CHAPITRE II CHROMATOGRAPHIE

INTRODUCTION :

La chromatographie permet la séparation ou la purification d'un ou de plusieurs

composés d'un mélange en vue de leur identification et de leur quantification.

Il existe différents types de chromatographie qui sont résumées dans l’organigramme ci-
dessous :

HPLC
Organigramme des principales techniques d’analyses chromatographiques

I. CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE (CPL)

Il en existe différents types : chromatographie sur couche mince (CCM) et chromatographie

sur colonne, qui se subdivisent en plusieurs catégories :

 Chromatographie liquide-solide : ou d’adsorption, la phse stationnaire est un solide

non inerte, qui favorise deux mécanismes d’adsorption possible, la physisorption et la
chimisorption.
 Chromatographie liquide-liquide : ou de partage, la phase stationnaire est un liquide
fixé sur un matériau inerte et poreux.
 Chromatographie ionique : la phase stationnaire comporte des sites ioniques, par
contre la phase mobile est une solution tampon aqueuse, permettant les échanges
d’ions.
 Chromatographie d’exclusion : la phase stationnaire est constituée d’un matériau
poreux. La séparation des substances dépend de la dimension des pores. Plus la taille
des particules est importante, plus la dimension des pores doit être élevée.

I.1. La phase stationnaire :

Les différents adsorbants utilisés sont dans le tableau suivant :

Adsorbants Types de séparation

Gel de silice [(SiO2)n , (H2O)x]
CCM et CCL (Chromatographie des bases et
Gel d’alumine [(Al2O3)n , (H2O)x]
Terres diatomiques
Cellulose
- CCM (2µm - 15µm) fine
- CCL (60 µm - 200µm) ou 40 à 100mesh
(Chromatographie d’adsorption de tous
les composés organiques)
des stéroïdes)
Séparation des sucres
- CCM
- CCL

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(Chromatographie de partage des

composés polaires, aminoacides, acides
polyamides, flavones,…)
Autres phases : saccharose, amidon, citrate
de Mg, talc, carbonates de Na et de Ca,
phosphates, magnésie MgO, charbon,…

Tableau 1 : Différents types d’adsorbants

I.2. La phase mobile :

L’interaction des solutés entre phase mobile et phase stationnaire permet de distinguer
deux cas :

- Si la phase stationnaire est polaire, la phase mobile doit être constituée de solvants
moins polaires. C’est la chromatographie en phase normal, le pouvoir d’élution
augmente avec la polarité de la phase mobile.
- Si la phase stationnaire est peu polaire, la phase mobile doit être plus polaire. C’est la
chromatographie à polarité inversée. Le pouvoir décroit avec la polarité de la phase
mobile.

On distinguera quatre types d’interactions du soluté avec le solvant de la phase mobile :

- Ioniques dues aux forces électriques superficielles.

- D’attraction entre des molécules adsorbées voisines.
- Diélectriques qui favorisent la dissolution des solutés.
- Par des liaisons hydrogènes, avec des éléments adsorbés.

I.3. Chromatographie sur couche mince (CCM) :

Deux types de chromatographies CCM :

 Analytique qui utilise des couches de support de la phase stationnaire avec des
dimensions réduites (3cm x 10cm et 250µm d’épaisseur).
 Et quantitative ou préparative employée pour séparer et purifier des substances
chimiques d’un mélange en solution. Cette dérniere est caractérisée par des dimesions
des plaques plus importantes (10cm x 10cm ou 20cm x 20cm) d’épaisseur de couche
de la phase stationnaire pouvant atteindre 3mm.

On dépose les substances en solution à séparer à environ 1,5cm du bord inférieur, à

l’aide d’une micro-pipette. Après évaporation complète du solvant, on place les plaques dans
une cuve de développement dans la quelle un solvant a été introduit (1cm de hauteur par
rapport au fond de la cuve). La cuve doit être hermétiquement fermée pour permettre une
bonne saturation de l’atmosphère de la cuve de développement. Pour un développement
ascendant, le solvant ou l’éluant versé au fond de la cuve, monte par capillarité et dépasse la
ligne de dépôt initiale des substances, en entrainent à différentes vitesses les substances
composant le mélange. C’est la migration des composés.

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Les séparations des composants sont obtenues grâce aux phénomènes d’adsorption, de
partage, d’échange ionique,…

Le paramètre qui gouverne la distribution des substances entre la phase stationnaire et la

phase mobile, est le coefficient de répartion ou de partage :

Concentration de la substance dans la phase

mobile

Plus K est élevé plus la substance migre lentement avec une vitesse de migration faible.

I.3.1. Identification des substances : Coefficient de rétention Rf

Pour identifier les substances inconnues d’un mélange, on doit utiliser des témoins de
chacune d’elles, qui seront chromatographies en même temps que la solution mélange. Puis
on compte les Rf (Coefficient de rétention) de chacune d’elles, défini en tant que :

Distance parcourue par le front du solvant

(cm ou mm)

Témoin 1 : Rf1=L1/D Mélange Inc :

----------------------------------
L4 Témoin 2 : Rf2=L2/D Subs2 :Rf2’=L2’/D=Rf2
D
L’3
Témoin 3 : Rf3=L3/D Subs3 :Rf3’=L3’/D=Rf3
L3
L1 Subs4 :Rf4’=L4’/D
L2 L’2
----------------------------------
T1 T2 T3 Inc
Schéma d’une chromatographie sur plaque CCM

La substance 1 est inexistante dans le mélange inconnu, par contre la substance 4 n,’est pas
identifiée.

I.3.2. Révélation des substances :

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Pour identifier par révélation des substances incolores chromatographiées, soit on utilise
une lampe UV pour les substances fluorescentes (généralement la plus part des composés
organiques), soit par de révélations universels chimiques tels que : H2SO4 concentré, H2SO4 –
K2Cr2O7, H2SO4 – HNO3 (dépôt noirs), l’iode I2 (taches brunes) par pulvérisation des plaques
et chauffage sur une plaque chauffante ou bien dans une étuve à 100° - 110°C, soit plu
lentement après évaporation des solvant à l’ai libre.

I.4. Chromatographie sur colonne en phase liquide :

La chromatographie sur colonne en phase liquide est basée sur le principe de l’élution
par entrainement de plusieurs substances, grâce à un solvant ou un mélange de solvant de
différentes polarités, constituant la phase mobile. La phase stationnaire est soit un solide
poreux inerte imprégné d’un liquide (c’est la chromatographie de partage) ou bien un solide
adsorbant fixant ou non un liquide (c’est la chromatographie d’adsorption), sous forme de
granulés de différentes dimensions (de 60 à 200µm) qui peuvent être soit un gel de silice, de
l’alumine,..remplissant une colonne de verre.

La vitesse linéaire moyenne de progression du soluté, à débit constant en éluant, dans la

phase stationnaire est donnée par l’expression :

Temps de rétention ou de séjour dans la

colonne (mn)
V : est la vitesse moyenne linéaire de migration (cm/mn)

Pour deux substances A et B, la première migre en premier (en tête) avec une vitesse plus
grande et un temps de rétention inférieur à celui de la substance B (voir le schéma suivant).

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Colonne

La loi de distribution des deux substances dans la colonne est régit par le coefficient de
partage K des différentes substances, entre la phase mobile liquide et la phase stationnaire.
Plus K est grand, plus la substance est retenue par la phase stationnaire, moins elle migre vite,
et donc avec une vitesse de migration plus faible.

II. CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE (CPG) :

L’analyse et la séparation par CPG repose sur les critères suivants :

 Tension de vapeur élevée des substances à séparer.

 Température de vaporisation des substances chimiques entre 50 et 300°C.
 Nature de la phase stationnaire (apolaire-polaire).
 Pression du gaz vecteur (débit du gaz constant pendant l’analyse).
 Dimensions de la colonne (diamètre faible, longueur plus au moins importante).
 Nature chimique de la substance (polaire- apolaire- poids moléculaire).

II.1. Grandeurs thermodynamiques :

L’équilibre du soluté entre la phase mobile (gaz vecteur) et la phase stationnaire est
caractérisée en tout point de la colonne par le coefficient de partage K :

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Concentration de la substance dans la phase

mobile
La rétention du soluté par la phase stationnaire est d’autant plu élevée que le coefficient de
partage K de la substance est grand :

On peut l’exprimer aussi par :

Ms / Ml (de phase stationnaire)

K=
Ms’ / cm 3 (de phase gazeuse)

Ms : Masse en mg du soluté dans la phase stationnaire ;

Ml : Masse de la phase stationnaire ;
Ms’ : Masse en mg du soluté dans la phase mobile.

II.1.1. Grandeurs de rétention :

II.1.1.1. Volume de rétention :

Le volume de rétention Vr d’un composé correspond au volume en phase mobile

(gazeuse) traversant la colonne nécessaire pour séparer le composé.

Vr = Vm + KVs

Tel que :

Vm : Volume de la colonne ou volume de la phase mobile sans rétention (pic de l’air).
Vs : Volume de la phase stationnaire.
K : Coefficient de partage.
Vr : Volume de rétention.

II.1.1.2. Temps de rétention :

C’est le temps nécessaire à un composé pour parcourir toute la colonne (temps écoulé
entre l’injection de l’échantillon et l’apparition du pic sur le chromatogramme).

Tr = Vr(ml) / Fc(ml/mn)

Tel que :
Vr : volume de rétention ou volume nécessaire en gaz pour séparer un composé.
Fc : Débit de la phase mobile (ml/mn).

Fc = ξπr2u

Tel que :

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ξ: est la porosité interparticulaire (sans dimension) désignant la fraction du volume total

occupé par la phase mobile (ml/mn)

Exemple : 0,8 en CPL sur support poreux

1 en CPG sur colonne capillaire

u : Vitesse linéaire moyenne de la phase mobile(gaz)

r : rayon de la colonne.

II.2. Grandeurs cinétiques :

II.2.1. Efficacité d’une colonne :

La largeur ou la finesse du pic chromatographique, définit la cinétique d’une séparation

chromatographique. Elle concerne l’efficacité de la colonne, qui correspond au nombre de
plateaux théoriques N pour une colonne donnée.

N = Tr = 5,54 Tr = 16 Tr
Ϭ δ W
Tel que :

Ϭ : écart type ;

δ : largeur à mis hauteur du pic chromatographique ;

W : largeur à la base du pic chromatographique.

W2 = 16 Ϭ2 et δ2 = 5,5 Ϭ2 => W = 1.7 δ

h’

h δ2
δ1

h’1/2
h1/2

W1 W2
tr1 tr2

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Schéma d’un chromatogramme composé de deux pics chromatographiques de soluté distincts

II.2.2. Hauteur équivalente à un plateau théorique : HEPT

L
HEPT ou H =
H

L est la longueur de la colonne et N et le nombre de plateau théoriques de la colonne

spécifique à un composé donné.

II.3. Appareillage

La chromatographie CPG est composée d’éléments suivants :

Un four thermostaté - un détecteur - un injecteur ou chambre d’injection - un système de

contrôle de pression de gaz vecteur (argon, azote, H2) - un système d’allumage de la flamme
et de contrôle de pression (H2/air) - un système de programmation de la température de la
colonne, de l’injection, du détecteur - une colonne ou 2 montés en parallèle - un amplificateur
- un intégrateur et enregistreur relié à une unité centrale pilotée par ordinateur servant au
stockage et au traitement des données.

Schéma de principe d’un chromatographe en phase gazeuse

II.3.1. Gaz vecteur

Le rôle principal du gaz vecteur est le transport des différents composés d’un mélange,
selon leurs différences de tension de vapeur, le long de la colonne. Il doit être inerte, pur et de
pression suffisante. Il peut être :

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 De l’Hydrogène ou de l’Hélium
 De l’Azote pour FID
 Un mélange Argon-Méthane.

La présence d’impuretés dans le gaz vecteur, peuvent endommager la phase liquide fixée par
la phase stationnaire par dégradation de celle-ci. Parmi ces impuretés, nous avons l’eau,
l’ammoniac (NH3).
Pour cela il est nécessaire d’utiliser un filtre à la sortie de la bouteille d’alimentation en gaz.

II.3.2. Les colonnes :

Le choix de la colonne d’analyse dépend de trois critères essentiels :

 Le matériel de remplissage (type de support, terres diatomées, silicates, alumine,

chromosorb…)
 Le type de colonne (verre, en cuivre ou en acier)
 Les dimensions de la colonne
 La quantité en phase stationnaire (phase liquide fixée par le support solide).

 La phase stationnaire :

Le choix de la phase stationnaire dépend des propriétés physico-chimiques des substances et

de leurs affinités vis-à-vis de la phase stationnaire.

Un échantillon apolaire convient à une phase apolaire.

Pour des substances polaires, on utilisera une phase stationnaire polaire.

Les pases stationnaires sont fixées sur des supports inertes et porreux tels que, les terres
diatomées, chromosorb, Anakrom, célite 545, Si-O-sel, Kieselguhr,…..

III.CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE A HAUTE PERFORMANCE (HPLC)

Le pouvoir de séparation d’une colonne chromatographique augmente avec la longueur

et le nombre de plateaux théoriques par unité de longueur. Ceci dis la longueur d’une colonne
ne peut pas être augmenté infiniment, en raison de l’apparition d’un élargissement des pics.
Etant donné que le nombre de plateaux théoriques est lié à la surface représentée par la phase
stationnaire, il s’ensuit que plus la taille des grains est petite plus la résolution est élevée.
Cependant, une phase stationnaire composée de grains très fins (3 à 10µm) génère une grande
résistance s’opposant au passage de la phase mobile. Par conséquent, la technique de
séparation HPLC permet l’utilisation de phase stationnaire très divisée supportant des
pressions très élevées de phase mobile pouvant aller jusqu’à 10MPa (10 bars).

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III.1. Les phases stationnaires et mobiles :

On distingue trois types de phases stationnaires :

- Les supports microporeux.

- Les supports pelliculaires (superficiellement poreux).
- Les phases greffées (groupement organiques tels que des alkyles greffés sur un
matériau inerte tel que la silice).

Les deux premières phases sont utilisées en chromatographie d’adsorption. La phase

microporeuse possède une capacité de séparation plus importante que la phase pelliculaire.

Le troisième type de phase, ou de phase greffée, est utilisé en chromatographie de partition.

On obtient deux catégories de séparation chromatographiques liquides, la chromatographie
en phase normale et en phase inverse. Dans le premier cas, la phase stationnaire est polaire
grâce à des dérivés tels que les alkyles nitriles et les alkyles amines. La phase mobile est non
polaire telle que l’hexane ou l’heptane. Pour le cas de phase inverse, la phase stationnaire est
au contraire apolaire telle que l’octacylane ou l’octadécylane, tandis que la phase mobile est
polaire, souvent composée d’un mélange eau/méthanol ou bien eau/acétonitrile.

III.2. Appareillage

III.2.1. Le pompage

Le système de pompage sert à la variation des compositions de l’éluant grâce à des

électrovannes (voir les schémas 1 et 2 ci dessous). Débit utilisés : 0,1 – 2 ml.min-1 pour des
pompes qui sont alternatives (faible volume interne et utilisable avec des gradients d’élution).
Elles sont soit d’un modèle mono ou double pistons. Elle doit délivrer un minimum de
pression de 50MPa (bars) et un maximum de 200MPa. Le débit maximal atteint est de 10
ml/min pour une séparation analytique (quanlitative et dosage), et de100ml/min pour une
séparation préparative (augmentation de la quantité de la concentration de l’échantillon).

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Schéma 1 : Appareillage HPLC

L’échantillon à l’entrée de la colonne est

introduit à l’aide d’une seringue dans un injecteur
à boucle externe en position LOAD. On injecte
toujours un volume supérieur celui de la boucle
en prenant soin de ne pas introduire de bulles
d’air dans la boucle. En tournant la valve en
position INJECT, seul le contenu de la boucle
est dirigé en tète de la colonne. Cette méthode
d’injection a l’avantage de donner des résultats
très reproductibles, d’une injection à l’autre.

Schéma 2 : Injecteur à boucles

Les principales étapes d’une analyse en chromatographie liquide à haute pression sont
similaires à celles de la chromatographie en phase gazeuse.

Préparation des échantillons :

a) Les produits doivent habituellement être soumis à un purification préliminaire pour

éliminer du mélange les produits indésirables. Les extrait obtenus sont filtrés sur une
membrane jetable de type Luer de 0,5µm ou moins, avant d’être injectés.
b) Ajustement des paramètres (débit d’éluant et pression, nature de l’éluant, etc.) pour
une séparation optimale des composés du mélange inconnu.
c) Injection des échantillons inconnus et des standards.
d) Calculs pour l’analyse qualitative et quantitative.

III.2.2. L’injection :

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Elle est réalisée avec une vanne Rheodyne en deux étapes en utilisant une boucle. On
dépose l’échantillon en tête de la colonne.

ΔP en HPLC est de l’ordre de quelques dizaines à 100-250 bars.

III.2.3. Colonnes :

Elles ont la forme de tubes de longueur L = 10 à 25 cm, de diamètre interne d= 4,6mm

le plus fréquent, avec pour diamètre moyen des particules de la phase stationnaire d p=3à
10µm et de nombre de plateaux théorique N=40000 à 60000 plateaux/m. on utilise aussi des
colonnes avec L=3 à 7,5 cm et dp=3 à 5µm, pour limiter la consommation de solvants.

On place souvent des pré-colonnes qui font office de filtres ; elles ont un dp superieur et
protègent la colonne des impuretés.

III.2.4. Détecteur :

Les différents détecteurs utilisés sont :

 Photomètre UV-Visible
 Réfectomètre
 Détecteur fluorimètrique
 Détecteur électrochimique
 Conductimètre.

III.2.4. Enregistrement

Les chromatogrammes obtenus sont composés d’une série de pics d’élution à différent
temps de rétention en minutes et d’intensités et d’aires de pics proportionnelles aux
concentrations correspondant à chacune des substances séparées. On peut effectuer des
calculs quantitatifs, en appliquant des méthodes d’étalonnage par étalons externes ou internes.

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