotte) et procédera à un lavage des mains avant tout prélèvement
¾ préciser le service, le local, la zone du local, la date et l'heure du prélèvement
Les modalités
ainsi que le nom de l'opérateur.
¾ Le prélèvement doit être réalisé 4 heures après le bio- nettoyage et/ou la désinfection, si
possible avant l’entrée d’un nouveau malade
¾ Boîte de type contact avec milieu adapté à la croissance fongique pour les
Le matériel surfaces planes (SABOURAUD, MALT-AGAR)
¾ Alternative : méthodes par écouvillonnage
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D:\travail\hygiène\hh128
3.2 Surveillance de la biocontamination aérienne :

Le plan d'échantillonnage Définir la zone préférentielle du ou de(s) prélèvement(s)

Calquée sur celui de la surveillance de l’aérobiocontamination :
¾ Trimestrielle en routine
La fréquence
¾ A la demande en cas de travaux ou de survenue d’aspergilose invasive
nosocomiale
¾ L'opérateur doit être en tenue identique au service (si nécessaire pyjama,
masque, charlotte) et procédera à un lavage des mains avant tout
prélèvement
Les modalités ¾ préciser le service, le local, la zone du local, la date et l'heure du
prélèvement ainsi que le nom de l'opérateur.
¾ Le prélèvement doit être réalisé 4 heures après l'heure du bio-
nettoyage et/ou de la désinfection
¾ Le bio-collecteur : appareil à prélèvement d'air fonctionnant par impaction
(vitesse d'impaction strictement inférieure à 20m/sec et débit d'aspiration
Le matériel supérieur à 100l/mn)
La durée du prélèvement doit être brève (temps optimal 2 minutes)
¾ Milieu de culture : gélose Sabouraud ou malt agar
¾ Le volume d’air à prélever est d’au moins 1000 litres pour les unités
équipées d’un filtre HEPA.
Le mode de prélèvement
¾ Le volume d’air à prélever sera de 250 à 500 litres pour les unités non
protégées.

4° Le mode opératoire :

Idéalement, le(s) prélèvement(s) et la phase d'analyse microbiologique devraient être réalisés par
la même personne.
Les géloses ensemencées lors du prélèvement seront incubées rapidement dans un incubateur
propre et si possible en l’absence des prélèvements cliniques en particulier pour une recherche
mycologique. En effet, la contamination est facile et peut remettre en cause la conformité du
résultat.
¾ L’incubation :
• incuber à température ambiante (reflet de la contamination fongique globale –
détection d’éventuelles anomalies de filtration).
• Et/ou à 37° C pour cibler les espèces capables de se développer à température
corporelle en particulier Aspergillus fumigatus et Aspergillus flavus.
¾ La lecture :
• Réaliser une lecture précoce à 48 heures
• Laisser incuber 5 à 7 jours

25

D:\travail\hygiène\hh128
5° La restitution des résultats et leur interprétation :

5.1 La restitution des résultats

¾ L'étude quantitative est réalisée par numération des colonies de champignons

filamenteux sur la boite gélosée, exprimée en PNC/m3 ou UFC/m3 (en connaissant le
volume analysé)
¾ L'étude qualitative est réalisée par identification mycologique.

5.2 L'interprétation des résultats

5.2.1 Blocs opératoires hors présence humaine

Le risque aspergillaire ne se justifie pas pour les blocs opératoires.

5.2.2 Chambre d’hospitalisation en présence humaine

Secteurs protégés HEPA Secteurs non HEPA

Air Cible 0 UFC / m3 -
Alerte > 1 UFC / m3 pour A. fumigatus -
Cible 0 UFC pour 6 points de prélèvement 5 UFC par chambre
Surface Alerte 1 UFC d’A. fumigatus -

Bibliographie

[1] LAJONCHERE JP, FEUILHADE DE CHAUVIN M – contamination aspergillaire : évaluation des mesures de prévention
et surveillance de l’environnement. Pathol. Biol. 1994 ;42 :718-729
[2] Groupe CLIOH. Réflexions sur la prophylaxie de l’aspergillose en onco-hématologie. La lettre de l’infectiologue 1995 ;
14 :553-8
[3] guidelines for prevention of nosocomial pneumonia. Centers for diseases control and prevention . Respiratory care,
1994, 39 :1191-1230
[4] FRIDKIN SK, JARVIS WR- epidemiology of nosocomial fungal infections. Clin. Microbiol. Rev, 1996 ;9 499-511
[5] GRILLOT R., NOLARD N. – méthodes de surveillance de l’environnement : techniques d’évaluation et utilité. Prévention
du risque aspergillaire chez les patients immunodéprimés. Conférence de consensus, institut pasteur , Paris ,
21 mars 2000
[6] Conférence de consensus sur « prévention du risque aspergillaire chez les patients immuno-déprimés (hématologie,
transplantation ) » - mars 2000

26

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 GLOSSAIRE DES MILIEUX DE CULTURE UTILISES DANS LES MODES
OPERATOIRES

TCS (trypto-casèine-soja)
¾ Hydrolysat trypsique de caséine 15
¾ Peptone de soja 5
¾ Chlorure de sodium 5
¾ Agar 15 en grammes par litre
¾ pH = 7.3+ 0.2

PCA (Plant Count agar-standard méthods agar)

¾ Hydrolisat trypsique de caséine 5
¾ Extrait de levure 2.5
¾ Glucose 1
¾ Agar 15 en grammes par litre
¾ pH = 7

BCP GELOSE (gélose lactosée au bromocrésol pourpre)

¾ Extrait de viande de bœuf 3
¾ Peptone 5
¾ Lactose 10
¾ Agar 10 en grammes par litre
¾ Bromocrésol pourpre 25 en milligrammes par litre
¾ pH = 6.8

TTC + TERGITOL (gélose de base lactosée)

¾ Peptone 10
¾ Extrait de viande 5
¾ Lactose 20
¾ Bleu de bromothymol 0.05
¾ Agar 12.75 en grammes par litre
¾ pH = 7.2 + 0,2
¾ Ajouter :
• 5ml d’une solution de chlorure de 2-3-5
triphenyl-tétrazolium (TTC) à 0.05%
• 5ml d’une solution de tergitol 7 à 0.2%

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Gélose Cétrimide
¾ Peptone 10
¾ Sulfate de potassium 10
¾ Chlorure de magnésium 1,4
¾ Cétrimide 0,3
¾ Agar 13,6 en grammes par litre

Milieu CHAPMAN
¾ Peptone 10
¾ Extrait de viande 1
¾ Chlorure de sodium 75
¾ Mannitol 10
¾ Rouge de phénol 0,025
¾ Agar 15 en grammes par litre

Milieu BCYE sans L cystéine

¾ Charbon activé 2
¾ Extrait de levure 10
¾ Tampon ACES (acide 2 acetamido, 2 10
aminoéthane sulfonique)
¾ Pyrophosphate ferrique 0,250
¾ alphacétoglutarate 1
¾ Agar 13 en grammes par litre

Milieu BCYE + L cystéine

Ajouter au milieu BCYE du chlorhydrate de L 0,40 en grammes par litre
cystéine

Milieu BCYE + L cystéine + antibiotiques (GVPC)

Ajouter au milieu BCYE + L cystéine :
¾ Glycine 3
¾ Vancomycine 1
¾ Polymyxine 79 200 UI
¾ Cycloheximide 80 en milligrammes par litre

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D:\travail\hygiène\hh128
Milieu SABOURAUD
¾ Peptone chapoteaut 10
¾ Glucose 20
¾ Agar 15 grammes par litre
¾ pH 6 ± 0,2

Milieu MALT AGAR

¾ extrait de malt 30
¾ agar 12 grammes par litre
¾ ph =5.5 + 0,5

Milieu Gélose R2A

¾ extrait de levure 0.5
¾ tryptone 0.25
¾ peptone 0.75
¾ glucose 0.5
¾ amidon 0.5
¾ phosphare dipotassique 0.3
¾ sulfate de magnésium 0.024
¾ pyruvate de sodium 0.3
¾ agar 15.0 grammes par litre
¾ ph 7. 2 + 0.2

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 Annexe 1
Version : 1
GERMES DE L’HOSPITALISME Date : juin 2001
Pagination :1/1

• Staphylococcus aureus méticilline-résistant

• Entérobactéries productrices de Bétalactamase à spectre étendu
• Enterocoque résistant à la Vancomycine
• D’autres germes peuvent être définis en fonction de l’écologie bactérienne et de la politique
d’isolement des Bactéries multirésistantes aux antibiotiques au sein de chaque établissement
(Acinetobacter baumannii , Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia…)

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 Annexe 2
Version : 1
RECHERCHE DE LEGIONELLA DANS UNE EAU
Date : juin 2001
SELON LA NORME NFT 90 431 : LE MODE OPERATOIRE
Pagination : 1/1

Eau à analyser

Ensemencer 0,2 ml pur et dilution 1/10 sur GVPC

Filtrer 1 litre d'eau sur membrane 0,45µm

Eau concentrée

Mettre la membrane dans 5 ml d'eau stérile

Placer dans une cuve à ultra-sons pendant 2-10 minutes

2 ml 0,1 ml
2 ml

Traitement acide Traitement thermique Pas de traitement

Porter à pH = 2,2 50°C pendant 30 minutes

0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml

Etaler sur milieu complet (GVPC)

Incuber 3 - 10 jours à 37°C

Colonies grisâtres - bacille gram négatif

Repiquage

Gélose au sang BCYE sans cystéine BCYE avec cystéine

Incuber 3 jours à 37°C

Pousse non caractéristique de Legionella Pousse non caractéristique de Legionella

Recherche par immunofluorescence de

legionella pneumophila

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