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Resumen
Los resultados mostraron que la flor es la única parte de la planta con actividad
proteolítica en las condiciones usuales de pH y temperatura utilizadas en tecnología
quesera, que la proteasa del cardo (C. cardunculus L.) presenta un comportamiento
michaeliano y que es una fuente potencial de proteasas que pueden aplicarse en la
tecnología quesera como un sucedáneo del cuajo animal e incluso de los coagulantes
fúngicos comerciales en algunos tipos de queso.
Palabras Clave: Cardo, cuajo, proteasas, actividad proteolítica, caracterización,
tecnología quesera.
Abstract
The results showed that the flower is the only part of the plant presenting
proteolitic activity at regular pH and temperature conditions, regularly used in cheese
technology, also the cardo (C. cardunculus L.) protease presents a michaelian’s
behavior and that it is a potential source of proteases, which may be applied in cheese
industry, as a substitute of animal rennet and even of the fungal commercial coagulants
in some kind of cheese.
Key Words: Cardo, rennet, protease, proteolitic activity, characterization, cheese
technology.
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1 Universidad Autónoma Agraria “Antonio Narro”.
2 Universidad Autónoma de Coahuila.
Introducción
El queso es un alimento obtenido a partir de la coagulación enzimática de la
leche fresca. La coagulación inicia por rompimiento del enlace Phe105-Met106 de la
caseína . La renina es responsable de la proteólisis ejercida sobre la caseína
(estabilizante de las otras caseínas en presencia de iones Ca) de la leche (Scott, 1991).
Como muchas enzimas coagulantes, la proteasa del Cardo (C. cardunculus L) inicia la
coagulación de la leche por fractura del enlace Phe105-Met106 de la caseína (Faro,
1991). Sin embargo, la acción de la proteasa no se limita a lisar la caseína , sino que
actúa sobre otras caseínas de la leche ( y ), lo que origina sabor amargo en quesos
madurados (Macedo, 1994). En México no existe antecedente del uso del cardo (C.
cardunculus L.) en la obtención de queso, mas que como conocimiento empírico.
Metodología Experimental
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Para realizar la extracción de proteínas, las paredes celulares de cada parte de
la planta se rompieron por congelación lenta, luego se maceraron 5 gramos de cada
muestra por separado y se mezclaron con 50 ml de solución búfer de fosfatos 0.1M al
pH correspondiente, (Lynch, et al.1987). Cada muestra centrifugó a 3, 500 rpm por 30
minutos en una centrífuga IEC International centrifuge modelo K No. 4410P-1, a
temperatura ambiente. Las condiciones anteriormente descritas no son las óptimas,
para toda la etapa de extracción se recomienda trabajar en centrifuga refrigerada a
16,000 g durante 30 minutos, a 4º C (NILO, 1997).
Una vez conocida la parte de la planta con actividad proteolítica, se continuó con
la extracción y purificación de la fracción enzimática a partir de la misma. Para lo
anterior se repitió la primera parte de la metodología de extracción de proteínas descrita
en párrafos anteriores, utilizando sólo la flor y concluido el tiempo del primer
centrifugado, el sobrenadante se pasó a una probeta graduada a fin de conocer el
volumen obtenido, el cual posteriormente se fraccionó en cuatro partes iguales y se
transfirió a igual número de tubos para centrífuga agregándose solución fría de sulfato
de amonio en las concentraciones que se muestran en el cuadro 1.
340
10 40
10 50
10 80
A fin de deducir los parámetros necesarios para determinar los valores de Vmax y
Km, se realizaron ensayos con distintas concentraciones de sustrato; se preparó una
serie de soluciones de caseína en búfer fosfatos de pH 6.6, en concentraciones de 1, 2,
3, 4 y 5%, las cuales se leyeron en espectrofotómetro Spectronic Biomate a 280 nm de
manera directa para conocer la absorbancia de cada una de las concentraciones.
Conocido lo anterior, se pudieron calcular entonces los parámetros cinéticos Vmax y Km
para la proteasa del cardo (C. cardunculus L.), aplicando el arreglo de Lineweaver -
Burk para la ecuación de Michaelis – Menten: 1/V0 = [(Km/Vmax) (1/[S]0)] + (1/Vmax).
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La fuerza de cuajo es la cantidad de litros de leche que puede coagular un litro
de extracto enzimático a 35oC en 40 minutos. Para esta determinación se utilizan 500
ml de leche fresca la cual se atempera y se le agrega 1 ml de coagulante, luego se
toma el tiempo de coagulación. Veisseyre (1972) propone la siguiente fórmula:
Donde: F = 500 X
F: fuerza del cuajo. 2400
t: tiempo (seg.). t
500: los ml de leche utilizados.
2400: los segundos equivalentes a 40 minutos.
Resultados Y Discusión
Se encontró que las flores son la parte de la planta que presenta actividad
proteolítica.En cuanto a la caracterización cinética, la proteasa del cardo (C.
cardunculus L.) presentó un comportamiento michaeliano, al igual que la renina del
cuajo animal, con parámetros cinéticos Vmax= 1.68x10-2 UABS/min y Km=2.16x10-3
mM/ml; con fuerza de cuajo de 1:2500 para extractos crudos y de 1:17400 para el
extracto precipitado-dializado, en comparación con el coagulante fúngico líquido
comercial que posee fuerza de cuajo de 1:10 000. En la figura 1 se muestra el
comportamiento de la formación de producto en la reacción entre el extracto enzimático
purificado y la solución de caseína al 2%, y en el cuadro 3 se muestra el análisis de las
fracciones del extracto enzimático de la flor de cardo (C. cardunculus L.)
0.07
0.06
ABSORBANCIA
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Tiempo (min.)
342
CUADRO 3: Evaluación del proceso de purificación de la proteasa del cardo (C.
cardunculus L.).
Fracción Volume Proteína Activida Activida Activida % Purifica-
n (ml) (mg/ml) d d E total d Rendi- ciones
[( A/mi Específi miento
n)/ml E] -
ca
[( A/mi
n)/
(mg P)]
Cruda 30 0.7060 0.0360 1.0800 0.0510 100.00 1.0000
Dializad 30 0.0794 0.0220 0.6600 0.2770 61.11 5.4313
a
Purificad 30 0.0562 0.0162 0.4860 0.2882 44.72 5.6521
a
Conclusiones
Recomendaciones Técnicas
343
Literatura Citada
344