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PHARMACOPÉE EUROPÉENNE - SUPPLÉMENT 6.3 DE LA 6e EDITION
publié le 10 juin 2008
La 6e Edition de la Pharmacopée Européenne est constituée par les tomes 1 et 2 de l’ouvrage 6.0 et par les
suppléments 6.1 à 6.3. Ils seront complétés par des suppléments non cumulatifs qui doivent tous être conservés
pendant la durée de la 6e Edition. 3 suppléments paraîtront chaque année en 2008 et 2009. Une liste cumulative des
réactifs sera publiée dans les suppléments 6.4 et 6.7.
Pour utiliser correctement la 6e Edition, assurez-vous que vous disposez de tous les suppléments parus et consultez
l’index du dernier d’entre eux pour vérifier que vous vous référez aux versions les plus récentes des monographies et
chapitres généraux.

PHARMACOPÉE EUROPÉENNE - VERSION ÉLECTRONIQUE


La 6e Edition est également disponible sous forme électronique (CD-ROM et version internet) reprenant tous les
textes, monographies et chapitres généraux, publiés dans la version imprimée. Elle fait l’objet d’une mise à jour

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cumulative à chaque publication d’un supplément.
En plus des textes officiels en anglais et en français, la version internet présente les textes en espagnol (5e Edition)
pour le confort des utilisateurs.

PHARMEUROPA
Forum de la Pharmacopée Européenne, à publication trimestrielle

Tous les projets de monographies (nouvelles ou révisées) sont publiés dans Pharmeuropa, ce qui permet à toutes les
parties intéressées de commenter les spécifications proposées avant leur adoption. Pharmeuropa contient également
des informations relatives au programme de travail et aux certificats de conformité aux monographies de la
Pharmacopée Européenne délivrés par la DEQM, et des articles d’intérêt général. L’abonnement à Pharmeuropa peut
être souscrit auprès de la DEQM. Il comprend l’abonnement à Pharmeuropa Bio et Pharmeuropa Scientific Notes
(articles scientifiques traitant de sujets en relation avec la pharmacopée). Pharmeuropa est aussi accessible en ligne,
en tant que service complémentaire aux abonnés à la version imprimée de Pharmeuropa.
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HARMONISATION INTERNATIONALE
Voir informations figurant dans le chapitre 5.8. Harmonisation des pharmacopées.

INTERNET
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HELPDESK
Pour poser une question ou contacter la DEQM, utiliser le système d’aide en ligne HELPDESK qui est accessible sur
le site internet de la DEQM (consulter http://www.edqm.eu/site/FAQ_Helpdesk-261.html).
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KNOWLEDGE
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informations sur le programme de travail de la Pharmacopée Européenne, les numéros de Pharmeuropa et
de suppléments dans lesquels un texte a été publié, des noms de marque de réactifs (notamment colonnes
chromatographiques) utilisés lors de l’élaboration des monographies, l’historique des révisions d’un texte depuis sa
publication dans la 5e Edition, les chromatogrammes représentatifs, la liste des étalons de référence utilisés et la liste
des certificats de conformité délivrés.

COMBISTATS
CombiStats est un logiciel dédié à l’analyse statistique des résultats de titrages biologiques, conformément au
chapitre 5.3 de la 6e Edition de la Pharmacopée Européenne. Pour plus d’informations, consulter
http://www.edqm.eu/combistats.
Membres de la Commission Européenne de Pharmacopée : Allemagne,
Autriche, Belgique, Bosnie-Herzégovine, Bulgarie, Chypre, Croatie, Danemark,
Espagne, Estonie, Finlande, France, Grèce, Hongrie, Irlande, Islande, Italie,
Lettonie, « l’ex-République yougoslave de Macédoine », Lituanie, Luxembourg,
Malte, Monténégro, Norvège, Pays-Bas, Pologne, Portugal, République
Slovaque, République Tchèque, Roumanie, Royaume-Uni, Serbie, Slovénie,
Suède, Suisse, Turquie, et Union Européenne.
Observateurs à la Commission Européenne de Pharmacopée : Albanie, Algérie,
Australie, Bélarus, Brésil, Canada, Chine, Etats-Unis d’Amérique, Fédération Russe,
Géorgie, Israël, Madagascar, Malaisie, Maroc, Moldavie, République du Kazakhstan,
Sénégal, Syrie, Tunisie, Ukraine et OMS (Organisation Mondiale de la Santé).

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PHARMACOPÉE EUROPÉENNE
SIXIÈME ÉDITION
Supplément 6.3
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PHARMACOPÉE
EUROPÉENNE
SIXIÈME ÉDITION
Supplément 6.3

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LÈPubliée selon la
Convention relative à l’élaboration
d’une Pharmacopée Européenne
(Série des traités européens, nº 50)
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Conseil de l’Europe
Strasbourg
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La Pharmacopée Européenne est publiée par la Direction de la Qualité du Médicament & Soins de
Santé du Conseil de l’Europe (DEQM).

© Conseil de l’Europe, 67075 Strasbourg Cedex, France - 2008


Toute reproduction, adaptation ou traduction du présent ouvrage faite sans le consentement écrit et
préalable de l’Editeur est illicite. L’utilisateur est toutefois autorisé à effectuer, pour son propre usage,
le nombre de copies strictement nécessaire.

ISBN 978-92-871-6311-0
TABLE DES MATIÈRES
CONTENU DU SUPPLÉMENT 6.3 xxxix
CHAPITRES GÉNÉRAUX 4171
2. Méthodes analytiques 4171
2.2. Méthodes physiques et physico-chimiques 4171
2.2.33. Spectrométrie de résonance magnétique nucléaire 4173
2.2.42. Masse volumique d’un solide 4176
2.5. Méthodes de dosage 4179

TE
2.5.24. Dioxyde de carbone dans les gaz 4181
2.5.25. Monoxyde de carbone dans les gaz 4181
2.5.27. Dosage de l’oxygène dans les gaz 4182
2.6. Méthodes biologiques 4183
2.6.1. Stérilité 4185
2.6.12. Contrôle microbiologique des produits non stériles : essais de dénombrement microbien 4189
2.6.13.

2.7. Titrages biologiques


2.7.2.

Contrôle microbiologique des produits non stériles : recherche de microorganismes
spécifiés

Titrage microbiologique des antibiotiques


4193

4199
4201
2.9. Méthodes de pharmacotechnie 4207
2.9.1. Désagrégation des comprimés et des capsules 4209
2.9.33. Caractérisation des solides cristallins et partiellement cristallins par diffraction X sur poudre 4211
O
4. Réactifs 4219
4.1.1. Réactifs 4221
4.1.2. Solutions étalons pour essais limites 4222
BS

4.1.3. Solutions tampons 4222


4.2.2. Solutions titrées 4222
5. Textes généraux 4223
5.1.4. Qualité microbiologique des préparations pharmaceutiques et des substances pour usage 4225
pharmaceutique non stériles
5.1.5. Application du concept F0 à la stérilisation par la vapeur des préparations aqueuses 4226
5.1.9. Indications sur l’application de l’essai de stérilité 4227
O

5.2.3. Substrats cellulaires utilisés pour la production de vaccins pour usage humain 4231
MONOGRAPHIES GÉNÉRALES 4235
MONOGRAPHIES DES FORMES PHARMACEUTIQUES 4243
MONOGRAPHIES DES VACCINS POUR USAGE HUMAIN 4251
MONOGRAPHIES DES PRÉPARATIONS RADIOPHARMACEUTIQUES 4267
MONOGRAPHIES 4279
INDEX 4633

Note : la composition de chaque chapitre est indiquée sur la page de séparation.


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O

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PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.0 Contenu du supplément 6.3

CONTENU DU SUPPLÉMENT 6.3


Les parties des textes qui ont été révisées ou corrigées sont indiquées par un trait vertical dans la marge et celles qui
ont été supprimées sont indiquées par un trait horizontal dans la marge. Cependant, il convient de souligner que ces
indications sont publiées à titre d’information et ne sont pas nécessairement exhaustives ; elles ne constituent pas une
partie officielle des textes. Les modifications rédactionnelles ne sont pas signalées.
Aucune copie de texte ne sera fournie.

NOUVEAUX TEXTES
CHAPITRES GÉNÉRAUX Artichaut (feuille d’), extrait sec de (2389)
5.1.9. Indications sur l’application de l’essai de stérilité Bénazépril (chlorhydrate de) (2388)
Calcium (gluconate de) anhydre (2364)
MONOGRAPHIES Citalopram (bromhydrate de) (2288)

TE
Les monographies ci-après paraissent pour la première Citalopram (chlorhydrate de) (2203)
fois dans la Pharmacopée Européenne et seront mises en Dydrogestérone (2357)
application le 1er janvier 2009 au plus tard. Esoméprazole magnésique trihydraté (2372)
Vaccins pour usage humain Filgrastim (solution concentrée de) (2206)
Vaccin vivant du zona (2418) Foie de morue d’élevage (huile de) (2398)
Interféron bêta-1a (solution concentrée d’) (1639)
Préparations radiopharmaceutiques Lamotrigine (1756)
Pentétate (calcium) de sodium pour préparations
LÈ Lauromacrogol 400 (2046)
radiopharmaceutiques (2353)
Mauve (feuille de) (2391)
Technétium (99mTc) (mébrofénine-), solution injectable de Méloxicam (2373)
(2393)
Méthylphénidate (chlorhydrate de) (2235)
Tétra-O-acétyl-mannose (triflate de) pour préparations
Oméprazole magnésique (2374)
radiopharmaceutiques (2294)
Saquinavir (mésilate de) (2267)
Monographies Schisandra de Chine (fruit de) (2428)
Aluminium (silicate d’) et de sodium (1676) Sévoflurane (2269)
Amidon de pois (2403) Téicoplanine (2358)
O
TEXTES RÉVISÉS
BS

CHAPITRES GÉNÉRAUX MONOGRAPHIES


2.2.33. Spectrométrie de résonance magnétique nucléaire Les monographies ci-après ont fait l’objet d’une révision
d’ordre technique depuis leur dernière publication. Elles
2.2.42. Masse volumique d’un solide
seront mises en application le 1er janvier 2009.
2.5.24. Dioxyde de carbone dans les gaz Monographies générales
2.5.25. Monoxyde de carbone dans les gaz Substances pour usage pharmaceutique (2034)
2.5.27. Oxygène dans les gaz Vaccins pour usage humain (0153)
2.6.1. Stérilité Formes pharmaceutiques
Contrôle microbiologique des produits non stériles : Poudres pour application cutanée (1166)
O

2.6.12.
essais de dénombrement microbien Préparations semi-solides pour application cutanée (0132)
2.6.13. Contrôle microbiologique des produits non stériles : Vaccins pour usage humain
recherche de microorganismes spécifiés
BCG pour immunothérapie (1929) (publié par erreur sous
2.7.2. Titrage microbiologique des antibiotiques la lettre B dans la section Monographies)
2.9.1. Désagrégation des comprimés et des capsules Vaccin conjugué de l’haemophilus type b (1219)
2.9.33. Caractérisation des solides cristallins et partiellement Vaccin diphtérique, tétanique, coquelucheux (acellulaire,
cristallins par diffraction X sur poudre multicomposé), poliomyélitique (inactivé) et conjugué de
4. Réactifs (nouveaux, révisés, corrigés) l’haemophilus type b, adsorbé (2065)
5.1.4. Vaccin poliomyélitique inactivé (0214)
Qualité microbiologique des préparations
pharmaceutiques et des substances pour usage Vaccin varicelleux vivant (0648)
pharmaceutique non stériles Préparations radiopharmaceutiques
5.1.5. Application du concept F0 à la stérilisation par la Technétium (99mTc) (macrosalb-), suspension injectable de
vapeur des préparations aqueuses (0296)
5.2.3. Substrats cellulaires utilisés pour la production de Technétium (99mTc) (microsphères-), suspension injectable
vaccins pour usage humain de (0570)

xxxix
Contenu du supplément 6.3 PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.0

Technétium (99mTc) (pyrophosphate d’étain et de), solution Gluconate ferreux (0493)


injectable de (0129) Glucose liquide (nébulisat de) (1525)
Technétium (99mTc) (sulfure de rhénium colloïdal et de), Glycérides hémi-synthétiques solides (0462)
solution injectable de (0126) Gomme adragante (0532)
Monographies Gomme arabique (0307)
N-Acétyltryptophane (1383) Gomme arabique (nébulisat de) (0308)
Adénosine (1486) Gomme xanthane (1277)
Agar-agar (0310) Guar (1218)
Air médicinal (1238) Guar (galactomannane du) (0908)
Alginique (acide) (0591) Hydroxypropylbétadex (1804)
Almagate (2010) Immunoglobuline humaine normale pour administration
Aluminium (oxyde d’) hydraté (0311) par voie intraveineuse (0918)
Aluminium (phosphate d’), gel de (2166) Kaolin lourd (0503)
Aluminim (silicate d’) et de magnésium (1388) Lactitol monohydraté (1337)
Amidon de blé (0359) Lactose anhydre (1061)

TE
Amidon de maïs (0344) Lactose monohydraté (0187)
Amidon de pomme de terre (0355) Lactulose (1230)
Amidon de riz (0349) Lactulose liquide (0924)
Amidon prégélatinisé (1267) Lévodropropizine (1535)
Amphotéricine B (1292) Lynestrénol (0558)
Aprotinine (0580) Magnésium (carbonate de) léger (0042)
Aprotinine (solution concentrée d’) (0579) Magnésium (oxyde de) léger (0040)
Ascorbate sodique (1791) Magnésium (oxyde de) lourd (0041)
Ascorbique (acide) (0253)
BCG pour immunothérapie (1929)

Béclométasone (dipropionate de) anhydre (0654)
Magnésium (stéarate de) (0229)
Maltitol (1235)
Maltodextrine (1542)
Béclométasone (dipropionate de) monohydraté (1709) Mannitol (0559)
Belladone (feuille de), extrait sec titré de (1294) Méfénamique (acide) (1240)
Bentonite (0467) Méthotrexate (0560)
Bétaméthasone (valérate de) (0811) Miansérine (chlorhydrate de) (0846)
O
Bourdaine (extrait sec titré de) (1214) Naphazoline (chlorhydrate de) (0730)
Calcium (folinate de) (0978) Nicotine (1452)
Calcium (gluconate de) (0172) Nicotine (résinate de) (1792)
Calcium (gluconate de) pour solution injectable (0979) Olivier (feuille d’) (1878)
Calcium (stéarate de) (0882) Oméga-3 (esters éthyliques 60 d’acides) (2063)
BS

Cellulose (acétate de) (0887) Oméga-3 (esters éthyliques 90 d’acides) (1250)


Cellulose (acétate phtalate de) (0314) Oméga-3 (triglycérides d’acides) (1352)
Cellulose en poudre (0315) Orange amère (épicarpe et mésocarpe d’) (1603)
Cellulose microcristalline (0316) Oranger amer (fleur d’) (1810)
Charbon activé (0313) Oxaliplatine (2017)
Chondroïtine (sulfate sodique de) (2064) Oxymétazoline (chlorhydrate d’) (0943)
Cisplatine (0599) Paclitaxel (1794)
Copolymère d’acide méthacrylique et d’acrylate d’éthyle Pancréas (poudre de) (0350)
O

(1:1) (dispersion de) à 30 pour cent (1129) Pepsine (poudre de) (0682)
Croscarmellose sodique (0985) Perphénazine (0629)
Crospovidone (0892) Plasma humain (mélange de) traité pour viro-inactivation
Dextran 1 pour préparations injectables (1506) (1646)
Dextran 40 pour préparations injectables (0999) Poly(acétate de vinyle) (dispersion de) à 30 pour cent (2152)
Dextran 60 pour préparations injectables (1000) Polyacrylate (dispersion de) à 30 pour cent (0733)
Dextran 70 pour préparations injectables (1001) Potassium (citrate de) (0400)
Eau hautement purifiée (1927) Pravastatine sodique (2059)
Eau pour préparations injectables (0169) Saccharose (0204)
Eau purifiée (0008) Séné (feuille de), extrait sec titré de (1261)
Erythritol (1803) Sodium (alginate de) (0625)
Foie de morue (huile de) (type A) (1192) Sodium (glycérophosphate de) hydraté (1995)
Foie de morue (huile de) (type B) (1193) Sodium (hyaluronate de) (1472)
Galactose (1215) Sodium (polystyrène sulfonate de) (1909)
Gélatine (0330) Sodium (stéarate de) (2058)

xl
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.0 Contenu du supplément 6.3

Solutions concentrées pour hémodialyse (eau pour Tétracosactide (0644)


dilution des) (1167) Tributyle (acétylcitrate de) (1770)
Sorbitol (0435) Trypsine (0694)
Sorbitol liquide partiellement déshydraté (2048)
Tryptophane (1272)
Sphères de sucre (1570)
Xylitol (1381)
Sumatriptan (succinate de) (1573)
Talc (0438)

TEXTES CORRIGÉS
Les textes ci-après ont été corrigés et sont republiés dans leur intégralité. Ces corrections sont à prendre en compte dès
la date de publication du supplément 6.2 (10 juin 2008).
MONOGRAPHIES Hypromellose (0348)
Hypromellose (phtalate d’) (0347)
Formes pharmaceutiques
Ichtammol (0917)

TE
Préparations intra-utérines pour usage vétérinaire (1806)
Macrogol 40 sorbitol (heptaoléate de) (2396)
Monographies Magaldrate (1539)
Acémétacine (1686) Méthylcellulose (0345)
Amiodarone (chlorhydrate d’) (0803) Méthyltestostérone (0410)
Amitriptyline (chlorhydrate d’) (0464) Millepertuis (extrait sec quantifié de) (1874)
Arnica (fleur d’) (1391) Moxidectine pour usage vétérinaire (1656)
Arnica (teinture d’) (1809) Phénol (0631)
Atropine (2056)
Atropine (sulfate d’) (0068)
Azithromycine (1649)
Buséréline (1077)
LÈ Pholcodine (0522)
Phosphate monosodique dihydraté (0194)
Pilocarpine (chlorhydrate de) (0633)
Pilocarpine (nitrate de) (0104)
Polysorbate 20 (0426)
Carprofène pour usage vétérinaire (2201) Polysorbate 40 (1914)
Cellules souches hématopoïétiques humaines (2323) Polysorbate 60 (0427)
Cholécalciférol (concentrat de), forme huileuse (0575) Polysorbate 80 (0428)
O
Cholécalciférol (concentrat de), forme hydrodispersible Racécadotril (2171)
(0598) Sertraline (chlorhydrate de) (1705)
Cholécalciférol (concentrat de), forme pulvérulente (0574) Sésame (huile de) raffinée (0433)
Clonidine (chlorhydrate de) (0477) Sodium (alendronate de) (1564)
Codergocrine (mésilate de) (2060) Sodium (molybdate de) dihydraté (1565)
BS

Ergocalciférol (0082) Sultamicilline (tosilate de) dihydraté (2212)


Ethacridine (lactate d’) monohydraté (1591) Telmisartan (2154)
Fluvoxamine (maléate de) (1977) Triamtérène (0058)
Glycérol (mono-oléate de) (1430) Verveine odorante (feuille de) (1834)
Granisétron (chlorhydrate de) (1695)

TEXTES DONT LE TITRE A ÉTÉ MODIFIÉ


O

Le titre des textes suivants a été modifié dans le supplément 6.3.


CHAPITRES GÉNÉRAUX
2.6.12. Contrôle microbiologique des produits non stériles : essais de dénombrement microbien (en remplacement de
Contrôle microbiologique des produits non stériles : dénombrement des germes aérobies viables totaux)
5.1.4. Qualité microbiologique des préparations pharmaceutiques et des substances pour usage pharmaceutique non
stériles (en remplacement de Qualité microbiologique des préparations pharmaceutiques)

TEXTES SUPPRIMÉS
Le texte suivant est supprimé à partir du 1er avril 2008.
MONOGRAPHIES
Vaccins pour usage humain
Vaccin coquelucheux (0160)

xli
Contenu du supplément 6.3 PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.0

TEXTES RÉINTRODUITS
Le texte suivant a été supprimé le 1er avril 2008 mais a été réintroduit tel quel dans le supplément 6.3. Il est à prendre en
compte dès la date de publication du supplément 6.3 (10 juin 2008).
MONOGRAPHIES
Monographies
Stanozolol (1568)

TE

O
BS
O

xlii
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

2.2. MÉTHODES PHYSIQUES


ET PHYSICO-CHIMIQUES
2.2.33. Spectrométrie de résonance magnétique 2.2.42. Masse volumique d’un solide.. .................................4176
nucléaire.. ................................................................................ 4173

TE

O
BS
O

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4171
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

TE

O
BS
O

4172 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 2.2.33. Spectrométrie de résonance magnétique nucléaire

01/2009:20233 Les méthodes homonucléaires et hétéronucléaires,


bidimensionnelles ou multidimensionnelles, permettent
d’établir des corrélations entre paramètres spectraux
2.2.33. SPECTROMÉTRIE DE différents (par exemple, déplacement chimique et constante
RÉSONANCE MAGNÉTIQUE de couplage, ou déplacements chimiques de différents
noyaux dans un même système moléculaire). Des
NUCLÉAIRE expériences appropriées permettent également d’accéder
à des informations sur les temps de relaxation T1 et T2, les
INTRODUCTION effets Overhauser nucléaires (NOE, nuclear Overhauser
La spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN) effects) et la cinétique des processus dépendants du temps.
est une méthode d’analyse qui permet, en particulier,
APPAREILLAGE
d’élucider la structure chimique des molécules organiques
par interprétation des spectres RMN obtenus, par exemple, Un spectromètre RMN haute résolution comporte au moins
pour 1H ou les noyaux X de type 13C, 19F, 15N, 31P. Les spectres les éléments suivants :
peuvent être utilisés à des fins d’analyse qualitative ou — un aimant chargé de générer le champ magnétique
quantitative. constant B0,
Dans des conditions expérimentales appropriées, l’intensité — une sonde, contrôlée en température, qui contient

TE
des signaux RMN (obtenue par intégration) est directement l’échantillon, délivre l’impulsion de radiofréquence et
proportionnelle au nombre de spins nucléaires que compte détecte le rayonnement émis par l’échantillon,
le groupe structurel responsable du signal. Ces intégrales — une console électronique qui génère les impulsions de
peuvent servir à l’analyse quantitative. radiofréquence haute puissance, collecte et numérise le
signal FID ; cette unité assure également la stabilisation
PRINCIPE GÉNÉRAL de l’électronique instrumentale,
— une unité d’acquisition et de traitement des données
Une population de noyaux possédant un moment cinétique et (ordinateur).
un moment magnétique, placée dans un champ magnétique
statique B0, subit un réarrangement en relation avec l’axe du
LÈ Il peut également comprendre :
champ magnétique. Les noyaux prennent alors certaines — une cellule en flux continu pour la RMN couplée à la
orientations, régies par la mécanique quantique, auxquelles chromatographie liquide ou la RMN par injection en flux
correspondent des énergies différentes. Si l’on applique continu,
un champ magnétique oscillant de haute fréquence B1, — un système adapté à la RMN à gradient de champ pulsé.
perpendiculaire à B0, il se produit, entre ces orientations, La génération du haut champ magnétique est réalisée par
des transitions qui s’accompagnent d’une absorption nette une bobine supraconductrice plongée dans un vase Dewar
d’énergie. D’après la condition de résonance ω0 = γB0 contenant de l’hélium liquide. L’échantillon est en général
(γ = rapport gyromagnétique, ω0 = fréquence de Larmor), on introduit dans la sonde, dans un tube à essai d’un diamètre
peut faire varier le champ magnétique B0 ou la fréquence extérieur de 5 mm ou dans une cellule de flux, et la sonde
O
ω1 du champ B1 de façon à obtenir un spectre (méthode de est connectée à l’électronique par des câbles RF assurant
l’onde continue). De nos jours, l’irradiation B1 est plutôt le transport de la fréquence de stabilisation (lock) et les
exercée au moyen d’une impulsion de radiofréquence (RF), fréquences des noyaux 1H et X. La présence de dispositifs
selon la méthode de la transformée de Fourier (FT). Le auxiliaires assurant le réglage d’accord et d’adaptation des
rayonnement cohérent émis lors du retour à l’état initial est circuits électroniques est essentielle, et l’emploi de systèmes
observé sous la forme d’une courbe de relaxation, également de contrôle de la température de l’échantillon est fréquent.
BS

appelée signal de précession libre (ou FID, free induction Il convient de démontrer le bon fonctionnement du
decay). L’application de la méthode de la transformée de spectromètre RMN. Les tests appropriés à cet effet sont,
Fourier fournit ensuite le spectre fréquentiel dont peuvent typiquement, la mesure de la largeur de raie à mi-hauteur
être extraites des informations sur la structure moléculaire. pour des pics et dans des conditions d’acquisition définis, le
Des champs de radiofréquence auxiliaires peuvent être rapport signal/bruit (S/N) pour des mélanges de référence,
appliqués lors de l’acquisition du signal FID, pour supprimer la puissance d’impulsion (mesurée par la largeur de
les interactions scalaires entre noyaux (interactions l’impulsion 90°) et la reproductibilité de l’impulsion. Tous
s’exerçant par le biais des liaisons chimiques) ; on parle alors les fabricants d’instruments publient des spécifications
de « découplage ». Les techniques utilisées peuvent être et des protocoles de mesure de ces paramètres pour des
O

unidimensionnelles ou multidimensionnelles, servir à des combinaisons instrument/sonde spécifiques, et la conformité


fins d’analyse qualitative ou quantitative, et être appliquées de l’appareillage à ces spécifications doit être démontrée.
à des échantillons à l’état liquide ou solide.
On peut, à partir de divers paramètres spectroscopiques, RMN À TRANSFORMÉE DE FOURIER (RMN-FT)
accéder à d’importantes informations structurelles : Les spectromètres contemporains opèrent généralement
selon le principe de la transformée de Fourier : après
fréquence de résonance espèce nucléaire observée excitation de l’échantillon par une impulsion de
nombre des signaux de résonance nombre de groupes de noyaux
radiofréquence ν, d’amplitude B1 et de durée τp appropriées,
(singulets, multiplets) chimiquement distincts puis un temps mort td de courte durée (pour permettre la
déplacement chimique δ (ppm) nature et environnement chimiques restauration de l’électronique), le signal FID analogique
du groupe structurel observé amplifié est échantillonné au cours du temps d’acquisition tac,
intensité des signaux de résonance nombre relatif de noyaux résonants puis numérisé par un convertisseur analogique-numérique, et
par groupe chimique distinct les résultats sont stockés dans la mémoire du spectromètre.
multiplicité des modes de couplage nombre de noyaux en interaction L’amplification du signal délivré par le récepteur intervient
scalaire avec le noyau observé avant la numérisation, afin d’optimiser la sensibilité sans
constante de couplage nJ (Hz) nombre de liaisons impliquées dans saturer le convertisseur. Dans le cas de l’observation de
le chemin de couplage, et géométrie noyaux X, l’équipement standard comporte si nécessaire un
de ce dernier découplage 1H large bande opéré via l’irradiation de tous

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4173
2.2.33. Spectrométrie de résonance magnétique nucléaire PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

les protons lors de l’expérience. Pour accroître le rapport Résolution numérique. La résolution numérique est la
S/N, plusieurs signaux FID peuvent être accumulés de façon séparation, en fréquence, des données (DP). Le signal traité
cohérente, puis sommés. La transformée de Fourier de ces doit comporter au moins 5 valeurs numériques au-dessus
données temporelles donne le spectre fréquentiel. de la hauteur médiane du signal à intégrer. Pour améliorer
PARAMÈTRES cette résolution, on peut ajouter des points d’intensité zéro
à la fin du signal FID expérimental, avant transformation
En RMN à transformée de Fourier, différents paramètres (procédé du zero filling).
d’acquisition influencent les résultats et doivent être ajustés
et contrôlés. Rapport signal/bruit (S/N). Il s’agit du rapport entre
l’intensité (mesurée par la hauteur de pic) d’un signal
Largeur d’impulsion τp. L’impulsion d’excitation est spécifié du spectre RMN et les fluctuations aléatoires de ce
orientée selon l’axe des x du repère tournant, sa durée (ou signal, que l’on mesure généralement dans une région du
« largeur » τp) détermine l’angle de basculement θ, et donc spectre ne contenant pas de signal provenant de l’analyte.
l’intensité I du signal de résonance : Un rapport S/N médiocre compromet l’exactitude de
l’intégration des pics et des analyses quantitatives. Un
(1) rapport S/N supérieur ou égal à 150:1 permet l’intégration
des pics avec un écart type inférieur à 1 pour cent. Les
spectromètres actuels comportent des algorithmes de calcul

TE
(2) donnant le rapport S/N des pics appropriés. Il peut être
difficile d’obtenir un rapport S/N suffisant lors de l’analyse
La magnétisation observée My est maximale à θ = 90°. La de solutions diluées, notamment lorsque la détection
durée d’impulsion doit être courte afin que tous les signaux porte sur des noyaux autres que 1H. Différentes méthodes
de la fenêtre spectrale SW présentent un degré d’excitation permettent d’améliorer ce rapport :
similaire. La magnétisation décroît par suite du processus — l’augmentation du nombre n de signaux accumulés,
de relaxation. puisque le rapport S/N croît comme ,
Temps mort td. Le temps mort est l’intervalle de temps — la multiplication exponentielle du signal FID avant
séparant la fin de l’impulsion du début de l’acquisition ; il
LÈ transformation de Fourier ; le facteur de multiplication
répond à des impératifs techniques, mais il faut prendre exponentielle doit être de l’ordre de grandeur de la
garde à son influence possible sur l’intensité du signal et largeur du pic à mi-hauteur,
la phase du pic. La réduction d’intensité liée au temps — l’emploi de spectromètres à champ magnétique B0 plus
mort affecte davantage les signaux à décroissance rapide intense, puisque le rapport S/N est proportionnel à B03/2,
(qui donnent des raies spectrales larges) que les signaux à
décroissance lente (qui donnent des raies spectrales étroites). — le recours à un filtrage numérique pour réduire le bruit,
Temps d’acquisition tac. Le temps d’acquisition tac est en — l’emploi de sondes permettant de maximiser le facteur
relation avec la fenêtre spectrale (largeur totale de la région de remplissage,
observée) et le nombre de données numériques (DP, data — l’emploi de cryosondes permettant de réduire le bruit
O
points) collectées lors de l’acquisition du signal. thermique.
Région d’intégration. L’intensité des signaux RMN est
obtenue par intégration du signal quasi-analogique soit
(3) par une fonction en escalier soit, pour une plus grande
exactitude, par intégration séparée des raies et présentation
L’intensité du signal et le rapport signal/bruit atteignent des données numériques. En RMN du liquide, les signaux
BS

leur maximum lorsque tac≈ 1,2/(πν1/2), ν1/2 étant la largeur à ont l’allure d’une courbe de Lorentz. Sauf indication
mi-hauteur, mais il convient d’opérer avec un tac d’au moins contraire dans la monographie ou chevauchement des pics,
5/(πν1/2) pour limiter la distorsion du signal. il convient d’utiliser pour le pic considéré et pour le pic
Temps de répétition tr. Le temps de relaxation spin-réseau T1 de référence le même intervalle d’intégration, exprimé en
détermine le temps requis pour le retour de l’aimantation à multiple de la largeur à mi-hauteur du pic.
sa valeur d’équilibre après une impulsion. Il est possible de Etendue dynamique. L’étendue dynamique du convertisseur
réduire le temps de relaxation à l’aide de réactifs spéciaux. analogique-numérique détermine la raie d’intensité la
Pour les analyses quantitatives, le temps de répétition utilisé plus faible pouvant être observée ou quantifiée lors de
doit être fixé en fonction de T1 et θ afin d’éviter les effets l’intégration de 2 signaux de même largeur de raie dans un
O

de saturation. spectre. Un convertisseur de 16 bits permet d’identifier un


Gain de réception. Le signal analogique détecté par la signal ayant une intensité relative de 0,003 pour cent par
sonde est amplifié avant d’être numérisé et mis en mémoire. rapport à un signal fort dont l’intensité occupe la totalité de
L’amplification, ou gain de réception, doit être réglée (de l’étendue dynamique du convertisseur.
façon automatique ou manuelle) de telle sorte que le signal RMN D’ÉCHANTILLONS EN SOLUTION
ne sature pas le convertisseur analogique-numérique, ce qui La plupart des mesures de RMN sont effectuées sur des
entraîne une distorsion du signal, mais permette au bruit solutions diluées (à environ 1 pour cent) de l’analyte dans un
aléatoire généré dans la sonde d’être numérisé (bruit non solvant approprié, qui peut être additionné d’un composé de
nul). référence approprié destiné à l’étalonnage du déplacement
OPTIMISATION DES PARAMÈTRES D’ACQUISITION ET chimique.
DE TRAITEMENT EN ANALYSE QUANTITATIVE Solvants. Le solvant doit être capable d’assurer la dissolution
En plus des paramètres d’acquisition, différents paramètres de l’analyte sans exercer d’autre interaction, sauf intention
de traitement affectent également l’intensité du signal. Après contraire. Pour limiter l’interférence des signaux émanant du
collecte d’un nombre suffisant de balayages (répétitions), solvant, il convient de travailler avec des solvants entièrement
le signal FID résultant fait l’objet d’une transformation de deutériés (oxyde de deutérium R, chloroforme deutérié R,
Fourier. La fiabilité des analyses quantitatives passe par diméthylsulfoxyde deutérié R, acétone deutériée R,
l’optimisation des paramètres suivants. méthanol deutérié R, etc.). Les atomes de solvants donnent

4174 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 2.2.33. Spectrométrie de résonance magnétique nucléaire

des signaux facilement identifiables par leur déplacement du composé de référence doivent être acquis par la même
chimique, et peuvent être utilisés pour étalonner l’axe des procédure et dans les mêmes conditions opératoires. Les pics
déplacements chimiques (témoin secondaire). figurant dans les 2 spectres, ou les régions caractéristiques
Références. La caractéristique spectrale la plus sensible à des spectres, doivent correspondre en position, en intensité
l’environnement chimique de l’atome au sein de la molécule et en multiplicité. Dans certains cas, une comparaison
est le déplacement chimique, désigné par δ et exprimé en mathématique, par exemple par calcul d’un coefficient
parties par million. Le déplacement chimique δX,échantillon de corrélation, peut être utile. En l’absence d’étalon de
de la résonance d’un noyau X actif en RMN s’exprime en référence, il est admis d’opérer avec une substance de
parties par million et est mesuré par la différence observée référence « maison », dont l’identité a été établie par des
entre la fréquence de résonance vX,échantillon de ce noyau et la méthodes alternatives, ou en démontrant que le spectre
fréquence de résonance vX,référence d’un témoin interne, toutes RMN est intégralement compatible avec la structure déclarée
deux exprimées en hertz, rapportée à la fréquence de travail du composé.
vX,référence du spectromètre, en megahertz, pour un champ B0 : ANALYSE QUANTITATIVE
Dans une expérience de RMN basique, l’intensité du signal
est l’aire, obtenue par intégration, située sous la courbe du
signal enregistré. Ce n’est que lorsque 2 signaux sont de
(4) largeur à mi-hauteur et de multiplicité identiques que la

TE
hauteur du signal peut servir de mesure de l’intensité. Dans
Par convention, la référence utilisée pour déterminer des conditions de relaxation pratiquement complète entre 2
les déplacements chimiques exacts est la raie 1H du acquisitions, l’intensité IA du signal est une mesure vraie du
tétraméthylsilane R (TMS), avec réglage de δTMS = 0 ppm. nombre NA de noyaux responsables du signal :
En principe, une fois l’échelle de déplacement du 1H établie
par référence au TMS, la fréquence exacte de toute autre (6)
résonance X peut être calculée et son échelle de déplacement
chimique étalonnée. La fréquence vX,référence d’une référence La constante KS englobe les constantes fondamentales, les
(secondaire) à δX = 0 ppm est calculée à partir de la fréquence propriétés de l’échantillon et les paramètres du récepteur,
et elle peut être éliminée lorsqu’il s’agit de comparer
1

H du TMS, vH,TMS et de la valeur indiquée dans une table du
rapport X,référence, entre la fréquence spécifique de l’isotope
et la fréquence 1H du TMS :
l’intensité de signaux, puisqu’elle exprime la relation de
proportionnalité qui existe entre les nombres de noyaux des 2
groupes structurels A et B faisant l’objet de la comparaison :

(5) (7)
Les composés de référence à δX = 0 ppm et les rapports Les nombres Ni de noyaux appartenant à des groupes
X,référence correspondants sont indiqués ci-après : structurels différents dans une même molécule sont des
O
petits entiers. Les valeurs mesurées sont arrondies à
Autres
Noyau Eaua X,référence solvants X,référence l’entier le plus proche. Cependant, il est facile de vérifier
1
H DSS b
1,00000000 TMS 1,00000000
que le spectromètre effectue correctement les opérations
d’acquisition et de traitement en comparant les intensités
13
C DSS b
0,25144953 TMS 0,25145020 exactes dans le spectre d’un composé organique approprié
de structure connue.
BS

15
N NH3 0,10132912 CH3NO2 0,10136767
19
F CF3COOH 0,94094011
Outre le fait que les intensités des signaux dus à chacun
non indiqué CCl3F
des composés d’un mélange sont liées les unes aux autres
31
P H3PO4 0,40480742 (CH3O)3PO 0,40480864 par de petits entiers, les quantités molaires relatives de
(85 pour cent) ces composés peuvent être mesurées par comparaison
a
Le déplacement chimique dépend du pH des intensités normalisées des résonances des différents
b
DSS = 2,2-diméthyl-2-silapentane-5-sulfonate de sodium composants. Le rapport molaire entre deux composants d’un
mélange est donné par l’équation suivante :
En pratique, les déplacements chimiques X sont directement
étalonnés à l’aide d’un composé de référence approprié.
O

En RMN du 1H et du 13C, la principale méthode utilisée est (8)


celle de l’étalon interne, où le composé de référence est
directement ajouté au système étudié. En RMN du 15N, du La détermination n’est valide que lorsque sont connues
19
F ou du 31P, la méthode de l’étalon externe, où l’échantillon les structures moléculaires (ou du moins les valeurs de N
et le composé de référence sont contenus séparément dans pour les groupes structurels observés) pour lesquelles sont
des tubes cylindriques coaxiaux, est souvent appropriée. déterminés IA et IB. Elle est effectuée soit au moyen d’un
étalon interne soit par normalisation des pics.
Stabilisation. Pour éviter la dérive du spectre dans le temps,
une procédure de stabilisation champ-fréquence (lock) est Méthode de l’étalon interne. On peut déterminer la masse
appliquée. Sauf spécification contraire dans la monographie, mA d’un analyte A en ajoutant à la solution, comme étalon
le signal 2H (deutérium) émanant de solvants deutériés est d’intensité, une masse connue mB d’une substance B dont
utilisé à cet effet. on connaît la teneur pour cent PB. L’équation (8) devient
alors l’équation (9) :
ANALYSE QUALITATIVE
En analyse qualitative, les spectres RMN sont principalement
utilisés comme outils d’identification, le spectre 1H ou 13C
d’un échantillon à analyser étant alors comparé au spectre (9)
d’un composé de référence ou, plus rarement, à un spectre
de référence publié. Les spectres du composé à examiner et où Mi désigne la masse moléculaire.

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4175
2.2.42. Masse volumique d’un solide PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

L’étalon d’intensité doit être soigneusement choisi : il doit Le découplage haute puissance constitue un autre outil
être totalement soluble dans le solvant utilisé pour l’analyte, efficace, et une 3e méthode, dite de polarisation croisée (CP,
il ne doit produire qu’un petit nombre de signaux, et le cross polarisation), repose sur un transfert de polarisation
« groupe témoin » doit émettre un signal dans une région de noyaux facilement excitables vers des noyaux moins
vide du spectre. L’emploi d’un composé de haute pureté et facilement polarisables. La combinaison de ces techniques
de masse moléculaire relativement élevée est recommandé. permet d’obtenir des spectres de haute résolution apportant
Procédé de normalisation. Les proportions relatives une grande quantité d’informations sur les caractéristiques
des composants d’un mélange, le degré de substitution chimiques et structurelles des solides vitreux, amorphes
d’un polymère structurellement modifié, la teneur d’un et cristallins, qu’il s’agisse de céramiques, polymères ou
contaminant peuvent être déterminés par comparaison de minéraux.
l’intensité relative des résonances. Si la RMN est appliquée à un solide, la procédure doit être
Il convient de valider la méthode expérimentale utilisée, intégralement décrite dans la monographie.
pour s’assurer de l’absence de chevauchement entre
les signaux considérés. Lorsque le contaminant est un 01/2009:20242
composé de structure ou de masse moléculaire mal connue
(émulsifiant par exemple), l’addition de petites quantités de 2.2.42. MASSE VOLUMIQUE D’UN
ce composé dans le tube RMN permet de construire une
SOLIDE

TE
courbe d’étalonnage.
La masse volumique (improprement appelée densité) d’un
MODE OPÉRATOIRE solide correspond à sa masse moyenne par unité de volume
Préparation de l’échantillon. Mettez la substance à examiner et est souvent exprimée en grammes par centimètre cube
en solution dans le solvant éventuellement additionné, selon (g/cm3), bien que l’Unité Internationale soit le kilogramme
les indications de la monographie, du composé de référence par mètre cube (1 g/cm3 = 1000 kg/m3).
approprié pour étalonner le déplacement chimique. Pour les Contrairement aux gaz et aux liquides, pour lesquels la
analyses quantitatives, les solutions doivent être exemptes masse volumique ne dépend que de la température et de la
de particules solides. Certaines analyses quantitatives
LÈ pression, la masse volumique d’une particule solide dépend
peuvent exiger l’addition d’un étalon interne permettant la également de l’assemblage moléculaire et, par conséquent,
comparaison, après intégration, des résonances observées varie avec la structure cristalline et le degré de cristallinité.
pour la substance à examiner et pour le composé de Si une particule solide est amorphe, ou partiellement
référence. Les composés de référence et concentrations à amorphe, sa masse volumique peut en outre dépendre des
utiliser sont indiqués dans les monographies spécifiques. conditions de sa préparation et des traitements ultérieurs.
Dans d’autres analyses quantitatives, le résultat est obtenu
par comparaison de l’intensité relative de 2 ou de la totalité Par conséquent, à la différence des fluides, 2 solides
des résonances observées pour la substance à examiner. chimiquement équivalents peuvent avoir une masse
Après avoir placé l’échantillon dans un tube, fermez le tube, volumique différente, et cet écart reflète des différences
dans la structure à l’état solide. La masse volumique des
O
introduisez-le dans l’aimant du spectromètre, puis réglez
les paramètres expérimentaux et effectuez la mesure. Les particules constituantes est une caractéristique physique
paramètres opératoires fondamentaux sont indiqués dans importante des poudres pharmaceutiques.
les monographies. La masse volumique d’une particule solide peut prendre des
valeurs différentes selon la méthode utilisée pour mesurer le
Procédure de mesure. Equilibrez l’échantillon contenu volume de cette particule. Il est utile de distinguer 3 niveaux
dans la sonde, puis optimisez les réglages instrumentaux
BS

d’expression de la masse volumique :


afin d’obtenir des conditions de résonance optimales
et un rapport S/N maximal par réglage d’accord et — la masse volumique cristalline, qui ne prend en compte
d’adaptation de la sonde, et procédez aux ajustements que la fraction solide du produit ; la masse volumique
nécessaires pour maximiser l’homogénéité du champ cristalline est également appelée masse volumique vraie,
magnétique à travers l’échantillon (shimming). Notez — la masse volumique particulaire, qui prend également en
ou enregistrez dans l’ordinateur les réglages utilisés. compte les pores intraparticulaires,
Une expérience peut être composée de multiples — la masse volumique vrac qui prend en compte, en outre,
séquences d’impulsion-acquisition-latence, et les signaux le volume des espaces interparticulaires formés au sein
FID correspondants sont sommés dans la mémoire de du lit de poudre ; la masse volumique vrac est également
l’ordinateur, avec calcul du bruit aléatoire moyen. Lorsqu’un appelée masse volumique apparente.
O

rapport S/N convenable a été obtenu, le signal FID est


mis en mémoire et le spectre fréquentiel est généré par MASSE VOLUMIQUE CRISTALLINE
transformation de Fourier des signaux FID sommés. La masse volumique cristalline d’une substance est la masse
moyenne par unité de volume, à l’exclusion de tout vide
RMN DU SOLIDE non constitutionnel de l’arrangement moléculaire. Elle
L’analyse d’échantillons solides est possible au moyen constitue une propriété intrinsèque de la substance et est
de spectromètres RMN spécialement équipés à cet effet. normalement, à ce titre, indépendante de la méthode de
Certaines techniques rendent observables les raies détermination utilisée. La masse volumique cristalline peut
individuelles des différents sites atomiques, d’où l’extension être déterminée par le calcul ou par simple mesure.
possible, et d’un grand intérêt, de l’application de la RMN à A. La masse volumique cristalline calculée est déterminée
des composés inorganiques. à partir des données cristallographiques (taille et
L’une de ces techniques consiste à soumettre l’échantillon composition de la structure cristalline élémentaire)
pulvérisé à une rotation rapide (4-30 kHz) dans un rotor obtenues pour un cristal parfait, par exemple par
(d’un diamètre extérieur d’environ 4 mm) incliné d’un diffraction X, et de la masse moléculaire de la substance.
angle de 54,7° (l’angle « magique ») par rapport à l’axe B. La masse volumique cristalline mesurée est le rapport
du champ magnétique B0 ; cette technique est appelée masse/volume obtenu après mesure de la masse et du
rotation à l’angle magique (MAS, magic angle spinning). volume du monocristal.

4176 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 2.2.42. Masse volumique d’un solide

MASSE VOLUMIQUE PARTICULAIRE normales, le mercure ne pénètre pas dans les pores de
La masse volumique particulaire prend à la fois en compte la très petite taille qui sont accessibles à l’hélium. Pour
masse volumique cristalline et la porosité intraparticulaire un même échantillon, plusieurs valeurs de la masse
(pores ouverts et/ou fermés). Elle dépend par conséquent de volumique granulaire peuvent être obtenues puisque,
la valeur du volume déterminé, qui est lui-même fonction de pour chaque pression d’intrusion appliquée, une masse
la méthode de détermination utilisée. La masse volumique volumique qui correspond au diamètre minimal d’accès
particulaire peut être déterminée par l’une des 2 méthodes sous cette pression peut être déterminée.
suivantes. MASSE VOLUMIQUE VRAC ET MASSE VOLUMIQUE
A. La masse volumique pycnométrique est déterminée par APRÈS TASSEMENT
mesure du volume occupé par une masse connue de La masse volumique vrac d’une poudre inclut la contribution
poudre, par équivalence avec le volume de gaz déplacé des espaces interparticulaires. Elle dépend par conséquent
par la poudre dans un pycnomètre à déplacement de à la fois de la masse volumique des particules et de leur
gaz (2.9.23). Dans les mesures de la masse volumique arrangement spatial dans le lit de poudre.
pycnométrique, le volume déterminé comprend le volume
occupé par les pores ouverts mais exclut le volume occupé La masse volumique vrac d’une poudre est souvent difficile à
par les pores fermés ou non accessibles au gaz. En raison mesurer, car la plus légère perturbation du lit peut entraîner
de la très grande diffusibilité de l’hélium, qui est le gaz une variation de masse volumique. Il est donc essentiel

TE
utilisé de préférence, la plupart des pores ouverts sont de préciser, avec toute mesure de masse volumique vrac,
accessibles au gaz, de sorte que la masse volumique comment la détermination a été effectuée.
pycnométrique d’une poudre finement broyée diffère A. La masse volumique vrac est déterminée par mesure du
généralement peu de la masse volumique cristalline. volume occupé par une masse connue de poudre versée
B. Dans la masse volumique par porosimétrie au mercure, dans une éprouvette graduée après passage à travers un
également appelée masse volumique granulaire, le tamis (2.9.34).
volume déterminé exclut également la contribution des B. La masse volumique après tassement est déterminée en
pores fermés, mais il comprend le volume des pores provoquant le tassement d’un échantillon de poudre versé
ouverts de taille supérieure à une valeur limite. Cette
LÈ dans une éprouvette graduée. Après relevé du volume
taille limite des pores, ou diamètre minimal d’accès, est initial, l’éprouvette est soumise à des chocs mécaniques
fonction de la pression maximale d’intrusion du mercure et des lectures sont faites jusqu’à ce que les changements
appliquée au cours de la mesure. Aux pressions de travail de volume observés soient minimes (2.9.34).
O
BS
O

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4177
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

TE

O
BS
O

4178 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

2.5. MÉTHODES DE DOSAGE


2.5.24. Dioxyde de carbone dans les gaz............................ 4181 2.5.27. Oxygène dans les gaz.. .............................................. 4182
2.5.25. Monoxyde de carbone dans les gaz........................ 4181

TE

O
BS
O

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4179
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

TE

O
BS
O

4180 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 2.5.25. Monoxyde de carbone dans les gaz

01/2009:20524 01/2009:20525

2.5.24. DIOXYDE DE CARBONE DANS 2.5.25. MONOXYDE DE CARBONE


LES GAZ DANS LES GAZ
Les gaz absorbent la lumière à une longueur d’onde unique. PROCÉDÉ I
Cette propriété est souvent utilisée pour effectuer une Appareillage. L’appareillage (figure 2.5.25.-1) est constitué
mesure hautement sélective de leur concentration. par les dispositifs suivants, disposés en série :
Description et principe de mesure. La concentration du — un tube en U (U1) contenant du gel de silice anhydre R
dioxyde de carbone dans d’autres gaz peut être déterminée imprégné de trioxyde de chrome R,
au moyen d’un analyseur infrarouge. — un flacon laveur (F1) contenant 100 ml d’une solution
d’hydroxyde de potassium R à 400 g/l,
L’analyseur infrarouge se compose généralement d’une
source lumineuse émettant un rayonnement infrarouge à — un tube en U (U2) contenant des pastilles d’hydroxyde
large spectre, d’un dispositif optique, d’une cellule de mesure de potassium R,
et d’un détecteur. Le dispositif optique peut être placé soit — un tube en U (U3) contenant du pentoxyde de
avant soit après la cellule de mesure ; il est constitué d’un diphosphore R dispersé sur de la pierre poreuse granulée

TE
ou plusieurs filtres optiques que traverse le rayonnement à et calcinée au préalable,
large spectre. Dans ce cas, le dispositif optique utilisé est — un tube en U (U4) contenant 30 g d’anhydride iodique
dédié au dioxyde de carbone. Le faisceau lumineux traverse recristallisé R granulé, desséché au préalable à 200 °C et
la cellule de mesure ; il peut aussi traverser une cellule de maintenu à 120 °C (T) pendant l’opération. Le réactif est
référence si l’analyseur en comporte une (elle est remplacée disposé en disques de 1 cm d’épaisseur séparés par des
par un système électronique dans certains analyseurs). disques de laine de verre de même épaisseur, de façon
La présence de dioxyde de carbone dans la cellule de à former une colonne d’anhydride iodique de 5 cm de
mesure entraîne une absorption d’énergie dans le faisceau longueur effective,
lumineux, selon la loi de Beer-Lambert, et par suite une
LÈ — un flacon à réaction (F2) contenant 2,0 ml de solution
variation du signal parvenant au détecteur. La comparaison d’iodure de potassium R additionnés de 0,15 ml de
de ce signal à un signal de référence génère un signal de solution d’amidon R.
sortie qui est fonction de la concentration de dioxyde de Mode opératoire. Purgez l’appareil avec 5,0 litres d’argon R
carbone. La linéarisation du signal généré permet d’obtenir et, le cas échéant, faites disparaître la coloration bleue de
la concentration en dioxyde de carbone. Pour éviter l’entrée la solution d’iodure par addition du volume strictement
de particules dans les capteurs pouvant entraîner des nécessaire d’une solution récemment préparée de thiosulfate
phénomènes optiques parasites, l’appareil est équipé d’un de sodium 0,002 M. Poursuivez la purge jusqu’à ce que la
filtre approprié. valeur obtenue avec 5,0 litres d’argon R ne dépasse pas
Caractéristiques techniques requises. Lorsqu’il est utilisé 0,045 ml de thiosulfate de sodium 0,002 M. Faites passer
O
dans un essai limite, l’analyseur infrarouge satisfait aux ensuite dans l’appareil le gaz à examiner en utilisant le
spécifications techniques suivantes : volume et le débit indiqués. Recueillez les dernières traces
d’iode libéré dans le flacon à réaction en purgeant l’appareil
— limite de détection : (généralement définie par un
avec 1,0 litre d’argon R. Titrez l’iode libéré par le thiosulfate
rapport signal/bruit de 2) au maximum 20 pour cent de
de sodium 0,002 M. Faites un essai à blanc en utilisant le
la concentration maximale admissible,
volume prescrit d’argon R. La différence entre les volumes
BS

— répétabilité : ETR maximum de 10 pour cent de la de thiosulfate de sodium 0,002 M utilisés dans les 2 titrages
concentration maximale admissible, déterminé sur n’est pas supérieure à la limite indiquée.
6 mesures,
— linéarité : au maximum 10 pour cent de la concentration PROCÉDÉ II
maximale admissible. Les gaz absorbent la lumière à une longueur d’onde unique.
Ces exigences doivent être satisfaites en présence des autres Cette propriété est souvent utilisée pour effectuer une
impuretés gazeuses de l’échantillon. mesure hautement sélective de leur concentration.
O

Figure 2.5.25.-1. - Détermination du monoxyde de carbone


Dimensions en millimètres

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4181
2.5.27. Oxygène dans les gaz PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

Description et principe de mesure. La concentration du 01/2009:20527


monoxyde de carbone dans d’autres gaz peut être déterminée
au moyen d’un analyseur infrarouge. 2.5.27. OXYGÈNE DANS LES GAZ
L’analyseur infrarouge se compose généralement d’une
source lumineuse émettant un rayonnement infrarouge à L’oxygène dans les gaz est déterminé à l’aide d’un analyseur
large spectre, d’un dispositif optique, d’une cellule de mesure paramagnétique.
et d’un détecteur. Le dispositif optique peut être placé soit Le principe de la méthode est fondé sur la sensibilité
avant soit après la cellule de mesure ; il est constitué d’un ou paramagnétique élevée de la molécule d’oxygène. L’oxygène
plusieurs filtres optiques que traverse le rayonnement à large exerce une forte interaction sur les champs magnétiques
spectre. Dans ce cas, le dispositif optique utilisé est dédié qui est mesurée électroniquement, amplifiée et convertie en
au monoxyde de carbone. Le faisceau lumineux traverse une lecture de la concentration en oxygène. La mesure de
la cellule de mesure, il peut aussi traverser une cellule de la concentration en oxygène dépend de la pression et de
référence si l’analyseur en comporte une (elle est remplacée la température : si l’analyseur n’est pas automatiquement
par un système électronique dans certains analyseurs). compensé pour des variations de température et de pression,
La présence de monoxyde de carbone dans la cellule de il doit être étalonné immédiatement avant l’emploi. Comme
mesure entraîne une absorption d’énergie dans le faisceau l’effet paramagnétique de l’oxygène est linéaire, l’instrument
lumineux, selon la loi de Beer-Lambert, et par suite une doit avoir une échelle appropriée permettant des lectures

TE
variation du signal parvenant au détecteur. La comparaison de 0,1 pour cent ou mieux.
de ce signal à un signal de référence génère un signal de Etalonnage de l’instrument. Procédez aux réglages de la
sortie qui est fonction de la concentration de monoxyde de manière suivante :
carbone. La linéarisation du signal généré permet d’obtenir
la concentration en monoxyde de carbone. Pour éviter — réglez le zéro en faisant passer dans l’instrument de
l’entrée de particules dans les capteurs pouvant entraîner l’azote R1 jusqu’à une lecture stable,
des phénomènes optiques parasites, l’appareil est équipé — réglez l’échelle à 100 pour cent en faisant passer dans
d’un filtre approprié. l’instrument de l’oxygène R au même débit que celui
Caractéristiques techniques requises. Lorsqu’il est utilisé
LÈ utilisé pour l’azote R1 jusqu’à une lecture stable,
dans un essai limite, l’analyseur infrarouge satisfait aux Dosage. Faites passer dans l’instrument du gaz à examiner,
spécifications techniques suivantes : à un débit constant, jusqu’à une lecture stable. Enregistrez
— limite de détection : (généralement définie par un la concentration en oxygène du gaz à examiner.
rapport signal/bruit de 2) au maximum 20 pour cent de
la concentration maximale admissible,
— répétabilité : ETR maximum de 10 pour cent de la
concentration maximale admissible, déterminé sur 6
mesures,
— linéarité : au maximum 10 pour cent de la concentration
O
maximale admissible.
Ces exigences doivent être satisfaites en présence des autres
impuretés gazeuses de l’échantillon.
BS
O

4182 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

2.6. MÉTHODES
BIOLOGIQUES
2.6.1. Stérilité.. ......................................................................... 4185 2.6.13. Contrôle microbiologique des produits non stériles :
2.6.12. Contrôle microbiologique des produits non stériles : recherche de microorganismes spécifiés.. ........................ 4193
essais de dénombrement microbien.. ................................ 4189

TE

O
BS
O

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4183
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

TE

O
BS
O

4184 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 2.6.1. Stérilité

01/2009:20601 stérile étanche à température comprise entre 2 °C et 25 °C.


Si le milieu a pris une coloration rose sur plus du tiers
2.6.1. STÉRILITÉ supérieur de sa hauteur, il est admis de le régénérer une
fois en plaçant le récipient dans un bain-marie ou dans de
L’essai s’applique aux substances, préparations et produits la vapeur circulante jusqu’à disparition de la coloration
qui doivent être stériles selon la Pharmacopée. Toutefois, rose, puis en le refroidissant rapidement en veillant à éviter
un résultat favorable signifie seulement qu’aucun l’introduction d’air non stérile dans le récipient. N’utilisez
microorganisme contaminant n’a pu être décelé dans pas le milieu au-delà de la durée de conservation validée.
l’échantillon examiné, dans les conditions de l’essai. La température d’incubation du milieu liquide au
PRÉCAUTIONS CONCERNANT LA CONTAMINATION thioglycolate est de 30-35 °C.
MICROBIENNE Pour les produits contenant un conservateur mercuriel,
L’essai de stérilité est réalisé dans des conditions aseptiques. auxquels la méthode de filtration sur membrane n’est
Pour que ces conditions soient réalisées, l’environnement pas applicable, le milieu liquide au thioglycolate incubé à
d’essai doit être adapté aux modalités de réalisation de 20-25 °C peut remplacer le milieu à l’hydrolysat de caséine
l’essai de stérilité. Les précautions prises pour éviter une et de soja, sous réserve de validation comme décrit dans
contamination microbienne ne doivent pas affecter les l’essai de fertilité du milieu.
microorganismes recherchés. Les conditions dans lesquelles L’emploi d’un milieu au thioglycolate alternatif, tel que décrit

TE
est réalisé l’essai sont régulièrement vérifiées par des ci-après, est possible dans des cas où cet emploi est prescrit
prélèvements adéquats effectués dans la zone de travail et ou justifié et autorisé. Préparez un mélange de même
par des contrôles appropriés. composition que celle du milieu liquide au thioglycolate,
mais sans gélose ni solution de résazurine sodique, puis
MILIEUX DE CULTURE ET TEMPÉRATURES stérilisez comme indiqué ci-dessus. Le pH après stérilisation
D’INCUBATION est de 7,1 ± 0,2. Chauffez dans un bain-marie avant emploi.
Les milieux de culture utilisés peuvent être préparés L’incubation du milieu s’effectue à 30-35 °C dans des
comme décrit ci-dessous ; on peut également utiliser conditions anaérobies.
des milieux équivalents disponibles dans le commerce à
LÈ Milieu à l’hydrolysat de caséine et de soja
condition qu’ils satisfassent à l’essai de fertilité. Hydrolysat pancréatique de caséine 17,0 g
Les milieux de culture suivants conviennent pour la
Hydrolysat papaïque de farine de soja 3,0 g
réalisation de l’essai de stérilité. Le milieu liquide au
thioglycolate est principalement destiné à la recherche des Chlorure de sodium 5,0 g
bactéries anaérobies, mais il permet également la détection Phosphate dipotassique 2,5 g
des bactéries aérobies. Le milieu à l’hydrolysat de caséine
convient à la fois à la recherche des levures et moisissures et Glucose monohydraté/anhydre 2,5 g/2,3 g
des bactéries aérobies. Eau R 1000 ml
O
Milieu liquide au thioglycolate pH après stérilisation : 7,3 ± 0,2
L-Cystine 0,5 g Dissolvez les différents constituants dans de l’eau R, en
Gélose 0,75 g chauffant doucement. Refroidissez la solution à température
ambiante. Ajoutez si nécessaire de l’hydroxyde de
Chlorure de sodium 2,5 g sodium 1 M pour que le pH de la solution après stérilisation
soit de 7,3 ± 0,2. Filtrez si nécessaire pour clarifier, puis
BS

Glucose monohydraté/anhydre 5,5 g/5,0 g


répartissez dans des récipients appropriés et stérilisez par
Extrait de levure (hydrosoluble) 5,0 g
un procédé validé. Sauf s’il est utilisé immédiatement,
Hydrolysat pancréatique de caséine 15,0 g conservez le milieu dans un récipient stérile bien fermé à
Thioglycolate de sodium ou 0,5 g
température comprise entre 2 °C et 25 °C. N’utilisez pas le
milieu au-delà de la durée de conservation validée.
Acide thioglycolique 0,3 ml La température d’incubation du milieu à l’hydrolysat de
Solution de résazurine sodique à 1 g/l, récemment 1,0 ml caséine et de soja est de 20-25 °C.
préparée Les milieux utilisés satisfont aux essais suivants, effectués
Eau R 1000 ml avant l’essai du produit à examiner ou en parallèle.
O

pH après stérilisation : 7,1 ± 0,2 Stérilité. Incubez des échantillons des milieux pendant
14 jours. Aucune croissance microbienne n’est observée.
Mélangez la L-cystine, la gélose, le chlorure de sodium, le
glucose, l’extrait de levure hydrosoluble et l’hydrolysat Essai de fertilité du milieu pour les bactéries aérobies et
pancréatique de caséine avec l’eau R et chauffez jusqu’à anaérobies et les levures et moisissures. Effectuez l’essai
dissolution. Dissolvez le thioglycolate de sodium ou l’acide sur chaque lot de milieu, qu’il soit acheté prêt à l’emploi ou
thioglycolique dans la solution et ajoutez si nécessaire de préparé à partir d’un milieu déshydraté ou des ingrédients
l’hydroxyde de sodium 1 M pour que le pH de la solution décrits. Des souches de microorganismes appropriées sont
après stérilisation soit de 7,1 ± 0,2. Si une filtration indiquées dans le tableau 2.6.1.-1.
s’avère nécessaire, réchauffez la solution sans la porter à Ensemencez des échantillons du milieu liquide au
ébullition puis filtrez à chaud sur un papier filtre humecté. thioglycolate avec un petit nombre (au maximum
Ajoutez la solution de résazurine sodique, mélangez et 100 UFC) des microorganismes suivants, en utilisant une
répartissez dans des récipients appropriés pour que le fraction séparée du milieu pour chacune des espèces de
rapport surface/hauteur du milieu soit tel que la zone microorganisme : Clostridium sporogenes, Pseudomonas
d’oxydation superficielle (zone de virage de l’indicateur aeruginosa, Staphylococcus aureus. Ensemencez des
coloré) ne représente pas plus de la moitié de la hauteur du échantillons du milieu à l’hydrolysat de caséine et de
milieu en fin d’incubation. Stérilisez par un procédé validé. soja avec un petit nombre (au maximum 100 UFC) des
Si le milieu est conservé, conservez-le dans un récipient microorganismes suivants, en utilisant une fraction séparée

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4185
2.6.1. Stérilité PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

Tableau 2.6.1.-1 — Souches des microorganismes d’essai appropriées pour les essais de fertilité du milieu et d’applicabilité
de la méthode
Bactéries aérobies
Staphylococcus aureus ATCC 6538, CIP 4.83, NCTC 10788, NCIMB 9518, NBRC 13276
Bacillus subtilis ATCC 6633, CIP 52.62, NCIMB 8054, NBRC 3134
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118, NBRC 13275
Bactérie anaérobie
Clostridium sporogenes ATCC 19404, CIP 79.3, NCTC 532, ATCC 11437, NBRC 14293
Moisissures et levures
Candida albicans ATCC 10231, IP 48.72, NCPF 3179, NBRC 1594
Aspergillus niger ATCC 16404, IP 1431.83, IMI 149007, NBRC 9455

du milieu pour chacune des espèces de microorganisme : b) chaque fois qu’une modification est apportée aux

TE
Aspergillus niger, Bacillus subtilis, Candida albicans. conditions expérimentales.
Incubez pendant au maximum 3 jours pour les bactéries et L’essai d’applicabilité de la méthode peut être réalisé au
pendant au maximum 5 jours pour les moisissures et levures. même moment que l’essai de stérilité du produit à examiner.
Les cultures sont effectuées selon un système de lot
de semence tel que les microorganismes utilisés pour ESSAI DE STÉRILITÉ DU PRODUIT À EXAMINER
l’inoculation n’aient pas subi plus de 5 passages à partir du L’essai peut être réalisé soit par la technique de filtration sur
lot de semence primaire. membrane, soit par ensemencement direct du milieu nutritif
Les milieux conviennent si une croissance des avec le produit à examiner. Il comprend dans tous les cas des
microorganismes est clairement observable. LÈ témoins négatifs appropriés. La technique de filtration sur
membrane est utilisée chaque fois que la nature du produit
ESSAI D’APPLICABILITÉ DE LA MÉTHODE le permet : préparations aqueuses filtrables, préparations
alcooliques ou huileuses, préparations solubles dans des
Opérez comme décrit ci-après, sous Essai de stérilité du solvants aqueux ou huileux ou miscibles à de tels solvants
produit à examiner, en appliquant exactement la même à condition que ceux-ci n’exercent pas d’effet antimicrobien
méthode aux modifications suivantes près. dans les conditions de l’essai.
Filtration sur membrane. Après transfert sur la membrane Filtration sur membrane. Utilisez des membranes d’une
du contenu du (des) récipient(s) à examiner, ajoutez un porosité nominale inférieure ou égale à 0,45 μm dont
inoculum contenant un petit nombre de microorganismes l’efficacité de rétention des microorganismes a été établie.
O
viables (au maximum 100 UFC) au volume final du diluant Des membranes de nitrate de cellulose par exemple sont
stérile utilisé pour rincer le filtre. utilisées pour les solutions aqueuses, huileuses ou faiblement
Ensemencement direct. Après transfert dans le milieu alcooliques, des membranes d’acétate de cellulose par
de culture du contenu du (des) récipient(s) à examiner exemple pour les solutions fortement alcooliques. L’emploi
(ou des fils pour le catgut et les autres fils chirurgicaux à de membranes spéciales peut être nécessaire pour certains
usage vétérinaire), ensemencez le milieu avec un inoculum produits, par exemple les antibiotiques.
BS

contenant un petit nombre de microorganismes viables (au La technique décrite ci-après suppose l’utilisation de
maximum 100 UFC). membranes d’un diamètre d’environ 50 mm. L’emploi de
Dans les deux cas, utilisez les mêmes microorganismes membranes d’un diamètre différent nécessite d’adapter
que ceux décrits sous Essai de fertilité du milieu pour les en conséquence le volume des dilutions et solutions de
bactéries aérobies et anaérobies et les levures et moisissures, rinçage utilisées. L’appareil de filtration et la membrane
et effectuez en parallèle un essai de fertilité (témoin positif). sont stérilisés par des moyens appropriés. L’appareil doit
Incubez tous les récipients contenant le milieu pendant au permettre l’introduction et la filtration de la solution à
maximum 5 jours. examiner dans des conditions aseptiques ; il doit également
Si l’on obtient après incubation une croissance microbienne être compatible avec un transfert aseptique de la membrane
dans le milieu de culture, ou avec une incubation directe
O

clairement observable et visuellement comparable à celle


observée avec le témoin positif, le produit ne possède pas dans l’appareil après addition du milieu de culture.
d’activité antimicrobienne dans les conditions de l’essai Solutions aqueuses. Si besoin est, introduisez dans
ou son activité antimicrobienne a été éliminée de façon l’appareil muni d’une membrane une petite quantité d’un
satisfaisante. L’essai de stérilité peut alors être effectué sans diluant stérile approprié, par exemple une solution neutre de
autre modification. peptone de viande ou de caséine à 1 g/l, de pH 7,1 ± 0,2,
puis filtrez. Le diluant peut contenir des substances
Si l’on n’obtient pas, en présence du produit à examiner, neutralisantes et/ou inactivantes appropriées, par exemple
une croissance microbienne clairement observable et dans le cas des antibiotiques.
visuellement comparable à celle observée avec le témoin
positif, le produit possède une activité antimicrobienne qui Transvasez dans un ou plusieurs appareils ainsi préparés
n’a pas été éliminée de façon satisfaisante dans les conditions le contenu du ou des récipients à examiner, après l’avoir
d’essai utilisées. Dans ce cas, modifiez les conditions si nécessaire complété au volume utilisé dans l’essai
pour éliminer l’activité antimicrobienne et répétez l’essai d’applicabilité de la méthode avec le diluant stérile choisi,
d’applicabilité de la méthode. mais en utilisant dans tous les cas au minimum la quantité
de produit prescrite dans le tableau 2.6.1.-2. Filtrez
Cet essai est effectué : immédiatement. Si le produit possède des propriétés
a) lorsque l’essai de stérilité doit être appliqué à un nouveau antimicrobiennes, rincez la membrane au moins 3 fois, en
produit, filtrant à chaque fois le volume de diluant stérile utilisé dans

4186 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 2.6.1. Stérilité

l’essai d’applicabilité de la méthode. Ne dépassez pas un ci-dessus, en chauffant si nécessaire à une température ne
volume de rinçage de 5 fois 100 ml par filtre, même s’il a dépassant pas 40 °C. Dans certains cas exceptionnels, il
été démontré lors de l’essai d’applicabilité de la méthode peut être nécessaire de chauffer jusqu’à au maximum 44 °C.
qu’un tel cycle ne permet pas d’éliminer totalement l’activité Filtrez aussi rapidement que possible et procédez comme
antimicrobienne. Transférez la membrane entière dans le décrit ci-dessus pour les huiles et solutions huileuses.
milieu de culture, ou découpez-la en 2 parties égales dans des Ensemencement direct du milieu de culture. Ensemencez
conditions aseptiques et placez chaque moitié dans un milieu directement le milieu de culture avec la quantité de
différent. Utilisez chaque fois le même volume de milieu que préparation indiquée dans le tableau 2.6.1.-2, de façon que
celui employé pour l’essai d’applicabilité de la méthode. Le le volume de produit utilisé ne dépasse pas 10 pour cent du
milieu peut aussi être introduit dans l’appareil directement volume du milieu, sauf indication contraire.
sur la membrane. Incubez pendant au minimum 14 jours.
Si le produit à examiner possède une activité antimicrobienne,
Poudres solubles. Utilisez au minimum, pour chaque effectuez l’essai après neutralisation de cette activité au
milieu de culture, la quantité de produit indiquée dans le moyen d’un neutralisant approprié ou par dilution avec une
tableau 2.6.1.-2, après dissolution dans un solvant approprié, quantité suffisante de milieu de culture. Lorsque le volume
par exemple le solvant fourni avec la préparation, de l’eau de produit requis pour l’essai est important, il peut être
pour préparations injectables, une solution saline, ou une préférable de se servir de milieux de culture concentrés,
solution neutre de peptone de viande ou de caséine à préparés de façon à tenir compte de la dilution qui va suivre.

TE
1 g/l, puis procédez comme décrit précédemment pour les Dans certains cas, le milieu de culture concentré peut être
solutions aqueuses en utilisant une membrane adaptée au ajouté directement au produit dans son récipient.
solvant choisi.
Liquides huileux. Utilisez des milieux additionnés d’un
Huiles et solutions huileuses. Utilisez, pour chaque milieu agent émulsionnant approprié à une concentration
de culture, au minimum la quantité de produit indiquée appropriée, déterminée lors de l’essai d’applicabilité de la
dans le tableau 2.6.1.-2. Les huiles et solutions huileuses méthode, par exemple du polysorbate 80 à la concentration
de viscosité suffisamment faible peuvent être filtrées sans de 10 g/l.
dilution préalable sur une membrane sèche. Les huiles
visqueuses peuvent être diluées avec un diluant stérile Pommades et crèmes. Emulsionnez avec un diluant stérile
approprié (par exemple du myristate d’isopropyle) dont
LÈ approprié, par exemple une solution neutre de peptone de
l’absence d’activité antimicrobienne dans les conditions de viande ou de caséine à 1 g/l, contenant l’agent émulsionnant
l’essai aura été démontrée. Laissez pénétrer l’huile dans la choisi, de façon à obtenir environ une dilution au 1/10.
membrane par gravité, puis filtrez en appliquant lentement Transvasez l’émulsion obtenue dans un milieu ne contenant
le vide ou en augmentant la pression. Rincez la membrane pas d’agent émulsionnant.
au moins 3 fois, en filtrant à chaque fois environ 100 ml Incubez les milieux ensemencés pendant au minimum
d’une solution stérile appropriée, par exemple une solution 14 jours. Examinez les cultures à plusieurs reprises
neutre de peptone de viande ou de caséine à 1 g/l, contenant au cours de la période d’incubation. Les cultures
un agent émulsionnant approprié à une concentration contenant des préparations huileuses doivent être agitées
appropriée, déterminée lors de l’essai d’applicabilité de la doucement chaque jour ; toutefois, pour la détection des
O
méthode (par exemple du polysorbate 80 à concentration de microorganismes anaérobies dans le milieu liquide au
10 g/l). Transférez la (les) membrane(s) dans le (les) milieu(x) thioglycolate, réduisez autant que possible l’agitation afin
de culture, ou inversement, comme décrit ci-dessus pour les de maintenir les conditions d’anaérobiose.
solutions aqueuses, et incubez à la même température et Catgut et autres fils chirurgicaux à usage vétérinaire.
pendant le même temps. Utilisez, pour chaque milieu de culture, au minimum la
BS

Pommades et crèmes. Utilisez au minimum, pour chaque quantité de produit indiquée dans le tableau 2.6.1.-2. Ouvrez
milieu de culture, la quantité de produit indiquée dans l’emballage scellé en respectant les conditions d’asepsie et
le tableau 2.6.1.-2. Les pommades à excipient gras et les prélevez, pour chaque milieu de culture, 3 segments de fil
émulsions du type eau dans huile peuvent être diluées d’une longueur de 30 cm situés en début, milieu et fin du
au 1/100 avec du myristate d’isopropyle comme décrit fil. Utilisez des fils entiers provenant de paquets récemment
Tableau 2.6.1.-2 — Quantités minimales à utiliser pour chaque milieu
Quantité minimale de préparation à utiliser pour chaque milieu,
Quantité par récipient
sauf exception justifiée et autorisée
Liquides
O

— < 1 ml Contenu total de chaque récipient


— 1-40 ml La moitié du contenu de chaque récipient, mais pas moins de 1 ml
— > 40 ml mais ≤ 100 ml 20 ml
— >100 ml 10 pour cent du contenu du récipient, mais pas moins de 20 ml
Liquides antibiotiques 1 ml
Préparations insolubles, crèmes et pommades à mettre en suspension Contenu total de chaque récipient, de façon à obtenir une masse minimale
ou en émulsion de 200 mg
Solides
— < 50 mg Contenu total de chaque récipient
— ≥ 50 mg mais < 300 mg La moitié du contenu de chaque récipient, mais pas moins de 50 mg
— 300 mg à 5 g 150 mg
— >5g 500 mg
Catgut et autres fils chirurgicaux à usage vétérinaire 3 segments de fil de 30 cm chacun

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4187
2.6.1. Stérilité PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

ouverts. Transférez chaque segment dans le milieu de Si l’essai est déclaré non valable, il est répété sur le même
culture choisi pour l’essai. Utilisez une quantité de milieu nombre d’unités que l’essai initial.
suffisante pour immerger complètement l’échantillon à
examiner (20-150 ml). S’il n’est pas observé de signes de croissance microbienne
lors de la répétition de l’essai, le produit à examiner satisfait
à l’essai. Si une croissance microbienne est observée lors
OBSERVATION ET INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS de la répétition de l’essai, le produit à examiner ne satisfait
A plusieurs reprises au cours de l’incubation, puis en pas à l’essai.
fin d’incubation, examinez les milieux pour détecter des
signes macroscopiques de prolifération microbienne. Si le APPLICATION DE L’ESSAI AUX PRÉPARATIONS
produit à examiner induit une turbidité du milieu qui rend PARENTÉRALES ET AUX PRÉPARATIONS
difficile la détection visuelle d’une éventuelle croissance OPHTALMIQUES OU AUTRES PRÉPARATIONS
microbienne, prélevez 14 jours après la mise en incubation NON INJECTABLES OBLIGATOIREMENT STÉRILES
des échantillons du milieu (d’au minimum 1 ml chacun),
transférez-les dans de nouveaux récipients contenant le Pour la technique de filtration sur membrane, utilisez
même milieu et incubez pendant au minimum 4 jours le chaque fois que possible le contenu total du récipient mais
milieu initial et les milieux transférés. en respectant les quantités minimales indiquées dans le

TE
tableau 2.6.1.-2. Complétez si nécessaire à environ 100 ml
S’il n’est pas observé de signes de croissance microbienne, avec un diluant stérile approprié, par exemple une solution
le produit à examiner satisfait à l’essai. Si une croissance neutre de peptone de viande ou de caséine à 1 g/l.
microbienne est observée, le produit à examiner ne satisfait
pas à l’essai à moins qu’il ne puisse être clairement démontréPour la technique d’ensemencement direct, utilisez les
que l’essai est non valable pour des raisons indépendantes quantités indiquées dans le tableau 2.6.1.-2, sauf exception
du produit. L’essai peut être considéré comme non valable justifiée et autorisée. Les recherches de contamination
si et seulement si une ou plusieurs des conditions suivantes bactérienne et de contamination fongique sont effectuées sur
sont réalisées : le même échantillon de produit. Si le contenu d’un récipient
ne suffit pas, utilisez le contenu de plusieurs récipients pour
a) les résultats du contrôle microbiologique des équipements ensemencer les différents milieux.

servant aux essais de stérilité font apparaître une anomalie,
b) l’examen de la procédure expérimentale utilisée pour
effectuer l’essai en question fait apparaître une anomalie, NOMBRE MINIMAL D’UNITÉS À CONTRÔLER

c) une croissance microbienne est observée pour les témoins Le nombre minimal d’unités à contrôler, en fonction de la
négatifs, taille du lot, est indiqué dans le tableau 2.6.1.-3.

d) après identification des microorganismes isolés au terme


de l’essai, il apparaît que la croissance de cette (ces) espèce(s)
O
est sans aucun doute possible imputable au matériel ou à la Des recommandations sur l’essai de stérilité sont données
technique utilisés pour la réalisation de l’essai de stérilité. dans le chapitre général 5.1.9.
BS

Tableau 2.6.1.-3 — Nombre minimal d’unités à examiner


Nombre minimal d’unités à examiner par milieu, sauf
Nombre d’unités dans le lot*
exception justifiée et autorisée**
Préparations parentérales
— nombre de récipients ≤ 100 10 pour cent des récipients, avec un minimum de 4
— 100 < nombre de récipients ≤ 500 10 récipients
O

2 pour cent des récipients, avec un maximum de 20 (10 dans le cas des
— nombre de récipients > 500
préparations parentérales de grand volume)
Préparations ophtalmiques et autres préparations non injectables
— nombre de récipients ≤ 200 5 pour cent des récipients, avec un minimum de 2
— nombre de récipients > 200 10 récipients
— Si le produit est conditionné en récipients unidoses, appliquez le plan
indiqué ci-dessus pour les préparations parentérales
Catgut et autres fils chirurgicaux à usage vétérinaire 2 pour cent des emballages, avec un minimum de 5 et un maximum de 20
Produits solides en vrac
— nombre de récipients ≤ 4 Tous les récipients
— 4 < nombre de récipients ≤ 50 20 pour cent des récipients, avec un minimum de 4
— nombre de récipients > 50 2 pour cent des récipients, avec un minimum de 10

* Si la taille des lots n’est pas connue, utilisez le nombre maximal d’unités spécifié.
** Si le contenu d’un seul récipient suffit à ensemencer les 2 milieux, cette colonne indique le nombre de récipients à utiliser pour l’ensemble
des 2 milieux.

4188 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 2.6.12. Essais de dénombrement microbien

01/2009:20612 4-2. PRÉPARATION DES SOUCHES DE RÉFÉRENCE


Utilisez des suspensions standardisées stables des souches
2.6.12. CONTRÔLE MICROBIOLOGIQUE de référence ou préparez des suspensions comme indiqué
DES PRODUITS NON STÉRILES : ci-après. Les cultures sont effectuées selon un système de lot
de semence tel que les microorganismes viables utilisés pour
ESSAIS DE DÉNOMBREMENT l’inoculation n’aient pas subi plus de 5 passages à partir
MICROBIEN du lot de semence primaire d’origine. Cultivez séparément
chacune des souches bactériennes et fongiques de référence
comme indiqué dans le tableau 2.6.12.-1.
1. INTRODUCTION
Les essais décrits ci-après permettent le dénombrement des Utilisez de la solution tampon peptonée au chlorure de
bactéries mésophiles et des moisissures et levures capables sodium pH 7,0 ou de la solution tampon phosphate pH 7,2
de croître en aérobiose. pour préparer les suspensions témoins ; pour mettre
en suspension les spores d’A. niger, 0,05 pour cent de
Ces essais sont en premier lieu destinés à déterminer si polysorbate 80 peuvent être ajoutés au tampon. Utilisez
une substance ou préparation satisfait à une spécification les suspensions dans les 2 h, ou dans les 24 h si elles sont
préétablie en matière de qualité microbiologique. Il convient conservées à 2-8 °C. On peut également, plutôt que de
dans ce cas de se conformer aux indications données ci-après, préparer puis diluer une suspension fraîche de cellules

TE
notamment en ce qui concerne le nombre d’échantillons à végétatives d’A. niger ou de B. subtilis, préparer une
prélever et l’interprétation des résultats. suspension de spores stable puis en utiliser un volume
Les méthodes décrites ne sont pas applicables aux approprié pour l’inoculation. Cette suspension peut être
produits contenant des microorganismes viables en tant maintenue à 2-8 °C pendant une durée validée.
qu’ingrédients actifs.
4-3. TÉMOIN NÉGATIF
D’autres méthodes microbiologiques, notamment des
méthodes automatisées, peuvent être utilisées à condition Pour vérifier les conditions opératoires, effectuez un contrôle
que leur équivalence avec la méthode de la Pharmacopée sur un témoin négatif préparé en substituant le diluant choisi
ait été démontrée. LÈ à la préparation à examiner. Aucune croissance microbienne
n’est observée.
2. PRÉCAUTIONS GÉNÉRALES
4-4. FERTILITÉ DES MILIEUX
Réalisez le dénombrement dans des conditions permettant Effectuez ce contrôle sur chaque lot de milieu, qu’il soit
d’éviter toute contamination microbienne extrinsèque du acheté prêt à l’emploi ou préparé à partir d’un milieu
produit à examiner. Les précautions prises pour éviter la déshydraté ou des ingrédients décrits.
contamination ne doivent pas affecter les microorganismes
susceptibles d’être mis en évidence. Ensemencez des fractions/plaques de milieu liquide
Si le produit à examiner possède une activité antimicrobienne, aux peptones de caséine et de soja et de milieu gélosé
celle-ci est autant que possible éliminée ou neutralisée. Si aux peptones de caséine et de soja avec un petit nombre
O
des neutralisants de l’activité antimicrobienne sont utilisés à (au maximum 100 UFC) des microorganismes indiqués
cet effet, leur efficacité et leur absence de toxicité à l’égard dans le tableau 2.6.12.-1, en utilisant pour chacun une
des microorganismes considérés doivent être démontrées. fraction/plaque de milieu séparée. Ensemencez des plaques
Si des substances tensioactives sont utilisées pour la de milieu Sabouraud dextrosé-gélosé avec un petit nombre
préparation des échantillons, leur absence de toxicité à (au maximum 100 UFC) des microorganismes indiqués dans
l’égard des microorganismes considérés et leur compatibilité le tableau 2.6.12.-1, en utilisant pour chacun une plaque de
BS

avec les neutralisants utilisés doivent être démontrées. milieu séparée. Incubez dans les conditions spécifiées dans
le tableau 2.6.12.-1.
3. MÉTHODES DE DÉNOMBREMENT
Utilisez la filtration sur membrane ou le dénombrement sur Pour les milieux solides, la croissance obtenue ne doit
plaque, selon que l’une ou l’autre méthode est prescrite. pas différer de plus d’un facteur 2 de la valeur calculée
La méthode dite du nombre le plus probable (NPP), bien pour un inoculum standardisé. Pour les inoculums
que généralement moins exacte que les autres méthodes récemment préparés, la croissance des microorganismes
de dénombrement microbien, peut néanmoins être la plus doit être comparable à celle observée avec un lot de milieu
adaptée pour certains groupes de produits présentant une précédemment contrôlé et approuvé. Les milieux liquides
biocharge très faible. conviennent si l’on observe une croissance clairement visible
O

Le choix de la méthode est déterminé par des facteurs tels des microorganismes, comparable à celle obtenue sur un lot
que la nature du produit et la limite spécifiée pour le nombre de milieu précédemment contrôlé et approuvé.
de microorganismes. Quelle que soit la méthode choisie, elle 4-5. APPLICABILITÉ DE LA MÉTHODE DE
doit permettre d’effectuer l’essai sur un échantillon de taille DÉNOMBREMENT EN PRÉSENCE DU PRODUIT
suffisante pour permettre l’évaluation de la conformité aux
4-5-1. Préparation des échantillons. La méthode de
spécifications, et il convient d’établir l’applicabilité de cette
préparation des échantillons dépend des caractéristiques
méthode.
physiques du produit à examiner. Si aucune des procédures
4. FERTILITÉ DES MILIEUX ET APPLICABILITÉ DE LA décrites ci-après ne s’avère satisfaisante, il est nécessaire de
MÉTHODE DE DÉNOMBREMENT développer une autre procédure.
4-1. CONSIDÉRATIONS GÉNÉRALES Produits hydrosolubles. Dissolvez ou diluez le produit à
L’aptitude de l’essai à permettre la détection des examiner (on prépare généralement une dilution au 1/10)
microorganismes en présence du produit doit être établie. dans de la solution tampon peptonée au chlorure de sodium
L’applicabilité de la méthode d’essai doit être confirmée pH 7,0, de la solution tampon phosphate pH 7,2 ou du
chaque fois qu’un changement susceptible d’affecter le milieu liquide aux peptones de caséine et de soja. Ajustez si
résultat de l’essai est apporté au mode opératoire ou au nécessaire à pH 6-8. Les dilutions suivantes, le cas échéant,
produit. sont préparées avec le même diluant.

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4189
2.6.12. Essais de dénombrement microbien PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

Tableau 2.6.12.-1. – Préparation et emploi des microorganismes de référence


Microorganisme Préparation de la Fertilité des milieux Applicabilité de la méthode de dénombrement
souche de référence en présence du produit
Germes aérobies Moisissures et levures Germes aérobies Moisissures et levures
totaux totaux
Staphylococcus Milieu gélosé aux Milieu gélosé aux Milieu gélosé aux
aureus peptones de caséine peptones de caséine peptones de caséine et
par exemple : et de soja ou milieu et de soja et milieu de soja/NPP : milieu
liquide aux peptones liquide aux peptones liquide aux peptones
ATCC 6538 de caséine et de soja - de caséine et de soja -
de caséine et de soja
NCIMB 9518 30-35 °C ≤ 100 UFC
≤ 100 UFC
CIP 4.83 18-24 h 30-35 °C
30-35 °C
NBRC 13276 ≤ 3 jours
≤ 3 jours
Pseudomonas Milieu gélosé aux Milieu gélosé aux Milieu gélosé aux
aeruginosa peptones de caséine peptones de caséine peptones de caséine et
par exemple : et de soja ou milieu et de soja et milieu de soja/NPP : milieu
liquide aux peptones liquide aux peptones liquide aux peptones
ATCC 9027 de caséine et de soja de caséine et de soja - de caséine et de soja -
NCIMB 8626 30-35 °C ≤ 100 UFC ≤ 100 UFC

TE
CIP 82.118 18-24 h 30-35 °C 30-35 °C
NBRC 13275 ≤ 3 jours ≤ 3 jours
Bacillus subtilis Milieu gélosé aux Milieu gélosé aux Milieu gélosé aux
par exemple : peptones de caséine peptones de caséine peptones de caséine et
et de soja ou milieu et de soja et milieu de soja/NPP : milieu
ATCC 6633 liquide aux peptones liquide aux peptones liquide aux peptones
NCIMB 8054 de caséine et de soja de caséine et de soja - de caséine et de soja -
CIP 52.62 30-35 °C ≤ 100 UFC ≤ 100 UFC
NBRC 3134 18-24 h 30-35 °C 30-35 °C
LÈ ≤ 3 jours ≤ 3 jours
Candida albicans Milieu Sabouraud Milieu gélosé aux Milieu Sabouraud Milieu gélosé aux Milieu Sabouraud
par exemple : dextrosé-gélosé peptones de caséine dextrosé-gélosé peptones de caséine dextrosé-gélosé
ou milieu liquide et de soja ≤ 100 UFC et de soja ≤ 100 UFC
ATCC 10231 Sabouraud dextrosé ≤ 100 UFC 20-25 °C ≤ 100 UFC 20-25 °C
NCPF 3179 20-25 °C
30-35 °C ≤ 5 jours 30-35 °C ≤ 5 jours
IP 48.72 2-3 jours
≤ 5 jours ≤ 5 jours
NBRC 1594
NPP : non applicable
Aspergillus niger Milieu Sabouraud Milieu gélosé aux Milieu Sabouraud Milieu gélosé aux Milieu Sabouraud
par exemple : dextrosé-gélosé ou peptones de caséine dextrosé-gélosé peptones de caséine dextrosé-gélosé
milieu dextrosé-gélosé et de soja ≤ 100 UFC et de soja ≤ 100 UFC
O
ATCC 16404 à la pomme de terre ≤ 100 UFC 20-25 °C ≤ 100 UFC 20-25 °C
IMI 149007 20-25 °C 30-35 °C ≤ 5 jours 30-35 °C ≤ 5 jours
IP 1431.83 5-7 jours, ou ≤ 5 jours ≤ 5 jours
NBRC 9455 jusqu’à sporulation
satisfaisante NPP : non applicable
BS

Produits de nature non lipidique insolubles dans l’eau. Produits liquides ou solides sous forme d’aérosols.
Mettez le produit à examiner en suspension (on prépare Transférez aseptiquement le produit dans un filtre
généralement une dilution au 1/10) dans de la solution à membrane ou dans un récipient stérile, pour les
tampon peptonée au chlorure de sodium pH 7,0, de la échantillonnages suivants. Utilisez pour chacun des
solution tampon phosphate pH 7,2 ou du milieu liquide récipients à examiner soit la totalité du contenu, soit un
aux peptones de caséine et de soja. Un agent tensioactif tel nombre défini de doses (aérosols à valve doseuse).
que du polysorbate 80 à la concentration de 1 g/l peut être Dispositifs transdermiques. Retirez le film protecteur
ajouté pour faciliter la mise en suspension des substances des dispositifs transdermiques et placez ces derniers, face
difficilement mouillables. Ajustez si nécessaire à pH 6-8. adhésive vers le haut, sur des plateaux de verre ou de
Les dilutions suivantes, le cas échéant, sont préparées avec plastique stériles. Couvrez la face adhésive avec une matière
O

le même diluant. poreuse stérile, par exemple de la gaze stérile, pour éviter
que les dispositifs transdermiques ne collent les uns aux
Produits de nature lipidique. Dissolvez le produit à autres, et transférez les dispositifs dans un volume approprié
examiner dans du myristate d’isopropyle stérilisé par du diluant choisi contenant des inactivateurs tels que du
filtration, ou mélangez-le avec la quantité minimum requise polysorbate 80 et/ou de la lécithine. Agitez énergiquement
de polysorbate 80 stérile ou d’un autre agent tensioactif non pendant au moins 30 min.
inhibiteur stérile, chauffé si nécessaire à une température
ne dépassant pas 40 °C ou dans certains cas exceptionnels 4-5-2. Inoculation et dilution. Ajoutez à l’échantillon
45 °C. Mélangez soigneusement et maintenez si nécessaire à préparé comme décrit ci-dessus (4-5-1) et à un témoin (ne
la température voulue, dans un bain-marie. Ajoutez le diluant contenant pas le produit à examiner) un volume de la
choisi, préalablement chauffé, en quantité requise pour suspension microbienne suffisant pour obtenir un inoculum
obtenir une dilution au 1/10 du produit initial. Mélangez d’au maximum 100 UFC. Le volume de suspension utilisé ne
soigneusement tout en maintenant à la même température doit pas dépasser 1 pour cent du volume du produit dilué.
pendant le temps minimum nécessaire à la formation d’une Pour démontrer que le recouvrement microbien est
émulsion. Les dilutions au 1/10 suivantes peuvent être acceptable, il faut effectuer l’essai sur l’échantillon préparé
préparées avec le diluant choisi additionné d’une quantité avec le plus bas facteur de dilution possible. Si l’activité
appropriée de polysorbate 80 stérile ou d’un autre agent antimicrobienne ou la faible solubilité du produit l’interdit,
tensioactif non inhibiteur stérile. un protocole spécifique doit être développé. S’il est

4190 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 2.6.12. Essais de dénombrement microbien

impossible d’éviter autrement une inhibition de la croissance Introduisez dans le filtre à membrane une quantité
par l’échantillon, on peut procéder à une neutralisation, appropriée de l’échantillon préparé comme décrit sous
dilution ou filtration avant addition de la suspension 4-5-1 à 4-5-3 (de préférence l’équivalent de 1 g de produit,
microbienne. ou moins si le nombre présumé d’UFC est élevé), filtrez
4-5-3. Neutralisation/élimination de l’activité immédiatement et rincez le filtre avec un volume approprié
antimicrobienne. Comparez le recouvrement microbien de diluant.
respectivement obtenu à partir de l’échantillon préparé, Pour le dénombrement des germes aérobies totaux
dilué comme décrit en 4-5-2 et incubé selon la procédure (DGAT), transférez la membrane sur du milieu gélosé aux
décrite en 4-5-4, et de la préparation témoin. peptones de caséine et de soja. Pour le dénombrement des
En cas d’inhibition de la croissance (réduction de plus d’un moisissures/levures totales (DMLT), transférez la membrane
facteur 2), apportez à la procédure suivie pour l’essai de sur du milieu Sabouraud dextrosé-gélosé. Incubez les boîtes
dénombrement concerné les modifications nécessaires pour comme indiqué dans le tableau 2.6.12.-1. Procédez au
garantir la validité des résultats. Ces modifications peuvent dénombrement.
par exemple consister en (1) une augmentation du volume 4-5-4-2. Dénombrement sur plaques. Effectuez le
du diluant ou du milieu de culture, (2) l’incorporation au dénombrement sur plaque au moins 2 fois pour chaque
diluant d’agents neutralisants spécifiques ou généraux, milieu et utilisez la moyenne des 2 résultats.
(3) une filtration sur membrane ou (4) une combinaison des

TE
modifications précitées. 4-5-4-2-1. Ensemencement en profondeur
Agents neutralisants. Des agents peuvent être utilisés Pour des boîtes de Pétri de 9 cm de diamètre, introduisez
pour neutraliser l’activité de substances antimicrobiennes dans la boîte 1 ml de l’échantillon préparé comme décrit sous
interférentes (tableau 2.6.12.-2). Ils peuvent être ajoutés 4-5-1 à 4-5-3, puis 15-20 ml de milieu gélosé aux peptones de
au diluant choisi ou au milieu, de préférence avant la caséine et de soja ou de milieu Sabouraud dextrosé-gélosé,
stérilisation. L’efficacité de tout neutralisant utilisé et son à une température ne dépassant pas 45 °C. Si les boîtes de
absence de toxicité à l’égard des microorganismes doivent Pétri utilisées sont plus grandes, augmentez en conséquence
être démontrées au moyen d’un blanc comportant le le volume de milieu gélosé. Utilisez au minimum 2 boîtes
neutralisant mais non le produit. LÈ de Pétri pour chacun des microorganismes cités dans le
tableau 2.6.12.-1. Incubez les boîtes comme indiqué dans
Tableau 2.6.12.-2. – Agents usuels de neutralisation des le tableau 2.6.12.-1. Prenez la moyenne arithmétique des
substances interférentes dénombrements par milieu et calculez le nombre d’UFC dans
Substance interférente Méthode de neutralisation l’inoculum initial.
possible
4-5-4-2-2. Etalement en surface
Glutaraldéhyde, mercuriels Hydrogénosulfite de sodium
(bisulfite de sodium) Pour des boîtes de Pétri de 9 cm de diamètre, introduisez
Phénoliques, alcool, aldéhydes, sorbate Dilution dans la boîte 15-20 ml de milieu gélosé aux peptones de
Aldéhydes Glycine caséine et de soja ou de milieu Sabouraud dextrosé-gélosé, à
O
une température d’environ 45 °C, puis laissez solidifier. Si
Ammoniums quaternaires (QAC), Lécithine les boîtes de Pétri utilisées sont plus grandes, augmentez
parahydroxybenzoates (parabènes),
bis-biguanides en conséquence le volume de milieu gélosé. Faites sécher
QAC, iode, parabènes Polysorbate les boîtes, par exemple dans une hotte à flux laminaire ou
un incubateur. Utilisez au minimum 2 boîtes de Pétri pour
Mercuriels Thioglycolate chacun des microorganismes cités dans le tableau 2.6.12.-1.
BS

Mercuriels, halogènes, aldéhydes Thiosulfate Etalez à la surface du milieu un volume mesuré, d’au moins
0,1 ml, de l’échantillon préparé comme décrit sous 4-5-1 à
EDTA (édétate) Ions Mg2+ ou Ca2+ 4-5-3. Procédez à l’incubation et au dénombrement comme
indiqué sous 4-5-4-2-1.
Si aucune méthode de neutralisation appropriée ne peut
être identifiée, on peut présumer que l’impossibilité 4-5-4-3. Méthode du nombre le plus probable (NPP). La
d’isoler le microorganisme inoculé est imputable à l’activité méthode du NPP présente une fidélité et une exactitude
microbicide du produit. Cette information tend à indiquer inférieures à celles de la filtration sur membrane ou du
que le produit n’est pas susceptible d’être contaminé par dénombrement sur plaques. Elle donne notamment des
l’espèce considérée du microorganisme. Il est cependant résultats peu fiables pour le dénombrement des moisissures.
O

possible que le produit inhibe certains des microorganismes Elle est donc à réserver aux DGAT pour lesquels le recours
spécifiés ici, mais n’en inhibe pas d’autres qui ne figurent aux autres méthodes est impossible. Si l’emploi de cette
pas parmi les souches de référence ou dont ces dernières ne méthode est justifié, procédez comme suit.
sont pas représentatives. Il convient donc d’effectuer l’essai Préparez au moins 3 dilutions en série au 1/10 du produit
au plus haut facteur de dilution qui soit compatible avec une comme décrit sous 4-5-1 à 4-5-3. Prélevez 3 fois 1 g ou
croissance microbienne et le critère d’acceptation spécifique. 1 ml à chaque niveau de dilution et transférez dans 3 tubes
4-5-4. Recouvrement de microorganismes en présence contenant chacun 9-10 ml de milieu liquide aux peptones
du produit. Effectuez des essais séparés pour chacun de caséine et de soja, si nécessaire additionné d’un agent
de microorganismes cités. Seuls sont dénombrés les tensioactif tel que le polysorbate 80 ou d’un neutralisant de
microorganismes de la souche d’ensemencement. l’activité antimicrobienne. Pour une série de 3 dilutions, il
faut par conséquent ensemencer 9 tubes.
4-5-4-1. Filtration sur membrane. Utilisez des membranes
filtrantes ayant une porosité nominale d’au maximum Incubez tous les tubes à 30-35 °C pendant au maximum
0,45 μm. Le matériau constituant les membranes est choisi 3 jours. Si la nature du produit à examiner rend la lecture
de telle sorte que l’efficacité de rétention bactérienne ne des résultats difficile ou incertaine, effectuez une subculture
soit pas affectée par les constituants de l’échantillon à dans le même milieu liquide ou sur du milieu gélosé
examiner. Une membrane filtrante est utilisée pour chacun aux peptones de caséine et de soja, incubez à la même
des microorganismes cités. température pendant 1-2 jours et utilisez les résultats

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4191
2.6.12. Essais de dénombrement microbien PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

ainsi obtenus. Déterminez le nombre le plus probable de 4-6. RÉSULTATS ET INTERPRÉTATION


microorganismes par gramme ou millilitre de produit à Lors de la vérification de l’applicabilité de la méthode de
examiner à l’aide du tableau 2.6.12.-3. filtration sur membrane ou de dénombrement sur plaques,
le nombre moyen obtenu pour chacun des microorganismes
Tableau 2.6.12.-3. – Valeurs du nombre le plus de référence ne doit pas différer de plus d’un facteur 2 de
probable (NPP) de microorganismes la valeur obtenue en l’absence du produit pour le témoin
Combinaisons observées du nombre défini en 4-5-2. Lors de la vérification de l’applicabilité de la
de tubes présentant une croissance méthode NPP, la valeur calculée à partir de l’inoculum doit
dans chaque série NPP par Limites de
gramme ou confiance se situer dans les limites de confiance à 95 pour cent des
Nombre de grammes ou millilitres millilitre de à 95 pour résultats obtenus avec le témoin.
de produit par tube produit cent
Si ces critères sont impossibles à satisfaire pour un ou
0,1 0,01 0,001 plusieurs des microorganismes soumis à l’essai par l’une
0 0 0 <3 0-9,4 des méthodes décrites, il y a lieu d’utiliser pour examiner le
produit la méthode et les conditions d’essai qui permettent
0 0 1 3 0,1-9,5
de s’en approcher le plus.
0 1 0 3 0,1-10
5. CONTRÔLE DES PRODUITS
0 1 1 6,1 1,2-17

TE
5-1. PRISE D’ESSAI
0 2 0 6,2 1,2-17 Sauf indication contraire, utilisez 10 g ou 10 ml du produit
0 3 0 9,4 3,5-35 à examiner, prélevés avec les précautions mentionnées
plus haut. Pour les liquides ou solides en aérosols,
1 0 0 3,6 0,2-17
effectuez l’échantillonnage sur 10 récipients. Pour les
1 0 1 7,2 1,2-17 dispositifs transdermiques, effectuez l’échantillonnage sur
1 0 2 11 4-35
10 dispositifs.
La prise d’essai peut être réduite pour les substances actives
1 1 0 7,4 1,3-20
LÈ qui seront formulées dans les conditions suivantes : quantité
1 1 1 11 4-35 par unité (par exemple comprimé, capsule, préparation
1 2 0 11 4-35
injectable) inférieure ou égale à 1 mg, ou quantité par
gramme ou millilitre (pour les préparations non présentées
1 2 1 15 5-38 par unités) inférieure à 1 mg. Dans ces cas, la prise d’essai
1 3 0 16 5-38 sera au moins égale à la quantité contenue dans 10 unités
ou dans 10 g ou 10 ml de produit.
2 0 0 9,2 1,5-35
Dans le cas de produits utilisés comme substances actives et
2 0 1 14 4-35 pour lesquels la quantité d’échantillon est limitée ou la taille
2 0 2 20 5-38
de lot extrêmement petite (moins de 1000 ml ou 1000 g), la
O
prise d’essai devra représenter 1 pour cent du lot, à moins
2 1 0 15 4-38 que l’emploi d’une quantité moindre ne soit prescrite ou
2 1 1 20 5-38 justifiée et autorisée.
2 1 2 27 9-94
Dans le cas de produits pour lesquels le nombre total
d’entités constituant un lot est inférieur à 200 (par exemple
2 2 0 21 5-40 échantillons utilisés dans des essais cliniques), la taille de
BS

2 2 1 28 9-94 l’échantillon peut être réduite à 2 unités, ou à 1 unité si la


taille du lot est inférieure à 100.
2 2 2 35 9-94
Effectuez les prélèvements au hasard dans le produit en
2 3 0 29 9-94 vrac ou les récipients dans lesquels est conditionnée la
2 3 1 36 9-94 préparation. Pour obtenir la quantité requise, mélangez le
contenu d’un nombre de récipients suffisant pour former
3 0 0 23 5-94 l’échantillon.
3 0 1 38 9-104 5-2. EXAMEN DU PRODUIT
3 0 2 64 16-181 5-2-1. Filtration sur membrane. Utilisez un appareil de
O

3 1 0 43 9-181
filtration permettant le transfert de la membrane sur le
milieu. Préparez l’échantillon par une méthode dont
3 1 1 75 17-199 l’applicabilité a été établie comme décrit dans la section 4,
3 1 2 120 30-360 et introduisez la quantité appropriée d’échantillon dans
2 filtres à membrane. Filtrez immédiatement. Lavez chaque
3 1 3 160 30-380 filtre selon la procédure préalablement établie.
3 2 0 93 18-360 Transférez l’une des membranes sur du milieu gélosé aux
3 2 1 150 30-380 peptones de caséine et de soja, pour le DGAT, et l’autre
membrane sur du milieu Sabouraud dextrosé-gélosé, pour
3 2 2 210 30-400 le DMLT. Incubez la boîte de milieu gélosé aux peptones de
3 2 3 290 90-990 caséine et de soja à 30-35 °C pendant 3-5 jours, et la boîte
de milieu Sabouraud dextrosé-gélosé à 20-25 °C pendant
3 3 0 240 40-990
5-7 jours. Calculez le nombre d’UFC par gramme ou par
3 3 1 460 90-1980 millilitre de produit.
3 3 2 1100 200-4000 Pour l’examen de dispositifs transdermiques, filtrez
séparément 10 pour cent du volume de la préparation décrite
3 3 3 > 1100 sous 4-5-1 sur 2 membranes stériles. Transférez l’une des

4192 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 2.6.13. Recherche de microorganismes spécifiés

membranes sur du milieu gélosé aux peptones de caséine et 01/2009:20613


de soja, pour le DGAT, et l’autre sur du milieu Sabouraud
dextrosé-gélosé, pour le DMLT.
2.6.13. CONTRÔLE
5-2-2. Dénombrement sur plaques
MICROBIOLOGIQUE DES PRODUITS
5-2-2-1. Ensemencement en profondeur NON STÉRILES : RECHERCHE DE
Préparez l’échantillon par une méthode dont l’applicabilité MICROORGANISMES SPÉCIFIÉS
a été établie comme décrit dans la section 4. Préparez au
moins 2 boîtes de Pétri par milieu et par niveau de dilution.
Incubez les boîtes de milieu gélosé aux peptones de caséine 1. INTRODUCTION
et de soja à 30-35 °C pendant 3-5 jours et les boîtes de milieu
Sabouraud dextrosé-gélosé à 20-25 °C pendant 5-7 jours. Les essais décrits ci-après permettent de contrôler l’absence,
Sélectionnez les boîtes correspondant à une dilution donnée ou la présence limitée, de microorganismes spécifiés pouvant
et présentant le plus grand nombre de colonies inférieur être décelés dans les conditions décrites.
à 250 pour le DGAT et à 50 pour le DMLT. Prenez la moyenne Ces essais sont en premier lieu destinés à déterminer si
arithmétique par milieu des dénombrements et calculez le une substance ou préparation satisfait à une spécification
nombre d’UFC par gramme ou par millilitre de produit. préétablie en matière de qualité microbiologique. Il convient

TE
dans ce cas de se conformer aux indications données ci-après,
5-2-2-2. Etalement en surface notamment en ce qui concerne le nombre d’échantillons à
Préparez l’échantillon par une méthode dont l’applicabilité prélever et l’interprétation des résultats.
a été établie comme décrit dans la section 4. Préparez au D’autres méthodes microbiologiques, notamment des
moins 2 boîtes de Pétri par milieu et par niveau de dilution. méthodes automatisées, peuvent être utilisées à condition
Pour l’incubation et le calcul du nombre d’UFC, procédez que leur équivalence avec la méthode de la pharmacopée
comme décrit pour l’ensemencement en profondeur. ait été démontrée.
5-2-3. Méthode du nombre le plus probable 2. PRÉCAUTIONS GÉNÉRALES

Préparez et diluez l’échantillon par une méthode dont
l’applicabilité a été établie comme décrit dans la section 4.
Incubez tous les tubes à 30-35 °C pendant 3-5 jours.
Effectuez si nécessaire une subculture, selon la procédure
préalablement établie. Pour chaque niveau de dilution, notez
Préparez les échantillons comme décrit dans le chapitre
2.6.12.
Si le produit à examiner possède une activité antimicrobienne,
celle-ci est autant que possible éliminée ou neutralisée
le nombre de tubes présentant une croissance microbienne. comme décrit dans le chapitre 2.6.12.
Déterminez le nombre le plus probable de microorganismes Si des substances tensioactives sont utilisées pour la
par gramme ou millilitre de produit à examiner à l’aide du préparation des échantillons, leur absence de toxicité à
tableau 2.6.12.-3. l’égard des microorganismes considérés et leur compatibilité
avec les neutralisants utilisés doivent être démontrées
O
5-3. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS
comme décrit dans le chapitre 2.6.12.
Le nombre de germes aérobies totaux (DGAT) est considéré
comme égal au nombre d’UFC obtenues avec le milieu 3. FERTILITÉ ET PROPRIÉTÉS INHIBITRICES DES
gélosé aux peptones de caséine et de soja ; si des colonies MILIEUX, APPLICABILITÉ DE LA MÉTHODE D’ESSAI
de moisissures ou levures sont détectées sur ce milieu,
elles sont comptabilisées dans le DGAT. Le nombre total L’aptitude de l’essai à permettre la détection des
BS

de moisissures et levures (DMLT) est considéré comme microorganismes en présence du produit à examiner doit
égal au nombre d’UFC obtenues avec le milieu Sabouraud être établie. L’applicabilité de la méthode d’essai doit
dextrosé-gélosé ; si des colonies de bactéries sont détectées être confirmée chaque fois qu’un changement susceptible
sur ce milieu, elles sont comptabilisées dans le DMLT. Si d’affecter le résultat de l’essai est apporté au mode opératoire
l’on prévoit que le DMLT risque de dépasser le critère ou au produit.
d’acceptation du fait de la croissance bactérienne, du milieu 3-1. PRÉPARATION DES SOUCHES DE RÉFÉRENCE
Sabouraud dextrosé-gélosé contenant des antibiotiques peut Utilisez des suspensions standardisées stables des souches
être utilisé. Si le dénombrement est effectué par la méthode de référence ou préparez des suspensions comme indiqué
du NPP, la valeur calculée est le DGAT. ci-après. Les cultures sont effectuées selon un système de lot
de semence tel que les microorganismes viables utilisés pour
O

Lorsqu’un critère d’acceptation est prescrit en matière de


l’inoculation n’aient pas subi plus de 5 passages à partir du
qualité microbiologique, il est interprété comme suit :
lot de semence primaire d’origine.
— 101 UFC : nombre maximal acceptable = 20 ; 3-1-1. Microorganismes aérobies. Cultivez séparément
— 102 UFC : nombre maximal acceptable = 200 ; chacune des souches bactériennes de référence dans du
milieu liquide aux peptones de caséine et de soja ou sur du
— 103 UFC : nombre maximal acceptable = 2000, et ainsi milieu gélosé aux peptones de caséine et de soja, à 30-35 °C
de suite. pendant 18-24 h, et la souche de référence de Candida
Les solutions et milieux recommandés sont décrits dans le albicans sur du milieu Sabouraud dextrosé-gélosé ou dans
chapitre général 2.6.13 . du milieu liquide Sabouraud dextrosé, à 20-25 °C pendant
2-3 jours.
— Staphylococcus aureus : par exemple ATCC 6538,
NCIMB 9518, CIP 4.83, NBRC 13276 ;
— Pseudomonas aeruginosa : par exemple ATCC 9027,
NCIMB 8626, CIP 82.118, NBRC 13275 ;
— Escherichia coli : par exemple ATCC 8739, NCIMB 8545,
CIP 53.126, NBRC 3972 ;

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4193
2.6.13. Recherche de microorganismes spécifiés PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

— Salmonella enterica ssp. enterica sérotype typhimurium : Contrôle de la fertilité, milieux liquides : ensemencez un
par exemple ATCC 14028 ; ou Salmonella enterica ssp. échantillon du milieu approprié avec une petite quantité (au
enterica sérotype abony : par exemple NBRC 100797, maximum 100 UFC) du microorganisme approprié. Incubez
NCTC 6017, CIP 80.39 ; à la température spécifiée pendant une durée inférieure
ou égale à la durée minimale spécifiée pour l’essai. Une
— Candida albicans : par exemple ATCC 10231, NCPF 3179, croissance clairement visible du microorganisme, comparable
IP 48.72, NBRC 1594. à celle obtenue sur un lot de milieu précédemment contrôlé
Utilisez de la solution tampon peptonée au chlorure et approuvé, est observée.
de sodium pH 7,0 ou de la solution tampon phosphate Contrôle de la fertilité, milieux solides : opérez par la
pH 7,2 pour préparer des suspensions témoins. Utilisez méthode d’ensemencement en surface, en ensemençant
les suspensions dans les 2 h ou dans les 24 h si elles sont chaque plaque avec une petite quantité (au maximum
conservées à 2-8 °C. 100 UFC) du microorganisme approprié. Incubez à la
température spécifiée pendant une durée inférieure ou égale
3-1-2. Clostridies. Utilisez une souche de Clostridium à la durée minimale spécifiée pour l’essai. Une croissance du
sporogenes, par exemple ATCC 11437 (NBRC 14293, microorganisme comparable à celle obtenue sur un lot de
NCIMB 12343, CIP 100651) ou ATCC 19404 (NCTC 532 ou milieu précédemment contrôlé et approuvé est observée.
CIP 79.03). Cultivez la souche clostridienne de référence
dans des conditions anaérobies dans du milieu renforcé pour Contrôle des propriétés inhibitrices, milieux liquides

TE
clostridies à 30-35 °C pendant 24-48 h. On peut également, ou solides : ensemencez le milieu approprié avec au
plutôt que de préparer puis diluer une suspension fraîche moins 100 UFC du microorganisme approprié. Incubez
de cellules végétatives de Cl. sporogenes, utiliser pour à la température spécifiée pendant une durée égale ou
l’inoculation une suspension de spores stable. Cette supérieure à la durée maximale spécifiée pour l’essai.
suspension peut être maintenue à 2-8 °C pendant une durée Aucune croissance du microorganisme n’est observée.
validée. Contrôle des propriétés indicatives : opérez par la méthode
d’ensemencement en surface, en ensemençant chaque
3-2. TÉMOIN NÉGATIF plaque avec une petite quantité (au maximum 100 UFC)
Pour vérifier les conditions opératoires, effectuez un contrôle du microorganisme approprié. Incubez à la température
sur un témoin négatif préparé en substituant le diluant choisi
LÈ spécifiée pendant une durée comprise dans l’intervalle
à la préparation à examiner. Aucune croissance microbienne spécifié pour l’essai. Les colonies sont comparables, quant
n’est observée. à leur aspect et aux réactions indicatives observées, à celles
3-3. FERTILITÉ ET PROPRIÉTÉS INHIBITRICES DES obtenues sur un lot de milieu précédemment contrôlé et
MILIEUX approuvé.
Effectuez ce contrôle sur chaque lot de milieu, qu’il soit 3-4. APPLICABILITÉ DE LA MÉTHODE D’ESSAI
acheté prêt à l’emploi ou préparé à partir d’un milieu Pour chaque produit à examiner, procédez à la préparation
déshydraté ou des ingrédients décrits. de l’échantillon comme décrit dans le paragraphe approprié
Vérifiez que les milieux concernés présentent les propriétés de la section 4. Ajoutez chaque souche de référence au
O
voulues (voir tableau 2.6.13.-1). moment du mélange, dans le milieu prescrit. Effectuez
Tableau 2.6.13.-1 – Fertilité, propriétés inhibitrices et propriétés indicatives des milieux
Milieu Propriétés Microorganisme de référence
Recherche des bactéries Milieu d’enrichissement pour les Fertilité E. coli
gram-négatives résistantes aux entérobactéries Mossel
BS

P. aeruginosa
sels biliaires Inhibition S. aureus
Milieu gélosé à la bile-violet-rouge Fertilité + indication E. coli
avec glucose P. aeruginosa
Recherche d’Escherichia coli Milieu liquide de MacConkey Fertilité E. coli
Inhibition S. aureus
Milieu gélosé de MacConkey Fertilité + indication E. coli
Recherche des salmonelles Milieu liquide d’enrichissement pour Fertilité Salmonella enterica ssp. enterica
les salmonelles Rappaport-Vassiliadis sérotype typhimurium ou Salmonella
O

enterica ssp. enterica sérotype abony


Inhibition S. aureus
Milieu gélosé xylose-lysine- Fertilité + indication Salmonella enterica ssp. enterica
désoxycholate sérotype typhimurium ou Salmonella
enterica ssp. enterica sérotype abony
Indication E. coli
Recherche de Pseudomonas Milieu gélosé-cétrimide Fertilité P. aeruginosa
aeruginosa
Inhibition E. coli
Recherche de Staphylococcus aureus Milieu gélosé mannitol-sel Fertilité + indication S. aureus
Inhibition E. coli
Recherche des clostridies Milieu renforcé pour clostridies Fertilité Cl. sporogenes
Gélose Columbia Fertilité Cl. sporogenes
Recherche de Candida albicans Milieu liquide Sabouraud dextrosé Fertilité C. albicans
Milieu Sabouraud dextrosé-gélosé Fertilité + indication C. albicans

4194 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 2.6.13. Recherche de microorganismes spécifiés

l’essai individuellement avec chaque souche de référence. 4-2. ESCHERICHIA COLI


Utilisez un nombre de microorganismes équivalant, au 4-2-1. Préparation de l’échantillon et pré-incubation.
maximum, à 100 UFC dans la préparation à examiner après Préparez un échantillon comme décrit dans le chapitre
ensemencement. 2.6.12, en utilisant une dilution au 1/10 d’au moins 1 g du
Effectuez l’essai comme décrit dans le paragraphe approprié produit à examiner, et ensemencez une quantité appropriée
de la section 4, en incubant pendant la durée minimale (déterminée comme décrit sous 3-4) de milieu liquide aux
prescrite. peptones de caséine et de soja avec 10 ml d’échantillon ou la
Les réactions indicatives décrites dans la section 4 doivent quantité correspondant à 1 g ou 1 ml de produit. Mélangez,
montrer la présence des microorganismes spécifiés. puis incubez à 30-35 °C pendant 18-24 h.
Si le produit présente une activité antimicrobienne, il faut 4-2-2. Sélection et subculture. Agitez le récipient, puis
apporter les modifications voulues à la procédure d’essai transférez 1 ml du milieu liquide aux peptones de caséine
(voir chapitre 2.6.12, paragraphe 4-5-3). et de soja dans 100 ml de milieu liquide de MacConkey et
S’il s’avère impossible de neutraliser l’activité incubez à 42-44 °C pendant 24-48 h. Repiquez sur du milieu
antimicrobienne exercée par un produit donné sur gélosé de MacConkey et incubez à 30-35 °C pendant 18-72 h.
un microorganisme dont la recherche est prescrite, ce
microorganisme sera présumé ne plus être présent dans le 4-2-3. Interprétation. La croissance de colonies indique
produit. la présence possible d’E. coli, à confirmer par des essais

TE
d’identification.
4. CONTRÔLE DES PRODUITS Le produit satisfait à l’essai si l’on n’observe la présence
4-1. BACTÉRIES GRAM-NÉGATIVES RÉSISTANTES AUX d’aucune colonie ou si les essais de confirmation de
SELS BILIAIRES l’identification sont négatifs.
4-1-1. Préparation de l’échantillon et pré-incubation. 4-3. SALMONELLES
Préparez un échantillon comme décrit dans le chapitre
2.6.12, en utilisant une dilution au 1/10 d’au moins 1 g du 4-3-1. Préparation de l’échantillon et pré-incubation.
produit à examiner, mais avec comme diluant du milieu Préparez le produit à examiner comme décrit dans le
liquide aux peptones de caséine et de soja. Mélangez, LÈ chapitre 2.6.12 et ensemencez une quantité appropriée
puis incubez à 20-25 °C pendant un temps suffisant pour (déterminée comme décrit sous 3-4) de milieu liquide
assurer la revivification des bactéries, mais insuffisant pour aux peptones de caséine et de soja avec une quantité
permettre leur multiplication (généralement 2 h mais pas d’échantillon correspondant à au moins 10 g ou 10 ml de
plus de 5 h). produit. Mélangez, puis incubez à 30-35 °C pendant 18-24 h.
4-1-2. Absence de ces bactéries. Sauf indication contraire, 4-3-2. Sélection et subculture. Transférez 0,1 ml du milieu
utilisez le volume d’inoculum correspondant à 1 g du liquide aux peptones de caséine et de soja dans 10 ml
produit, préparé comme décrit sous 4-1-1, pour ensemencer de milieu liquide d’enrichissement pour les salmonelles
du milieu d’enrichissement pour les entérobactéries-Mossel. Rappaport-Vassiliadis et incubez à 30-35 °C pendant 18-24 h.
Repiquez sur du milieu gélosé xylose-lysine-désoxycholate et
O
Incubez à 30-35 °C pendant 24-48 h. Repiquez sur du milieu
gélosé à la bile-violet-rouge avec glucose et incubez 30-35 °C incubez à 30-35 °C pendant 18-48 h.
pendant 18-24 h. 4-3-3. Interprétation. La croissance de colonies rouges
Le produit satisfait à l’essai s’il n’est pas observé de bien développées, avec ou sans centre noir, indique la
croissance de colonies. présence possible de salmonelles, à confirmer par des essais
d’identification.
4-1-3. Essai quantitatif
BS

4-1-3-1. Sélection et subculture. Ensemencez des Le produit satisfait à l’essai si l’on n’observe la présence
quantités appropriées de milieu d’enrichissement pour les d’aucune colonie du type décrit ou si les essais de
entérobactéries-Mossel avec la préparation décrite sous confirmation de l’identification sont négatifs.
4-1-1 et/ou des dilutions de cette préparation contenant 4-4. PSEUDOMONAS AERUGINOSA
respectivement 0,1 g, 0,01 g et 0,001 g (ou 0,1 ml, 0,01 ml
et 0,001 ml) du produit à examiner. Incubez à 30-35 °C 4-4-1. Préparation de l’échantillon et pré-incubation.
pendant 24-48 h. Repiquez chacune des cultures sur du Préparez un échantillon comme décrit dans le chapitre 2.6.12,
milieu gélosé à la bile-violet-rouge avec glucose. Incubez à en utilisant une dilution au 1/10 d’au moins 1 g du produit
30-35 °C pendant 18-24 h. à examiner, et ensemencez une quantité appropriée
(déterminée comme décrit sous 3-4) de milieu liquide aux
O

4-1-3-2. Interprétation. La croissance de colonies constitue peptones de caséine et de soja avec 10 ml d’échantillon
un résultat positif. Notez la plus petite quantité de produit ou la quantité correspondant à 1 g ou 1 ml de produit.
qui donne un résultat positif et la plus grande quantité de Mélangez. Pour les dispositifs transdermiques, filtrez sur
produit qui donne un résultat négatif. Déterminez le nombre une membrane stérile le volume d’échantillon correspondant
probable de bactéries à l’aide du tableau 2.6.13.-2. à 1 dispositif, préparé comme décrit dans le paragraphe 4-5-1
Tableau 2.6.13.-2 – Interprétation des résultats du chapitre 2.6.12, puis transférez la membrane dans 100 ml
de milieu liquide aux peptones de caséine et de soja. Incubez
Résultats obtenus avec une quantité de produit de Nombre
probable de à 30-35 °C pendant 18-24 h.
0,1 g ou 0,01 g ou 0,001 g ou bactéries par 4-4-2. Sélection et subculture. Repiquez sur du milieu
0,1 ml 0,01 ml 0,001 ml gramme ou
millilitre de gélosé-cétrimide et incubez à 30-35 °C pendant 18-72 h.
produit 4-4-3. Interprétation. La croissance de colonies indique la
+ + + > 103 présence possible de P. aeruginosa, à confirmer par des
+ + − < 103 et > 102 essais d’identification.
+ − − < 102 et > 10 Le produit satisfait à l’essai si l’on n’observe la présence
− − − d’aucune colonie ou si les essais de confirmation de
< 10
l’identification sont négatifs.

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4195
2.6.13. Recherche de microorganismes spécifiés PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

4-5. STAPHYLOCOCCUS AUREUS 5. SOLUTIONS ET MILIEUX DE CULTURE


RECOMMANDÉS
4-5-1. Préparation de l’échantillon et pré-incubation.
Préparez un échantillon comme décrit dans le chapitre Les solutions et milieux de culture suivants se sont avérés
2.6.12, en utilisant une dilution au 1/10 d’au moins 1 g du satisfaisants pour la réalisation des essais de contamination
produit à examiner, et ensemencez une quantité appropriée microbienne prescrits dans la Pharmacopée. D’autres
(déterminée comme décrit sous 3-4) de milieu liquide aux milieux peuvent être utilisés s’ils possèdent des propriétés
peptones de caséine et de soja avec 10 ml d’échantillon de fertilité et d’inhibition de croissance équivalentes.
ou la quantité correspondant à 1 g ou 1 ml de produit. Solution tampon mère. Transférez 34 g de phosphate
Mélangez. Pour les dispositifs transdermiques, filtrez sur monopotassique dans une fiole jaugée de 1000 ml, dissolvez
une membrane stérile le volume d’échantillon correspondant dans 500 ml d’eau purifiée, ajustez à pH 7,2 ± 0,2 avec de
à 1 dispositif, préparé comme décrit dans le paragraphe 4-5-1 l’hydroxyde de sodium, complétez à 1000.0 ml avec de l’eau
du chapitre 2.6.12, puis transférez la membrane dans 100 ml purifiée et mélangez. Répartissez en récipients et stérilisez.
de milieu liquide aux peptones de caséine et de soja. Incubez Conservez à une température de 2-8 °C.
à 30-35 °C pendant 18-24 h. Solution tampon phosphate pH 7,2. Préparez un mélange
4-5-2. Sélection et subculture. Repiquez sur du milieu de solution tampon mère et d’eau purifiée (1:800 V/V) et
gélosé mannitol-sel et incubez à 30-35 °C pendant 18-72 h. stérilisez.
Solution tampon peptonée au chlorure de sodium pH 7,0

TE
4-5-3. Interprétation. La croissance de colonies
jaunes/blanches entourées d’une zone jaune indique la Phosphate monopotassique 3,6 g
présence possible de S. aureus, à confirmer par des essais Phosphate disodique dihydraté 7,2 g équivalant à 0,067 M de
d’identification. phosphate
Chlorure de sodium 4,3 g
Le produit satisfait à l’essai si l’on n’observe la présence
Peptone de viande ou de caséine 1,0 g
d’aucune colonie du type décrit ou si les essais de
confirmation de l’identification sont négatifs. Eau purifiée 1000 ml
4-6. CLOSTRIDIES LÈ Stérilisez à l’autoclave selon un cycle validé.
4-6-1. Préparation de l’échantillon et traitement à la Milieu liquide aux peptones de caséine et de soja
chaleur. Préparez le produit à examiner comme décrit Peptone pancréatique de caséine 17,0 g
dans le chapitre 2.6.12. Prélevez 2 fractions égales de
l’échantillon correspondant chacune à au moins 1 g ou 1 ml Peptone papaïque de soja 3,0 g
de produit. Chauffez l’une d’elles à 80 °C pendant 10 min, Chlorure de sodium 5,0 g
puis refroidissez rapidement. Ne chauffez pas l’autre.
Phosphate dipotassique 2,5 g
4-6-2. Sélection et subculture. Transférez 10 ml de 2,5 g
Glucose monohydraté
chacune des fractions homogénéisées dans 2 récipients
O
de 38 mm × 200 mm, ou d’autres récipients appropriés, Eau purifiée 1000 ml
contenant 100 ml de milieu renforcé pour clostridies.
Incubez en anaérobiose à 30-35 °C pendant 48 h. Après Ajustez le pH pour qu’il soit de 7,3 ± 0,2 à 25 °C après
incubation, effectuez à partir de chaque récipient un stérilisation. Stérilisez à l’autoclave selon un cycle validé.
repiquage sur de la gélose Columbia, puis incubez en Milieu gélosé aux peptones de caséine et de soja
anaérobiose à 30-35 °C pendant 48 h. Peptone pancréatique de caséine 15,0 g
BS

4-6-3. Interprétation. La croissance anaérobie de bâtonnets Peptone papaïque de soja 5,0 g


(avec ou sans endospores) donnant une réaction catalase Chlorure de sodium 5,0 g
négative indique la présence de clostridies.
Gélose 15,0 g
Le produit satisfait à l’essai si l’on n’observe aucune
Eau purifiée 1000 ml
croissance microbienne anaérobie sur la gélose Columbia ou
si le test catalase est positif. Ajustez le pH pour qu’il soit de 7,3 ± 0,2 à 25 °C après
4-7. CANDIDA ALBICANS stérilisation. Stérilisez à l’autoclave selon un cycle validé.
Milieu Sabouraud dextrosé-gélosé
4-7-1. Préparation de l’échantillon et pré-incubation.
O

Préparez le produit à examiner comme décrit dans le Dextrose 40,0 g


chapitre 2.6.12 et ensemencez 100 ml de milieu liquide Mélange de peptone peptique de tissu animal et de 10,0 g
Sabouraud dextrosé avec 10 ml d’échantillon ou la quantité peptone pancréatique de caséine (1:1)
correspondant à 1 g ou 1 ml de produit. Mélangez, puis Gélose 15,0 g
incubez à 30-35 °C pendant 3-5 jours. Eau purifiée 1000 ml
4-7-2. Sélection et subculture. Repiquez sur du milieu
Sabouraud dextrosé-gélosé et incubez à 30-35 °C pendant Ajustez le pH pour qu’il soit de 5,6 ± 0,2 à 25 °C après
24-48 h. stérilisation. Stérilisez à l’autoclave selon un cycle validé.
Milieu dextrosé-gélosé à la pomme de terre
4-7-3. Interprétation. La croissance de colonies blanches
Infusion de pomme de terre 200 g
indique la présence possible de C. albicans, à confirmer par
des essais d’identification. Dextrose 20,0 g

Le produit satisfait à l’essai si l’on n’observe la présence Gélose 15,0 g


d’aucune colonie du type décrit ou si les essais de Eau purifiée 1000 ml
confirmation de l’identification sont négatifs.
Ajustez le pH pour qu’il soit de 5,6 ± 0,2 à 25 °C après
La section suivante est donnée à titre d’information. stérilisation. Stérilisez à l’autoclave selon un cycle validé.

4196 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 2.6.13. Recherche de microorganismes spécifiés

Milieu liquide Sabouraud dextrosé Ajustez le pH pour qu’il soit de 7,1 ± 0,2 à 25 °C après
Dextrose 20,0 g stérilisation. Portez à ébullition pendant 1 min en agitant
constamment, puis stérilisez à l’autoclave selon un cycle
Mélange de peptone peptique de tissu animal et de 10,0 g validé.
peptone pancréatique de caséine (1:1)
Eau purifiée 1000 ml Milieu liquide d’enrichissement pour les salmonelles
Rappaport-Vassiliadis
Ajustez le pH pour qu’il soit de 5,6 ± 0,2 à 25 °C après Peptone de soja 4,5 g
stérilisation. Stérilisez à l’autoclave selon un cycle validé.
Chlorure de magnésium hexahydraté 29,0 g
Milieu d’enrichissement pour les entérobactéries-Mossel Chlorure de sodium 8,0 g
Hydrolysat pancréatique de gélatine 10,0 g
Phosphate dipotassique 0,4 g
Glucose monohydraté 5,0 g
Phosphate monopotassique 0,6 g
Bile de boeuf déshydratée 20,0 g
Vert malachite 0,036 g
Phosphate monopotassique 2,0 g
Eau purifiée 1000 ml
Phosphate disodique dihydraté 8,0 g

TE
Vert brillant 15 mg Dissolvez en chauffant doucement. Stérilisez à l’autoclave
selon un cycle validé, à une température ne dépassant pas
Eau purifiée 1000 ml 115 °C. Le pH doit être de 5,2 ± 0,2 à 25 °C après chauffage
et passage à l’autoclave.
Ajustez le pH pour qu’il soit de 7,2 ± 0,2 à 25 °C après
chauffage. Chauffez à 100 °C pendant 30 min et refroidissez Milieu gélosé xylose-lysine-désoxycholate
immédiatement. Xylose 3,5 g
L-Lysine 5,0 g
Milieu gélosé à la bile-violet-rouge avec glucose
Extrait de levure
LÈ 3,0 g Lactose monohydraté 7,5 g

Hydrolysat pancréatique de gélatine 7,0 g Saccharose 7,5 g

Sels biliaires 1,5 g Chlorure de sodium 5,0 g

Chlorure de sodium 5,0 g Extrait de levure 3,0 g

Glucose monohydraté 10,0 g Rouge de phénol 80 mg

Gélose 15,0 g Gélose 13,5 g

Rouge neutre 30 mg Désoxycholate sodique 2,5 g


O
Violet cristallisé 2 mg Thiosulfate de sodium 6,8 g

Eau purifiée 1000 ml Citrate ferrique et d’ammonium 0,8 g


Eau purifiée 1000 ml
Ajustez le pH pour qu’il soit de 7,4 ± 0,2 à 25 °C après
chauffage. Chauffez à ébullition ; ne chauffez pas en Ajustez le pH pour qu’il soit de 7,4 ± 0,2 à 25 °C après
BS

autoclave. chauffage. Chauffez à ébullition, refroidissez à 50 °C et


Milieu liquide de MacConkey répartissez en boîtes de Pétri. Ne chauffez pas en autoclave.
Hydrolysat pancréatique de gélatine 20,0 g Milieu gélosé-cétrimide
10,0 g Hydrolysat pancréatique de gélatine 20,0 g
Lactose monohydraté
5,0 g Chlorure de magnésium 1,4 g
Bile de boeuf déshydratée
10 mg Sulfate dipotassique 10,0 g
Pourpre de bromocrésol
Cétrimide 0,3 g
Eau purifiée 1000 ml
O

Gélose 13,6 g
Ajustez le pH pour qu’il soit de 7,3 ± 0,2 à 25 °C après Eau purifiée 1000 ml
stérilisation. Stérilisez à l’autoclave selon un cycle validé.
Glycérol 10,0 ml
Milieu gélosé de MacConkey
Hydrolysat pancréatique de gélatine 17,0 g
Chauffez à ébullition pendant 1 min en agitant. Ajustez le
Peptones de viande et de caséine 3,0 g
pH pour qu’il soit de 7,2 ± 0,2 à 25 °C après stérilisation.
Lactose monohydraté 10,0 g Stérilisez à l’autoclave selon un cycle validé.
Chlorure de sodium 5,0 g Milieu gélosé mannitol-sel
Sels biliaires 1,5 g Peptone pancréatique de caséine 5,0 g
Gélose 13,5 g Peptone peptique de tissu animal 5,0 g
Rouge neutre 30,0 mg Extrait de viande de boeuf 1,0 g
Violet cristallisé 1 mg D-Mannitol 10,0 g
Eau purifiée 1000 ml Chlorure de sodium 75,0 g

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4197
2.6.13. Recherche de microorganismes spécifiés PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

Gélose 15,0 g Faites gonfler la gélose, dissolvez en chauffant à ébullition


Rouge de phénol 0,025 g sous agitation constante. Si nécessaire, ajustez le pH pour
qu’il soit de 6,8 ± 0,2 à 25 °C après stérilisation. Stérilisez à
Eau purifiée 1000 ml l’autoclave selon un cycle validé.
Gélose Columbia
Chauffez à ébullition pendant 1 min en agitant. Ajustez le 10,0 g
Peptone pancréatique de caséine
pH pour qu’il soit de 7,4 ± 0,2 à 25 °C après stérilisation.
Stérilisez à l’autoclave selon un cycle validé. Peptone peptique de viande 5,0 g

Milieu renforcé pour clostridies Peptone pancréatique de coeur 3,0 g


Extrait de viande de boeuf 10,0 g Extrait de levure 5,0 g
Peptone 10,0 g Amidon de maïs 1,0 g
Extrait de levure 3,0 g Chlorure de sodium 5,0 g
Amidon soluble 1,0 g Gélose, selon pouvoir gélifiant 10,0-15,0 g
Glucose monohydraté 5,0 g Eau purifiée 1000 ml

TE
Chlorhydrate de cystéine 0,5 g Faites gonfler la gélose, dissolvez en chauffant à ébullition
Chlorure de sodium 5,0 g sous agitation constante. Si nécessaire, ajustez le pH pour
qu’il soit de 7,3 ± 0,2 à 25 °C après stérilisation. Stérilisez
Acétate de sodium 3,0 g
à l’autoclave selon un cycle validé. Laissez refroidir à
Gélose 0,5 g 45-50 °C ; ajoutez si nécessaire une quantité de sulfate de
gentamicine correspondant à 20 mg de gentamicine base et
Eau purifiée 1000 ml
répartissez en boîtes de Pétri.


O
BS
O

4198 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

2.7. TITRAGES
BIOLOGIQUES
2.7.2. Titrage microbiologique des antibiotiques.............. 4201

TE

O
BS
O

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4199
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

TE

O
BS
O

4200 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 2.7.2. Titrage microbiologique des antibiotiques

01/2009:20702 Utilisez le solvant et la solution tampon indiqués dans le


tableau 2.7.2.-1 pour préparer les solutions de la préparation
de référence et les solutions de l’antibiotique à examiner,
2.7.2. TITRAGE MICROBIOLOGIQUE en concentrations présumées égales. Déposez les solutions,
DES ANTIBIOTIQUES soit dans des cylindres stériles de porcelaine, d’acier
inoxydable ou de tout autre matériau approprié, disposés à
L’activité d’un antibiotique est estimée par comparaison de la surface du milieu, soit dans des cavités découpées dans la
l’inhibition de la croissance de microorganismes sensibles gélose (le volume de solution ajouté dans chaque cylindre
provoquée respectivement par des concentrations connues ou cavité doit être uniforme), soit à l’aide de disques de
de l’antibiotique à examiner et d’une substance de référence. papier absorbant de bonne qualité et stériles, imprégnés de
solutions de la préparation de référence ou de solutions de
Les préparations de référence utilisées dans les titrages sont
l’antibiotique à examiner avant qu’ils ne soient déposés à
des substances dont l’activité a été déterminée avec précision
la surface de la gélose.
par rapport à l’étalon international correspondant ou à la
préparation de référence internationale. Afin de vérifier la validité du titrage, utilisez au moins 3 doses
Le plan expérimental doit être tel qu’il permette de vérifier différentes de la substance de référence ainsi que 3 doses de
la validité du modèle mathématique sur lequel est basée l’antibiotique à examiner ayant la même activité présumée
l’équation de l’activité. Si un modèle de lignes parallèles que les doses de la substance de référence. Il est recommandé

TE
est choisi, les 2 relations log dose-réponse (ou réponse d’utiliser des séries de doses en progression géométrique.
transformée) correspondant à la préparation à examiner et Dans les titrages courants, lorsque la linéarité du système
à la préparation de référence doivent être parallèles ; elles est démontrée par un nombre adéquat d’expériences dans
doivent être linéaires dans l’intervalle des doses retenues l’essai à 3 points, il suffirait, si l’Autorité de contrôle
pour le calcul du titre. Ces conditions doivent être vérifiées compétente donne son accord, d’effectuer le titrage sur
par des épreuves de validité pour un niveau donné de 2 points seulement. Toutefois, en cas de contestation, le
probabilité, généralement P = 0,05. D’autres modèles titrage est fait sur 3 points comme il est indiqué ci-dessus.
mathématiques peuvent également être utilisés, par exemple
le modèle à rapport de pente du titrage, à condition que la
LÈ Disposez les solutions dans chaque boîte de Pétri ou dans
validité soit démontrée. chaque boîte rectangulaire, selon un plan statistiquement
Sauf indication contraire dans la monographie, les limites approprié. Dans le cas de petites boîtes ne pouvant
de confiance (P = 0,95) du titrage ne sont pas inférieures recevoir plus de 6 solutions, il est recommandé d’alterner
à 95 pour cent ni supérieures à 105 pour cent de l’activité la disposition des solutions de l’antibiotique à examiner et
estimée. de la substance de référence afin d’éviter toute interaction
entre les solutions les plus concentrées.
Effectuez le titrage par le procédé A ou le procédé B.
Faites incuber à une température appropriée pendant
A. TITRAGE PAR DIFFUSION environ 18 h. Préalablement à l’incubation, une période de
O
Liquéfiez le milieu adapté aux conditions du titrage diffusion de 1-4 h à la température ambiante ou à environ
(voir ci-dessous), puis ensemencez à une température 4 °C, selon le cas, peut être nécessaire afin de réduire les
appropriée, par exemple, pour les formes végétatives, effets dus au décalage de temps entre l’application des
de 48 °C à 50 °C, avec une quantité déterminée d’une solutions sur les plaques et, ainsi, d’améliorer la pente de
suspension de microorganismes sensibles à l’antibiotique régression.
à examiner, qui permet d’obtenir des zones d’inhibition
BS

Mesurez les diamètres, avec une précision d’au moins


nettement délimitées et d’un diamètre convenable avec les 0,1 mm, ou les surfaces des zones d’inhibition, avec une
concentrations d’antibiotique utilisées pour le titrage. Versez précision correspondante. Calculez le titre de l’antibiotique
immédiatement en couche uniforme de 2-5 mm d’épaisseur à examiner à l’aide de méthodes statistiques appropriées.
le milieu ensemencé dans des boîtes de Pétri ou dans de
grandes boîtes rectangulaires. Le milieu peut être constitué Le nombre de répétitions par dose dans chaque titrage doit
de 2 couches, la couche supérieure étant seule ensemencée. être suffisant pour assurer la précision requise ; le titrage
Conservez les boîtes dans des conditions telles qu’aucune peut être répété et les résultats combinés statistiquement
croissance notable ou la mort du microorganisme d’essai afin d’obtenir la précision requise et de vérifier que l’activité
n’intervienne avant utilisation et que la surface du milieu de l’antibiotique n’est pas inférieure à l’activité minimale
O

soit sèche au moment de l’emploi. requise.

Tableau 2.7.2.-1. — Titrage des antibiotiques par diffusion


Solvant à utiliser
Substance de Milieu et pH final Température
Antibiotique pour préparer la Solution tampon (pH) Microorganisme
référence (± 0,1 unité pH) d’incubation
solution-mère
Saccharomyces
Amphotéricine Diméthylsulfoxy- cerevisiae
Amphotéricine B pH 10,5 (0,2 M) F - pH 6,1 35-37 °C
B SCR de R ATCC 9763
IP 1432-83
Micrococcus luteus
Bacitracine- Acide chlor- NCTC 7743
Bacitracine-zinc pH 7,0 (0,05 M) A - pH 7,0 35-39 °C
zinc SCR hydrique 0,01 M CIP 53.160
ATCC 10240
Mycobacterium
Bléomycine (sulfate Sulfate de smegmatis
Eau R pH 6,8 (0,1 M) G - pH 7,0 35-37 °C
de) bléomycine SCR
ATCC 607

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4201
2.7.2. Titrage microbiologique des antibiotiques PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

Solvant à utiliser
Substance de Milieu et pH final Température
Antibiotique pour préparer la Solution tampon (pH) Microorganisme
référence (± 0,1 unité pH) d’incubation
solution-mère
Bordetella
bronchiseptica
NCTC 8344
CIP 53.157
Colistiméthate de Colistiméthate de ATCC 4617
Eau R pH 6,0 (0,05 M) B - pH 7,3 35-39 °C
sodium sodium SCR Escherichia coli
NCIB 8879
CIP 54.127
ATCC 10536

Bacillus subtilis E - pH 7,9 30-37 °C


NCTC 10400
CIP 52.62
Framycétine (sulfate Sulfate de
Eau R pH 8,0 (0,05 M) ATCC 6633
de) framycétine SCR
Bacillus pumilus E - pH 7,9 30-37 °C

TE
NCTC 8241
CIP 76.18
Bacillus pumilus A - pH 7,9 35-39 °C
NCTC 8241
CIP 76.18
Gentamicine (sulfate Sulfate de Staphylococcus A - pH 7,9 35-39 °C
Eau R pH 8,0 (0,05 M)
de) gentamicine SCR epidermidis
NCIB 8853
LÈ CIP 68.21
ATCC 12228
Bacillus subtilis
Méthanol R (voir la CIP 52.62
Josamycine Josamycine SCR pH 5,6 A - pH 6,6 35-37 °C
monographie) ATCC 6633
NCTC 10400
Bacillus subtilis
Josamycine Propionate de Méthanol R (voir la CIP 52.62
pH 5,6 A - pH 6,6 35-37 °C
(propionate de) josamycine SCR monographie) ATCC 6633
NCTC 10400
O
Bacillus subtilis A - pH 7,9 30-37 °C
Kanamycine NCTC 10400
(monosulfate de) CIP 52.62
ATCC 6633
Monosulfate de
Eau R pH 8,0 (0,05 M) Staphylococcus A - pH 7,9 35-39 °C
kanamycine SCR
aureus
BS

Kanamycine (sulfate NCTC 7447


acide de)
CIP 53.156
ATCC 6538P
Bacillus pumilus E - pH 7,9 30-37 °C
NCTC 8241
Sulfate de néomyci- CIP 76.18
Néomycine (sulfate
ne pour dosage mi- Eau R pH 8,0 (0,05M) Bacillus subtilis E - pH 7,9 30-37 °C
de)
crobiologique SCR NCTC 10400
CIP 52.62
O

ATCC 6633
Staphylococcus
Nétilmicine (sulfate Sulfate de aureus
Eau R pH 8,0 ± 0,1 A - pH 7,9 32-35 °C
de) nétilmicine SCR ATCC 6538P
CIP 53.156
Candida tropicalis F - pH 6,0 30-37 °C
CIP 1433-83
pH 6,0 (0,05 M) NCYC 1393
Diméthyl- contenant 5 pour Saccharomyces F - pH 6,0 30-32 °C
Nystatine Nystatine SCR
formamide R cent V/V de diméthyl- cerevisiae
formamide R NCYC 87
CIP 1432-83
ATCC 9763
Micrococcus luteus
Rifamycine NCTC 8340
Rifamycine sodique Méthanol R pH 7,0 (0,05 M) A - pH 6,6 35-39 °C
sodique SCR CIP 53.45
ATCC 9341

4202 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 2.7.2. Titrage microbiologique des antibiotiques

Solvant à utiliser
Substance de Milieu et pH final Température
Antibiotique pour préparer la Solution tampon (pH) Microorganisme
référence (± 0,1 unité pH) d’incubation
solution-mère
Bacillus subtilis
NCTC 10400
Spiramycine Spiramycine SCR Méthanol R pH 8,0 (0,05 M) A - pH 7,9 30-32 °C
CIP 52.62
ATCC 6633
Bacillus subtilis A - pH 7,9 30-37 °C
NCTC 8236
CIP 1.83
Streptomycine Sulfate de
Eau R pH 8,0 (0,05 M) Bacillus subtilis A - pH 7,9 30-37 °C
(sulfate de) streptomycine SCR
NCTC 10400
CIP 52.62
ATCC 6633
Bacillus subtilis
NCTC 10400
Téicoplanine Téicoplanine SCR pH 6,0 (0,05 M) pH 6,0 (0,05 M) H - pH 7,8-8,0 35-37 °C
CIP 5262

TE
ATCC 6633
Tylosine pour usage Mélange de
vétérinaire Méthanol R à 40 volumes de Micrococcus luteus
2,5 pour cent V/V méthanol R et NCTC 8340
Tylosine (tartrate Tylosine SCR dans la solution de 60 volumes de A - pH 8,0 32-35 °C
tampon phosphate solution tampon CIP 53.45
de) pour usage
vétérinaire pH 7,0 (0,1 M) R phosphate pH 8,0 ATCC 9341
(0,1 M) R
Bacillus subtilis
Vancomycine Chlorhydrate de NCTC 8236
Eau R pH 8,0 A - pH 8,0 37-39 °C
(chlorhydrate de) vancomycine SCR LÈ CIP 52.62
ATCC 6633

B. TITRAGE TURBIDIMÉTRIQUE Disposez convenablement tous les tubes, soit au hasard,


soit en carré latin, soit en forme de bloc aléatoire, dans un
Ensemencez le milieu approprié avec une suspension
bain-marie ou dans un autre appareil convenable, permettant
du microorganisme choisi (voir ci-dessous) sensible à
de porter rapidement tous les tubes à la température
l’antibiotique à examiner de façon à obtenir une diminution
d’incubation indiquée. Maintenez-les à cette température
O
importante de la culture microbienne dans les conditions du
pendant 3-4 h. Veillez à assurer une température uniforme
titrage. Utilisez une quantité déterminée de la suspension de
et une durée d’incubation identique.
façon à obtenir une opacité facilement mesurable après une
durée d’incubation d’environ 4 h.
Après incubation, bloquez la croissance des cultures, par
Le milieu ensemencé doit être utilisé dès sa préparation. exemple par addition de 0,5 ml de formaldéhyde R dans
chaque tube, ou par traitement à la chaleur, puis mesurez
BS

Utilisez le solvant et la solution tampon indiqués dans le l’opacité au moyen d’un appareil optique approprié avec une
tableau 2.7.2.-2 pour préparer les solutions de la substance précision allant jusqu’à 3 chiffres significatifs. Il est, d’autre
de référence et les solutions de l’antibiotique à examiner, en part, possible d’utiliser un autre procédé qui permette
concentrations présumées égales. de mesurer l’opacité de chaque tube après une période
d’incubation identique.
Afin de vérifier la validité du titrage, utilisez au moins
3 doses différentes de la substance de référence ainsi que Calculez le titre de l’antibiotique à examiner à l’aide de
3 doses de l’antibiotique à examiner ayant la même activité méthodes statistiques appropriées.
présumée que les doses de la substance de référence. Il est
O

recommandé d’utiliser des séries de doses en progression La linéarité du rapport dose-réponse, transformé ou non,
géométrique. Il pourrait être nécessaire de ne retenir pour est souvent obtenue dans un intervalle de doses limité ;
le calcul, parmi un plus grand nombre de doses, que les c’est cet intervalle qui doit être utilisé pour le calcul de
3 doses consécutives correspondantes de la solution de l’activité. Il doit cependant comporter au moins 3 doses
référence et de la solution d’essai permettant d’obtenir la consécutives permettant d’effectuer une vérification de la
linéarité requise. linéarité. Dans les titrages courants, lorsque la linéarité du
système est démontrée par un nombre adéquat d’expériences
Utilisez des tubes à essai identiques. Ajoutez dans chacun dans l’essai à 3 points, il suffirait, si l’Autorité de contrôle
d’eux un volume égal de chaque solution et un même volume compétente donne son accord, d’effectuer le titrage sur
de milieu nutritif ensemencé (par exemple 1 ml de solution 2 points seulement. Toutefois, en cas de contestation, le
et 9 ml de milieu). Pour le titrage de la tyrothricine, ajoutez titrage est fait sur 3 points.
0,1 ml de solution à 9,9 ml de milieu ensemencé.
Le nombre de répétitions par dose dans chaque titrage doit
Préparez simultanément 2 tubes témoins sans antibiotique, être suffisant pour assurer la précision requise ; le titrage
contenant l’un et l’autre le milieu nutritif ensemencé, peut être répété et les résultats combinés statistiquement
le second étant additionné immédiatement de 0,5 ml de afin d’obtenir la précision requise et de vérifier que l’activité
formaldéhyde R. Ces tubes servent à étalonner l’appareil de l’antibiotique à examiner n’est pas inférieure à l’activité
optique utilisé pour mesurer la croissance. minimale requise.

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4203
2.7.2. Titrage microbiologique des antibiotiques PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

Tableau 2.7.2.-2. — Titrage des antibiotiques par turbidimétrie


Solvant à utiliser
Substance de Solution tampon Milieu et pH final Température
Antibiotique pour préparer la Microorganisme
référence (pH) (± 0,1 unité pH) d’incubation
solution-mère
Escherichia coli
NCIB 8666
Colistiméthate de Colistiméthate de
Eau R pH 7,0 CIP 2.83 C - pH 7,0 35-37 °C
sodium sodium SCR
ATCC 9637

Staphylococcus
aureus
Framycétine Sulfate de NCTC 7447
Eau R pH 8,0 C - pH 7,0 35-37 °C
(sulfate de) framycétine SCR
CIP 53.156
ATCC 6538P
Staphylococcus
aureus

TE
Gentamicine Sulfate de NCTC 7447
Eau R pH 7,0 C - pH 7,0 35-37 °C
(sulfate de) gentamicine SCR
CIP 53.156
ATCC 6538P
Enterococcus
hirae
CIP 58.55
Gramicidine SCR Méthanol R pH 7,0* ATCC 10541 C - pH 7,0 35-37 °C
Gramicidine Staphylococcus
aureus

dilutions, par exemple 0,1 mg/ml de polysorbate 80 R.
ATCC 6538P
*L’addition d’un agent tensioactif peut être nécessaire pour éviter une adsorption éventuelle sur le matériel au cours des

Staphylococcus
aureus
Méthanol R - voir CIP 53.156
Josamycine Josamycine SCR pH 5,6 C - pH 8,0 35-37 °C
la monographie
ATCC 6538P
NCTC 7447
O
Staphylococcus
aureus
Josamycine Propionate de Méthanol R - voir CIP 53.156
pH 5,6 C - pH 8,0 35-37 °C
(propionate de) josamycine SCR la monographie
ATCC 6538P
NCTC 7447
Kanamycine Staphylococcus
BS

(monosulfate de) aureus


Monosulfate de NCTC 7447
Eau R pH 8,0 C - pH 7,0 35-37 °C
kanamycine SCR
Kanamycine CIP 53.156
(sulfate acide de) ATCC 6538P
Staphylococcus
Sulfate de néomy- aureus
Néomycine cine pour dosa- NCTC 7447
Eau R pH 8,0 C - pH 7,0 35-37 °C
(sulfate de) ge microbiologi-
que SCR CIP 53.156
ATCC 6538P
O

Escherichia coli
Rifamycine Rifamycine NCIB 8879
Méthanol R pH 7,0 C - pH 7,0 35-37 °C
sodique sodique SCR CIP 54.127
ATCC 10536
Staphylococcus
aureus
Spiramycine Spiramycine SCR Méthanol R pH 7,0 NCTC 7447 C - pH 7,0 35-37 °C
CIP 53.156
ATCC 6538P
Klebsiella
pneumoniae
Streptomycine Sulfate de strepto- NCTC 7427
Eau R pH 8,0 C - pH 7,0 35-37 °C
(sulfate de) mycine SCR
CIP 53.153
ATCC 10031

4204 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 2.7.2. Titrage microbiologique des antibiotiques

Solvant à utiliser
Substance de Solution tampon Milieu et pH final Température
Antibiotique pour préparer la Microorganisme
référence (pH) (± 0,1 unité pH) d’incubation
solution-mère
Tylosine pour Méthanol R Staphylococcus
usage vétérinaire à 2,5 pour aureus
cent V/V dans la NCTC 6571
Tylosine (tartrate Tylosine SCR pH 7,0 C - pH 7,0 37 °C
solution tampon
de) pour usage phosphate pH 7,0 ATCC 9144
vétérinaire (0,1 M) R CIP 53.154

Enterococcus
Tyrothricine Gramicidine SCR Alcool R Alcool R hirae C - pH 7,0 37 °C
ATCC 10541
Staphylococcus
Vancomycine Chlorhydrate de aureus
Eau R pH 8,0 C - pH 7,0 37-39 °C
(chlorhydrate de) vancomycine SCR CIP 53.156
ATCC 6538P

TE
La section suivante est publiée à titre d’information. il a été démontré qu’elle fournit un rapport satisfaisant
dose-réponse dans le titrage par turbidimétrie ou provoque
des zones d’inhibition nettement délimitées de diamètre
Recommandations pour le titrage convenable dans le titrage par diffusion, selon le cas.
microbiologique des antibiotiques Saccharomyces cerevisiae ; Candida tropicalis. Cultivez le
microorganisme à 30-37 °C pendant 24 h sur le milieu F.
Les textes suivants énumèrent les microorganismes Avec une solution stérile de chlorure de sodium R à 9 g/l,
recommandés et indiquent les conditions de travail. D’autres enlevez par lavage les microorganismes cultivés et diluez de
microorganismes peuvent être utilisés à condition qu’ils
LÈ façon à obtenir une opacité adéquate.
présentent la même sensibilité à l’antibiotique à examiner
et soient utilisés dans des milieux appropriés, dans des Solutions tampons. Préparez les solutions tampons dont
conditions favorables de température et de pH. Le choix des le pH est de 5,8 à 8,0 en mélangeant 50,0 ml de solution
concentrations des solutions doit assurer qu’une relation de phosphate monopotassique 0,2 M R avec les quantités
linéaire existe entre le logarithme de la dose et la réponse d’hydroxyde de sodium 0,2 M indiquées au tableau 2.7.2.-3
dans les conditions de l’essai. et en complétant à 200,0 ml avec de l’eau R récemment
distillée.
Préparation de l’inoculum. Bacillus cereus var. mycoides ;
Bacillus subtilis ; Bacillus pumilus. Préparez comme suit Tableau 2.7.2.-3.
O
les suspensions de spores des microorganismes destinées à
être utilisées comme inoculum. pH Hydroxyde de sodium 0,2 M (ml)

Cultivez le microorganisme à 35-37 °C pendant 7 jours, à la 5,8 3,72


surface d’un milieu approprié additionné au préalable de 6,0 5,70
0,001 g/l de sulfate de manganèse R. Avec de l’eau R stérile,
6,2 8,60
enlevez, par lavage, la culture qui comprend principalement
BS

des spores. Chauffez la suspension à 70 °C pendant 30 min 6,4 12,60


et diluez de façon à obtenir une concentration convenable 6,6 17,80
de spores – généralement 10 × 106 à 100 × 106 spores par
millilitre. La suspension de spores peut être conservée 6,8 23,65
pendant une longue période à une température ne dépassant 7,0 29,63
pas 4 °C.
7,2 35,00
Une suspension de spores peut également être préparée par
7,4 39,50
culture des microorganismes à 26 °C pendant 4-6 jours dans
le milieu C. Ajoutez aseptiquement une quantité suffisante 7,6 42,80
O

de sulfate de manganèse R pour obtenir une concentration 7,8 45,20


de 0,001 g/l, puis faites incuber pendant 48 h. Vérifiez
au microscope la présence d’une sporulation appropriée 8,0 46,80
(environ 80 pour cent), puis centrifugez. Préparez une
nouvelle suspension du dépôt dans de l’eau R stérile pour Utilisez ces solutions tampons pour tous les titrages
obtenir une concentration de 10 × 106 à 100 × 106 spores par microbiologiques indiqués au tableau 2.7.2.-1, à l’exception
millilitre. Chauffez à 70 °C pendant 30 min. Conservez la de ceux du sulfate de bléomycine et de l’amphotéricine B.
suspension à une température maximale de 4 °C. Pour le titrage du sulfate de bléomycine, utilisez la solution
Bordetella bronchiseptica. Cultivez le microorganisme tampon pH 6,8 préparée comme suit : dissolvez 6,4 g de
d’essai à 35-37 °C pendant 16-18 h sur le milieu B. Avec de phosphate monopotassique R et 18,9 g de phosphate
l’eau R stérile, enlevez par lavage les éléments bactériens qui disodique R dans de l’eau R et complétez à 1000 ml avec
ont cultivé et diluez de façon à obtenir une opacité adéquate. de l’eau R.
Staphylococcus aureus ; Klebsiella pneumoniae ; Pour le titrage de l’amphotéricine B, utilisez la solution
Escherichia coli ; Micrococcus luteus ; Staphylococcus tampon phosphate pH 10,5 (0,2 M) préparée comme suit :
epidermidis. Effectuez la préparation comme indiqué dissolvez 35 g de phosphate dipotassique R dans 900 ml
ci-dessus pour B. bronchiseptica, en utilisant le milieu A d’eau R, ajoutez 20 ml d’hydroxyde de sodium 1 M et
et en ajustant l’opacité de façon à obtenir une valeur dont complétez à 1000,0 ml avec de l’eau R.

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4205
2.7.2. Titrage microbiologique des antibiotiques PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

Milieux de culture. Les milieux suivants ou des milieux Milieu E


équivalents peuvent être utilisés. Peptone 5g
Milieu A 3g
6g Extrait de viande
Peptone
Phosphate disodique,12H2O 26,9 g
Peptone pancréatique de caséine 4g
Gélose 10 g
Extrait de viande de bœuf 1,5 g
Eau q.s.p. 1000 ml
Extrait de levure 3g

Glucose monohydraté 1g Le phosphate disodique en solution stérile est ajouté au


15 g
milieu stérilisé au préalable.
Gélose
1000 ml
Milieu F
Eau q.s.p.
Peptone 9,4 g
Milieu B Extrait de levure 4,7 g
Peptone pancréatique de caséine 17 g
Extrait de viande de bœuf 2,4 g
Peptone papaïque de soja 3g

TE
Chlorure de sodium 10,0 g
Chlorure de sodium 5g
Glucose monohydraté 10,0 g
Phosphate dipotassique 2,5 g
Gélose 23,5 g
Glucose monohydraté 2,5 g
Eau q.s.p. 1000 ml
Gélose 15 g

Polysorbate 80 10 g Milieu G
1000 ml Glycérol 10 g
Eau q.s.p.
LÈ Peptone 10 g
Ajoutez le polysorbate 80 à la solution chaude renfermant
Extrait de viande 10 g
les autres composants après l’avoir portée à ébullition et
immédiatement avant d’ajuster son volume. Chlorure de sodium 3g
Milieu C Gélose 15 g
Peptone 6g
Eau q.s.p. 1000 ml
Extrait de viande de bœuf 1,5 g

Extrait de levure 3g pH 7,0 ± 0,1 après stérilisation.


3,5 g Milieu H
O
Chlorure de sodium
Peptone 5,0 g
Glucose monohydraté 1g
Gélose 15,0 g
Phosphate dipotassique 3,68 g
Extrait de viande de bœuf 3,0 g
Phosphate monopotassique 1,32 g
Eau q.s.p. 1000 ml
1000 ml
BS

Eau q.s.p.

Milieu D pH 7,8 - 8,0 ajusté avec de l’hydroxyde de sodium 0,1 M.


Extrait de cœur 1,5 g

Extrait de levure 1,5 g

Peptone de caséine 5g

Glucose monohydraté 1g

Chlorure de sodium 3,5 g


O

Phosphate dipotassique 3,68 g

Phosphate monopotassique 1,32 g

Nitrate de potassium 2g

Eau q.s.p. 1000 ml

4206 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

2.9. MÉTHODES DE
PHARMACOTECHNIE
2.9.1. Désagrégation des comprimés et des capsules......4209 2.9.33. Caractérisation des solides cristallins et partiellement
cristallins par diffraction X sur poudre............................. 4211

TE

O
BS
O

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4207
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

TE

O
BS
O

4208 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 2.9.1. Désagrégation des comprimés et des capsules

01/2009:20901 d’épaisseur et 20,7 ± 0,15 mm de diamètre, constitué d’une


matière plastique transparente appropriée possédant une
2.9.1. DÉSAGRÉGATION DES densité de 1,18-1,20. Chaque disque est percé sur toute son
épaisseur de 5 trous tubulaires parallèles de 2 ± 0,1 mm
COMPRIMÉS ET DES CAPSULES de diamètre, dont l’un est centré sur l’axe du cylindre et
Cet essai est destiné à déterminer l’aptitude des comprimés les autres, situés à 6 ± 0,2 mm de l’axe, sur des droites
ou capsules à se désagréger dans un temps prescrit, en imaginaires perpendiculaires à l’axe et parallèles entre
milieu liquide et dans les conditions expérimentales décrites elles. La surface latérale des disques comporte 4 encoches
ci-après. trapézoïdales identiques, sensiblement perpendiculaires aux
2 bases du cylindre ; ces encoches ont la forme d’un trapèze
Dans le cadre de cet essai, la désagrégation n’implique pas symétrique dont les 2 côtés parallèles coïncident avec les
une dissolution complète de l’unité soumise à l’essai ni même bases du cylindre et sont parallèles à une droite imaginaire
de son composant actif. Par définition la désagrégation est reliant les centres de 2 trous adjacents situés à 6 mm de l’axe.
complète, lorsque tout résidu, à l’exception de fragments Le côté du trapèze qui est visible sur la face inférieure du
insolubles d’enrobage ou d’enveloppe de capsule, pouvant cylindre a une longueur de 1,6 ± 0,1 mm et l’arête inférieure
subsister sur la grille de l’appareil ou adhérer à la face est en retrait de 1,5 mm à 1,8 mm de la circonférence du
inférieure du disque, si l’on en a utilisé un, est constitué cylindre. Le côté du trapèze qui est visible sur la face
d’une masse molle ne comportant pas de noyau palpable.

TE
supérieure du cylindre a une longueur de 9,4 ± 0,2 mm, et
Utilisez l’appareillage A pour les comprimés et les son centre est en retrait de 2,6 ± 0,1 mm de la circonférence
capsules dont la dimension n’excède pas 18 mm. Dans du cylindre. Toutes les surfaces du disque sont lisses.
le cas de comprimés ou de capsules plus grands, utilisez
l’appareillage B. Si l’emploi de disques est prescrit, placez un disque dans
chaque tube puis faites fonctionner l’appareil comme indiqué
ESSAI A – COMPRIMÉS ET CAPSULES DE DIMENSIONS sous Mode opératoire. Les disques sont conformes aux
NORMALES spécifications dimensionnelles présentées figure 2.9.1.-1.
Appareillage. L’appareillage se compose d’un panier L’usage de disques modifiés en vue d’une détection
porte-tubes, d’un vase cylindrique bas de 1 litre destiné
LÈ automatique est permis dans les cas où l’usage de disques
à contenir le liquide d’immersion, d’une hauteur de est spécifié ou autorisé. Ces disques doivent satisfaire aux
149 ± 11 mm et d’un diamètre intérieur de 106 ± 9 mm, exigences de densité et de dimensions indiquées dans ce
d’un système thermostatique permettant de maintenir le chapitre.
liquide à une température comprise entre 35-39 °C, et
d’un dispositif servant à imprimer au porte-tubes, dans le Mode opératoire. Placez 1 unité de la préparation à examiner
liquide d’immersion, un mouvement vertical alternatif de dans chacun des 6 tubes du râtelier, puis ajoutez un disque
fréquence constante comprise entre 29-32 cycles par minute si l’emploi de disques est prescrit. Faites fonctionner
de montée-descente et d’amplitude de 55 ± 2 mm. Le volume l’appareil en utilisant, comme liquide d’immersion, le milieu
de liquide introduit dans le vase est ajusté pour que le treillis spécifié maintenu à 37 ± 2 °C. Au temps indiqué, remontez
métallique soit, en haut de course, à au moins 15 mm de la le porte-tubes hors du liquide et examinez l’état des unités
O
surface du liquide et, en bas de course, à au moins 25 mm soumises à l’essai. Toutes les unités sont complètement
du fond du vase. A aucun moment le haut du panier ne désagrégées. Si 1 ou 2 d’entre elles ne sont pas désagrégées,
doit être submergé. Les temps de montée et de descente répétez l’essai sur 12 unités supplémentaires. Les exigences
sont égaux, et le changement de sens s’effectue selon une de l’essai sont satisfaites si au moins 16 des 18 unités
transition progressive plutôt qu’une inversion brutale. Le soumises à l’essai sont désagrégées.
BS

porte-tubes suit un mouvement vertical suivant son axe, sans


mouvement horizontal appréciable ni déviation significative ESSAI B – COMPRIMÉS ET CAPSULES DE GRANDES
par rapport à la verticale. DIMENSIONS
Ensemble mobile. Le râtelier porte 6 tubes transparents Appareillage. La partie principale de l’appareillage
ouverts aux 2 extrémités. Chacun possède une longueur de (figure 2.9.1.-2) est constituée par un assemblage rigide
77,5 ± 2,5 mm, un diamètre intérieur de 21,85 ± 1,15 mm, supportant 3 tubes cylindriques transparents. Chaque tube
et une paroi de 1,9 ± 0,9 mm d’épaisseur. Les tubes sont a une longueur de 77,5 ± 2,5 mm et un diamètre intérieur
maintenus en position verticale par 2 plaques, de 90 ± 2 mm de 33,0 ± 0,5 mm ; la paroi a une épaisseur de 2,5 ± 0,5 mm.
de diamètre et 6,75 ± 1,75 mm d’épaisseur, percées chacune Chacun de ces tubes est pourvu d’un disque cylindrique
de 6 trous de 24 ± 2 mm de diamètre, régulièrement espacés (diamètre 31,4 ± 0,13 mm et épaisseur 15,3 ± 0,15 mm) en
O

et équidistants du centre de la plaque. Sous la plaque matière plastique transparente d’une densité de 1,18-1,20.
inférieure est fixé un treillis métallique en fils d’acier Chaque disque est percé de part en part de 7 trous de
inoxydable de 0,615 ± 0,045 mm de diamètre, à tissage 3,15 ± 0,1 mm de diamètre : 1 trou central et 6 autres
simple et mailles carrées de 2,0 ± 0,2 mm d’ouverture. également espacés et disposés sur un cercle de 4,2 mm
Les différentes parties de l’ensemble sont assemblées et de rayon à partir du centre du disque. Les tubes sont
maintenues de façon rigide par 3 boulons traversant les maintenus verticaux par 2 plaques, séparées et superposées,
2 plaques. Un dispositif adéquat permet de suspendre en matière plastique rigide, de 97 mm de diamètre et de
l’ensemble au mécanisme moteur par un point situé sur l’axe 9 mm d’épaisseur, percées chacune de 3 trous. Les trous
du porte-tubes. sont équidistants du centre de la plaque et également
La configuration de l’appareil peut présenter des variations espacés entre eux. Sous la plaque inférieure est fixée une
de détail, sous réserve que les spécifications dimensionnelles toile métallique en fils d’acier inoxydable de 0,63 ± 0,03 mm
des tubes et du treillis métallique soient respectées. Les de diamètre et à mailles de 2,0 ± 0,2 mm. Les plaques sont
dimensions sont conformes aux spécifications présentées maintenues en place à une distance de 77,5 mm par des
figure 2.9.1.-1. tiges métalliques verticales situées à la périphérie ; la plaque
Disques. L’utilisation de disques n’est admise que lorsqu’elle supérieure porte également, fixée en son centre, une tige
est explicitement spécifiée ou autorisée. Chaque tube est métallique qui permet de relier cet assemblage à un dispositif
alors pourvu d’un disque cylindrique de 9,5 ± 0,15 mm mécanique destiné à assurer un mouvement vertical,

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4209
2.9.1. Désagrégation des comprimés et des capsules PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

alternatif et régulier, dont l’amplitude est de 55 ± 2 mm ; Les éléments mécaniques décrits peuvent subir des
le nombre de déplacements complets, montée-descente, est modifications de détail mais les cotes des tubes et de la toile
de 29-32 par minute. métallique doivent être conformes aux prescriptions décrites
L’appareil est placé de préférence dans un vase cylindrique ci-dessus.
de 1 litre ou dans tout autre récipient convenable. Le volume Mode opératoire. Examinez 6 comprimés ou capsules, soit
de liquide à verser dans le récipient est tel que, lorsque en utilisant 2 appareils en parallèle, soit en répétant l’essai.
l’assemblage est dans la position la plus élevée, le tamis Dans chacun des 3 tubes, introduisez un comprimé ou une
métallique est au moins à 15 mm en dessous de la surface du capsule, puis un disque s’il est prescrit ; placez l’assemblage
liquide et, lorsque l’assemblage est dans sa position la plus dans le vase cylindrique contenant le milieu liquide indiqué.
basse, le tamis est au moins à 25 mm du fond, les extrémités Faites fonctionner l’appareil pendant le temps prescrit. Ce
supérieures des tubes ouverts demeurant au-dessus de temps écoulé, retirez l’assemblage et examinez l’état des
la surface du liquide. Un dispositif adéquat maintient la comprimés ou des capsules. L’essai est satisfaisant si les
température de l’ensemble à 35-39 °C. 6 échantillons sont désagrégés.

TE
Panier porte-tubes

1,9 ± 0,9 21,85 LÈ Disque


± 1,15

6
±
6,75 ± 1,75

2,6 ± 0,1

0,
2
Vue
du dessus

1
0,
±
77,5 ± 2,5

2
9,4 ± 0,2
O
BS
6,75 ± 1,75

90 ± 2
Vue
de côté
9,5 ± 0,15
O

1,6 ± 0,1
15
0,
±
,7
24 ± 2

20

Vue
de dessous

1,5-1,8

Figure 2.9.1.-1 – Appareil de désagrégation A


Dimensions en millimètres

4210 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 2.9.33. Caractérisation de la cristallinité des solides par diffraction X

TE

O
BS

Figure 2.9.1.-2. – Appareillage de désagrégation B


Dimensions en millimètres
01/2009:20933 de diffraction, qui dépend principalement de la nature et
de l’arrangement des atomes ainsi que de l’orientation
2.9.33. CARACTÉRISATION des particules dans l’échantillon ; et la forme des raies de
diffraction, qui est fonction de la résolution de l’instrument,
O

DES SOLIDES CRISTALLINS ET de la taille des cristallites, des contraintes et de l’épaisseur


PARTIELLEMENT CRISTALLINS PAR d’échantillon.
DIFFRACTION X SUR POUDRE L’étude de la position angulaire et de l’intensité des raies de
diffraction peut servir à des applications telles que l’analyse
Chaque phase cristalline présente dans une substance qualitative des phases (par exemple, identification des
donnée produit une « image » de diffraction X caractéristique. phases cristallines) et l’analyse quantitative des phases d’un
De telles images, appelées diffractogrammes (ou encore matériau cristallin. Une estimation des fractions amorphe et
diagrammes ou spectres de diffraction), sont obtenues à cristalline(1) peut également être effectuée.
partir de poudres cristallines présentant une orientation La diffractométrie X sur poudre comporte l’avantage,
aléatoire, composées de cristallites ou fragments cristallins sur d’autres méthodes d’analyse, d’être en général non
de taille finie. Le diffractogramme d’une poudre fournit destructive (la préparation des échantillons se limite
essentiellement 3 types d’informations : la position angulaire habituellement à un broyage destiné à assurer une
des raies de diffraction, qui est fonction de la géométrie orientation aléatoire au sein de l’échantillon). Les analyses
et de la taille de la maille cristalline ; l’intensité des raies
(1) Il existe de nombreuses autres applications de la diffractométrie X sur poudre qui peuvent concerner les substances pharmaceutiques à structure cristalline : élucidation et affinement des
structures cristallines, détermination de la pureté cristallographique des phases cristallines, caractérisation de la texture cristallographique, etc. Ces applications ne sont pas décrites dans
ce chapitre.

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4211
2.9.33. Caractérisation de la cristallinité des solides par diffraction X PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

de diffractométrie X sur poudre peuvent par ailleurs être de diffraction (également appelés « raies », « réflexions » ou
réalisées dans des conditions in situ sur des échantillons « réflexions de Bragg ») est caractéristique de l’architecture
exposés à des conditions non ambiantes, par exemple, à des du réseau cristallin (distances inter-réticulaires), tandis que
températures et des taux d’humidité faibles ou élevés. leur intensité théorique dépend du contenu de la maille
élémentaire (nature et position des atomes) et la forme des
PRINCIPE raies de la perfection et de l’étendue du réseau cristallin. Le
La diffraction des rayons X résulte de l’interaction de pic de diffraction présente alors une intensité finie qui est la
ces rayons avec le nuage électronique des atomes. Selon résultante de l’arrangement atomique, du type d’atomes, des
l’arrangement atomique, les rayons X diffractés produisent mouvements thermiques et des imperfections structurelles,
des interférences. Ces interférences sont constructives si ainsi que des caractéristiques instrumentales.
la différence de marche entre 2 ondes X diffractées est un L’intensité dépend de plusieurs paramètres tels que la
multiple entier de la longueur d’onde, condition décrite par structure, la température, la cristallinité, la polarisation, la
la relation (ou loi) de Bragg (figure 2.9.33.-1) : multiplicité et le facteur de Lorentz.
Les principaux paramètres caractérisant les raies de
diffraction sont la position 2θ, la hauteur, la surface et
La longueur d’onde λ du rayonnement X est du même la forme des pics (décrite, par exemple, par la largeur
ordre de grandeur que la distance dhkl séparant les plans ou l’asymétrie du pic, ou par une fonction analytique

TE
réticulaires successifs, ou distance inter-réticulaire ; θhkl est ou une représentation empirique). A titre d’exemple,
l’angle d’incidence du faisceau X sur la famille de plans des enregistrements obtenus pour une même substance
réticulaires, et sinθhkl est inversement proportionnel à la sous 5 phases solides différentes sont présentés dans la
distance inter-réticulaire. figure 2.9.33.-2.
L’orientation et l’espacement des plans par rapport aux Outre les pics de diffraction, une analyse par diffractométrie X
axes des mailles élémentaires sont définis par les indices de génère un fond plus ou moins uniforme, sur lequel se
Miller {hkl}. Ces indices sont les inverses, réduits à l’entier surimposent les pics. A ce bruit de fond contribuent, en plus
immédiatement inférieur, des intersections du plan avec les de la préparation de l’échantillon, d’autres facteurs comme
axes de la maille élémentaire. Les dimensions de la maille LÈ le porte-échantillon, la diffraction diffuse due à l’air et à
élémentaire sont données par les distances sur les axes a, b l’équipement, et d’autres paramètres instrumentaux tels
et c et par les angles α, β et γ formés par ces axes. que le bruit du détecteur, le rayonnement général du tube
générateur de rayons X, etc. Il est possible d’augmenter le
La distance inter-réticulaire d’une famille donnée de plans rapport signal/bruit en réduisant le fond et en opérant avec
parallèles hkl est notée dhkl. Chaque famille de plans ainsi des temps d’exposition plus longs.
identifiée peut présenter des ordres de diffraction supérieurs,
où les valeurs d associées aux familles de plans nh, nk, nl APPAREILLAGE
diminuent d’un facteur 1/n (n étant un entier : 2, 3, 4, etc.). Composants de l’appareillage. Les analyses par diffraction X
A chaque famille de plans présente dans un cristal est sont généralement effectuées au moyen de diffractomètres
associé, selon la relation de Bragg, un angle de diffraction
O
sur poudre ou d’appareils à chambre photographique.
spécifique θhkl (pour une longueur d’onde λ spécifique). Un diffractomètre sur poudre comprend généralement
Un échantillon de poudre est supposé polycristallin, de 5 parties principales : une source de rayons X, des
sorte qu’il existe pour tout angle θhkl des cristallites dont éléments optiques agissant sur le faisceau incident
l’orientation permet la diffraction selon la loi de Bragg(2). (monochromatisation, filtrage, collimation et/ou
Pour une longueur d’onde X donnée, la position des pics focalisation, etc.), un goniomètre, des éléments optiques
BS
O

Figure 2.9.33.-1. – Diffraction des rayons X par un cristal, selon la loi de Bragg
(2) La poudre « idéale », pour une étude de diffraction, se compose d’un grand nombre de petits cristallites sphériques (domaines cristallins à diffraction cohérente) d’orientation aléatoire. Si
leur nombre est suffisant, il y aura toujours dans la poudre suffisamment de cristallites présentant une orientation telle que l’on puisse obtenir un diffractogramme reproductible.

4212 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 2.9.33. Caractérisation de la cristallinité des solides par diffraction X

Forme D

Forme C

TE
Forme B

Forme A
LÈ amorphe

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31

Echelle 2 θ (λ Cu)
O
Figure 2.9.33.-2. – Diffractogrammes obtenus avec 5 phases solides différentes d’une même substance
(intensités normalisées)
agissant sur le faisceau diffracté (monochromatisation, orientés convergent en une ligne au niveau d’une fente
filtrage, collimation et focalisation ou parallélisation, etc.) et réceptrice. Un second groupe de collimateurs parallèles
un détecteur. Des systèmes d’acquisition et de traitement des et une fente anti-diffusion peuvent être placés avant ou
BS

données sont également nécessaires et sont généralement après la fente réceptrice. Les axes de la focale et de la
inclus dans les appareils modernes. fente réceptrice se situent à égale distance de l’axe du
Le type d’analyse à effectuer (identification de phases, goniomètre. Les quanta de rayonnement X sont comptés
analyse quantitative, détermination des paramètres de par un détecteur de rayonnement, qui est généralement un
maille, etc.) conditionne la configuration instrumentale compteur à scintillation, un compteur proportionnel à gaz
et le niveau de performance requis. L’instrument le plus scellé ou un détecteur « état solide » sensible à la position,
simple permettant d’enregistrer des diffractogrammes de par exemple à plaque photosensible (image plate) ou à
poudres est la chambre photographique. Le remplacement couplage de charge (CCD). La fente réceptrice et le détecteur
du film photographique par des détecteurs photoniques sont solidaires et se déplacent tangentiellement au cercle
comme outils de détection a conduit au développement de de focalisation. Pour les balayages θ/2θ, le goniomètre
O

diffractomètres où la géométrie des éléments optiques n’est entraîne l’échantillon en rotation autour du même axe que
pas à véritable focalisation, mais à focalisation approchée le détecteur, mais à une vitesse 2 fois plus faible, selon
comme dans la géométrie de Bragg-Brentano. Le montage une géométrie θ/2θ. La surface de l’échantillon reste
en focalisation approchée de Bragg-Brentano, actuellement donc tangentielle au cercle de focalisation. Le collimateur
le plus utilisé, est brièvement décrit ici. parallèle limite la divergence axiale du faisceau et contrôle
donc partiellement la forme des raies de diffraction.
Un instrument donné peut être utilisé soit en géométrie θ/2θ
horizontale ou verticale soit en géométrie θ/θ verticale. Un diffractomètre peut également être utilisé en mode
Dans les 2 géométries, le faisceau X incident forme un transmission. L’avantage de cette technique est de réduire
angle θ avec la surface plane de l’échantillon et le faisceau X les effets dus à l’orientation préférentielle. Un capillaire
diffracté forme un angle 2θ avec la direction du faisceau X d’une épaisseur d’environ 0,5-2 mm peut également être
incident (et un angle θ avec la surface plane de l’échantillon). utilisé pour les petits échantillons.
Le montage classique est représenté figure 2.9.33.-3. Le Rayonnement X. Au laboratoire, les rayons X sont produits
faisceau incident divergent émis par le tube générateur par bombardement d’une anode métallique avec des
(dit « faisceau primaire ») passe à travers des collimateurs électrons émis par effet thermoionique et accélérés dans
parallèles et une fente de divergence, puis illumine la un champ électrique puissant (produit par un générateur
surface plane de l’échantillon. Tous les rayons diffractés haute tension). L’énergie cinétique des électrons est en
selon un angle 2θ par des cristallites convenablement grande partie dissipée sous forme de chaleur, ce qui limite

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4213
2.9.33. Caractérisation de la cristallinité des solides par diffraction X PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

TE
A. tube à rayons X
B. fente de divergence
C. échantillon
D. fente anti-diffusion
LÈ E. fente réceptrice
F. monochromateur
G. fente réceptrice du détecteur
H. détecteur

Figure 2.9.33.-3. – Montage en focalisation approchée de Bragg-Brentano


J. cercle de diffraction
K. cercle de focalisation

la puissance des tubes et nécessite un système efficace de selon différents angles, de façon à permettre la sélection et
refroidissement de l’anode. L’utilisation d’anodes tournantes l’entrée dans le détecteur d’un seul d’entre eux. Il est même
et l’emploi d’optiques X permettent un gain de brillance possible de séparer les rayonnements Kα1 et Kα2 en utilisant
d’un facteur 20 à 30. Une autre approche possible consiste un monochromateur spécifique. Malheureusement, le gain
à produire des photons X dans un centre de rayonnement à obtenu en produisant un faisceau monochromatique à l’aide
O
grande échelle (synchrotron). d’un filtre ou d’un monochromateur est contrebalancé par
Le spectre d’émission d’un tube générateur de rayons X une perte d’intensité. Une autre méthode permettant de
opérant sous une différence de potentiel suffisante se séparer les longueurs d’onde Kα et Kβ consiste à utiliser
compose d’un fond continu de rayonnement polychromatique des miroirs courbes pour rayons X, capables d’opérer
auquel s’ajoute un rayonnement caractéristique dépendant simultanément la monochromatisation et la focalisation ou
la parallélisation du faisceau X.
BS

du type d’anode. Seul ce rayonnement caractéristique est


utilisé dans les analyses par diffraction X. Les sources les PROTECTION CONTRE LES RAYONNEMENTS :
plus courantes en diffractométrie X sont les tubes à vide l’exposition de toute partie du corps humain à un
à anode de cuivre, molybdène, fer, cobalt ou chrome ; les rayonnement X constitue un risque pour la santé. Il est
rayons X du cuivre, du molybdène ou du cobalt sont les plus donc essentiel, lorsque l’on utilise un équipement mettant
utilisés pour les substances organiques (les anodes de cobalt, en œuvre des rayons X, de prendre des précautions
notamment, peuvent permettre une meilleure séparation adéquates pour assurer la protection de l’opérateur et de
des raies X). Le choix du rayonnement à mettre en œuvre toute autre personne se trouvant à proximité. Les pratiques
dépendra des propriétés d’absorption de l’échantillon et recommandées pour assurer cette protection, ainsi que les
d’une éventuelle émission de fluorescence par les atomes niveaux maximums admissibles d’exposition aux rayons X,
O

contenus dans l’échantillon. Les longueurs d’onde utilisées sont régis par la législation nationale de chaque pays.
en diffractométrie de poudre correspondent généralement En l’absence de réglementations ou recommandations
au rayonnement Kα émis par l’anode. Il est donc souhaitable officielles dans un pays, il convient de se référer aux
de rendre le faisceau X « monochromatique » en éliminant recommandations les plus récentes de la Commission
toutes les autres composantes du spectre d’émission. Cette Internationale de Protection Radiologique.
opération peut être partiellement assurée par des filtres Kβ,
qui sont des filtres métalliques dont le seuil d’absorption PRÉPARATION ET MONTAGE DE L’ÉCHANTILLON
est compris entre les longueurs d’onde Kα et Kβ émises par La préparation des matériaux pulvérisés et le montage des
le tube. échantillons dans un porte-échantillon approprié constituent
Un tel filtre est généralement inséré entre le tube générateur des étapes critiques de nombreuses méthodes d’analyse,
de rayons X et l’échantillon. Une autre façon, de plus en particulièrement en diffractométrie X sur poudre où elles
plus employée, d’obtenir un faisceau X monochromatique peuvent affecter très sensiblement la qualité des données
est d’utiliser un cristal monochromateur de grande taille collectées(3). Les principales sources d’erreur associées à la
(communément appelé « monochromateur »). Ce cristal, préparation et au montage de l’échantillon sont brièvement
placé avant ou après l’échantillon, diffracte les différents discutées ici, dans le contexte des instruments opérant en
pics caractéristiques du faisceau X (c’est-à-dire Kα et Kβ) focalisation approchée de Bragg-Brentano.
(3) De même, des modifications peuvent intervenir dans l’échantillon lors de la collecte des données si l’équilibre au sein de l’échantillon n’est pas assuré (température, humidité).

4214 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 2.9.33. Caractérisation de la cristallinité des solides par diffraction X

PRÉPARATION de fond nul) tel qu’une plaque de silicium monocristallin


La morphologie des particules cristallines tend en général coupée parallèlement aux plans réticulaires 510(5). L’un
à donner un échantillon présentant dans son support des avantages d’opérer en mode transmission est la
un certain degré d’orientation préférentielle. Ceci est moindre importance des problèmes liés à l’épaisseur et à la
particulièrement évident dans le cas de cristaux en forme transparence de l’échantillon. L’emploi d’un étalon interne
d’aiguilles ou de plaquettes, où la réduction de taille donne approprié permet de détecter et corriger simultanément cet
des aiguilles ou des plaquettes plus petites. L’orientation effet et l’effet de déplacement de l’échantillon.
préférentielle au sein de l’échantillon affecte l’intensité
des différentes réflexions, si bien que certaines sont moins CONTRÔLE DE LA PERFORMANCE DE L’APPAREILLAGE
intenses et d’autres plus intenses que ce que l’on attendrait Les goniomètres et les éléments optiques qui agissent
d’un échantillon sans orientation préférentielle. Plusieurs sur le faisceau X avant et après diffraction comportent
techniques peuvent être mises en œuvre pour améliorer le de nombreuses parties mécaniques nécessitant un
caractère aléatoire de l’orientation des cristallites (et donc ajustement. Le degré d’alignement ou de mésalignement
limiter l’orientation préférentielle), mais l’approche la plus affecte directement la qualité des résultats de l’analyse
simple et la plus satisfaisante est souvent une réduction diffractométrique. Il est donc essentiel de procéder à un
plus poussée de la taille des particules. Le nombre optimal ajustement soigneux des différents éléments composant le
de cristallites dépend de la géométrie du diffractomètre, diffractomètre (systèmes optiques et mécaniques, etc.) afin

TE
de la résolution requise et de l’atténuation du faisceau X de limiter les erreurs systématiques tout en optimisant les
par l’échantillon. Dans certains cas, des particules de intensités reçues par le détecteur. La recherche de l’intensité
taille importante (pouvant aller jusqu’à 50 μm) donneront maximale et celle de la résolution maximale, lors de
des résultats satisfaisants en identification de phases. Un l’alignement d’un diffractomètre, sont toujours antagonistes.
broyage trop poussé (cristallites de taille inférieure à environ Il faut donc rechercher un compromis optimal entre les deux.
0,5 μm) peut toutefois entraîner un élargissement des raies Il existe de nombreuses configurations possibles, et chaque
et des altérations significatives de l’échantillon lui-même, appareil requiert des procédures d’alignement spécifiques.
par exemple :
Le bon fonctionnement global du diffractomètre doit
— par contamination de l’échantillon par des particules ensuite être contrôlé et vérifié périodiquement au moyen de
arrachées aux instruments de broyage (mortier, broyeur,
billes, etc.),
— par réduction du degré de cristallisation,
— par transition à l’état solide donnant un autre polymorphe,
— par décomposition chimique,
LÈ matériaux de référence certifiés appropriés. Selon le type
d’analyse, un autre matériau de référence bien défini peut
également être utilisé, bien que l’usage de matériaux de
référence certifiés est préférable.
ANALYSE QUALITATIVE DES PHASES (IDENTIFICATION
— par introduction de contraintes internes, DES PHASES)
— par induction de réactions à l’état solide. L’identification par diffractométrie X sur poudre des
Il est donc recommandé de comparer le diffractogramme de phases en présence, dans un échantillon inconnu, repose
O
l’échantillon non broyé à celui d’un échantillon contenant habituellement sur la comparaison, visuelle ou assistée
des particules de plus petite taille (par exemple, un par ordinateur, d’une portion du diffractogramme obtenu
échantillon broyé). Si le diffractogramme obtenu est de avec celui (expérimental ou calculé) d’un matériau de
qualité adéquate pour l’usage visé, il peut être inutile de référence. Dans le cas idéal, il est souhaitable que ces
procéder à un broyage. diffractogrammes de référence soient obtenus à partir
Il est à noter que, si un échantillon contient plusieurs phases d’échantillons monophases bien caractérisés. Cette approche
BS

et que l’on effectue un tamisage pour isoler des particules permet, dans la plupart des cas, d’identifier une substance
de taille spécifique, la composition initiale peut s’en trouver cristalline à partir des angles de diffraction 2θ ou des
altérée. distances inter-réticulaires, et des intensités relatives. La
comparaison, assistée par ordinateur, du diffractogramme
MONTAGE de l’échantillon inconnu avec les données de référence
Effet de déplacement de l’échantillon. Un désaxage D de peut porter, soit sur un intervalle 2θ plus ou moins étendu
la surface de l’échantillon par rapport à l’axe de rotation du diffractogramme total, soit sur un corps de données
du diffractomètre entraîne des erreurs systématiques qu’il réduites dérivées du diffractogramme. Par exemple, la liste
est très difficile d’éviter totalement ; en mode réflexion, des distances inter-réticulaires et des intensités normalisées
ceci se traduit par des décalages absolus D·cosθ(4) aux Inorm, dite « liste (d, Inorm) », extraite du diffractogramme,
O

positions 2θ (typiquement de l’ordre de 0,01° aux angles constitue la signature cristallographique du produit et peut
faibles (cosθ 1) pour un déplacement D = 15 μm) et un être comparée aux listes (d, Inorm) d’échantillons monophases
élargissement asymétrique du profil vers les valeurs 2θ enregistrées dans des bases de données.
faibles. L’emploi d’un étalon interne approprié permet de Pour la plupart des cristaux organiques, lorsque le
détecter et corriger simultanément cet effet et l’effet de rayonnement CuKα est utilisé, il est approprié d’enregistrer
transparence de l’échantillon. Cette source d’erreur est le diffractogramme sur un intervalle 2θ allant d’une valeur
de loin la plus importante lorsque le diffractomètre est aussi voisine que possible de 0° jusqu’à 40°. Le degré
correctement aligné. de concordance, pour les angles de diffraction 2θ, entre
Effets d’épaisseur et de transparence de l’échantillon. En l’échantillon et le matériau de référence est d’au maximum
diffractométrie X sur poudre en mode réflexion, il est souvent 0,2° pour la même forme cristalline, tandis qu’il peut exister
préférable de travailler sur des échantillons d’épaisseur d’importantes variations entre échantillon et matériau
« infinie ». Afin de minimiser l’effet de transparence, il est de référence quant aux intensités relatives, en raison des
souhaitable d’utiliser un support non diffractant (à bruit effets d’orientation préférentielle. De par leur nature, il est
(4) Notons qu’un désalignement du zéro du goniomètre entraînerait un décalage constant à toutes les positions 2θ observées, autrement dit une translation de l’ensemble du diffractogramme
de Z° en 2θ.
(5) Dans le cas d’un échantillon mince à faible atténuation, une mesure exacte des positions de raies est possible en opérant avec un diffractomètre focalisant sous une géométrie de
transmission ou de réflexion. Pour l’exactitude de la mesure des positions de raies sur des échantillons à faible atténuation, il est préférable d’utiliser des diffractomètres à optique de faisceau
parallèle. Ceci permet de réduire l’effet d’épaisseur de l’échantillon.

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4215
2.9.33. Caractérisation de la cristallinité des solides par diffraction X PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

reconnu que les hydrates et les solvates variables peuvent MÉTHODES UTILISANT UN ÉTALON
présenter des dimensions de maille élémentaire différentes Les méthodes les plus couramment utilisées pour l’analyse
occasionnant une dérive dans la position des pics des quantitative sont :
diffractogrammes enregistrés pour ces substances. Pour ces — la méthode dite « de l’étalon externe »,
substances particulières, il n’est pas exclu de rencontrer
des variations supérieures à 0,2° pour les positions 2θ. Par — la méthode dite « de l’étalon interne »,
conséquent, il est impossible de leur appliquer la limite de — la méthode dite « des ajouts dosés ».
0,2°. Pour d’autres types d’échantillons (par exemple les La méthode « de l’étalon externe » est la plus générale ; elle
sels inorganiques), il peut être nécessaire d’étendre bien consiste à comparer le diffractogramme X du mélange, ou
au-delà de 40° la région 2θ balayée. Il suffit généralement l’intensité des raies correspondantes, avec le diffractogramme
de couvrir les 10 principales réflexions identifiées dans la ou les raies mesurées pour un mélange de référence, ou
base de données de diffraction X sur poudre monophase. encore avec les intensités théoriques d’un modèle structurel
totalement connu.
Il est parfois difficile, voire impossible, d’identifier les phases
en présence dans les cas suivants : Pour limiter les erreurs dues aux effets de matrice, on peut
utiliser un matériau de référence qui présente une taille
— substances non cristallisées ou amorphes, de cristallites et un coefficient d’absorption des rayons X
— faible proportion en masse des composants à identifier comparables à ceux des composants de l’échantillon, et dont

TE
par rapport aux quantités d’analytes (généralement moins le spectre de diffraction n’interfère en aucun point avec
de 10 pour cent m/m), celui de la substance à analyser. Une quantité connue de ce
— effets prononcés d’orientation préférentielle, matériau de référence est ajoutée à l’échantillon à examiner
et à chaque préparation témoin. Dans ces conditions, il
— absence de la phase à identifier dans la base de données existe une relation linéaire entre l’intensité des raies et la
utilisée, concentration. Cette méthode « de l’étalon interne » exige
— formation de solutions solides, une mesure fidèle des intensités diffractées.
— présence de désordres structurels affectant la maille Dans la méthode « des ajouts dosés », une quantité donnée
élémentaire, de phase a pure est ajoutée au mélange contenant a à une
concentration inconnue. Des ajouts multiples sont ainsi
— existence d’un trop grand nombre de phases dans
l’échantillon,
— présence de déformations du réseau cristallin,
— similarité structurelle de phases différentes.
LÈ effectués pour établir une courbe de l’intensité en fonction
de la concentration ; le point d’intersection (négatif) de cette
courbe avec l’axe des x représente la concentration de la
phase a dans l’échantillon d’origine.
ESTIMATION DES FRACTIONS AMORPHES ET
ANALYSE QUANTITATIVE DES PHASES CRISTALLINES
Si l’échantillon étudié est un mélange d’au moins 2 phases Dans un mélange de phases cristallines et amorphes, il
connues, dont une au maximum est amorphe, il est souvent existe plusieurs moyens d’estimer les fractions de chacune
O
possible de déterminer le pourcentage (en volume ou des phases. Le choix de la méthode dépend de la nature de
en masse) de chaque phase cristalline et de la phase l’échantillon :
amorphe. L’analyse quantitative des phases peut reposer
— si l’échantillon se compose de fractions cristallines et
sur l’intégration des intensités, sur les hauteurs de pics
d’une fraction amorphe de compositions chimiques
de plusieurs raies de diffraction(6) ou sur l’ensemble du
différentes, la quantité de chacune des phases cristallines
diffractogramme. Ces intensités intégrées, hauteurs de
BS

en présence peut être estimée au moyen de substances de


pics ou diffractogrammes sont comparés aux valeurs
référence appropriées, comme décrit précédemment ; la
correspondantes de matériaux de référence. Ceux-ci peuvent
fraction amorphe est alors déduite par soustraction ;
être des substances monophases ou des mélanges de phases
connues. Les difficultés rencontrées en analyse quantitative — si l’échantillon se compose d’une fraction cristalline
sont liées à la préparation de l’échantillon (l’exactitude et et d’une fraction amorphe, en mélange monophase ou
la fidélité des résultats exigent notamment l’homogénéité biphase, de même composition élémentaire, la quantité
de toutes les phases et une distribution granulométrique de phase cristalline (ou « degré de cristallinité ») peut
appropriée au sein de chaque phase) et aux effets de matrice. être estimée à partir de 3 surfaces mesurées sur le
Dans les meilleures conditions, il est possible de déterminer diffractogramme :
dans des matrices solides des quantités de phases cristallines
O

A = surface totale des pics résultant de la diffraction


n’excédant pas 10 pour cent. due à la fraction cristalline de l’échantillon,
B = surface totale sous la surface A,
ÉCHANTILLONS POLYMORPHES
Dans le cas d’un échantillon composé de 2 phases C = surface correspondant au fond (dû à la
polymorphes a et b, l’expression suivante peut être utilisée diffraction diffuse par l’air, à une émission de
pour quantifier la fraction Fa de la phase a : fluorescence, à l’équipement, etc).
Une fois la mesure de ces surfaces obtenue, une
approximation du degré de cristallinité est donnée par la
formule suivante :
La fraction est obtenue en mesurant le rapport des intensités
des 2 phases, la valeur de la constante K étant connue.
K est le rapport Ioa/Iob des intensités absolues des 2 phases Il est à noter que cette méthode ne fournit pas des valeurs
polymorphes pures. Sa valeur peut être déterminée par des absolues du degré de cristallinité, et n’est donc généralement
mesures effectuées sur des échantillons de référence. utilisée qu’à des fins comparatives.
(6) Si la structure cristalline de tous les composants est connue, leur quantification, avec une exactitude satisfaisante, est possible par la méthode de Rietveld. Si la structure cristalline des
composants n’est pas connue, la méthode de Pawley ou la méthode des moindres carrés peuvent être utilisées.

4216 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 2.9.33. Caractérisation de la cristallinité des solides par diffraction X

Il existe par ailleurs des méthodes plus sophistiquées telles paramètres de maille sont relativement larges, la symétrie
que la méthode de Ruland. faible et les propriétés de diffraction généralement très
limitées.
Pour toute forme cristalline donnée d’une substance, la
STRUCTURE DES MONOCRISTAUX connaissance de la structure cristalline permet de calculer
En règle générale, la détermination des structures cristallines le diffractogramme X correspondant et d’établir ainsi
s’effectue à partir des données de diffraction X obtenues un diffractogramme de référence « libre d’orientation
sur des monocristaux. Toutefois, l’analyse structurelle préférentielle » qui peut alors être utilisé pour l’identification
de cristaux organiques est une entreprise ardue, car les des phases.

TE

O
BS
O

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4217
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

TE

O
BS
O

4218 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

4. RÉACTIFS
4.1.1. Réactifs.. ......................................................................... 4221 4.1.3. Solutions tampons.. .....................................................4222
4.1.2. Solutions étalons pour essais limites.......................4222 4.2.2. Solutions titrées............................................................4222

TE

O
BS
O

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4219
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

TE

O
BS
O

4220 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 4.1.1. Réactifs

01/2009:40101 : environ 0,820.


F : 24 à 27 °C.
4.1.1. RÉACTIFS Teneur : au minimum 98,0 pour cent de C12H26O, déterminé
par chromatographie en phase gazeuse.
Acétonitrile deutérié. C22H3N. (Mr 44,1). 1173100.
[2206-26-0]. Lithium (trifluorométhanesulfonate de). CF3LiO3S.
(Mr 156,0). 1173400. [33454-82-9].
Le degré de deutériation est au minimum de 99,8 pour cent.
Liquide limpide, incolore, miscible à l’eau, à l’acétone et au Méthylal. C3H8O2. (Mr 76,1). 1173500. [109-87-5].
méthanol. Diméthoxyméthane. Dioxapentane. Formaldéhyde-
diméthylacétal. Bisoxyde de méthylène et de diméthyle.
: environ 0,78.
Liquide limpide, incolore, volatil et inflammable, soluble
: environ 1,344. dans l’eau et miscible à l’éthanol à 96 pour cent.
Adénine. 1172800. [73-24-5]. : environ 0,860.
Voir Adénine (0800). : environ 1,354.
Eb : environ 41 °C.
Aescine. 1001700. [6805-41-0].

TE
Le méthylal utilisé en chromatographie en phase gazeuse
Mélange de saponosides apparentés, obtenu à partir des satisfait également à l’essai suivant.
graines d’Aesculus hippocastanum L. Teneur : au minimum 99,5 pour cent, déterminé par
Poudre amorphe, fine, pratiquement blanche ou légèrement chromatographie gazeuse.
jaunâtre ou rougeâtre.
3-Pentanone. C5H10O. (Mr 86,13). 1173600. [96-22-0].
Chromatographie. Examinez comme prescrit dans la Diéthylcétone.
monographie Racine de polygala (0202) en déposant 20 μl
de la solution. Après pulvérisation de la solution d’aldéhyde β-Pinène. C10H16. (Mr 136,2). 1109000. [127-91-3].
anisique R et chauffage, le chromatogramme présente une
LÈ 6,6-Diméthyl-2-méthylènedicyclo[3.1.1]heptane.
bande principale dont le RF est environ 0,4. Liquide huileux, incolore, d’odeur rappelant celle de
l’essence de térébenthine, pratiquement insoluble dans l’eau,
Cadmium. Cd. (Ar 112,4). 1014100. [7440-43-9]. miscible à l’éthanol à 96 pour cent.
Métal blanc argent brillant, pratiquement insoluble dans
Le β-pinène utilisé en chromatographie en phase gazeuse
l’eau, facilement soluble dans l’acide nitrique et dans l’acide
satisfait également à l’essai suivant.
chlorhydrique chaud.
Dosage. Opérez par chromatographie en phase gazeuse
Calcium édétate de sodium. 1174000. [62-33-9]. (2.2.28) comme prescrit dans la monographie Huile
Voir calcium édétate de sodium (0231). essentielle de fleur d’oranger amer (1175).
O
Solution à examiner. Le β-pinène à examiner.
Chrome(III) (acétylacétonate de). C15H21CrO6. (Mr 349,3). Teneur : au minimum 99,0 pour cent.
1172900. [21679-31-2]. (OC-6-11)-Tris(2,4-pentanedionato-
κO,κO′)chrome. Poly(cyanopropylphényl)(14)(méthyl)(86)siloxane.
1173700.
Eau. 1095500. Phase stationnaire pour chromatographie.
BS

Eau distillée désionisée. 1095508. Contient 14 pour cent de groupes cyanopropylphényle et


86 pour cent de groupes méthyle.
Eau R désionisée, préparée par distillation, avec une
résistivité d’au minimum 0,18 Mohm·m. Schisandrine. C24H32O7. (Mr 432,5). 1173800.
[7432-28-2]. Schisandrol A. Wuweizichun A.
Endoprotéase LysC. 1173200. (6S,7S,12aRa)-5,6,7,8-Tétrahydro-1,2,3,10,11,12-
Enzyme protéolytique microbienne extracellulaire sécrétée hexaméthoxy-6,7-diméthyldibenzo[a,c]cyclooctan-6-ol.
par Achromobacter lyticus. Poudre lyophilisée, exempte de Poudre cristalline, blanche ou sensiblement blanche.
sels. La schisandrine utilisée dans le dosage de la monographie
O

Fruit de schisandra de Chine (2428) satisfait également aux


Formamide. CH3NO. (Mr 45,0). 1039200. [75-12-7].
conditions suivantes.
Liquide huileux, limpide et incolore, hygroscopique, Dosage. Chromatographie liquide (2.2.29) selon les
miscible à l’eau et à l’éthanol à 96 pour cent. Le formamide conditions données dans la monographie Fruit de
s’hydrolyse dans l’eau. schisandra de Chine (2428) : utilisez le procédé de
: environ 1,134. normalisation.
Eb : environ 210 °C. Teneur : au minimum 95 pour cent.
Teneur : au minimum 99,5 pour cent. Conservation : en récipient étanche, à une température
inférieure ou égale à − 20 °C.
Conservation : en récipient étanche.
γ-Schisandrine. C23H28O6. (Mr 400,5). 1173900.
Glutamyl endopeptidase pour cartographie peptidique. [61281-37-6]. Schisandrine B. Wuweizisu B.
1173300. [137010-42-5]. Endoprotéinase Glu-C hautement rac-(6R,7S,13aRa)-1,2,3,13-Tetraméthoxy-6,7-diméthyl-5,6,7,
purifiée de la souche V8 de Staphylococcus aureus 8-tétrahydrobenzo[3,4]cycloocta[1,2-f][1,3]benzodioxole.
(EC 3.4.21.19).
Poudre cristalline, blanche ou sensiblement blanche.
Laurique (alcool). C12H26O. (Mr 186,3). 1119900. [112-53-8]. Conservation : en récipient étanche, à une température
Dodécan-1-ol. inférieure ou égale à − 20 °C.

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4221
4.1.2. Solutions étalons pour essais limites PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

Solution de coloration au Coomassie R1. 1173000. Détermination du titre : effectuez le dosage du magnésium
Dissolvez 0,275 g de bleu brillant R dans 200 ml de par complexométrie (2.5.11).
méthanol R. Agitez jusqu’à dissolution complète des cristaux
(pendant environ 2 h). Ajoutez 750 ml d’eau R et 50 ml
d’acide acétique glacial R. Continuez à agitez pendant toute
la nuit (pendant au moins 16 h). Filtrez. 01/2009:40103
1,3,4,6-Tétra-O-acétyl-β-D-mannopyranose. C14H20O10.
(Mr 348,3). 1174100. [18968-05-3]. 4.1.3. SOLUTIONS TAMPONS
Poudre ou cristaux incolores ou blancs. Solution tampon tris-chlorhydrate pH 9,0 (0,05 M).
F : 160 °C à 161 °C. 4013500.
: − 68, déterminé avec une solution à 7 g/l dans le Dissolvez 0,605 g de tris(hydroxyméthyl)aminométhane R
chlorure de méthylène R. dans de l’eau R. Ajustez le pH (2.2.3) avec de l’acide
Tétrazolium (sel de). C20H17N5O6S2. (Mr 487,5). 1174200. chlorhydrique 1 M et complétez à 100,0 ml avec de l’eau R.
[138169-43-4]. Sel interne du 5-(3-carboxyméthoxyphényl)-
3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2-(4-sulfophényl)-2H-tétrazolium.
MTS.

TE
01/2009:40202
01/2009:40102
4.2.2. SOLUTIONS TITRÉES
4.1.2. SOLUTIONS ÉTALONS POUR
ESSAIS LIMITES Lanthane (nitrate de) 0,1 M. 3010100.
Dissolvez 43,30 g de nitrate de lanthane R dans de l’eau R
Solution à 3 ppm d’ammonium (NH4). 5006100. et complétez à 1000,0 ml avec le même solvant.
Dissolvez dans de l’eau R une quantité de chlorure Détermination du titre. A 20 ml de la solution de
d’ammonium R correspondant à 0,889 g de NH4Cl et
LÈ nitrate de lanthane, ajoutez 15 ml d’eau R et 25 ml
complétez à 1000,0 ml avec le même solvant ; diluez au d’édétate de sodium 0,1 M. Ajoutez environ 50 mg de
1/100 avec de l’eau R immédiatement avant l’emploi. mélange composé au xylénolorange R et environ 2 g
Solution à 1000 ppm de magnésium (Mg). 5006200. d’hexaméthylènetétramine R. Titrez par le sulfate de zinc
Dissolvez 5,275 g de nitrate de magnésium R dans 16 ml 0,1 M jusqu’à virage du jaune au rose-violet.
d’acide nitrique dilué R et complétez à 500,0 ml avec de 1 ml d’édétate de sodium 0,1 M correspond à 43,30 mg de
l’eau R. La(NO3)3,6H2O.
O
BS
O

4222 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

5.1. TEXTES GÉNÉRAUX


SUR LA MICROBIOLOGIE
5.1.4. Qualité microbiologique des préparations 5.1.5. Application du concept F0 à la stérilisation par la
pharmaceutiques et des substances pour usage vapeur des préparations aqueuses.....................................4226
pharmaceutique non stériles...............................................4225 5.1.9. Indications sur l’application de l’essai de stérilité.. 4227

TE

O
BS
O

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4223
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

TE

O
BS
O

4224 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 5.1.4. Qualité microbiologique des produits pharmaceutiques non stériles

01/2009:50104 5.1.4.-2 donnent des critères d’acceptation applicables


aux produits pharmaceutiques non stériles sur la base du
dénombrement des germes aérobies totaux (DGAT) et du
5.1.4. QUALITÉ MICROBIOLOGIQUE dénombrement des moisissures/levures totales (DMLT).
DES PRÉPARATIONS Ces critères d’acceptation reposent sur des résultats
individuels, ou sur des résultats moyens lorsque l’on effectue
PHARMACEUTIQUES ET DES plusieurs dénombrements (réplicats), par exemple pour les
SUBSTANCES POUR USAGE dénombrements sur plaques.
PHARMACEUTIQUE NON STÉRILES Lorsqu’un critère d’acceptation est prescrit en matière de
qualité microbiologique, il est interprété comme suit :
— 101 UFC : nombre maximal acceptable = 20 ;
La présence de certains microorganismes dans des — 102 UFC : nombre maximal acceptable = 200 ;
préparations non stériles peut réduire voire annuler l’activité
thérapeutique du produit, et constitue un danger potentiel — 103 UFC : nombre maximal acceptable = 2000, et ainsi
pour la santé du patient. Les fabricants sont donc tenus de suite.
d’assurer une faible charge microbienne (biocharge) dans les

TE
formes pharmaceutiques finies, par la mise en oeuvre des Tableau 5.1.4.-2. – Critères d’acceptation de la
textes en vigueur sur les Bonnes Pratiques de Fabrication qualité microbiologique des substances pour usage
au cours de la fabrication, de la conservation et de la pharmaceutique non stériles
distribution des préparations pharmaceutiques. DGAT DMLT
Le contrôle microbiologique des produits non stériles (UFC/g ou UFC/ml) (UFC/g ou UFC/ml)
est réalisé selon les méthodes décrites dans les chapitres Substances pour
10 3
102
généraux 2.6.12 et 2.6.13. Les tableaux 5.1.4.-1 et usage pharmaceutique

Voie d’administration

Tableau 5.1.4.-1. – Critères d’acceptation de la qualité microbiologique des formes pharmaceutiques non stériles
DGAT DMLT
Microorganismes spécifiés
(UFC/g ou UFC/ml) (UFC/g ou UFC/ml)
Voie orale : préparations non aqueuses 103 102 Absence d’Escherichia coli (1 g ou 1 ml)
Voie orale : préparations aqueuses 102 101 Absence d’Escherichia coli (1 g ou 1 ml)
O
Voie rectale 103 102 -
Voie buccale
Voie gingivale
Absence de Staphylococcus aureus (1 g ou 1 ml)
Voie cutanée 102 101
Absence de Pseudomonas aeruginosa (1 g ou 1 ml)
Voie nasale
Voie auriculaire
BS

Absence de Pseudomonas aeruginosa (1 g ou 1 ml)


Voie vaginale 102 101 Absence de Staphylococcus aureus (1 g ou 1 ml)
Absence de Candida albicans (1 g ou 1 ml)
Voie transdermique (limites pour un dispositif Absence de Staphylococcus aureus (1 dispositif)
transdermique, film protecteur et support 102 101
compris) Absence de Pseudomonas aeruginosa (1 dispositif)
Absence de Staphylococcus aureus (1 g ou 1 ml)
Inhalation (des exigences spécifiques
2 1 Absence de Pseudomonas aeruginosa (1 g ou 1 ml)
s’appliquent aux préparations liquides 10 10
dispensées au moyen de nébuliseurs) Absence de bactéries gram-négatives résistantes
O

aux sels biliaires (1 g ou 1 ml)


Disposition spéciale de la Ph. Eur. pour
les préparations pour administration par
voie orale contenant des matières premières Au maximum 102 UFC de bactéries gram-négatives
d’origine naturelle (animale, végétale résistantes aux sels biliaires (1 g ou 1 ml)
ou minérale), lorsqu’un prétraitement 104 102 Absence de salmonelles (10 g ou 10 ml)
antimicrobien est impossible et que l’Autorité Absence d’Escherichia coli (1 g ou 1 ml)
compétente admet une DGAT des matières Absence de Staphylococcus aureus (1 g ou 1 ml)
premières supérieure à 103 UFC par gramme
ou par millilitre.
Disposition spéciale de la Ph. Eur. pour les
médicaments à base de plantes exclusivement
composés d’une ou plusieurs drogues
végétales (entières, divisées ou en poudre) :
— médicaments à base de plantes dont Au maximum 102 UFC d’Escherichia coli
107 105
l’emploi fait intervenir de l’eau bouillante (voir annexe) (1 g ou 1 ml)
— médicaments à base de plantes dont Au maximum 103 UFC de bactéries gram-négatives
105 104
l’emploi ne fait pas intervenir d’eau bouillante résistantes aux sels biliaires (1 g ou 1 ml)
Absence d’Escherichia coli (1 g ou 1 ml)
Absence de salmonelles (10 g ou 10 ml)

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4225
5.1.5. Concept F0 et stérilisation par la vapeur PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

Le tableau 5.1.4.-1 comprend une liste de microorganismes Interprétation. La croissance de colonies indique la présence
spécifiés pour lesquels sont établis des critères d’acceptation. possible d’E. coli, à confirmer par des essais d’identification.
Cette liste n’est pas forcément exhaustive et la recherche
d’autres microorganismes peut être nécessaire pour une Notez la plus petite quantité de produit qui donne un résultat
préparation donnée, selon la nature de la matière de départ positif et la plus grande quantité de produit qui donne un
et le procédé de fabrication. résultat négatif.

S’il a été démontré qu’aucune des recherches prescrites ne Déterminez le nombre probable de bactéries à l’aide du
permet un dénombrement valide des microorganismes au tableau suivant.
niveau prescrit, une méthode validée ayant une limite de
Résultats obtenus avec une quantité Nombre probable de
détection aussi proche que possible du critère d’acceptation de produit de bactéries par gramme
indiqué est utilisée. 0,1 g ou 0,01 g ou 0,001 g ou ou millilitre de produit
0,1 ml 0,01 ml 0,001 ml
Outre les microorganismes cités dans le tableau 5.1.4.-1, + + + > 103
l’importance à accorder à la présence d’autres
microorganismes doit être évaluée au regard de différents + + - < 103 et > 102
facteurs : + - - < 102 et > 10

TE
— utilisation du produit : risque variable selon la voie - - - < 10
d’administration (ophtalmique, nasale, respiratoire) ;
— nature du produit : aptitude à favoriser la croissance
microbienne, propriétés antimicrobiennes adéquates ;
— mode d’administration ;
— catégorie de patients visée : risque potentiellement 01/2009:50105
différent pour les nourrissons, les jeunes enfants, les

personnes fragiles ;
5.1.5. APPLICATION DU CONCEPT F0
— emploi d’agents immunosuppresseurs, de
corticostéroïdes ; À LA STÉRILISATION PAR LA VAPEUR
DES PRÉPARATIONS AQUEUSES
— existence de pathologies, de blessures, de lésions
organiques.
Le chapitre suivant est publié à titre d’information.
Lorsqu’elle est justifiée, une évaluation des facteurs
La valeur F0 associée à un procédé de stérilisation par la
O
en cause, au regard du risque induit, est conduite par
du personnel disposant d’une formation spécialisée en vapeur saturée exprime sa létalité, en termes de temps (en
analyse microbiologique et interprétation des données minutes) d’exposition à une température de 121 °C qui
microbiologiques. Pour les matières premières, cette serait nécessaire pour obtenir le même résultat qu’avec le
évaluation tient compte du traitement auquel est soumis procédé utilisé, appliqué au produit dans son récipient final,
le produit, des techniques actuelles de contrôle et de la par rapport à des microorganismes possédant une valeur Z
BS

disponibilité de produits de la qualité désirée. théorique de 10.


La F0 totale d’un procédé prend en compte les phases de
montée en température et de refroidissement du cycle, et
Annexe : disposition spéciale de la Ph. Eur. peut être calculée par intégration par rapport au temps des
taux de létalité associés à des intervalles de température
pour les médicaments à base de plantes discrets.
exclusivement composés d’une ou plusieurs
Lorsqu’un cycle de stérilisation par la vapeur est choisi sur
drogues végétales (entières, divisées ou en la base du concept F0, il faut s’assurer qu’il permet d’obtenir
poudre) : recherche quantitative d’E. coli de façon constante une assurance de stérilité adéquate.
O

Pour valider le procédé, il peut également être nécessaire


d’effectuer un suivi microbiologique continu et rigoureux
Opérez selon le protocole suivant. pendant la production de routine, afin de démontrer que
Préparation des échantillons et pré-incubation. Préparez les paramètres microbiologiques restent compris dans
un échantillon comme décrit dans le chapitre 2.6.12, en les tolérances établies, de façon à donner un NAS d’au
utilisant une dilution au 1/10 d’au moins 1 g du produit moins 10− 6.
à examiner, et ensemencez une quantité appropriée
(déterminée comme indiqué sous 3-4 dans le chapitre 2.6.13) Dans le contexte de la stérilisation par la vapeur, la valeur Z
de milieu liquide aux peptones de caséine et de soja avec caractérise la résistance d’un microorganisme aux variations
des quantités d’échantillon correspondant respectivement à de température. Elle est définie comme la variation de
0,1 g, 0,01 g et 0,001 g (ou 0,1 ml, 0,01 ml et 0,001 ml) de température nécessaire pour modifier la valeur D d’un
produit. Mélangez, puis incubez à 30-35 °C pendant 18-24 h. facteur 10.
Sélection et subculture. Agitez le récipient, puis transférez La valeur D est la valeur d’un paramètre de stérilisation
1 ml de milieu liquide aux peptones de caséine et de soja (durée ou dose absorbée) nécessaire pour réduire
dans 100 ml de milieu liquide de MacConkey et incubez à jusqu’à 10 pour cent de sa valeur initiale le nombre de
42-44 °C pendant 24-48 h. Repiquez sur du milieu gélosé de microorganismes viables. La valeur D n’a de signification
MacConkey et incubez à 30-35 °C pendant 18-72 h. que dans des conditions expérimentales bien définies.

4226 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 5.1.9. Indications sur l’application de l’essai de stérilité

Il existe entre ces différents paramètres les relations contrôlé) est fonction de l’homogénéité du lot, des conditions
mathématiques suivantes : de fabrication et de l’efficacité du plan d’échantillonnage
adopté. C’est pourquoi, pour les besoins du présent texte, le
lot est défini comme un ensemble homogène de récipients
scellés préparés de telle sorte que le risque de contamination
D121 = valeur D des spores de référence (5.1.2) à 121 °C, soit le même pour chacune des unités composantes.
N0 = nombre initial de microorganismes viables, Dans le cas des produits faisant l’objet d’une stérilisation
terminale, l’assurance qu’apportent des preuves physiques,
N = nombre final de microorganismes viables, biologiquement fondées et enregistrées automatiquement,
IF = facteur d’inactivation. démontrant que le traitement de stérilisation a été
correctement appliqué à l’ensemble du lot, est supérieure
à celle qu’apporte l’essai de stérilité. Les circonstances
dans lesquelles il est admis de recourir à la libération
paramétrique sont décrites dans le chapitre 5.1.1. Méthodes
D1 = valeur D du microorganisme à la température T1, de préparation des produits stériles. La simulation avec des
témoins-milieux peut être utilisée pour évaluer l’asepsie d’un
D2 = valeur D du microorganisme à la température T2. procédé de fabrication. Ceci mis à part, l’essai de stérilité

TE
reste la seule méthode analytique qui convient aux produits
préparés dans des conditions aseptiques ; il constitue par
ailleurs, dans tous les cas, la seule méthode analytique à
disposition des autorités amenées à contrôler la stérilité d’un
t = temps d’exposition, échantillon du produit.
D = valeur D du microorganisme dans les conditions La probabilité de détecter des microorganismes par l’essai
d’exposition. de stérilité augmente avec leur nombre dans l’échantillon
contrôlé et varie selon la capacité de croissance des espèces
microbiennes présentes. La probabilité de détection d’une
très faible contamination même uniformément répartie au

5.1.9. INDICATIONS SUR



01/2009:50109 sein du lot est très réduite. L’interprétation des résultats
de l’essai de stérilité repose sur l’hypothèse que tous les
récipients constituant le lot donneraient le même résultat
si leur contenu était contrôlé. Comme il est à l’évidence
L’APPLICATION DE L’ESSAI DE impossible de contrôler chacun des récipients, il convient
d’appliquer un plan d’échantillonnage approprié. Dans
STÉRILITÉ le cas de la production dans des conditions aseptiques, il
est recommandé d’examiner des échantillons répartis en
L’objectif de l’essai de stérilité (2.6.1), comme celui
récipients en début et en fin de lot et après toute intervention
O
de tout essai de la Pharmacopée, est d’apporter à un
significative.
analyste-contrôleur indépendant les moyens de vérifier qu’un
produit particulier répond aux exigences de la Pharmacopée OBSERVATION ET INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS
Européenne. Un fabricant n’est pas tenu d’effectuer l’essai,
Les techniques microbiologiques/biochimiques
pas plus qu’il ne lui est interdit d’appliquer des variantes
conventionnelles sont généralement satisfaisantes pour
de la méthode spécifiée ou des méthodes alternatives à
BS

l’identification des microorganismes isolés lors de l’essai


condition qu’il ait établi que le produit en question, s’il était
de stérilité. Néanmoins, si un fabricant souhaite utiliser
contrôlé par la méthode officielle, satisferait aux exigences
la condition (d) comme critère unique d’invalidation d’un
de la Pharmacopée Européenne.
essai de stérilité, il peut être nécessaire de recourir à des
PRÉCAUTIONS CONCERNANT LA CONTAMINATION techniques de typage sensibles pour démontrer qu’un
MICROBIENNE microorganisme isolé à partir du produit examiné est
identique à un microorganisme isolé à partir du matériel
Les conditions aseptiques requises pour effectuer l’essai de et/ou de l’environnement d’essai. En effet, si les techniques
stérilité peuvent être réalisées, par exemple, sous une hotte microbiologiques/biochimiques d’identification de routine
à flux laminaire de classe A située dans une salle propre de permettent d’établir la non-identité de 2 isolats, elles ne sont
classe B ou dans un isolateur.
O

pas toujours suffisamment sensibles ou fiables pour apporter


la preuve absolue que 2 isolats proviennent de la même
INDICATIONS À L’INTENTION DES FABRICANTS source. Il peut être nécessaire de recourir à des méthodes
Le niveau d’assurance qu’apporte, quant à la qualité globale plus sensibles, par exemple un typage moléculaire basé sur le
du lot, l’obtention d’un résultat satisfaisant à l’essai de pourcentage d’homologie ARN/ADN, pour établir la parenté
stérilité (absence d’unités contaminées dans l’échantillon clonale et l’origine commune des microorganismes.

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4227
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

TE

O
BS
O

4228 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

5.2. TEXTES GÉNÉRAUX


SUR LES PRODUITS
BIOLOGIQUES
5.2.3. Substrats cellulaires utilisés pour la production de
vaccins pour usage humain................................................. 4231

TE

O
BS
O

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4229
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

TE

O
BS
O

4230 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 5.2.3. Substrats cellulaires pour vaccins pour usage humain

01/2009:50203 Lignées cellulaires continues. Une lignée cellulaire continue


possède une capacité illimitée de multiplication in vitro ; les
5.2.3. SUBSTRATS CELLULAIRES cellules présentent souvent des différences de caryotype avec
UTILISÉS POUR LA PRODUCTION DE les cellules d’origine ; elles peuvent être obtenues à partir
d’un tissu sain ou d’un tissu tumoral.
VACCINS POUR USAGE HUMAIN Dans le cas de vaccins injectables préparés sur une lignée
Le présent chapitre général traite des lignées de cellules cellulaire continue, le procédé de purification est validé afin
diploïdes et des lignées cellulaires continues utilisées de démontrer la réduction du taux d’ADN provenant des
pour la production de vaccins pour usage humain ; cellules du substrat jusqu’à un niveau équivalent à 10 ng
certains points spécifiques aux vaccins préparés par la par dose humaine unitaire au maximum, sauf indication
méthode dite de l’ADN recombinant sont traités dans la contraire.
monographie Produits obtenus par la méthode dite de Système de banques de cellules. La production de vaccins
l’ADN recombinant (0784). Le tableau 5.2.3.-1 donne la en lignées cellulaires continues ou en lignées cellulaires
liste des essais à effectuer aux différentes étapes (cellules de diploïdes est fondée sur un système de banques de cellules.
semence, banque de cellules primaire, banque de cellules L’âge in vitro des cellules est compté à partir du lot de
de travail, cellules appartenant à un niveau de doublement semence primaire. Chaque banque de cellules de travail est
de population au moins égal au niveau maximal qui sera

TE
préparée à partir d’un ou plusieurs récipients de la banque
utilisé pour la production). Les dispositions générales de cellules primaire. L’utilisation, l’identité et l’inventaire
concernant l’utilisation des lignées cellulaires et l’application des récipients sont minutieusement notés.
des méthodes d’essai figurent ci-après. Lorsqu’un vaccin est
produit au moyen de cellules primaires ou de cellules n’ayant Milieux et substances d’origine humaine et animale.
subi qu’un faible nombre de passages, sans constitution La composition des milieux utilisés pour l’isolement et
de banque cellulaire, les exigences applicables à ce vaccin l’ensemble des cultures ultérieures est minutieusement
figurent dans la monographie le concernant. notée ; si des substances d’origine humaine ou animale sont
utilisées, elles sont exemptes d’agents étrangers.
Lignées cellulaires diploïdes. Une lignée cellulaire diploïde
possède une capacité élevée mais définie de multiplication
LÈ Si de l’albumine humaine est utilisée, elle est conforme à la
in vitro. monographie Solution d’albumine humaine (0255).

Tableau 5.2.3.-1. — Essais effectués sur les lignées de cellules


Essai Cellules de Banque de cellules Banque de cellules Cellules à un niveau de
semence primaire de travail doublement de population
(BCP) (BCT) au moins égal au niveau
maximal qui sera utilisé pour
la production
1. IDENTITÉ ET PURETÉ
O
Morphologie + + + +

Empreinte génomique et sélection appropriée parmi + + + +


les essais suivants : biochimique (par ex. isoenzymes),
immunologique (par ex. histocompatibilité), marqueurs
cytogénétiques
BS

Caryotype (lignées diploïdes) + + +(1) +(1)

Durée de vie (lignées diploïdes) − + + −

2. AGENTS ÉTRANGERS
Contamination bactérienne et fongique − + + −

Mycoplasmes − + + −

Essais sur cultures cellulaires − − + −

Co-culture − − +(2)
+(2)
O

Essais sur animaux et sur oeufs − − +(2) +(2)

Recherche spécifique de contaminants potentiels selon − − +(2) +(2)


l’origine des cellules (voir « Agents contaminants
infectieux », ci-dessus)
Rétrovirus − +(3) − +(3)

3. TUMORIGÉNICITÉ
Tumorigénicité +(5) − − +(4)

(1) Le caractère diploïde est démontré pour chaque banque de cellules de travail mais en utilisant des cellules à un niveau de doublement de population
au moins égal au niveau maximal qui sera utilisé pour la production.
(2) Essai effectué pour chaque banque de cellules de travail mais en utilisant des cellules à un niveau de doublement de population au moins égal
au niveau maximal qui sera utilisé pour la production.
(3) Essai effectué pour la banque de cellules primaire mais en utilisant des cellules à un niveau de doublement de population au moins égal au niveau
maximal qui sera utilisé pour la production.
(4) Les lignées cellulaires MRC-5, WI-38 et FRhL-2 sont reconnues comme non tumorigènes et ne nécessitent pas d’essai de tumorigénicité. Les essais de
tumorigénicité ne sont pas non plus réalisés sur les lignées cellulaires à tumorigénicité connue ou présumée.
(5) Essai effectué sur les cellules de semence mais en utilisant des cellules à un niveau de doublement de population au moins égal au niveau maximal qui
sera utilisé pour la production.

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4231
5.2.3. Substrats cellulaires pour vaccins pour usage humain PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

Il est démontré, par des essais appropriés, que les Agents contaminants infectieux. Les lignées cellulaires
sérums d’origine bovine utilisés pour la préparation et utilisées pour la production de vaccins doivent être exemptes
la maintenance des cultures cellulaires sont stériles et d’agents contaminants infectieux. Des recherches d’agents
indemnes de virus bovins, notamment du virus de la diarrhée contaminants sont effectuées comme indiqué dans le
des bovidés, ainsi que de mycoplasmes. tableau 5.2.3.-1.
Des essais appropriés sont effectués sur la trypsine utilisée Selon l’origine et l’historique de culture de la lignée
pour la préparation des cultures cellulaires pour démontrer cellulaire, la recherche de certains contaminants spécifiques
la stérilité et l’absence de mycoplasmes et de virus, potentiels peut être nécessaire, notamment ceux réputés
notamment les pestivirus et parvovirus. constituer des agents infectieux latents de l’espèce d’origine
(par exemple le virus simien 40 pour le macaque rhésus).
Cellules de semence. Les données sur la base desquelles est Dans le cas des lignées cellulaires provenant de rongeurs,
évaluée l’acceptabilité des cellules de semence comprennent, des essais de production d’anticorps sont effectués sur la
chaque fois qu’il est possible, des indications sur leur souris, le rat et le hamster pour détecter d’éventuels virus
provenance, leur historique et leur caractérisation. spécifiques de l’espèce.
Provenance des cellules de semence. Pour les lignées Les lignées cellulaires font l’objet d’une recherche de
cellulaires humaines, le dossier contient les informations rétrovirus comme décrit ci-après. Si la présence de rétrovirus
capables de réplication est détectée, la lignée cellulaire

TE
suivantes concernant le donneur : origine ethnique et
géographique, âge, sexe, état physiologique général, tissu concernée n’est pas acceptable pour la production de
ou organe utilisé, résultats des éventuelles recherches de vaccins.
pathogènes. Tumorigénicité. Pour la préparation de vaccins vivants, la
lignée cellulaire ne doit pas être tumorigène aux niveaux
Pour les lignées cellulaires animales, le dossier contient de doublements de population utilisés pour la production.
les informations suivantes concernant la provenance des Si une lignée cellulaire tumorigène est utilisée pour
cellules : espèce, lignée, conditions d’élevage, origine la préparation d’autres types de vaccin, le procédé de
géographique, âge, sexe, état physiologique général, tissu purification est validé afin de démontrer que le taux d’ADN
ou organe utilisé, résultats des éventuelles recherches de
LÈ provenant des cellules du substrat est réduit à un niveau
pathogènes. équivalent à 10 ng au maximum par dose humaine unitaire
Les cellules d’origine neurale (par exemple les du vaccin, sauf indication contraire, et que le taux des
neuroblastomes et les cellules P12) peuvent contenir des protéines provenant des cellules du substrat est réduit à un
substances qui concentrent les agents des encéphalopathies niveau acceptable.
spongiformes ; ces cellules ne sont pas utilisées pour la Si une lignée cellulaire possède un potentiel tumorigène
production de vaccins. reconnu, il n’est pas nécessaire de procéder à des essais
de tumorigénicité. Si le potentiel tumorigène d’une lignée
Historique des cellules de semence. Le dossier contient cellulaire est inconnu, cette lignée sera soit considérée
les informations suivantes : méthode utilisée pour isoler comme tumorigène, soit soumise à un essai de tumorigénicité
O
les cellules de semence, les méthodes de culture et toute in vitro comme décrit plus loin ; si le résultat de l’essai
autre procédure utilisée pour établir la banque de cellules in vitro est négatif ou s’il n’est pas clairement positif, la
primaire, notamment celles susceptibles d’entraîner une lignée fera l’objet d’un essai in vivo comme décrit plus loin.
exposition des cellules à des agents étrangers. Les essais seront effectués sur des cellules appartenant à
un niveau de doublement de population au moins égal au
Les informations disponibles sur les ingrédients des milieux niveau maximal qui sera utilisé pour la production.
BS

antérieurement utilisés pour la culture des cellules, par


exemple la provenance des substances d’origine animale, Les lignées de cellules diploïdes MRC-5, WI-38 et FRhL-2
sont parfois incomplètes ; dans les cas justifiés et autorisés, sont reconnues comme non tumorigènes et ne nécessitent
des banques de cellules déjà établies à l’aide de tels milieux donc pas d’essai de tumorigénicité.
peuvent néanmoins être utilisées pour la production de Caractérisation chromosomique. La diploïdie des lignées de
vaccins. cellules diploïdes doit être démontrée ; une caractérisation
plus poussée par analyse du caryotype est nécessaire si
Caractérisation des cellules de semence. La caractérisation l’élimination des cellules intactes pendant le traitement après
des cellules porte sur les aspects suivants : la récolte n’a pas été validée. Des échantillons provenant
O

(1) identité (par exemple : isoenzymes, sérologie, empreinte de 4 niveaux de passage régulièrement distribués sur la
génomique), durée de vie de la lignée cellulaire sont examinés. Chaque
examen porte sur au moins 200 cellules en métaphase, pour
(2) caractéristiques de croissance et propriétés vérification du nombre exact de chromosomes et évaluation
morphologiques (microscopie optique et électronique), de la fréquence d’hyperploïdie, d’hypoploïdie, de polyploïdie,
de cassures et d’anomalies structurelles.
(3) caryotype des lignées cellulaires diploïdes, Les lignées de cellules MRC-5, WI-38 et FRhL-2 sont
(4) durée de vie in vitro des lignées cellulaires diploïdes, en reconnues comme étant diploïdes, et bien caractérisées ;
termes de niveaux de doublement de population. lorsqu’elles n’ont pas été génétiquement modifiées, une
caractérisation plus poussée n’est pas nécessaire.
Stabilité des substrats cellulaires. Il doit être démontré
que la lignée cellulaire a une viabilité appropriée dans les MÉTHODES D’ESSAI APPLICABLES AUX CULTURES
conditions prévues pour la conservation. Pour chaque CELLULAIRES
produit préparé à l’aide de la lignée cellulaire, il est
nécessaire de démontrer qu’une production reproductible Identification. L’identité des cellules est établie sur la
peut être obtenue avec des cellules appartenant à des base de l’empreinte génomique et d’un choix approprié des
niveaux de passage situés au début et à la fin de la durée aspects suivants :
d’utilisation prévue. (1) caractéristiques biochimiques (analyse des isoenzymes),

4232 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 5.2.3. Substrats cellulaires pour vaccins pour usage humain

(2) caractéristiques immunologiques (antigènes valable si moins de 80 pour cent des animaux de chaque
d’histocompatibilité), groupe restent en bonne santé et survivent jusqu’à la fin de
(3) marqueurs cytogénétiques. la période d’observation.
Dans le cas de cellules de rongeurs (par exemple les cellules
Cellules contaminantes. L’empreinte génomique effectuée ovariennes de hamster chinois ou les cellules rénales de
aux fins d’identification sert également à démontrer hamster nouveau-né), effectuez sur les animaux auxquels ont
l’absence de cellules contaminantes. été injectées les cellules des recherches d’anticorps dirigés
Contamination bactérienne et fongique. La banque de contre les contaminants viraux potentiels de l’espèce.
cellules primaire et chaque banque de cellules de travail Essais sur œufs. Injectez au moins 106 cellules viables par
satisfont à l’essai de stérilité (2.6.1), effectué sur 10 ml du œuf dans la cavité allantoïdienne de 10 œufs de poules
surnageant des cultures cellulaires pour chaque milieu et sur EOPS embryonnés (5.2.2) âgés de 9-11 jours, et dans le
1 pour cent des récipients, avec un minimum de 2 récipients. sac vitellin de 10 œufs de poules EOPS embryonnés âgés
Mycoplasmes (2.6.7). La banque de cellules primaire et de 5-6 jours. Placez en incubation pendant au minimum
chaque banque de cellules de travail satisfont à l’essai 5 jours. Procédez à une recherche d’hémagglutinines sur les
des mycoplasmes, effectué sur un ou plusieurs récipients liquides allantoïdiens à l’aide d’érythrocytes mammaliens et
par la méthode dite en culture et par la méthode dite aviaires ; effectuez l’essai à une température de 5 ± 3 °C et
d’épifluorescence en cultures cellulaires. à une température de 20-25 °C et lisez les résultats après

TE
Recherche des agents étrangers sur cultures cellulaires. 30-60 min. Les cellules satisfont à l’essai si aucun signe de
Les cellules satisfont à l’essai des virus hémadsorbants et présence d’agents étrangers n’est observé. L’essai n’est
aux essais de recherche des agents étrangers sur culture pas valable si moins de 80 pour cent des embryons restent
cellulaire qui sont décrits dans le chapitre 2.6.16 sous en bonne santé et survivent jusqu’à la fin de la période
« Culture cellulaire de production : cellules témoins ». Si d’observation.
les cellules sont d’origine simienne, elles sont également Essais de tumorigénicité in vitro. Les essais suivants
inoculées à des cultures de cellules rénales de lapin pour une peuvent être utilisés :
recherche de l’herpèsvirus B (herpèsvirus cercopithécin 1). (1) formation de colonies en gélose molle,
Co-culture. Co-cultivez séparément des cellules intactes (2) production d’une croissance cellulaire envahissante après

et des cellules lysées avec d’autres systèmes cellulaires
comprenant des cellules humaines et des cellules simiennes.
Recherchez l’apparition d’éventuels changements
morphologiques. Effectuez sur les liquides de culture une
inoculation à des cultures d’organes,
(3) étude du pouvoir transformant au moyen, par exemple,
du système d’épreuve 3T3 qui met en évidence la présence
d’oncogènes activés.
recherche de virus hémagglutinants. Les cellules satisfont à
l’essai s’il n’y a aucune indication de la présence d’un agent Essais de tumorigénicité in vivo. L’essai consiste à établir
étranger. une comparaison entre la lignée cellulaire continue et
un témoin positif approprié (cellules HeLa ou Hep2, par
Rétrovirus. Recherchez la présence éventuelle de rétrovirus : exemple).
O
(1) par une recherche de transcriptase inverse (essai PERT - Les systèmes animaux suivants sont appropriés :
product-enhanced reverse transcriptase) (2.6.21) effectuée (1) souris athymiques (génotype Nu/Nu),
sur les surnageants des banques cellulaires en utilisant les
(2) souris, rats ou hamsters nouveau-nés ayant été traités par
cellules à un niveau de doublement de population au moins
un sérum ou une globuline antithymocytaire,
égal au niveau maximal qui sera utilisé pour la production,
(3) souris thymectomisées et irradiées ayant été restaurées
BS

(2) par microscopie électronique de transmission. (T–, B+) avec de la moelle osseuse de souris saine.
Si l’essai (1) et/ou l’essai (2) donnent un résultat positif, Quel que soit le système animal choisi, la lignée cellulaire
effectuez l’essai (3), et les cellules de référence sont injectées à des groupes
(3) des essais d’infectivité réalisés sur des cellules humaines distincts de 10 animaux chacun. Dans les 2 cas, l’inoculum
avec un essai PERT en point final sur le surnageant. par animal est de 107 cellules en suspension dans un
volume de 0,2 ml et l’injection peut être pratiquée par
Etant donné que la sensibilité des essais PERT est très voie intramusculaire ou sous-cutanée. Si l’on emploie des
grande, l’interprétation d’un signal positif peut être animaux nouveau-nés, ils sont traités avec 0,1 ml de sérum
équivoque, et une décision relative à l’acceptabilité d’un ou globuline antithymocytaire aux jours 0, 2, 7 et 14 à
substrat cellulaire devra être fondée sur toutes les données compter de la naissance. Sont considérés comme actifs les
O

disponibles. sérums ou globulines aptes à supprimer les mécanismes


Essais sur animaux. A chacun des groupes d’animaux immunitaires d’animaux en cours de croissance jusqu’au
suivants, injectez par voie intramusculaire (ou, dans le cas point où l’inoculation des 107 cellules de référence positives
des souriceaux, par voie sous-cutanée) 107 cellules viables produit régulièrement des tumeurs et des métastases. Si
également réparties entre les animaux du groupe : des animaux sont sévèrement affectés et présentent sans
(1) 2 portées d’au moins 10 souriceaux à la mamelle âgés ambiguïté des tumeurs à croissance progressive, sacrifiez-les
de moins de 24 h, avant la fin de l’essai pour leur épargner des souffrances
inutiles.
(2) 10 souris adultes.
A la fin de la période d’observation, sacrifiez et examinez
Injectez en outre 106 cellules viables à chacune des 10 souris tous les animaux, y compris ceux des groupes témoins ;
adultes par voie intracérébrale, pour détecter la présence recherchez des signes macroscopiques et microscopiques de
éventuelle du virus de la chorioméningite lymphocytaire. prolifération des cellules inoculées, au site d’injection et dans
Placez les animaux en observation pendant au moins d’autres organes (par exemple, les ganglions lymphatiques,
4 semaines. Examinez chaque animal qui présente des les poumons, les reins et le foie).
symptômes de maladie ou une anomalie pour en déterminer Dans tous les cas, examinez les animaux à intervalles
la cause. Les cellules satisfont à l’essai si aucun signe de réguliers en procédant à une palpation pour détecter la
présence d’agents étrangers n’est observé. L’essai n’est pas formation éventuelle de nodules aux sites d’injection.

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4233
5.2.3. Substrats cellulaires pour vaccins pour usage humain PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

Mesurez les nodules selon 2 directions perpendiculaires macroscopiques de formation tumorale au site d’injection et
et notez régulièrement les résultats des mesures, pour dans d’autres organes (par exemple : ganglions lymphatiques,
déterminer si le nodule est en croissance progressive. Si poumons, cerveau, rate, reins, foie). Procédez à un examen
certains animaux présentent des nodules montrant des histologique de toutes les lésions d’apparence tumorale et
signes de régression au cours de la période d’observation, du site d’injection. Par ailleurs, certaines lignées cellulaires
sacrifiez-les avant que les nodules ne soient plus détectables pouvant donner des métastases sans manifestation de
à la palpation, et procédez à un examen histologique. croissance tumorale locale, procédez systématiquement sur
Observez les animaux présentant des nodules en croissance tous les animaux à un examen histologique des ganglions
progressive pendant 1-2 semaines, et les animaux ne lymphatiques régionaux détectables et des poumons.
présentant pas de formation de nodules pendant 3 semaines, Si moins de 9 des 10 animaux auxquels ont été inoculées
pour la moitié d’entre eux, et pendant 12 semaines pour les cellules de référence positives présentent des tumeurs à
l’autre moitié, avant de les sacrifier et de procéder à un croissance progressive, l’essai n’est pas valable.
examen histologique. Effectuez sur chaque animal une
nécropsie comprenant notamment la recherche de signes

TE

O
BS
O

4234 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

MONOGRAPHIES
GÉNÉRALES
Substances pour usage pharmaceutique............................4237 Vaccins pour usage humain...................................................4239

TE

O
BS
O

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4235
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

TE

O
BS
O

4236 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 Substances pour usage pharmaceutique

01/2009:2034 PRODUCTION
Les substances pour usage pharmaceutique sont produites
SUBSTANCES POUR USAGE par des procédés conçus pour assurer une qualité
reproductible et satisfaire aux exigences des monographies
PHARMACEUTIQUE ou de spécifications approuvées.
Les dispositions du chapitre général 5.10 s’appliquent au
Corpora ad usum pharmaceuticum contrôle des impuretés dans les substances pour usage
pharmaceutique.
DÉFINITION Que la monographie d’une substance pour usage
Les substances pour usage pharmaceutique sont des pharmaceutique spécifie ou non que la substance :
substances organiques ou inorganiques, quelles qu’elles — est une protéine recombinante ou une autre substance
soient, utilisées en tant que substances actives ou excipients dont l’obtention découle directement d’une modification
pour la production de médicaments pour usage humain ou génétique, dans les cas appropriés, la substance satisfait
vétérinaire. Elles peuvent être obtenues à partir de sources également aux exigences de la monographie générale
naturelles ou produites par extraction à partir de matières Produits obtenus par la méthode dite de l’ADN
premières, par fermentation ou par synthèse. recombinant (0784) ;

TE
Cette monographie générale ne s’applique ni aux — est obtenue à partir d’animaux sensibles aux
drogues végétales, ni aux drogues végétales pour encéphalopathies spongiformes transmissibles autrement
préparations homéopathiques, ni aux préparations à base que par épreuve expérimentale, dans les cas appropriés,
de drogues végétales, ni aux extraits, ni aux teintures la substance satisfait également aux exigences de la
mères pour préparations homéopathiques, qui font monographie générale Produits comportant un risque de
l’objet de monographies générales distinctes (Drogues transmission d’agents d’encéphalopathies spongiformes
végétales (1433), Drogues végétales pour préparations animales (1483) ;
homoéopathiques (2045), Préparations à base de drogues — est une substance obtenue par un procédé de
végétales (1434), Extraits (0765), Teintures mères
LÈ fermentation, indépendamment du fait que les
pour préparations homéopathiques (2029)). Elle ne microorganismes impliqués sont modifiés par des
s’applique pas aux matières premières pour préparations procédés traditionnels ou par la technologie dite de l’ADN
homéopathiques, sauf lorsqu’il existe une monographie recombinant (ADNr), dans les cas appropriés, la substance
spécifique sur la substance dans la partie non homéopathique satisfait également aux exigences de la monographie
de la Pharmacopée. générale Produits de fermentation (1468).
Lorsqu’une substance pour usage pharmaceutique qui Lorsque des solvants sont utilisés en cours de production,
ne fait pas l’objet d’une monographie spécifique de la ils sont de qualité appropriée ; en outre, leur toxicité et leur
Pharmacopée est incorporée dans un médicament préparé taux résiduel sont pris en considération (5.4). Si de l’eau est
pour les besoins spécifiques d’un malade déterminé, la utilisée en cours de production, elle est de qualité appropriée.
O
nécessité de conformité à la présente monographie générale Si une substance est produite ou traitée en vue d’obtenir une
est décidée à la lumière d’une évaluation du risque qui certaine forme ou qualité, cette forme ou qualité particulière
prend en compte la qualité disponible et l’usage auquel le de la substance satisfait aux exigences de la monographie.
médicament est destiné. Certains essais de caractéristiques liées à la fonctionnalité
Lorsque la fabrication de médicaments fait intervenir des peuvent être décrits pour contrôler des propriétés
substances pour usage pharmaceutique d’origine humaine susceptibles d’affecter l’adéquation de la substance et, par
BS

ou animale, les exigences du chapitre 5.1.7. Sécurité virale suite, les propriétés des formes pharmaceutiques où elle est
s’appliquent. utilisée.
Les substances pulvérisées peuvent faire l’objet d’un
Les substances pour usage pharmaceutique peuvent être
traitement visant à obtenir un certain degré de finesse
utilisées soit en l’état soit comme matières premières
(2.9.35).
dans le cadre d’une formulation pour la préparation de
médicaments. Selon la formulation, certaines substances Les substances compactées font l’objet d’un traitement
peuvent être utilisées soit comme substances actives soit visant à augmenter la taille des particules ou à leur conférer
comme excipients. Les substances solides peuvent faire une forme spécifique et/ou à accroître la masse volumique
l’objet de traitements tels que le compactage, l’enrobage, de la substance.
O

la granulation, la réduction en poudre de finesse donnée, Les substances actives enrobées se composent de particules
ou autres. Une monographie s’applique à une substance de la substance, enrobées d’un ou plusieurs excipients
traitée avec ajout d’excipients seulement si ce traitement est appropriés.
mentionné dans la section Définition de cette monographie. Les substances actives granulées sont des particules de
Qualités spéciales d’une substance pour usage taille et/ou forme spécifiées, produites par granulation à
pharmaceutique. Sauf mention contraire ou restriction partir de la substance directement ou au moyen d’un ou
explicite dans les monographies, toute substance pour usage plusieurs excipients appropriés.
pharmaceutique est destinée à être utilisée chez l’homme Si le traitement des substances fait intervenir des excipients,
et l’animal et est de qualité appropriée à la fabrication de ces derniers satisfont aux exigences de leur monographie
toutes les formes pharmaceutiques dans lesquelles elle peut respective ou, si une telle monographie n’existe pas, de la
être utilisée. spécification approuvée.
Polymorphisme. En règle générale, les monographies Lorsque les substances actives subissent un traitement
spécifiques ne traitent pas de formes cristallines ou amorphes faisant intervenir des excipients pour produire, par exemple,
particulières, sauf si la biodisponibilité de la substance en des substances enrobées ou granulées, le traitement est
est affectée. Sauf indication contraire, toutes les formes effectué selon les bonnes pratiques de fabrication. Les
d’une substance pour usage pharmaceutique satisfont aux substances ainsi traitées sont considérées comme des
exigences de la monographie de cette substance. intermédiaires dans la fabrication d’un médicament.

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4237
Substances pour usage pharmaceutique PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

CARACTÈRES Qualité microbiologique. Les monographies spécifiques


Les indications figurant sous la rubrique Caractères présentent des critères d’acceptation de la qualité
(par exemple concernant la solubilité ou une éventuelle microbiologique lorsqu’un tel contrôle est nécessaire.
température de décomposition) ne sont pas à interpréter de Le tableau 5.1.4.-2. – Critères d’acceptation de la
manière stricte, et ne constituent pas des exigences. Elles qualité microbiologique des substances pour usage
sont données à titre d’information. pharmaceutique non stériles du chapitre 5.1.4. Qualité
microbiologique des préparations pharmaceutiques
L’existence d’un possible polymorphisme peut être signalée et des substances pour usage pharmaceutique non
sous Caractères, afin d’attirer l’attention de l’utilisateur sur stériles présente des recommandations quant à la qualité
cette caractéristique dont il peut avoir à tenir compte lors de microbiologique qui sont d’une application générale pour
la formulation d’une préparation. les substances sujettes à contamination microbienne. En
fonction de la nature de la substance et de l’utilisation à
IDENTIFICATION laquelle elle est destinée, des critères d’acceptation différents
peuvent être justifiés.
Lorsque la rubrique Identification d’une monographie
comporte 2 sous-rubriques intitulées Première identification Stérilité (2.6.1). Les substances pour usage pharmaceutique
et Seconde identification, le ou les essais de la Première destinées à la préparation de formes stériles sans autre
identification peuvent être utilisés en toutes circonstances. procédé approprié de stérilisation, ou présentées comme

TE
Le ou les essais de la Seconde identification peuvent substances de qualité « stérile », satisfont à l’essai de stérilité.
être utilisés à condition qu’il puisse être démontré que la Endotoxines bactériennes (2.6.14). Les substances pour
substance provient bien d’un lot attesté conforme à toutes usage pharmaceutique présentées comme substances de
les autres exigences de la monographie. qualité « exempte d’endotoxines bactériennes » satisfont
à l’essai des endotoxines bactériennes. La limite et la
ESSAI méthode d’essai à utiliser (s’il ne s’agit pas de la méthode A
Polymorphisme (5.9). Si la nature d’une forme cristalline ou de gélification) sont indiquées dans la monographie de la
amorphe impose certaines restrictions quant à son utilisation substance. La limite est calculée selon les Recommandations
dans des préparations, la nature de la forme cristalline
LÈ pour la réalisation de l’essai des endotoxines bactériennes
ou amorphe spécifiquement considérée est identifiée, sa du chapitre 2.6.14. Essai des endotoxines bactériennes,
morphologie est convenablement contrôlée et son identité sauf si une limite inférieure est justifiée au vu des résultats
est indiquée sur l’étiquette. obtenus sur les lots de production, ou est exigée par
l’Autorité compétente. Lorsqu’un essai des endotoxines
Substances apparentées. Dans les substances actives, les bactériennes est prescrit, il n’est pas exigé d’essai des
impuretés organiques sont déclarées, identifiées chaque pyrogènes.
fois qu’il est possible et qualifiées selon les indications du
Pyrogènes (2.6.8). Les substances pour usage
tableau 2034.-1, sauf indication contraire ou exception
pharmaceutique pour lesquelles il est justifié d’utiliser
justifiée et autorisée.
l’essai des pyrogènes plutôt que celui des endotoxines
O
Des seuils spécifiques peuvent s’appliquer dans le cas bactériennes et qui sont présentées comme substances
d’impuretés connues pour être très actives ou pour avoir des de qualité « exempte de pyrogènes », satisfont à l’essai
effets toxiques ou pharmacologiques inattendus. des pyrogènes. La limite et la méthode d’essai à utiliser
Si une monographie spécifique n’apporte pas un contrôle sont indiquées dans la monographie de la substance, ou
approprié d’une nouvelle impureté, un essai approprié doit approuvées par l’Autorité compétente. Sous réserve de
validation comparative appropriée, l’essai des endotoxines
BS

être mis au point et ajouté aux spécifications de la substance.


bactériennes peut remplacer celui des pyrogènes.
Les exigences ci-dessus ne s’appliquent pas aux produits
Propriétés supplémentaires. Le contrôle de propriétés
biologiques ou biotechnologiques, aux peptides, aux
particulières (caractéristiques physiques, caractéristiques
oligonucléotides, aux produits radiopharmaceutiques, aux
liées à la fonctionnalité par exemple) peut être nécessaire
produits de fermentation et produits semi-synthétiques
pour certains procédés de fabrication ou certaines
dérivés, aux produits bruts d’origine animale ou végétale ou
formulations. Des qualités spéciales d’une substance (stérile,
aux produits végétaux.
exempte d’endotoxines, apyrogène, ...) peuvent être produites
Solvants résiduels. La teneur en solvants résiduels est en vue de la fabrication de préparations pour administration
limitée selon les principes définis dans le chapitre 5.4, par la parentérale ou d’autres formes pharmaceutiques, et des
O

méthode générale 2.4.24 ou une autre méthode appropriée. exigences appropriées peuvent alors être spécifiées dans la
Si une détermination quantitative d’un solvant résiduel est monographie de la substance.
effectuée et qu’un essai de perte à la dessiccation n’est pas
effectué, il est tenu compte de la teneur en solvant résiduel DOSAGE
dans le calcul de la teneur lors du dosage de la substance et Sauf exception justifiée et autorisée, les teneurs en
dans celui du pouvoir rotatoire spécifique et de l’absorbance substances pour usage pharmaceutique sont déterminées,
spécifique. au moyen de méthodes appropriées.

Tableau 2034.-1. – Déclaration, identification et qualification des impuretés dans les substances actives
Utilisation Dose maximale Seuil de Seuil Seuil de
journalière déclaration d’identification qualification
Usage humain ou usage ≤ 2 g/jour > 0,05 pour cent Soit > 0,10 pour cent soit Soit > 0,15 pour cent soit
humain et vétérinaire > 1,0 mg par jour, en prenant > 1,0 mg par jour, en prenant
le plus petit des deux le plus petit des deux
Usage humain ou usage > 2 g/jour > 0,03 pour cent > 0,05 pour cent > 0,05 pour cent
humain et vétérinaire
Usage vétérinaire Non applicable > 0,1 pour cent > 0,2 pour cent > 0,5 pour cent
uniquement

4238 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 Vaccins pour usage humain

ÉTIQUETAGE conjugats ou de polymères afin d’augmenter leur pouvoir


D’une manière générale, l’étiquetage est régi par des accordsimmunogène. Les vaccins peuvent contenir un adjuvant. Si
internationaux et par des règlements supranationaux l’antigène est adsorbé sur un adjuvant minéral, le vaccin est
et nationaux. Les indications figurant sous la rubrique appelé vaccin « adsorbé ».
Etiquetage ne constituent donc pas une liste exhaustive Certains termes employés dans les monographies des vaccins
et, par ailleurs, seules sont obligatoires aux fins de la pour usage humain sont définis dans le chapitre 5.2.1.
Pharmacopée, les indications d’étiquetage nécessaires Les vaccins bactériens contenant des cellules entières
pour démontrer la conformité ou non conformité à la sont des suspensions d’opacité variable dans des liquides
monographie. Toute autre information est donnée à titre de incolores ou sensiblement incolores ou ils peuvent être
recommandation. Lorsque le terme « étiquette » est employé cryodesséchés. Ils peuvent être adsorbés. La concentration
dans la Pharmacopée, les indications, peuvent figurer sur le en bactéries vivantes ou inactivées est exprimée en Unités
récipient, sur l’emballage, sur une notice qui accompagne Internationales d’opacité, ou selon le cas, par dénombrement
l’emballage, sur le certificat d’analyse qui accompagne le des germes dans une cellule compte-microbes ou pour les
produit, selon la décision de l’Autorité compétente. germes vivants, par culture.
Dans les cas appropriés, l’étiquette indique que la substance :
Les vaccins bactériens contenant des composants
— est destinée à un usage spécifique, de bactérie sont des suspensions ou des produits
— présente une forme cristalline distincte, cryodesséchés. Ils peuvent être adsorbés. La teneur en

TE
— possède un degré de finesse spécifique, antigène est déterminée par un dosage approprié validé.
— a fait l’objet d’un compactage, Les anatoxines bactériennes sont préparées à partir
— a fait l’objet d’un enrobage, de toxines par réduction de leur toxicité à un niveau
acceptable ou par neutralisation complète de cette toxicité
— a fait l’objet d’une granulation, au moyen de méthodes physiques ou chimiques, tout en
— est stérile, maintenant des propriétés immunogènes adéquates. Les
— est exempte d’endotoxines bactériennes, toxines sont obtenues à partir de souches sélectionnées de
— est apyrogène, microorganismes. La méthode de préparation est choisie
LÈ de façon à transformer de manière irréversible la toxine en
— contient des agents régulateurs d’écoulement. anatoxine. Les anatoxines sont purifiées. La purification
Dans les cas appropriés, l’étiquette indique : est effectuée avant et/ou après détoxification. Les vaccins
— le degré d’hydratation, anatoxiniques peuvent être adsorbés.
— le nom et la concentration de toute substance ajoutée (par Les vaccins viraux sont préparés à partir de virus cultivés
exemple, conservateur antimicrobien ou antioxydant). soit sur animaux ou sur œufs embryonnés, soit sur cultures
Lorsqu’une substance active a fait l’objet d’un traitement cellulaires ou sur tissus appropriés, soit par la culture de
faisant intervenir l’addition d’un ou plusieurs excipients, cellules modifiées par génie génétique. Les vaccins viraux
sont liquides et peuvent être d’opacité variable selon le
l’étiquette indique le(s) excipient(s) utilisé(s) et les teneurs
type de préparation ou ils peuvent être cryodesséchés. Ils
O
en substance active et en excipient(s).
peuvent être adsorbés. Les préparations liquides et les
préparations cryodesséchées reconstituées peuvent être
01/2009:0153 colorées lorsqu’un indicateur de pH tel que le rouge de
phénol a été utilisé dans le milieu de culture.
VACCINS POUR USAGE HUMAIN Les vaccins à antigène de synthèse sont généralement
BS

des liquides limpides ou incolores. La concentration des


Vaccina ad usum humanum composants est habituellement exprimée par une teneur en
antigène spécifique.
DÉFINITION Les vaccins combinés sont des préparations ayant plusieurs
Les vaccins pour usage humain sont des préparations composants et formulées de telle façon que plusieurs
contenant des antigènes ayant la propriété de créer chez antigènes sont administrés simultanément. Les différents
l’homme une immunité active et spécifique contre l’agent composants antigéniques sont destinés à protéger contre
infectant ou la toxine ou l’antigène élaborés par celui-ci. différents types ou souches d’un même organisme et/ou
Les réponses immunitaires comprennent l’induction des contre différents organismes. Un vaccin combiné peut être
présenté par le fabricant soit sous forme d’une préparation
O

mécanismes innés et adaptifs (cellulaires, humoraux) du


système immunitaire. Il doit être démontré que les vaccins unique liquide ou cryodesséchée soit sous forme de plusieurs
à usage humain possèdent une activité immunogène et constituants accompagnés des indications nécessaires
une innocuité acceptables chez l’homme lorsqu’ils sont pour le mélange avant emploi. Lorsqu’il n’existe aucune
administrés selon le programme de vaccination préconisé. monographie pour une combinaison particulière, le vaccin
Les vaccins pour usage humain peuvent être constitués par : est conforme à la monographie de chaque composant
des microorganismes entiers (bactéries, virus ou parasites), individuel, avec les modifications éventuellement approuvées
inactivés par des moyens chimiques ou physiques qui par l’Autorité compétente.
maintiennent des propriétés immunogènes adéquates ; des Les vaccins adsorbés sont des suspensions ; ils peuvent
microorganismes vivants entiers naturellement avirulents laisser un dépôt au fond du récipient.
ou qui ont été traités afin d’atténuer leur virulence tout
en maintenant des propriétés immunogènes adéquates ; PRODUCTION
des antigènes extraits des microorganismes ou sécrétés Dispositions générales. Il doit être établi que le procédé de
par des microorganismes ou préparés par génie génétique production utilisé pour un produit donné permet d’obtenir
ou synthèse chimique. Les antigènes peuvent être utilisés de façon constante des lots comparables à celui pour lequel
dans leur état d’origine ou ils peuvent être détoxifiés ou l’efficacité clinique, le pouvoir immunogène et l’innocuité
modifiés de toute autre manière, par des moyens chimiques chez l’homme ont été démontrées. Les spécifications du
ou physiques et peuvent être sous forme d’agrégats, de produit, y compris les contrôles en cours de fabrication,

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4239
Vaccins pour usage humain PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

doivent être établies. Des exigences spécifiques concernant ne sont pas manipulées. Il est démontré que le sérum et
la production, y compris les essais effectués en cours de la trypsine utilisés dans la préparation des suspensions de
fabrication figurent dans les monographies spécifiques. cellules et des milieux sont exempts d’agents étrangers.
Dans des cas justifiés et autorisés, certains essais peuvent Lots de semence/banques de cellules. Le lot de semence
ne pas être effectués s’il peut être démontré par d’autres primaire ou la banque de cellules sont identifiés par des
moyens, par exemple des essais de validation, que le procédé données historiques, y compris des informations sur leur
de production donne de façon régulière un produit qui est origine et leur manipulation ultérieure. Des mesures
conforme à l’essai. appropriées sont prises pour assurer qu’aucun agent
Sauf exception justifiée et autorisée, les vaccins sont préparés étranger, ou toute autre substance indésirable, n’est présent
selon un système de lot de semence. Les méthodes de dans un lot de semence primaire ou de travail ou dans une
préparation sont conçues de façon à conserver les propriétés banque de cellules.
immunogènes adéquates, à rendre la préparation inoffensive
et à prévenir la contamination par des agents étrangers. Milieux de culture. Les milieux de culture sont exempts,
dans la mesure du possible, de substances reconnues
Lorsque la fabrication de vaccins pour usage humain fait comme ayant provoqué des réactions toxiques, des réactions
intervenir des matières d’origine humaine ou animale, les allergiques ou d’autres réactions indésirables chez l’homme ;
exigences générales du chapitre 5.1.7. Sécurité virale s’il est nécessaire d’employer de tels ingrédients pendant la
s’appliquent en complément des exigences plus spécifiques production, il sera démontré que la quantité présente dans

TE
concernant la sécurité virale qui figurent dans cette le lot final est telle que la préparation est inoffensive. Du
monographie ainsi que dans les chapitres 5.2.2. Elevage de sérum animal approuvé (mais non humain) peut être utilisé
poulets exempts de microorganismes pathogènes spécifiés dans les milieux de culture pour la croissance cellulaire, mais
pour la production et le contrôle de qualité des vaccins, le milieu final utilisé pour maintenir les cultures cellulaires
5.2.3. Substrats cellulaires utilisés pour la production en cours de multiplication virale ne contient pas de sérum
de vaccins pour usage humain, 2.6.16. Essai des agents animal sauf indication contraire. Les milieux de culture
étrangers dans les vaccins viraux pour usage humain, et cellulaire peuvent contenir un indicateur de pH tel que le
dans les monographies spécifiques. rouge de phénol et des antibiotiques approuvés à la plus
Sauf exception justifiée et autorisée, pour la production
LÈ faible concentration efficace, mais il est préférable d’utiliser
d’un lot final de vaccin, le nombre de passages d’un virus un substrat exempt d’antibiotiques pendant la production.
ou le nombre de subcultures d’une bactérie à partir du
Multiplication et récolte. La multiplication des cultures de
lot de semence primaire n’est pas supérieur à celui utilisé
semence et la récolte sont effectuées dans des conditions
pour la production du vaccin qui s’est avéré satisfaisant
définies. La pureté de la récolte est vérifiée par des essais
en ce qui concerne l’innocuité et l’efficacité ou le pouvoir
appropriés comme définis dans la monographie.
immunogène, lors d’essais cliniques.
Dans la mesure du possible, les vaccins sont exempts de Cellules témoins. Dans les cas de vaccins produits sur
substances reconnues comme ayant provoqué des réactions cultures cellulaires, des cellules témoins sont maintenues
toxiques, des réactions allergiques ou d’autres réactions et examinées selon les indications de la monographie. Ces
O
indésirables chez l’homme. Des additifs convenables, cellules représentent un contrôle valable seulement si elles
y compris des stabilisants et des adjuvants, peuvent sont maintenues dans des conditions qui sont équivalentes
être ajoutés pendant la préparation. La pénicilline et pour l’essentiel à celles utilisées pour la culture cellulaire de
la streptomycine ne sont utilisées à aucun stade de la production, y compris l’emploi des mêmes lots de milieux et
préparation ni ajoutées dans le produit final ; néanmoins, les mêmes changements de milieu.
les lots de semence primaires préparés à l’aide de milieux Œufs témoins. Dans les cas de vaccins produits sur œufs,
BS

contenant de la pénicilline ou de la streptomycine peuvent des œufs témoins sont maintenus et examinés selon les
être utilisés pour la production dans des cas justifiés et indications de la monographie.
autorisés. Purification. Dans les cas appropriés, des procédés de
La régularité de la production est une caractéristique purification validés peuvent être utilisés.
importante de la production des vaccins. Les monographies
relatives à des vaccins pour usage humain fournissent des Inactivation. Les vaccins inactivés sont préparés à l’aide
limites concernant différents essais effectués en cours de d’un procédé d’inactivation validé dont l’efficacité et la
production et sur le lot final. Ces limites peuvent se présenter régularité ont été démontrées. Lorsqu’il est reconnu que des
sous la forme de valeurs maximales, de valeurs minimales ou agents étrangers peuvent être présents dans une récolte, par
de tolérances minimales et maximales autour d’une valeur exemple lorsque le vaccin est produit sur des œufs provenant
O

donnée. Si la conformité à ces limites est requise, elles ne d’un élevage sain non EOPS, le procédé d’inactivation est
suffisent pas nécessairement à garantir la régularité de la également validé vis-à-vis d’une gamme de modèles d’agents
production pour un vaccin donné. Pour disposer d’essais étrangers représentatifs des agents étrangers potentiels. Un
pertinents, le fabricant doit donc définir pour chaque essai de mesure de l’efficacité du procédé d’inactivation est
produit un ou plusieurs seuils appropriés d’intervention ou effectué aussitôt que possible après l’inactivation.
une ou plusieurs limites appropriées pour la libération du Vrac final. Le vrac final est préparé par mélange aseptique
produit, à appliquer au vu des résultats obtenus sur des lots des différents ingrédients du vaccin. Dans le cas des
testés cliniquement et les lots utilisés pour démontrer la vaccins non liquides pour administration par une voie
régularité de la production. Ces limites peuvent être affinées autre que parentérale, le vrac final est préparé par mélange
ultérieurement sur une base statistique, à la lumière des des différents ingrédients du vaccin dans des conditions
données de la production. appropriées.
Substrats pour la multiplication des microorganismes. Les Adjuvants. Un ou plusieurs adjuvants peuvent entrer dans
substrats utilisés satisfont aux exigences appropriées de la la formulation d’un vaccin pour potentialiser et/ou moduler
Pharmacopée (5.2.2, 5.2.3) ou à défaut à celles décidées par la réponse immunitaire vis-à-vis du/des antigène(s). Ces
l’Autorité compétente. L’utilisation des banques de cellules adjuvants peuvent figurer dans la formulation du vaccin final
et des cultures cellulaires qui en sont issues est faite dans ou être présentés séparément. Un contrôle de la qualité et
des conditions d’asepsie, dans un endroit où d’autres cellules une caractérisation appropriés du/des adjuvant(s), seul(s) et

4240 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 Vaccins pour usage humain

combiné(s) à l’antigène (ou aux antigènes), sont essentiels — des polyosides conjugués,
pour une production reproductible. Des spécifications — un vrac final,
relatives à la qualité sont établies pour chaque adjuvant, seul
— un vaccin dans son récipient final fermé, conservé à une
et combiné à l’antigène (ou aux antigènes).
température inférieure à celle utilisée pour les études
Adsorbants utilisés comme adjuvants. Les vaccins peuvent de stabilité du produit final et destiné à être libéré sans
être adsorbés sur de l’hydroxyde d’aluminium, du phosphate nouvelle détermination de l’activité.
d’aluminium, du phosphate de calcium ou d’autres
adsorbants appropriés. Les adsorbants sont préparés dans Sauf dans le cas où ils sont utilisés dans un bref délai, des
des conditions particulières qui leur confèrent la forme études de stabilité sont conduites sur les intermédiaires
physique et les propriétés d’adsorption appropriées. dans les conditions de conservation prévues afin d’établir
l’étendue prévue de la dégradation. Pour le vrac final,
Si un adsorbant est utilisé comme adjuvant et est généré in des études de stabilité peuvent être effectuées sur des
situ au cours de la production du vaccin, des spécifications échantillons représentatifs dans des conditions équivalentes
de qualité sont établies pour chaque ingrédient et pour à celles utilisées pour la conservation. Dans les cas
l’adsorbant généré dans le vaccin. Les spécifications de appropriés, une durée de validité applicable dans les
qualité visent en particulier à contrôler : conditions de conservation prévues est établie au vue des
— la composition chimique qualitative et quantitative, études de stabilité pour chaque intermédiaire (sauf pour les
— la forme physique et les propriétés d’adsorption associées, lots de semence et les banques de cellules).

TE
dans les cas appropriés, notamment si l’adjuvant est Lot final. Le lot final est préparé par répartition aseptique
présent en tant qu’adsorbant, du vrac final dans des récipients stériles à fermeture
— l’interaction entre adjuvant et antigène, inviolable qui sont fermés, dans les cas appropriés après
— la pureté, notamment la teneur en endotoxines cryodessiccation, de façon à prévenir toute contamination.
bactériennes et la qualité microbiologique, Dans le cas des vaccins non liquides pour administration
— tout autre paramètre jugé indispensable à la fonctionnalité. par une voie autre que parentérale, le lot final est préparé
La stabilité de chaque adjuvant, seul et combiné à l’antigène par répartition, dans des conditions appropriées, du vrac
(ou aux antigènes), notamment en ce qui concerne final dans des récipients stériles à fermeture inviolable. Dans

les paramètres critiques, est établie lors des études de des cas justifiés et autorisés, certains essais prescrits pour
développement. le lot final peuvent être effectués sur le vrac final s’il a été
démontré que les opérations de fabrication ultérieures sont
Conservateurs antimicrobiens. Des conservateurs sans effet sur la conformité.
antimicrobiens sont employés pour empêcher l’altération
de la préparation ou éviter des effets indésirables suite à Aspect. Sauf exception justifiée et autorisée, chaque
une contamination microbienne du vaccin pendant son récipient (flacon, seringue ou ampoule) de chaque lot final
utilisation. Les conservateurs antimicrobiens ne sont est inspecté à l’oeil nu ou de façon automatisée pour vérifier
pas incorporés dans les préparations cryodesséchées. si l’aspect est acceptable.
Généralement, il n’est pas acceptable d’incorporer un Degré d’adsorption. Sauf exception justifiée et autorisée,
O
conservateur antimicrobien dans les préparations liquides dans le cas d’un vaccin adsorbé, une spécification du degré
unidoses. Dans le cas de préparations multidoses liquides, d’adsorption pour la libération des lots est établie en fonction
la nécessité d’un conservateur antimicrobien est évaluée, des résultats trouvés pour des lots utilisés lors des essais
compte tenu de la possibilité de contamination pendant cliniques. A partir des données de stabilité obtenues pour
l’utilisation du vaccin et de la période maximale d’utilisation le vaccin, il doit être démontré que le degré d’adsorption à
recommandée du récipient entamé. Si le vaccin contient la fin de la période de validité n’est pas inférieur à celui des
BS

un conservateur antimicrobien, il est démontré que celui-ci lots utilisés pour les essais cliniques.
n’affecte ni l’innocuité ni l’efficacité du vaccin. L’addition Stabilité. Pendant les études de développement, le maintien
d’antibiotiques en tant que conservateurs antimicrobiens de l’activité du lot final pendant toute la durée de validité
n’est généralement pas acceptable. est démontré ; la perte d’activité dans les conditions de
Au cours de la phase de développement, l’efficacité du conservation recommandées est mesurée et une perte
conservateur antimicrobien pendant toute la durée de excessive peut indiquer que le vaccin n’est pas acceptable,
validité doit être démontrée à l’Autorité compétente. même si l’activité reste supérieure au minimum acceptable.
L’efficacité du conservateur antimicrobien est évaluée Date de péremption. Sauf indication contraire, la date de
comme décrit dans le chapitre 5.1.3. Lorsque ni les critères A péremption est calculée à partir du début de l’essai d’activité
ni les critères B ne peuvent être respectés, dans les cas ou de la détermination du titre en virus selon le cas et
O

justifiés les critères suivants sont appliqués aux vaccins pour pour les vaccins combinés à partir du début du premier
usage humain : bactéries, pas d’augmentation à 24 h et à essai d’activité ou détermination de titre. Pour les vaccins
7 jours, réduction de 3 log à 14 jours, pas d’augmentation conservés à une température inférieure à celle utilisée
à 28 jours ; champignons, pas d’augmentation à 14 jours pour les études de stabilité et destinés à être libérés sans
et à 28 jours. nouvelle détermination de l’activité, la date de péremption
Stabilité des intermédiaires. Pendant la production de est calculée à partir de la date de sortie des conditions
vaccins, les intermédiaires sont obtenus à différents stades de froid. Si pour un vaccin donné il n’est pas effectué de
et sont conservés, parfois pour de longues durées. Ces détermination de l’activité, la date de péremption du lot final
intermédiaires incluent : est calculée à compter de la date de réalisation d’un essai
— des lots de semence et banques de cellules, indicatif de stabilité approuvé ou à défaut à compter de la
date de lyophilisation ou de la date de conditionnement dans
— des récoltes vivantes ou inactivées, le récipient final. Dans le cas d’un vaccin combiné ayant
— des récoltes purifiées qui peuvent être des toxines ou des des composants présentés en récipients séparés, la date
anatoxines, des polyosides, des suspensions bactériennes de péremption correspond à celle du composant qui sera
ou virales, périmé en premier.
— des antigènes purifiés, La date de péremption s’applique aux vaccins conservés
— des antigènes adsorbés, dans les conditions prescrites.

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4241
Vaccins pour usage humain PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

Essai sur animaux. Conformément aux dispositions de Phénol (2.5.15) : au maximum 2,5 g/l dans le produit final
la Convention européenne sur la protection des animaux lorsque le phénol a été utilisé pendant la préparation du
vertébrés utilisés à des fins expérimentales ou à d’autres vaccin, sauf indication contraire.
fins scientifiques, les essais doivent être réalisés de telle Eau (2.5.12) : au maximum 3,0 pour cent m/m lorsque le
façon qu’ils utilisent le moins d’animaux possible et qu’ils vaccin est cryodesséché, sauf indication contraire.
réduisent au minimum toutes douleur, souffrance, détresse
ou nuisance durable. Les critères d’évaluation des essais Volume extractible (2.9.17). Sauf exception justifiée et
dans les monographies doivent être mis en application en autorisée, le vaccin satisfait aux exigences relatives au
tenant compte de ces considérations. Par exemple, s’il est volume extractible.
indiqué qu’un animal est considéré positif, infecté, etc., Endotoxines bactériennes. Sauf exception justifiée et
quand apparaissent des signes cliniques typiques ou en cas autorisée, un essai des endotoxines bactériennes est
de mort de l’animal, alors, dès que l’indication suffisante d’un effectué sur le produit final. S’il n’est pas spécifié de limite
résultat positif est obtenue, l’animal en question doit être dans la monographie spécifique, la teneur en endotoxines
euthanasié ou recevoir un traitement approprié pour éviter bactériennes, déterminée par une méthode appropriée
toute souffrance inutile. Conformément aux Prescriptions (2.6.14), est inférieure à la limite approuvée pour le produit
Générales, des méthodes d’essai de remplacement peuvent considéré.
être utilisées pour démontrer la conformité à la monographie
CONSERVATION

TE
et l’utilisation de tels essais est particulièrement encouragée
quant elle entraîne le remplacement ou la réduction de A l’abri de la lumière. Sauf indication contraire, les vaccins
l’utilisation d’animaux ou la réduction de leur souffrance. sont conservés à une température de 5 ± 3 °C et les vaccins
liquides et adsorbés ne doivent pas être congelés.
ESSAI
ÉTIQUETAGE
Les vaccins satisfont aux essais prescrits dans les
monographies spécifiques, y compris dans les cas appropriés, L’étiquette indique :
aux essais figurant ci-après. — le nom de la préparation,
pH (2.2.3). Les vaccins liquides, après reconstitution dans — une référence qui identifie le lot final,
— la dose humaine recommandée et la voie d’administration,
pour la préparation considérée.

les cas appropriés, satisfont aux limites de pH approuvées

Adjuvant. Si le vaccin contient un adjuvant, sa teneur est


déterminée et il est démontré qu’elle est dans les limites
acceptables par rapport à la teneur attendue (voir également
— les conditions de conservation,
— la date de péremption,
— le nom et la concentration du conservateur antimicrobien,
le cas échéant,
les essais de l’aluminium et du calcium ci-dessous). — le nom des antibiotiques, adjuvants, aromatisants et
Aluminium (2.5.13) : au maximum 1,25 mg d’aluminium stabilisants présents, le cas échéant, dans le vaccin,
(Al) par dose humaine unitaire lorsqu’un adsorbant à base — dans les cas appropriés, que le vaccin est adsorbé,
d’aluminium a été utilisé, sauf indication contraire.
O
— la mention des substances susceptibles de provoquer
Calcium (2.5.14) : au maximum 1,3 mg de calcium (Ca) des réactions secondaires, des contre-indications pour
par dose humaine unitaire lorsqu’un adsorbant à base de l’utilisation du vaccin,
calcium a été utilisé, sauf indication contraire. — dans le cas des vaccins cryodesséchés :
Formaldéhyde libre (2.4.18) : au maximum 0,2 g/l en — le nom ou la composition et le volume du liquide de
formaldéhyde libre dans le lot final lorsque le formaldéhyde reconstitution à ajouter,
BS

a été utilisé pendant la préparation du vaccin, sauf indication — la période pendant laquelle le vaccin doit être utilisé
contraire. après reconstitution.
O

4242 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

FORMES
PHARMACEUTIQUES
Poudres pour application cutanée.. .....................................4245 Préparations semi-solides pour application cutanée.. .....4247
Préparations intra-utérines pour usage vétérinaire.. .......4245

TE

O
BS
O

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4243
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

TE

O
BS
O

4244 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 Préparations intra-utérines pour usage vétérinaire

01/2009:1166 Uniformité de teneur (2.9.6). Sauf indication contraire ou


exception justifiée et autorisée, les poudres pour application
cutanée unidoses dont la teneur en substance active est
POUDRES POUR APPLICATION inférieure à 2 mg ou dans lesquelles la substance active
CUTANÉE représente moins de 2 pour cent de la masse totale satisfont
à l’essai B d’uniformité de teneur des préparations unidoses.
Si la préparation contient plusieurs substances actives,
Pulveres ad usum dermicum l’essai ne s’applique qu’à celles qui répondent aux conditions
Dans certains cas justifiés et autorisés, les exigences de indiquées ci-dessus.
la présente monographie peuvent ne pas s’appliquer aux Uniformité de masse (2.9.5). Les poudres pour application
poudres pour usage vétérinaire. cutanée unidoses satisfont à l’essai d’uniformité de masse
des préparations unidoses. Lorsqu’un essai d’uniformité de
DÉFINITION teneur est prescrit pour toutes les substances actives, l’essai
Les poudres pour application cutanée sont des préparations d’uniformité de masse n’est pas exigé.
constituées de particules solides sèches, libres et plus ou Stérilité (2.6.1). Lorsque l’étiquette indique que la poudre
moins fines. Elles contiennent une ou plusieurs substances est stérile, celle-ci satisfait à l’essai de stérilité.
actives additionnées ou non d’excipients et, si nécessaire, de

TE
colorants autorisés par l’Autorité compétente. ÉTIQUETAGE
Les poudres pour application cutanée se présentent sous L’étiquette indique :
forme de poudres unidoses ou de poudres multidoses. — que la préparation est destinée à un usage externe,
Elles sont exemptes d’agglomérats palpables. Les poudres — dans les cas appropriés, que la préparation est stérile.
spécifiquement destinées à être appliquées sur des plaies
ouvertes importantes ou sur une peau gravement atteinte
sont stériles.
Les poudres pour application cutanée présentées sous
LÈ 01/2008:1806
forme de poudres multidoses peuvent être conditionnées en corrigé 6.3
récipients saupoudreurs, en récipients munis d’un dispositif
mécanique de pulvérisation ou en récipients sous pression.
PRÉPARATIONS INTRA-UTÉRINES
Les poudres conditionnées en récipients sous pression
satisfont aux exigences de la monographie Préparations
POUR USAGE VÉTÉRINAIRE
pharmaceutiques pressurisées (0523).
Dans les cas appropriés, les récipients destinés aux poudres Praeparationes intra-uterinae
pour application cutanée satisfont aux exigences relatives ad usum veterinarium
aux Matériaux utilisés dans la fabrication des récipients (3.1
O
et sous-chapitres) et aux Récipients (3.2 et sous-chapitres). DÉFINITION
Les préparations intra-utérines pour usage vétérinaire sont
PRODUCTION des préparations liquides, semi-solides ou solides destinées
Lors de la fabrication des poudres pour application cutanée, à être administrées directement dans l’utérus (col, cavité
des mesures sont prises pour assurer que la taille des ou fond), généralement en vue d’une action locale. Elles
BS

particules est appropriée à l’usage prévu de la préparation. contiennent 1 ou plusieurs substances actives dans un
excipient approprié.
Lors de la fabrication, du conditionnement, de la conservation
et de la distribution des poudres pour application cutanée, Dans les cas appropriés, les récipients destinés aux
des mesures appropriées sont prises pour assurer la qualité préparations intra-utérines pour usage vétérinaire satisfont
microbiologique du produit ; des recommandations sont aux exigences relatives aux Matériaux utilisés dans la
fournies à cet égard dans le texte Qualité microbiologique fabrication des récipients (3.1 et sous-chapitres) et aux
des préparations pharmaceutiques (5.1.4). Récipients (3.2 et sous-chapitres).
Les poudres pour application cutanée stériles sont préparées Plusieurs catégories de préparations intra-utérines pour
à partir de produits et par des méthodes propres à assurer usage vétérinaire peuvent être distinguées :
O

leur stérilité et à empêcher l’introduction de contaminants — les comprimés intra-utérins,


et la croissance de microorganismes ; des recommandations — les capsules intra-utérines,
sont fournies à cet égard dans le texte Méthodes de — les solutions, émulsions et suspensions intra-utérines, et
préparation des produits stériles (5.1.1). les solutions intra-utérines à diluer,
ESSAI — les comprimés pour solutions et pour suspensions
intra-utérines,
Granulométrie. Lorsque la finesse d’une poudre pour
application cutanée est prescrite, elle est déterminée par — les préparations intra-utérines semi-solides,
tamisage (2.9.35) ou par une autre méthode appropriée. — les mousses intra-utérines,
Uniformité des préparations unidoses. Les poudres pour — les bâtons intra-utérins.
application cutanée unidoses satisfont à l’essai d’uniformité
des préparations unidoses (2.9.40) ou, dans les cas justifiés PRODUCTION
et autorisés, aux essais d’uniformité de teneur et/ou Au cours du développement des préparations intra-utérines
d’uniformité de masse présentés ci-après. Les drogues pour usage vétérinaire dont la formulation comporte un
végétales et les préparations à base de drogues végétales conservateur antimicrobien, l’efficacité du conservateur
présentes dans cette forme pharmaceutique ne sont pas choisi doit être démontrée de manière à satisfaire l’Autorité
soumises aux dispositions de ce paragraphe. compétente. Le texte Efficacité de la conservation

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4245
Préparations intra-utérines pour usage vétérinaire PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

antimicrobienne (5.1.3) décrit une méthode d’essai ÉTIQUETAGE


appropriée et indique des critères d’évaluation des propriétés L’étiquette indique :
antimicrobiennes de la formulation.
— le nom de tout conservateur antimicrobien ajouté,
Lors de la fabrication, du conditionnement, de la conservation — dans les cas appropriés, que la préparation est stérile.
et de la distribution des préparations intra-utérines pour
usage vétérinaire, des mesures appropriées sont prises
pour assurer la qualité microbiologique du produit ; des Comprimés intra-utérins
recommandations sont fournies à cet égard dans le texte
Qualité microbiologique des préparations pharmaceutiques DÉFINITION
(5.1.4), voir tableau 5.1.4.-1. – Voie cutanée.
Les comprimés intra-utérins sont des préparations solides
Les préparations intra-utérines pour usage vétérinaire contenant une unité de prise d’une ou plusieurs substances
stériles sont préparées à partir de matières premières actives. Ils répondent sur le plan général à la définition
et par des méthodes propres à assurer leur stérilité et à donnée dans la monographie Comprimés (0478).
empêcher l’introduction de contaminants et la croissance de Un applicateur approprié peut être utilisé pour
microorganismes ; des recommandations sont fournies à cet l’administration de la préparation dans l’utérus.
égard dans le texte Méthodes de préparation des produits

TE
stériles (5.1.1). ESSAI
Au cours du développement, il doit être démontré qu’il est Désagrégation. A moins qu’ils ne soient destinés à une
possible de prélever le contenu nominal du récipient des action locale prolongée, les comprimés intra-utérins satisfont
préparations intra-utérines pour usage vétérinaire présentées à l’essai de désagrégation des suppositoires et des ovules
sous la forme de récipients unidoses. (2.9.2). Examinez l’état des comprimés après 30 min, sauf
exception justifiée et autorisée.

ESSAI LÈ Capsules intra-utérines


Uniformité des préparations unidoses. Les préparations
intra-utérines pour usage vétérinaire unidoses satisfont à DÉFINITION
l’essai d’uniformité des préparations unidoses (2.9.40) ou,
dans les cas justifiés et autorisés, aux essais d’uniformité Les capsules intra-utérines sont des préparations unidoses
de teneur et/ou d’uniformité de masse présentés ci-après. solides. Elles sont de façon générale semblables aux capsules
Les drogues végétales et préparations à base de drogues à enveloppe molle, dont elles diffèrent simplement par la
végétales présentes dans cette forme pharmaceutique ne forme et la taille. Les capsules intra-utérines sont de forme
sont pas soumises aux dispositions de ce paragraphe. variable, mais le plus souvent ovoïde ; elles sont lisses et leur
aspect extérieur est uniforme.
Uniformité de teneur (2.9.6). Sauf indication contraire
O
ou exception justifiée et autorisée, les préparations Un applicateur approprié peut être utilisé pour
intra-utérines pour usage vétérinaire unidoses solides dont l’administration de la préparation dans l’utérus.
la teneur en substance active est inférieure à 2 mg ou dans
lesquelles la substance active représente moins de 2 pour ESSAI
cent de la masse totale satisfont aux essais A (comprimés Désagrégation. A moins qu’elles ne soient destinées à une
intra-utérins) ou B (capsules intra-utérines) d’uniformité de
BS

action locale prolongée, les capsules intra-utérines satisfont


teneur des préparations unidoses. Si la préparation contient à l’essai de désagrégation des suppositoires et des ovules
plusieurs substances actives, l’essai ne s’applique qu’à celles (2.9.2). Examinez l’état des capsules après 30 min, sauf
qui répondent aux conditions indiquées ci-dessus. exception justifiée et autorisée.
Uniformité de masse (2.9.5). Les préparations intra-utérines
pour usage vétérinaire unidoses solides satisfont à l’essai
d’uniformité de masse des préparations unidoses. Lorsqu’un Solutions, émulsions et
essai d’uniformité de teneur est prescrit ou justifié et autorisé suspensions intra-utérines
pour toutes les substances actives, l’essai d’uniformité de Solutions intra-utérines à diluer
masse n’est pas exigé.
O

Dissolution. Dans le cas des préparations intra-utérines DÉFINITION


pour usage vétérinaire unidoses solides, un essai approprié Les solutions, émulsions et suspensions intra-utérines sont
peut être réalisé pour démontrer que la libération de la ou des préparations liquides. Les solutions intra-utérines à
des substances actives est satisfaisante, par exemple l’un des diluer sont destinées à être administrées après dilution.
essais décrits dans le texte Essai de dissolution des formes
solides (2.9.3). Elles peuvent contenir des excipients destinés, par exemple, à
ajuster la viscosité de la préparation, à adapter ou stabiliser le
Lorsqu’un essai de dissolution est prescrit, un essai de pH, à augmenter la solubilité de la ou des substances actives
désagrégation peut ne pas être exigé. ou à stabiliser la préparation. Ces excipients ne nuisent pas
Stérilité (2.6.1). Les préparations intra-utérines pour à l’action médicamenteuse recherchée et, aux concentrations
usage vétérinaire stériles satisfont à l’essai de stérilité. Les choisies, ne provoquent pas d’irritation locale notable.
applicateurs fournis avec la préparation satisfont également Les émulsions peuvent présenter des signes de séparation
à l’essai de stérilité. Sortez l’applicateur de son emballage des phases, mais sont facilement redispersées par agitation.
dans des conditions aseptiques et transférez-le dans un tube à Les suspensions peuvent présenter un sédiment, qu’il
essai contenant du milieu de culture, en veillant à l’immerger est facile de disperser par agitation de façon à obtenir
totalement. Procédez à l’incubation et à l’interprétation des une suspension suffisamment stable pour permettre
résultats comme indiqué dans l’essai de stérilité. l’administration d’une préparation homogène.

4246 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 Préparations semi-solides pour application cutanée

Les solutions, émulsions et suspensions intra-utérines Bâtons intra-utérins


peuvent être conditionnées en récipients unidoses. Le
récipient est de forme adaptée à l’administration de la DÉFINITION
préparation dans l’utérus ou peut être accompagné d’un Les bâtons intra-utérins satisfont aux exigences de la
applicateur approprié. monographie Bâtons (1154). Ils produisent souvent une
mousse au contact des fluides physiologiques.
PRODUCTION
Lors de la fabrication des suspensions intra-utérines, des
mesures sont prises pour assurer que la taille des particules
est convenablement maîtrisée et qu’elle est appropriée à 01/2009:0132
l’usage prévu de la préparation.
PRÉPARATIONS SEMI-SOLIDES POUR
Comprimés pour solutions et suspensions APPLICATION CUTANÉE
intra-utérines
Praeparationes molles ad usum dermicum
DÉFINITION

TE
Les comprimés destinés à la préparation de solutions ou Les exigences de la présente monographie s’appliquent
suspensions intra-utérines sont des préparations unidoses à toutes les préparations semi-solides pour application
à dissoudre ou disperser dans de l’eau au moment de cutanée. Dans le cas de préparations semi-solides destinées
l’administration. Ils peuvent contenir des excipients destinés à être appliquées sur des surfaces particulières ou sur les
à faciliter la dissolution ou la dispersion ou à empêcher muqueuses, elles peuvent le cas échéant être complétées
l’agrégation des particules. par des exigences spécifiques figurant dans d’autres
monographies générales, par exemple les monographies
Les comprimés pour solutions ou suspensions intra-utérines Préparations auriculaires (0652), Préparations
répondent à la définition donnée dans la monographie nasales (0676), Préparations ophtalmiques (1163),
Comprimés (0478). LÈ Préparations rectales (1145) et Préparations
Après dissolution ou mise en suspension, la préparation vaginales (1164).
satisfait, selon le cas, aux exigences concernant les solutions
ou les suspensions intra-utérines. DÉFINITION
Les préparations semi-solides pour application cutanée sont
ESSAI formulées en vue d’une libération locale ou transdermique
Désagrégation. Opérez comme décrit dans l’essai de de substances actives, ou pour leur action émolliente ou
désagrégation des comprimés et des capsules (2.9.1), protectrice. Elles présentent un aspect homogène.
mais en utilisant de l’eau R à 15-25 °C. Les comprimés se Les préparations semi-solides pour application cutanée sont
désagrègent en moins de 3 min. constituées d’un excipient, simple ou composé, dans lequel
O
sont habituellement dissous ou dispersés 1 ou plusieurs
ÉTIQUETAGE substances actives. Selon sa composition, cet excipient peut
L’étiquette indique : avoir une influence sur l’activité de la préparation.
— le mode de préparation de la solution ou suspension Les excipients utilisés peuvent être des substances d’origine
intra-utérine, naturelle ou synthétique, et peuvent être monophases ou
BS

— les conditions et la durée de conservation de la solution multiphases. Selon la nature de l’excipient, la préparation
ou suspension après reconstitution. peut avoir des propriétés hydrophiles ou hydrophobes. La
préparation peut également contenir d’autres excipients
appropriés tels que des agents antimicrobiens, des
Préparations intra-utérines semi-solides antioxydants, des agents stabilisants, des émulsifiants, des
épaississants et des agents de pénétration.
DÉFINITION
Les préparations semi-solides pour application cutanée
Les préparations intra-utérines semi-solides sont des destinées à être appliquées sur une peau gravement lésée
pommades, crèmes ou gels. sont stériles.
Les préparations intra-utérines semi-solides satisfont aux Dans les cas appropriés, les récipients destinés aux
O

exigences de la monographie Préparations semi-solides préparations semi-solides pour application cutanée satisfont
pour application cutanée (0132). aux exigences relatives aux Matériaux utilisés dans la
Elles sont souvent conditionnées en récipients unidoses. fabrication des récipients (3.1 et sous-chapitres) et aux
Le récipient est de forme adaptée à l’administration de la Récipients (3.2 et sous-chapitres).
préparation dans l’utérus ou peut être accompagné d’un Plusieurs catégories de préparations semi-solides pour
applicateur approprié. application cutanée peuvent être distinguées :
— les pommades,
Mousses intra-utérines — les crèmes,
DÉFINITION — les gels,
— les pâtes,
Les mousses intra-utérines satisfont aux exigences de la
monographie Mousses médicamenteuses (1105). — les cataplasmes,
Elles sont conditionnées en récipients multidoses. Le — les emplâtres médicamenteux.
récipient est de forme adaptée à l’administration de la Selon leur structure, les pommades, crèmes et gels
préparation dans l’utérus ou peut être accompagné d’un présentent généralement un comportement viscoélastique
applicateur approprié. et les propriétés des fluides non-newtoniens (par exemple

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4247
Préparations semi-solides pour application cutanée PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

de type plastique, pseudoplastique ou thixotrope) sous Stérilité (2.6.1). Lorsque l’étiquette indique que la
des vitesses de cisaillement élevées. Les pâtes présentent préparation est stérile, celle-ci satisfait à l’essai de stérilité.
souvent des propriétés de dilatance.
CONSERVATION
PRODUCTION En récipient étanche si la préparation contient de l’eau ou
Au cours du développement des préparations semi-solides d’autres composants volatils. Si la préparation est stérile,
pour application cutanée dont la formulation comporte un elle est conservée en récipient stérile, étanche, à fermeture
conservateur antimicrobien, la nécessité et l’efficacité du inviolable.
conservateur choisi doivent être démontrées de manière
à satisfaire l’Autorité compétente. Le texte Efficacité de la ÉTIQUETAGE
conservation antimicrobienne (5.1.3) décrit une méthode L’étiquette indique :
d’essai appropriée et indique des critères d’évaluation — le nom de tout conservateur antimicrobien ajouté,
des propriétés antimicrobiennes de la formulation. Lors
— dans les cas appropriés, que la préparation est stérile.
de la fabrication, du conditionnement, de la conservation
et de la distribution des préparations semi-solides pour
application cutanée, des mesures appropriées sont prises Pommades
pour assurer la qualité microbiologique du produit ; des

TE
recommandations sont fournies à cet égard dans le texte DÉFINITION
Qualité microbiologique des préparations pharmaceutiques Les pommades se composent d’un excipient monophase dans
(5.1.4). Les préparations semi-solides pour application lequel peuvent être dispersés des liquides ou des solides.
cutanée stériles sont préparées à partir de produits et
Pommades hydrophobes
par des méthodes propres à assurer leur stérilité et à
empêcher l’introduction de contaminants et la croissance de Les pommades hydrophobes ne peuvent absorber que
microorganismes ; des recommandations sont fournies à cet de petites quantités d’eau. Les excipients les plus
égard dans le texte Méthodes de préparation des produits communément employés pour la formulation de telles
stériles (5.1.1). pommades sont la paraffine solide, la paraffine liquide, la
LÈ paraffine liquide légère, les huiles végétales, les graisses
Au cours du développement, il doit être démontré qu’il animales, les glycérides synthétiques, les cires et les
est possible de prélever le contenu nominal du récipient polyalkylsiloxanes liquides.
des préparations semi-solides pour application cutanée
présentées en récipients unidoses. Pommades absorbant l’eau
Lors de la fabrication des préparations semi-solides pour Ces pommades peuvent absorber des quantités plus
application cutanée, des mesures adéquates sont prises pour importantes d’eau et conduire par conséquent à l’obtention
assurer l’obtention des propriétés rhéologiques recherchées. d’émulsions eau-dans-huile ou huile-dans-eau, après
Dans les cas appropriés, les essais suivants, d’application homogénéisation, selon la nature des agents émulsifiants.
non obligatoire, peuvent être effectués : mesure de la Des agents émulsifiants eau-dans-huile tels que des alcools de
O
consistance par pénétrométrie (2.9.9), viscosité (viscosité graisse de laine, des esters de sorbitan, des monoglycérides,
apparente) (2.2.10) et un essai approprié peut être réalisé des alcools gras, ou des agents émulsifiants huile-dans-eau
pour démontrer que la libération de la ou des substances tels que des alcools gras sulfatés, des polysorbates, l’éther
actives est satisfaisante. cétostéarylique de macrogol ou des esters d’acides gras et de
macrogols peuvent être utilisés dans ce but. Les excipients
Lors de la fabrication de préparations semi-solides pour utilisés sont ceux d’une pommade hydrophobe.
BS

application cutanée contenant 1 ou plusieurs substances


actives qui ne sont pas dissoutes dans l’excipient (par Pommades hydrophiles
exemple émulsions ou suspensions), des mesures sont prises Les pommades hydrophiles sont des préparations
pour assurer une homogénéité adéquate de la préparation dont l’excipient est miscible à l’eau. Cet excipient est
à administrer. habituellement constitué de mélanges de macrogols
(polyéthylèneglycols) liquides et solides. Il peut contenir des
Lors de la fabrication des préparations semi-solides pour
quantités appropriées d’eau.
application cutanée contenant des particules en dispersion,
des mesures sont prises pour assurer que la taille des
particules est convenablement contrôlée et qu’elle est Crèmes
appropriée à l’usage prévu de la préparation.
O

DÉFINITION
ESSAI Les crèmes sont des préparations multiphases composées
Uniformité des préparations unidoses. Les préparations d’une phase lipophile et d’une phase aqueuse.
semi-solides conditionnées en récipients unidoses Crèmes lipophiles
représentant une dose de médicament et destinées à la Dans les crèmes lipophiles, la phase externe est la phase
libération transdermique de substances actives en vue lipophile. Ces préparations contiennent généralement des
d’un effet systémique satisfont à l’essai d’uniformité agents émulsifiants eau-dans-huile tels que des alcools de
des préparations unidoses (2.9.40). Les préparations graisse de laine, des esters de sorbitan et des monoglycérides.
semi-solides dans lesquelles la (les) substance(s) active(s)
est (sont) dissoute(s) satisfont à l’essai de variation de Crèmes hydrophiles
masse ; les préparations semi-solides dans lesquelles la (les) Dans les crèmes hydrophiles, la phase externe est la
substance(s) active(s) est (sont) en suspension satisfont à phase aqueuse. Ces préparations contiennent des agents
l’essai d’uniformité de teneur. Suivez la procédure indiquée émulsifiants huile-dans-eau tels que des savons de sodium
pour les formes pharmaceutiques liquides. Les drogues ou de trolamine, des alcools gras sulfatés, des polysorbates
végétales et les préparations à base de drogues végétales et des esters d’acides et d’alcools gras polyoxyéthylénés,
présentes dans ces formes pharmaceutiques ne sont pas éventuellement en combinaison avec des agents émulsifiants
soumises aux dispositions de ce paragraphe. eau-dans-huile.

4248 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 Préparations semi-solides pour application cutanée

Gels Emplâtres médicamenteux


DÉFINITION
Les gels sont constitués de liquides gélifiés à l’aide d’agents DÉFINITION
gélifiants appropriés.
Les emplâtres médicamenteux sont des préparations souples
Gels lipophiles contenant 1 ou plusieurs substances actives. Ils sont destinés
Les gels lipophiles (oléogels) sont des préparations dont à être placés sur la peau en vue de maintenir un contact
l’excipient est habituellement de la paraffine liquide étroit entre la peau et la ou les substances actives, de telle
additionnée de polyéthylène, ou des huiles grasses gélifiées sorte que ceux-ci puissent être absorbés lentement ou agir
par de la silice colloïdale ou des savons d’aluminium ou de comme agents protecteurs ou kératolytiques.
zinc
Gels hydrophiles Ils consistent en une base adhésive, colorée ou non,
contenant 1 ou plusieurs substances actives, étalée en
Les gels hydrophiles (hydrogels) sont des préparations une couche uniforme sur un support approprié constitué
dont l’excipient est habituellement de l’eau, du glycérol d’un matériau naturel ou synthétique. Les emplâtres
ou du propylèneglycol gélifiés à l’aide d’agents gélifiants médicamenteux ne sont pas responsables d’irritations ou
appropriés tels que des poloxamères, de l’amidon, des de sensibilisation de la peau. Les bases adhésives sont
dérivés de la cellulose, des carbomères ou des silicates de

TE
recouvertes d’une bande de protection appropriée qui est
magnésium-aluminium. retirée avant application sur la peau. Lorsqu’elle est retirée,
la bande protectrice n’entraîne pas la préparation avec elle.
Pâtes
Les emplâtres médicamenteux sont soit présentés sous des
DÉFINITION dimensions permettant un usage direct, soit sous forme
Les pâtes sont des préparations semi-solides pour application de bandes destinées à être coupées avant utilisation. Ils
cutanée contenant de fortes proportions de poudres adhèrent fermement à la peau par simple pression et peuvent
finement dispersées dans l’excipient. être retirés facilement sans causer de blessure notable de la
LÈ peau ni de séparation de la préparation et du support.
Cataplasmes
DÉFINITION ESSAI
Les cataplasmes se composent d’un excipient hydrophile Dissolution. Un essai approprié peut être nécessaire afin de
rétenteur de chaleur, dans lequel sont dispersées des démontrer que la libération de la ou des substances actives
substances actives solides ou liquides. Ils sont généralement est adéquate ; à cette fin l’un des essais décrits dans la
étalés en couche épaisse sur un pansement approprié et méthode Essai de dissolution des dispositifs transdermiques
chauffés avant application sur la peau. (2.9.4) peut être effectué.
O
BS
O

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4249
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

TE

O
BS
O

4250 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

VACCINS POUR USAGE


HUMAIN
Vaccin conjugué de l’haemophilus type b.. ........................4253 Vaccin poliomyélitique inactivé.. ..........................................4259
Vaccin diphtérique, tétanique, coquelucheux (acellulaire, Vaccin varicelleux vivant.. ......................................................4262
multicomposé), poliomyélitique (inactivé) et conjugué de Vaccin vivant du zona.. ...........................................................4263
l’haemophilus type b, adsorbé.. ..........................................4256

TE

O
BS
O

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4251
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

TE

O
BS
O

4252 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 Vaccin conjugué de l’haemophilus type b

01/2009:1219 de groupe sanguin, le procédé de fabrication doit être


validé pour démontrer que, suite à l’étape de purification,
de telles substances ne sont plus décelables. La pureté
VACCIN CONJUGUÉ DE bactériologique de la culture est vérifiée par des méthodes
L’HAEMOPHILUS TYPE b de sensibilité appropriée. Ces méthodes peuvent comprendre
un ensemencement en milieux appropriés, l’examen
Vaccinum haemophili stirpi b coniugatum morphologique des colonies, l’examen microscopique de
frottis à coloration de Gram et l’agglutination des cultures
DÉFINITION à l’aide d’antisérums spécifiques appropriés. La culture
Le vaccin conjugué de l’haemophilus type b est une peut ensuite être inactivée. Le PRP est séparé du milieu
préparation liquide ou cryodesséchée d’un polyoside de culture et purifié par une méthode appropriée. Les
obtenu à partir d’une souche appropriée d’Haemophilus substances volatiles, dont l’eau, contenues dans le polyoside
influenzae type b, couplé par liaison covalente à purifié sont déterminées par une méthode appropriée ; le
une protéine vectrice. Le polyoside est du phosphate résultat de la détermination sert à calculer le résultat de
de polyribosylribitol, également appelé PRP, un certains essais par rapport à la substance desséchée, selon
copolymère linéaire constitué d’un enchaînement d’unités les indications ci-après.
3-β-D-ribofuranosyl-(1→1)-ribitol-5-phosphate [(C10H19O12P)n], Seul un PRP satisfaisant aux exigences ci-après peut être

TE
de taille moléculaire définie. La protéine vectrice conjuguée utilisé pour la préparation du conjugué.
au polyoside est capable d’induire une réponse immunitaire Identification. Le PRP est identifié par une méthode
des lymphocytes B, dépendante des lymphocytes T, vis-à-vis immunochimique (2.7.1) ou toute autre méthode appropriée,
du polyoside. par exemple, la spectrométrie de résonance magnétique
PRODUCTION nucléaire 1H (2.2.33).
DISPOSITIONS GÉNÉRALES Distribution de taille moléculaire. Le pourcentage de PRP
Il doit avoir été établi que le procédé de production élué avant une valeur donnée de K0 ou dans un intervalle
employé fournit de façon régulière un vaccin conjugué donné de K0 est déterminé par chromatographie d’exclusion

de l’haemophilus type b dont l’innocuité et le pouvoir (2.2.30). Une valeur acceptable est établie pour chaque
immunogène pour l’homme sont satisfaisants. Le PRP et la produit considéré et il doit être démontré que chaque lot
protéine vectrice sont préparés selon un système de lot de de PRP est conforme à cette limite. Les limites appliquées
semence. aux produits actuellement approuvés, en utilisant la phase
stationnaire indiquée, figurent à titre d’information dans le
Le procédé de production fait l’objet d’une validation tableau 1219.-1. Dans les cas appropriés, la taille moléculaire
permettant de démontrer que le produit satisferait à l’essai est également déterminée après modification chimique du
de toxicité anormale des immunosérums et vaccins pour polyoside.
usage humain (2.6.9), s’il lui était appliqué.
La chromatographie liquide (2.2.29) avec détection à angles
Pendant les études de développement et chaque fois qu’il est multiples de dispersion de lumière laser peut également être
O
nécessaire de revalider le procédé de production, il doit être utilisée pour déterminer la distribution de taille moléculaire.
démontré par un essai chez l’animal que le vaccin est capable
d’induire de façon régulière une réponse immunitaire des Une méthode validée de détermination du degré de
lymphocytes B, dépendante des lymphocytes T. polymérisation ou de la moyenne massique de la
masse moléculaire et de la dispersion de la masse moléculaire
La stabilité du lot final et des substances intermédiaires
peuvent être utilisées au lieu de la détermination de la
BS

appropriées est évaluée au moyen d’un ou de plusieurs essais


distribution de taille moléculaire.
indicatifs. Les essais indicatifs de stabilité sont par exemple
la détermination de la taille moléculaire, la détermination du Ribose (2.5.31). Calculée par rapport à la substance
PRP libre dans le conjugué et l’essai du pouvoir immunogène desséchée, la teneur en ribose se situe dans les limites
chez la souris. En fonction des résultats des essais de approuvées par l’Autorité compétente pour le produit
stabilité, des spécifications de libération des lots sont établies considéré.
pour ces essais indicatifs de façon à démontrer que le vaccin Phosphore (2.5.18). Calculée par rapport à la substance
sera satisfaisant à la fin de la période de validité. desséchée, la teneur en phosphore se situe dans les limites
LOTS DE SEMENCE approuvées par l’Autorité compétente pour le produit
considéré.
O

Il est démontré que les lots de semence de H. influenzae


type b sont exempts de contaminants par des méthodes de Protéines (2.5.16) : au maximum 1,0 pour cent, calculé par
sensibilité appropriée. Ces méthodes peuvent comprendre rapport à la substance desséchée. Utilisez une quantité de
un ensemencement en milieux appropriés, l’examen PRP suffisante pour permettre la détection des protéines à
morphologique des colonies, l’examen microscopique de partir d’une concentration de 1 pour cent.
frottis à coloration de Gram et l’agglutination des cultures à Acides nucléiques (2.5.17) : au maximum 1,0 pour cent,
l’aide d’antisérums spécifiques appropriés. calculé par rapport à la substance desséchée.
Le milieu utilisé pour préserver la viabilité de la souche, Endotoxines bactériennes (2.6.14) : moins de 25 UI par
soit à l’état cryodesséché, soit congelée, ne contient aucune microgramme de PRP.
substance complexe d’origine animale.
Résidus de réactifs. Dans les cas appropriés, des essais
Il est recommandé de caractériser le PRP produit au moyen
sont effectués pour déterminer les résidus des réactifs
du lot de semence, à l’aide de la spectrométrie de résonance
utilisés pendant l’inactivation et la purification. Une valeur
magnétique nucléaire (2.2.33).
acceptable est établie pour chaque réactif et pour chaque
POLYOSIDE DE H. INFLUENZAE TYPE b (PRP) produit considéré et il est démonté que chaque lot de PRP
H. influenzae type b est cultivée dans un milieu liquide est conforme à cette limite. Si les études de validation ont
ne contenant pas de polyosides de masse moléculaire démontré l’élimination des résidus d’un réactif, l’essai sur
élevée ; si un ingrédient du milieu contient des substances le PRP peut être omis.

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4253
Vaccin conjugué de l’haemophilus type b PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

Tableau 1219.-1. – Caractéristiques des produits et spécifications du PRP et de la protéine vectrice dans les produits
actuellement approuvés
Vecteur Polyoside d’Haemophilus Conjugaison
Type Pureté Quantité Nature du PRP Quantité Méthode de Procédure
nominate par nominale par liaison
dose dose
Anatoxine > 1500 Lf par 18 μg PRP de taille moléculaire 25 μg activation du anatoxine
diphtérique milligramme réduite K0 : 0,6-0,7, sur PRP par le diphtérique
d’azote agarose réticulé pour bromure de activée (D-AH+),
chromatographie R cyanogène PRP activé au
bromure de
cyanogène
Anatoxine > 1500 Lf par 20 μg PRP ≥ 50 % 10 μg carbodiimide PRP activé
tétanique milligramme ≤ K0 : 0,30 sur par ADH
d’azote agarose réticulé pour (PRP-cov.-AH)
chromatographie R + anatoxine
tétanique
+ EDAC
Protéine > 90 % de protéine 25 μg PRP de taille moléculaire 10 μg amination réduc- liaison directe du

TE
diphtérique CRM diphtérique réduite trice (une étape) PRP au CRM 197
197 Dp = 15-35 ou 10-35 ou activation par (activé par le cya-
le N-hydroxysuc- noborohydrure)
cinimide
Protéine de la vésicules de 125 μg ou PRP de taille moléculaire 7,5 μg ou 15 μg liaison thioéther activation du
membrane externe la membrance 250 μg réduite PRP par le CDI
de méningocoque protéique K0 < 0,6, sur agarose PRP-IM + BuA2
de groupe B (OMP) externe : ≤ 8 % réticulé pour + BrAc = PRP-
de lipopolyoside chromatographie R ou BuA2-BrAc
+ OMP
Mw > 50 × 103 thioactivée
ADH = dihydrazide d’acide adipique
BrAc = chlorure de bromoacétyle
BuA2 = butane-1,4-diamide
CDI = carbonyldiimidazole
LÈ Dp = degré de polymérisation
EDAC = 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide
IM = imidazolium
Mw = moyenne massique de la masse moléculaire

PROTÉINE VECTRICE Complexe protéique de la membrane externe de Neisseria


La protéine vectrice est choisie de telle sorte que, une fois meningitidis groupe B (OMP). L’OMP satisfait aux essais
conjuguée avec le PRP, elle soit capable d’induire une suivants de lipopolyosides et de pyrogènes.
O
réponse immunitaire des lymphocytes B, dépendante des Lipopolyosides : au maximum 8 pour cent, déterminé par
lymphocytes T. Les protéines vectrices et les méthodes de une méthode appropriée.
couplage actuellement approuvées sont indiquées à titre Pyrogènes (2.6.8). Injectez à chaque lapin 0,25 μg d’OMP
d’information dans le tableau 1219.-1. Les protéines vectrices par kilogramme de masse corporelle.
sont produites par culture de microorganismes appropriés.
La pureté bactériologique de la culture est vérifiée. La CONJUGUÉ EN VRAC
BS

culture peut être inactivée. La protéine vectrice est purifiée Pour pouvoir être conjugué, le PRP subit une modification
par une méthode appropriée. chimique ; il est généralement partiellement dépolymérisé
Seule une protéine vectrice qui satisfait aux essais ci-après avant ou au cours de cette modification. Des groupes
peut être utilisée pour la préparation du conjugué. fonctionnels réactifs ou espaceurs peuvent être introduits
dans la protéine vectrice ou le PRP avant l’obtention du
Identification. La protéine vectrice est identifiée par une conjugué. Afin de contrôler la régularité du procédé, le
méthode immunochimique appropriée (2.7.1). degré de dérivatisation est déterminé. Le conjugué est
Stérilité (2.6.1). Utilisez pour chaque milieu 10 ml ou obtenu en couplant le PRP et la protéine vectrice par
l’équivalent de 100 doses, en choisissant la quantité moindre. une liaison covalente. Il est soumis à un traitement de
purification destiné à éliminer les réactifs résiduels, et dans
O

Anatoxine diphtérique. L’anatoxine diphtérique est


les cas appropriés, les groupes fonctionnels restés libres
préparée selon les indications données dans la monographie
sont neutralisés en cours de fabrication au moyen d’agents
Vaccin diphtérique adsorbé (0443) et satisfait aux exigences
masquants.
pour l’anatoxine purifiée en vrac.
Seul un conjugué en vrac qui satisfait aux essais ci-après
Anatoxine tétanique. L’anatoxine tétanique est préparée peut être utilisé pour la préparation du vrac final. Une valeur
selon les indications données dans la monographie Vaccin acceptable est établie pour chaque essai et chaque produit
tétanique adsorbé (0452) et satisfait aux exigences pour considéré et il doit être démontré que chaque lot de conjugué
l’anatoxine purifiée en vrac sauf que la pureté antigénique est conforme à ces limites. Pour certains des essais, les
n’est pas inférieure à 1500 Lf par milligramme d’azote limites appliquées aux produits actuellement approuvés sont
protéique. indiquées à titre d’information dans le tableau 1219.-2. Dans
Protéine diphtérique CRM 197 : au minimum 90 pour le cas d’un vaccin cryodesséché, certains essais peuvent
cent, déterminé par une méthode appropriée. Des essais être effectués sur le lot final et non sur le conjugué en vrac
appropriés sont effectués, pour la validation ou en routine, lorsque le procédé de cryodessiccation peut modifier le
afin de démontrer que le produit n’est pas toxique. composé à déterminer.
PRP. La teneur en PRP est établie par une détermination du
phosphore (2.5.18) ou du ribose (2.5.31) ou par un dosage
immunochimique (2.7.1).

4254 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 Vaccin conjugué de l’haemophilus type b

Protéine. La teneur en protéine est déterminée par une LOT FINAL


méthode chimique appropriée (par exemple, 2.5.16). Seul peut être libéré un lot final qui satisfait à chacune des
Rapport des teneurs en PRP et protéines. Déterminez le exigences suivantes et des exigences spécifiées ci-dessous
rapport par calcul. sous Identification et Essai. Si l’essai de teneur en
conservateur antimicrobien a été effectué sur le vaccin final
Distribution de taille moléculaire. Le conjugué en vrac en vrac, il peut être omis sur le lot final.
fait l’objet d’un essai de taille moléculaire effectué par
chromatographie d’exclusion (2.2.30). pH (2.2.3). Le pH du vaccin, reconstitué si nécessaire, se
situe dans les limites approuvées pour le produit considéré.
PRP libre. Plusieurs techniques ont été utilisées pour
séparer le PRP libre du conjugué, comme par exemple PRP libre. Plusieurs techniques ont été utilisées pour
la précipitation, la filtration sur gel, la chromatographie séparer le PRP libre du conjugué, comme par exemple
d’exclusion, d’échange d’anions ou hydrophobe, la précipitation, la filtration sur gel, la chromatographie
l’ultrafiltration et l’ultracentrigugation. Le PRP libre peut d’exclusion, d’échange d’anions ou hydrophobe,
alors être quantifié par diverses techniques, comme une l’ultrafiltration et l’ultracentrigugation. Le PRP libre peut
chromatographie d’échange d’anions de haute performance alors être quantifié par diverses techniques, comme une
couplée à une détection par ampérométrie pulsée HPAEC-PAD ou un immunodosage avec des anticorps
(HPAEC-PAD) ou un immunodosage avec des anticorps anti-PRP. La teneur en PRP libre n’est pas supérieure à celle
approuvée pour le produit considéré.

TE
anti-PRP.
Protéine vectrice libre. Déterminez la teneur en protéine
vectrice libre soit directement par une méthode appropriée IDENTIFICATION
soit par calcul à partir des résultats des autres essais. La Le vaccin est identifié par une méthode immunochimique
teneur est comprise dans les limites approuvées pour le appropriée (2.7.1) pour le PRP.
produit considéré.
Groupes fonctionnels libres. Le conjugué en vrac ne doit ESSAI
contenir aucun groupe fonctionnel n’ayant pas réagi, à moins PRP : au minimum 80 pour cent de la quantité de PRP
qu’il n’ait été démontré lors de la validation du procédé que
LÈ indiquée sur l’étiquette. La teneur en PRP est déterminée
les groupes fonctionnels libres détectables à ce stade sont soit par un dosage du ribose (2.5.31) ou du phosphore
éliminés ensuite lors du procédé de fabrication (par exemple (2.5.18), soit par une méthode immunochimique (2.7.1), soit
du fait de la brièveté de leur demi-vie). par chromatographie liquide d’échange d’anions avec un
Réactifs résiduels. L’élimination des réactifs détecteur ampérométrique à pulsations (2.2.29).
résiduels, par exemple le cyanure, l’EDAC Aluminium (2.5.13) : au maximum 1,25 mg par dose
(éthyldiméthylaminopropylcarbodiimide) et le phénol, est humaine unitaire, si l’adsorbant utilisé est de l’hydroxyde
confirmée par des essais appropriés ou par une validation d’aluminium ou du phosphate d’aluminium hydraté.
du procédé.
Conservateur antimicrobien. Dans les cas appropriés,
Stérilité (2.6.1). Utilisez pour chaque milieu 10 ml ou
O
déterminez la teneur en conservateur antimicrobien par
l’équivalent de 100 doses, en choisissant la quantité moindre. une méthode chimique ou physico-chimique appropriée.
VRAC FINAL Cette teneur n’est pas inférieure à la valeur dont il a été
Le conjugué en vrac est dilué à la concentration finale établi qu’elle correspond au seuil d’efficacité ni supérieure à
avec un diluant approprié. Un adjuvant, un conservateur 115 pour cent de la quantité indiquée sur l’étiquette.
antimicrobien et un stabilisant peuvent être ajoutés avant Eau (2.5.12) : au maximum 3,0 pour cent pour les vaccins
BS

la dilution. cryodesséchés.
Seul un vrac final qui satisfait aux essais suivants peut être Stérilité (2.6.1). Le vaccin à examiner satisfait à l’essai de
utilisé pour la préparation du lot final. stérilité.
Conservateur antimicrobien. Dans les cas appropriés, Pyrogènes (2.6.8). Le vaccin à examiner satisfait à l’essai des
déterminez la teneur en conservateur antimicrobien par une pyrogènes. Injectez par kilogramme de masse corporelle de
méthode chimique ou physico-chimique appropriée. Cette lapin une quantité de vaccin équivalente à : 1 μg de PRP si la
teneur n’est pas inférieure à 85 pour cent ni supérieure à protéine vectrice est l’anatoxine diphtérique ou la protéine
115 pour cent de la teneur voulue. diphtérique CRM 197 ; 0,1 μg de PRP si la protéine vectrice
Stérilité (2.6.1). Le vrac final satisfait à l’essai de stérilité. est l’anatoxine tétanique ; 0,025 μg de PRP si la protéine
O

Utilisez 10 ml de vrac final pour chaque milieu. vectrice est l’OMP.

Tableau 1219.-2. – Spécifications des conjugués en vrac des produits actuellement approuvés
Essai Protéine vectrice
Anatoxine diphtérique Anatoxine tétanique CRM 197 OMP
PRP libre < 37 % < 20 % < 25 % < 15 %
Protéine libre <4% < 1 % ; dans les cas < 1 % ou 2 % selon la non applicable
appropriés méthode de liaison
Rapport PRP : protéine 1,25 - 1,8 0,30 - 0,55 0,3 - 0,7 0,05 - 0,1
Taille moléculaire (KO) :
agarose réticulé pour 95 % < 0,75 60 % < 0,2 50 % 0,3 - 0,6 85 % < 0,3
chromatographie R
agarose réticulé pour 0,6 - 0,7 85 % < 0,5
chromatographie R1

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4255
Vaccin DTC (acellulaire, multicomposé), polio et de l’haemophilus type b PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

ÉTIQUETAGE influenzae type b. La protéine vectrice conjuguée au


L’étiquette indique : PRP est capable d’induire une réponse immunitaire des
lymphocytes B, dépendante des lymphocytes T, vis-à-vis du
— le nombre de microgrammes de PRP par dose humaine polyoside.
unitaire,
— la nature de la protéine vectrice et la quantité nominale
PRODUCTION
par dose humaine unitaire.
DISPOSITIONS GÉNÉRALES
Il doit être établi que le procédé de production utilisé donne
de façon reproductible des vaccins comparables à celui dont
01/2009:2065 l’efficacité clinique et l’innocuité chez l’homme ont été
démontrées.
VACCIN DIPHTÉRIQUE, TÉTANIQUE, Toxicité spécifique des composants diphtérique et
tétanique. Le procédé de production fait l’objet d’une
COQUELUCHEUX (ACELLULAIRE, validation permettant de démontrer que le produit satisferait
MULTICOMPOSÉ), POLIOMYÉLITIQUE à l’essai suivant, s’il lui était appliqué : utilisez 5 cobayes
en bonne santé, pesant 250-350 g et n’ayant pas été traités
(INACTIVÉ) ET CONJUGUÉ DE

TE
auparavant par une substance susceptible de fausser l’essai.
L’HAEMOPHILUS TYPE b, ADSORBÉ Injectez à chacun d’eux par voie sous-cutanée une quantité
équivalant à 5 fois la dose humaine unitaire indiquée sur
l’étiquette. Si, dans les 42 jours qui suivent l’injection,
Vaccinum diphtheriae, tetani, pertussis un des animaux présente des signes ou meurt de toxémie
sine cellulis ex elementis praeparatum, diphtérique ou du tétanos, le vaccin ne satisfait pas à l’essai.
poliomyelitidis inactivatum et haemophili Si plus de 1 animal meurt de causes non spécifiques, répétez
l’essai une seule fois ; si plus de 1 animal meurt dans le
stirpi b coniugatum adsorbatum LÈ second essai, le vaccin ne satisfait pas à l’essai.
DÉFINITION Endotoxines bactériennes (2.6.14). Une détermination
de la teneur en endotoxines bactériennes de l’anatoxine
Le vaccin diphtérique, tétanique, coquelucheux (acellulaire, diphtérique purifiée, de l’anatoxine tétanique purifiée,
multicomposé), poliomyélitique (inactivé) et conjugué de des composants coquelucheux purifiés, des récoltes
l’haemophilus type b, adsorbé, est un vaccin combiné monovalentes purifiées de virus poliomyélitiques et du
composé d’anatoxine diphtérique, d’anatoxine tétanique, conjugué PRP en vrac est effectuée afin de contrôler la
de composants antigéniques de Bordetella pertussis, procédure de purification et limiter la teneur en endotoxines
purifiés séparément, de souches appropriées de virus bactériennes du vaccin final. Pour chaque composant,
poliomyélitiques humains de type 1, 2 et 3, cultivés en la teneur en endotoxines bactériennes est inférieure à la
cultures cellulaires appropriées et inactivées par une
O
limite approuvée par l’Autorité compétente pour le vaccin
méthode validée, de phosphate de polyribosylribitol (PRP) considéré.
couplé par liaison covalente à une protéine vectrice et d’un
adsorbant minéral tel que l’hydroxyde d’aluminium ou le Etudes de développement et études destinées à démontrer
phosphate d’aluminium hydraté. Le produit se présente soit la régularité du procédé de production. Pendant les études
sous forme de formulation pentavalente liquide dans un de développement et chaque fois qu’il est nécessaire de
BS

même récipient, soit sous forme de formulation tétravalente revalider le procédé de production, il doit être démontré par
avec le composant haemophilus cryodesséché dans un un essai chez l’animal que le vaccin est capable d’induire
récipient séparé dont le contenu est mélangé aux autres une réponse immunitaire des lymphocytes B, dépendante
composants immédiatement avant l’utilisation. des lymphocytes T, vis-à-vis du PRP.
Les anatoxines sont obtenues par action du formaldéhyde Lorsque le composant haemophilus est présenté dans un
sur les toxines résultant respectivement de la croissance de récipient séparé, et pendant les études destinées à démontrer
Corynebacterium diphtheriae et de Clostridium tetani. la régularité du procédé de production, les titrages d’activité
Le vaccin contient soit l’anatoxine coquelucheuse, soit des composants diphtérique, tétanique, coquelucheux et
une protéine apparentée à la toxine coquelucheuse mais poliomyélitique sont effectués sur un nombre approprié
dépourvue de propriétés toxiques, obtenue par l’expression de lots du vaccin reconstitué selon le mode d’emploi. Par
O

d’une forme génétiquement modifiée du gène correspondant. la suite, les titrages d’activité peuvent être effectués sans
L’anatoxine coquelucheuse est obtenue à partir de la toxine mélange avec le composant haemophilus.
coquelucheuse par une méthode qui la rend inoffensive mais Vaccin(s) de référence. Sous réserve qu’ils permettent
qui maintient des propriétés immunogènes adéquates et évite d’effectuer des titrages d’activité valables, les vaccins
la réversibilité. Le composant coquelucheux acellulaire peut monocomposants de référence peuvent être utilisés pour
également contenir de l’hémagglutinine filamenteuse et de la les déterminations d’activité du vaccin combiné. Si leur
pertactine (protéine de 69 kDa de la membrane externe) ainsi utilisation n’est pas possible, du fait d’interactions entre
que d’autres composants définis de B. pertussis, par exemple les composants du vaccin combiné ou de différences de
les antigènes fimbria-2 et fimbria-3 ; ces 2 antigènes peuvent composition entre le vaccin de référence monocomposant
être copurifiés. La composition et les caractéristiques et le vaccin à examiner, un lot du vaccin combiné dont
antigéniques reposent sur la démonstration de l’induction l’efficacité a été démontrée lors d’essais cliniques ou un lot
d’une protection et de l’absence de réaction non attendue représentatif est utilisé comme vaccin de référence. Le lot
dans le groupe cible auquel est destiné le vaccin. représentatif doit être préparé par un procédé strictement
Le PRP est un copolymère linéaire constitué d’un identique à celui utilisé pour le lot soumis aux essais
enchaînement d’unités 3-β-D-ribofuranosyl-(1→1)-ribitol- cliniques. Le vaccin de référence peut être stabilisé par
5-phosphate [(C10H19O12P)n], de taille moléculaire définie, une méthode dont l’absence d’effet sur la procédure de
obtenu à partir d’une souche appropriée d’Haemophilus détermination de l’activité a été démontrée.

4256 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 Vaccin DTC (acellulaire, multicomposé), polio et de l’haemophilus type b

PRODUCTION DES COMPOSANTS d’acceptation de la détermination de la teneur en antigène D


La production des composants est conforme aux exigences sont tels qu’ils fournissent les mêmes résultats que le titrage
des monographies Vaccin diphtérique adsorbé (0443), d’activité in vivo en termes d’acceptation ou de rejet d’un
Vaccin tétanique adsorbé (0452), Vaccin coquelucheux lot. Cette démonstration doit comprendre des essais sur des
(adsorbé, multicomposé, acellulaire) (1356), Vaccin lots à activité altérée, produits de manière expérimentale
poliomyélitique inactivé (0214) et Vaccin conjugué de si nécessaire via un traitement par la chaleur par exemple
l’haemophilus type b (1219). ou d’autres moyens permettant de diminuer l’activité
VRACS FINALS immunogène. En cas de modification significative du
procédé de production des antigènes ou de leur formulation,
Le vrac final tétravalent des composants diphtérique, l’impact sur les titrages d’activité in vivo et in vitro devra
tétanique, coquelucheux et poliomyélitique est préparé être évalué, et le besoin de revalidation devra être considéré.
par adsorption séparée ou concomitante de quantités
appropriées d’anatoxine diphtérique purifiée, d’anatoxine Osmolalité (2.2.35). L’osmolalité du vaccin, reconstitué le
tétanique purifiée et de composants coquelucheux purifiés cas échéant, se situe dans les limites approuvées pour le
sur un support minéral tel que l’hydroxyde d’aluminium produit considéré.
ou le phosphate d’aluminium hydraté, puis addition de PRP libre. Lorsque le composant haemophilus est présenté
quantités appropriées de récoltes monovalentes purifiées de sous forme de formulation liquide, la présence des autres
virus poliomyélitiques de type 1, 2 et 3 ou d’une quantité composants peut interférer dans le titrage et il peut ne pas

TE
appropriée de mélange trivalent de ces récoltes monovalentes être possible de séparer le PRP de l’adjuvant. La présence
purifiées. Des conservateurs antimicrobiens appropriés de PRP libre peut être déterminée sur le conjugué en vrac
peuvent être ajoutés. avant l’addition des autres composants ou sur la fraction
Si le vaccin est présenté avec les 5 composants dans le même non adsorbée de la combinaison finale.
récipient, le vrac final est préparé par ajout d’une quantité Si le composant haemophilus est présenté dans un récipient
appropriée du conjugué haemophilus en vrac au vrac séparé, plusieurs techniques sont utilisables pour séparer le
tétravalent. Lorsque le composant haemophilus est présenté PRP libre du conjugué, comme par exemple la précipitation,
dans un récipient séparé, le vrac final est préparé par dilution la filtration sur gel, la chromatographie d’exclusion,
du conjugué en vrac avec des diluants appropriés pour la
LÈ d’échange d’anions ou hydrophobe, l’ultrafiltration et
cryodessiccation. Un stabilisant peut être rajouté. l’ultracentrigugation. Le PRP libre peut alors être quantifié
Des vracs finals ne peuvent être utilisés pour la préparation par diverses techniques, comme une chromatographie
du lot final que s’ils satisfont aux exigences suivantes. d’échange d’anions de haute performance couplée à une
Sérum-albumine bovine. Déterminée par une méthode détection par ampérométrie pulsée (HPAEC-PAD) ou un
immunochimique appropriée (2.7.1) sur les composants immunodosage avec des anticorps anti-PRP. La teneur en
poliomyélitiques pendant la préparation du vrac final avant PRP libre n’est pas supérieure à celle approuvée pour le
l’addition de l’adsorbant, la quantité de sérum-albumine produit considéré.
bovine est telle que la teneur dans le lot final ne sera pas
supérieure à 50 ng par dose humaine unitaire. IDENTIFICATION
O
Les identifications A, B, C et D sont effectuées sur le
Conservateur antimicrobien. Le cas échéant, déterminez
récipient contenant les composants diphtérique, tétanique,
la teneur en conservateur antimicrobien par une méthode
coquelucheux et poliomyélitique. L’identification E est
chimique appropriée. Cette teneur n’est pas inférieure à
effectuée soit sur le récipient contenant les 5 composants,
85 pour cent ni supérieure à 115 pour cent de la teneur
soit sur le récipient contenant le composant haemophilus
voulue.
seul.
BS

Stérilité (2.6.1). Utilisez 10 ml de préparation pour chaque A. L’anatoxine diphtérique est identifiée par une méthode
milieu. immunochimique appropriée (2.7.1). La méthode ci-après,
LOT FINAL applicable à certains vaccins, est donnée à titre d’exemple.
Lorsque le composant haemophilus est présenté dans Dissolvez dans le vaccin à examiner une quantité
un récipient séparé, le vrac final de ce composant est suffisante de citrate de sodium R pour obtenir une
cryodesséché. solution à 100 g/l. Maintenez à 37 °C pendant environ
Un lot final ne peut être libéré que s’il satisfait à l’essai 16 h et centrifugez jusqu’à obtention d’un surnageant
d’osmolalité et aux exigences spécifiées ci-après sous limpide. Le surnageant limpide réagit avec une antitoxine
Identification, Essai et Activité. diphtérique appropriée en donnant un précipité.
O

Si l’essai d’absence de toxine coquelucheuse résiduelle et B. L’anatoxine tétanique est identifiée par une méthode
d’irréversibilité de l’anatoxine coquelucheuse, l’essai de immunochimique appropriée (2.7.1). La méthode ci-après,
teneur en conservateur antimicrobien et le titrage d’activité applicable à certains vaccins, est donnée à titre d’exemple.
ont été réalisés avec des résultats satisfaisants sur le vrac Le surnageant limpide obtenu dans l’identification A
final, ils peuvent ne pas être effectués sur le lot final. réagit avec une antitoxine tétanique appropriée en
Si la teneur en formaldéhyde libre a été déterminée soit sur donnant un précipité.
les antigènes purifiés en vrac et sur les récoltes monovalentes C. Les composants coquelucheux sont identifiés par
purifiées ou le mélange trivalent de virus poliomyélitiques, une méthode immunochimique appropriée (2.7.1). La
soit sur le vrac final et s’il a été démontré que la teneur du méthode ci-après, applicable à certains vaccins, est
lot final ne dépassera pas 0,2 g/l, l’essai du formaldéhyde donnée à titre d’exemple. Le surnageant limpide obtenu
libre peut ne pas être effectué sur le lot final. dans l’identification A réagit avec des immunosérums
Si le titrage d’activité in vivo du composant poliomyélitique spécifiques des composants coquelucheux du vaccin.
est utilisé, et s’il a été effectué avec des résultats satisfaisants D. Il est démontré, par une méthode immunochimique
sur le vrac final, il peut ne pas être effectué sur le lot final. appropriée (2.7.1) telle que la détermination de
Le titrage d’activité in vivo du composant poliomyélitique l’antigène D par immunoadsorption à enzyme conjuguée
peut ne pas être effectué s’il a été démontré sur un produit (ELISA), que le vaccin contient les virus poliomyélitiques
donné et pour chaque type de poliovirus, que les critères humains de type 1, 2 et 3.

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4257
Vaccin DTC (acellulaire, multicomposé), polio et de l’haemophilus type b PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

E. Le composant haemophilus est identifié par une méthode Conservateur antimicrobien. Le cas échéant, déterminez
immunochimique (2.7.1) appropriée pour le PRP. la teneur en conservateur antimicrobien par une méthode
chimique appropriée. Cette teneur n’est pas inférieure à la
valeur minimale efficace préalablement établie, ni supérieure
ESSAI
à 115 pour cent de la valeur indiquée sur l’étiquette.
Lorsque le composant haemophilus est présenté dans Eau (2.5.12) : au maximum 3,0 pour cent pour le composant
un récipient séparé, les essais Absence de toxine haemophilus cryodesséché.
coquelucheuse résiduelle et d’irréversibilité de l’anatoxine
coquelucheuse, Aluminium, Formaldéhyde libre, Stérilité (2.6.1). Le vaccin satisfait à l’essai de stérilité.
Conservateur antimicrobien et Stérilité sont effectués Pyrogènes (2.6.8). Le vaccin satisfait à l’essai des pyrogènes.
sur le récipient contenant les composants diphtérique, Injectez à chaque lapin, par kilogramme de masse corporelle,
tétanique, coquelucheux et poliomyélitique ; les essais PRP, une quantité de vaccin équivalant à : 1 μg de PRP si la
Eau, Stérilité et Pyrogènes sont effectués sur le récipient protéine vectrice est l’anatoxine diphtérique ou la protéine
contenant le composant haemophilus seul. diphtérique CRM 197 ; 0,1 μg de PRP si la protéine vectrice
est l’anatoxine tétanique ; 0,025 μg de PRP si la protéine
Lorsque le composant haemophilus est présenté dans un
vectrice est l’OMP.
récipient séparé, certains essais peuvent être effectués
sur le produit cryodesséché plutôt que sur le conjugué en ACTIVITÉ

TE
vrac, car la cryodessiccation peut affecter le composant
à examiner. Composant diphtérique. Evaluez l’activité du composant
diphtérique par l’une des méthodes prescrites pour le titrage
Absence de toxine coquelucheuse résiduelle et du vaccin diphtérique adsorbé (2.7.6).
irréversibilité de l’anatoxine coquelucheuse. Cet essai n’est
pas nécessaire pour le produit obtenu par modification Sauf exception justifiée et autorisée, la limite inférieure de
génétique. Utilisez 3 groupes ne comptant pas moins de confiance (P = 0,95) de l’activité estimée n’est pas inférieure
er
5 souris sensibles à l’histamine. Injectez au 1 groupe, à 30 UI par dose humaine unitaire.
par voie intrapéritonéale, l’équivalent de 2 fois la dose Composant tétanique. Evaluez l’activité du composant
humaine unitaire du vaccin conservé à une température de
LÈ tétanique par l’une des méthodes prescrites pour le titrage
2-8 °C. Injectez au 2e groupe, par voie intrapéritonéale, du vaccin tétanique adsorbé (2.7.8).
l’équivalent de 2 fois la dose humaine unitaire du vaccin La limite inférieure de confiance (P = 0,95) de l’activité
incubé à une température de 37 °C pendant 4 semaines. estimée n’est pas inférieure à 40 UI par dose humaine
Injectez le diluant, par voie intrapéritonéale, au 3e groupe unitaire.
de souris. Après 5 jours, injectez à chaque souris, par voie
intrapéritonéale, 2 mg d’histamine base dans un volume Composant coquelucheux. Le vaccin satisfait au titrage
maximal de 0,5 ml et placez les animaux en observation d’activité du vaccin coquelucheux (acellulaire) (2.7.16).
pendant 24 h. L’essai n’est pas valable si 1 ou plusieurs Composant poliomyélitique
souris témoins meurent suite à l’épreuve à l’histamine. Teneur en antigène D. Afin de contrôler la reproductibilité
O
Le vaccin satisfait à l’essai si, dans les 2 groupes recevant de la production, déterminez la teneur en antigène D pour
le vaccin, aucune souris ne meurt suite à l’épreuve à les virus poliomyélitiques humains de type 1, 2 et 3 après
l’histamine. Si 1 souris meurt dans le 1er et/ou le 2e groupe, désorption par une méthode immunochimique appropriée
l’essai peut être répété avec le même nombre ou avec un plus (2.7.1), en utilisant une préparation de référence étalonnée
grand nombre de souris, en combinant les résultats des essais en Unités Pharmacopée Européenne d’antigène D. Pour
valables ; le vaccin satisfait à l’essai si, dans les 2 groupes
BS

chaque type, la teneur mesurée, exprimée par rapport à


recevant le vaccin, pas plus de 5 pour cent du nombre total la teneur en antigène D indiquée sur l’étiquette, se situe
de souris ne meurent suite à l’épreuve à l’histamine. dans les limites approuvées pour le produit considéré. Le
La sensibilité à l’histamine de la lignée de souris utilisée est vaccin poliomyélitique inactivé PBR, étalonné en Unités
vérifiée à intervalles appropriés par la méthode suivante : Pharmacopée Européenne, est destiné à la détermination de
injectez, par voie intraveineuse, des dilutions au tiers d’une la teneur en antigène D. L’Unité Pharmacopée Européenne
préparation de référence de la toxine coquelucheuse dans de et l’Unité Internationale sont équivalentes.
la solution saline tamponnée au phosphate contenant 2 g/l Essai in vivo. Le vaccin satisfait au titrage d’activité in vivo
de gélatine, et effectuez une épreuve à l’histamine comme du vaccin poliomyélitique inactivé (2.7.20).
indiqué ci-dessus. La lignée est acceptable si plus de 50 pour
O

cent des animaux sont sensibilisés par 50 ng de toxine ÉTIQUETAGE


coquelucheuse et si aucun des animaux témoins traités avec L’étiquette indique :
le diluant seul, puis soumis à l’épreuve à l’histamine ne — le nombre minimal d’Unités Internationales d’anatoxine
présente de signe de sensibilisation. diphtérique et d’anatoxine tétanique par dose humaine
La toxine coquelucheuse PBR convient comme toxine unitaire,
coquelucheuse de référence. — le nom et la quantité des composants coquelucheux par
PRP : au minimum 80 pour cent de la quantité de PRP dose humaine unitaire,
indiquée sur l’étiquette. La teneur en PRP est déterminée — la quantité nominale du virus poliomyélitique de chaque
soit par dosage du ribose (2.5.31) ou du phosphore type (1, 2 et 3), exprimée en Unités Pharmacopée
(2.5.18), soit par dosage immunochimique (2.7.1), soit par Européenne d’antigène D, par dose humaine unitaire,
chromatographie liquide (2.2.29) à échange d’anions avec — le substrat cellulaire utilisé pour la production du
détection ampérométrique à pulsations. composant poliomyélitique,
Aluminium (2.5.13) : au maximum 1,25 mg par dose — la quantité de PRP, en microgrammes, par dose humaine
humaine unitaire, si l’adsorbant utilisé est de l’hydroxyde unitaire,
d’aluminium ou du phosphate d’aluminium hydraté. — la nature de la protéine vectrice et la quantité nominale
Formaldéhyde libre (2.4.18) : au maximum 0,2 g/l. par dose humaine unitaire,

4258 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 Vaccin poliomyélitique inactivé

— dans les cas appropriés, que le vaccin est destiné à la passage sur des cellules provenant de singes sauvages peut
vaccination primaire des enfants et ne convient pas être utilisé dans la préparation du vaccin si les données
nécessairement à la vaccination des adultes, ni aux historiques sur l’innocuité le justifient.
rappels ultérieurs, Colonies fermées et surveillées de singes. Les singes
— le nom et la quantité de l’adsorbant utilisé, sont logés en groupes dans des cages. Pour prévenir la
— que le vaccin doit être agité avant l’emploi, contamination par des agents étrangers, les animaux
— que le vaccin ne doit pas être congelé, utilisés sont maintenus dans les colonies fermées, soumis à
une surveillance vétérinaire et à des essais de laboratoire
— dans les cas appropriés, que le vaccin contient une systématiques et continus afin de déceler la présence
protéine apparentée à la toxine coquelucheuse, produite d’agents infectieux. Le fournisseur des animaux doit être
par modification génétique. agréé par l’Autorité compétente. Chaque singe subit des
essais sérologiques à intervalles réguliers pendant une
période de quarantaine d’au moins 6 semaines avant d’entrer
01/2009:0214 dans la colonie, puis pendant son séjour dans la colonie.
On vérifiera que les singes employés présentent une réaction
VACCIN POLIOMYÉLITIQUE INACTIVÉ négative vis-à-vis de la tuberculine et qu’ils sont exempts
d’anticorps contre le virus simien 40 (SV40) et contre le

TE
Vaccinum poliomyelitidis inactivatum virus de l’immunodéficience simienne. Le prélevèment de
l’échantillon sanguin utilisé dans la recherche d’anticorps
DÉFINITION dirigés contre le SV40 doit être aussi proche que possible
Le vaccin poliomyélitique inactivé est une préparation de la récolte des reins. Si des singes du genre Macaca sont
liquide obtenue à partir de souches appropriées des virus utilisés pour la production, on vérifiera également qu’ils sont
poliomyélitiques humains de type 1, 2 et 3, cultivés en exempts d’anticorps contre l’herpèsvirus B (herpèsvirus 1
cultures cellulaires appropriées et inactivés par une méthode cercopithécin). L’herpèsvirus 1 humain a été utilisé comme
validée. Il se présente sous la forme d’un liquide limpide qui indicateur de l’absence d’anticorps contre l’herpèsvirus B
peut être coloré en raison de la présence d’un indicateur
LÈ (herpèsvirus 1 cercopithécin) en raison du danger que
de pH. comporte la manipulation de ce dernier.
PRODUCTION Les singes dont les reins doivent être prélevés sont examinés
avec soin, notamment pour déceler la tuberculose et une
Il convient d’établir que le procédé de production infection par l’herpèsvirus B (herpèsvirus 1 cercopithécin).
utilisé donne de façon constante des vaccins de pouvoir Tout singe présentant une lésion pathologique en rapport
immunogène et d’innocuité acceptables chez l’homme. avec l’utilisation de ses reins pour la préparation d’un lot
Le vaccin est produit selon un système de lot de semence de semence ou d’un vaccin ne sera pas utilisé, pas plus que
virale. Les lignées cellulaires sont utilisées selon un système ne le seront les autres singes du groupe concerné, à moins
de banque de cellules. Si des cellules rénales primaires, qu’il ne soit évident que leur emploi ne compromettra pas
O
secondaires ou tertiaires de singe sont utilisées, la production l’innocuité du produit.
satisfait aux spécifications indiquées ci-dessous. Toutes les opérations décrites dans la présente section sont
Sauf exception justifiée et autorisée, le virus contenu effectuées en dehors des locaux de production du vaccin.
dans le vaccin final ne doit pas avoir subi, depuis le lot de Cultures de cellules rénales de singe destinées à la
semence primaire, un nombre de passages supérieur à celui production du vaccin. Les reins utilisés pour la préparation
utilisé pour préparer le vaccin dont les études cliniques ont
BS

des cultures de cellules ne doivent présenter aucun signe


démontré l’innocuité et l’efficacité. pathologique. Chaque groupe de cultures cellulaires
Le procédé de production fait l’objet d’une validation provenant d’un singe constitue une culture cellulaire de
permettant de démontrer que le produit satisferait à l’essai production séparée d’où dérive une récolte unique séparée.
de toxicité anormale des immunosérums et vaccins pour La suspension de cellules rénales primaires de singe satisfait
usage humain (2.6.9), s’il lui était appliqué. à l’essai des mycobactéries (2.6.2) ; effectuez l’essai sur un
SUBSTRAT DE MULTIPLICATION DES VIRUS lysat des cellules.
Le virus est multiplié dans une lignée de cellules diploïdes Si des cellules secondaires ou tertiaires sont utilisées, il sera
humaines (5.2.3), dans une lignée continue de cellules démontré par des essais de validation appropriés que des
(5.2.3) ou dans des cellules rénales primaires, secondaires cellules à un niveau de passage au-delà de celui utilisé pour
O

ou tertiaires de singe. la production sont exemptes de pouvoir tumorigène.


Cellules rénales primaires, secondaires ou tertiaires de LOTS DE SEMENCE
singe. Les spécifications particulières suivantes pour le L’identité des 3 souches de virus de la poliomyélite utilisées
substrat de multiplication du virus s’appliquent aux vaccins est attestée par des documents indiquant notamment leur
préparés sur cellules rénales primaires, secondaires ou origine et les manipulations qu’elles ont subies par la suite.
tertiaires de singe. Seul un lot de semence de travail qui satisfait aux
Singes employés dans la préparation des cultures de spécifications suivantes peut être utilisé pour la
cellules rénales pour la production et le contrôle du multiplication du virus.
vaccin. Les animaux utilisés appartiennent à une espèce
approuvée par l’Autorité compétente, en bonne santé et, Identification. Chaque lot de semence de travail est identifié
sauf exception justifiée et autorisée, n’ayant jamais servi à comme virus poliomyélitique humain de type 1, 2 ou 3 par
aucune expérience. Les cellules rénales utilisées pour la un essai de neutralisation du virus en cultures cellulaires à
production et le contrôle du vaccin sont obtenues à partir l’aide d’anticorps spécifiques.
de singes élevés en colonies fermées et surveillées, et non Concentration en virus. La concentration en virus de
d’animaux capturés dans le milieu naturel. Sous réserve de chaque lot de semence de travail est évaluée de façon à
l’autorisation de l’Autorité compétente, un lot de semence déterminer la quantité de virus à utiliser lors de l’inoculation
déjà approuvé et préparé à partir de virus qui a subi un des cellules de production.

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4259
Vaccin poliomyélitique inactivé PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

Agents étrangers. Le lot de semence de travail satisfait Essai dans des cultures de cellules rénales de cercopithecus.
aux spécifications définies pour les lots de semence pour Examinez un échantillon d’au moins 10 ml du mélange de
vaccins viraux (2.6.16). En outre, si des cellules rénales liquide surnageant des cellules témoins, afin de déceler le
primaires, secondaires ou tertiaires de singe ont été utilisées virus SV40 et d’autres agents étrangers, par inoculation à
dans l’isolement de la souche, les contrôles sont pratiqués des cultures cellulaires préparées à partir de reins de singes
pour s’assurer que ces virus ne sont pas contaminés par cercopithecus, ou d’autres cellules démontrées au moins
des virus simiens tels que le virus de l’immunodéficience aussi sensibles au SV40 ; procédez comme il est décrit sous
simienne, le virus simien 40, les filovirus et l’herpèsvirus B Essai dans des cultures de cellules rénales de lapin. L’essai
(herpèsvirus 1 cercopithécin). Un lot de semence de travail n’est pas valable si plus de 20 pour cent des cultures témoins
préparé dans des cellules rénales primaires, secondaires ou sont rejetées pour des raisons non spécifiques accidentelles.
tertiaires de singe satisfait également aux spécifications Identification. La récolte unique est identifiée comme
données ci-après sous Multiplication et récolte du virus pour contenant du virus poliomyélitique humain de type 1, 2 ou 3
les récoltes uniques préparées sur de telles cellules. par un essai de neutralisation du virus en cultures cellulaires
MULTIPLICATION ET RÉCOLTE à l’aide d’anticorps spécifiques.
Toutes les manipulations effectuées sur la banque de cellules Concentration en virus. La concentration en virus de la
et les cultures cellulaires sont conduites dans des conditions récolte unique est déterminée en titrant le pouvoir infectieux
aseptiques dans des locaux où ne sont pas manipulés du virus sur cultures cellulaires.

TE
simultanément d’autres cellules ou d’autres virus. Un Contamination bactérienne et fongique. La récolte unique
sérum animal approuvé (à l’exclusion de sérum humain) satisfait à l’essai de stérilité (2.6.1). Utilisez 10 ml de récolte
peut être utilisé dans les milieux de culture cellulaire. pour chaque milieu.
L’absence d’agents étrangers dans le sérum et la trypsine
employés pour la préparation des suspensions cellulaires Mycoplasmes (2.6.7). La récolte unique satisfait à l’essai des
et des milieux est vérifiée. Les milieux de culture cellulaire mycoplasmes. Utilisez 10 ml de récolte.
peuvent contenir un indicateur de pH, tel que le rouge de Essai dans des cultures de cellules rénales de lapin. Si la
phénol, et des antibiotiques approuvés, à la concentration production est effectuée sur des cellules rénales primaires,
correspondant au seuil d’efficacité. Réservez un volume
LÈ secondaires ou tertiaires de singe, examinez un échantillon
correspondant à au moins 500 ml des cultures cellulaires d’au moins 10 ml de la récolte unique, afin de déceler
utilisées pour la production du vaccin comme culture l’herpèsvirus B (herpèsvirus 1 cercopithécin) et d’autres
de cellules non infectées (cellules témoins). Dans le cas virus, par inoculation à des cultures de cellules rénales de
d’utilisation d’une lignée continue de cellules cultivée en lapin comme il est décrit ci-dessus pour les cellules témoins.
fermenteur, prélevez 200 × 106 cellules pour la préparation
Essai dans des cultures de cellules rénales de cercopithecus.
des cellules témoins. Dans le cas d’utilisation de cellules
Si la production est effectuée sur des cellules rénales
rénales primaires, secondaires ou tertiaires de singe,
primaires, secondaires ou tertiaires de singe, examinez un
prélevez un échantillon équivalant à au moins 500 ml de la
échantillon d’au moins 10 ml de la récolte unique, afin
suspension cellulaire à la concentration employée pour la
de déceler le virus SV40 et d’autres agents étrangers.
production (cellules témoins).
O
Neutralisez l’échantillon à l’aide d’un antisérum de titre élevé
Seule une récolte unique qui satisfait aux spécifications contre le type de virus poliomyélitique présent. Effectuez
suivantes peut être utilisée dans la préparation du vaccin. l’essai sur des cellules rénales primaires de cercopithecus
Les essais d’identification et de contamination bactérienne ou sur des cellules démontrées au moins aussi sensibles
et fongique peuvent être effectués sur le mélange de récoltes au SV40. Faites incuber les cellules à 37 °C et observez
monovalentes purifiées plutôt que sur la récolte unique. pendant 14 jours. A la fin de cette période, effectuez au
BS

L’essai de concentration en virus peut être effectué sur le moins une subculture de liquide dans des cellules du même
mélange de récoltes monovalentes purifiées plutôt que sur la système et observez les cultures primaires et les subcultures
récolte unique, après que la régularité de la production au pendant encore 14 jours.
stade de la récolte unique a été démontrée.
PURIFICATION ET RÉCOLTE MONOVALENTE PURIFIÉE
Cellules témoins. Les cellules témoins de la culture cellulaire Plusieurs récoltes uniques de même type peuvent être
de production satisfont à un essai d’identification (si un mélangées et éventuellement concentrées. La récolte
système de banque de cellules est utilisé pour la production) monovalente ou le mélange de récoltes monovalent est
et aux spécifications des agents étrangers (2.6.16 ; si des purifié par des méthodes validées. Si la production est
cellules rénales primaires, secondaires ou tertiaires de singe effectuée sur lignées cellulaires continues, il convient de
sont utilisées pour la production, les essais sur cultures
O

démontrer que le procédé de purification employé réduit


cellulaires sont effectués comme il est décrit ci-après sous régulièrement la teneur en ADN issu des cellules du substrat
Essai dans des cultures de cellules rénales de lapin et Essai à 100 pg maximum par dose humaine unitaire.
dans des cultures de cellules rénales de cercopithecus). Seule une récolte monovalente purifiée qui satisfait aux
Essai dans des cultures de cellules rénales de lapin. spécifications suivantes peut être utilisée pour la préparation
Examinez un échantillon d’au moins 10 ml du mélange de la récolte monovalente inactivée.
de liquide surnageant de cellules témoins par inoculation Identification. Le virus est identifié soit par neutralisation
à des cultures de cellules rénales de lapin afin de déceler en cultures cellulaires à l’aide d’anticorps spécifiques, soit
l’herpèsvirus B (herpèsvirus 1 cercopithécin) et d’autres par détermination de l’antigène D.
virus. La dilution du liquide surnageant dans le milieu
nutritif ne doit pas dépasser 1/4 et la surface de la couche Concentration virale. La concentration en virus est
cellulaire doit être d’au moins 3 cm par millilitre d’inoculum. déterminée en titrant le pouvoir infectieux.
2

Maintenez un ou plusieurs récipients de chaque lot de Activité spécifique. Le rapport entre la concentration
cellules avec le même milieu comme cellules témoins en virus ou la teneur en antigène D, déterminée par une
non-ensemencées. Faites incuber les cultures à 37 °C et méthode immunochimique appropriée (2.7.1), et la teneur
observez-les pendant au moins 2 semaines. L’essai n’est pas en protéines totales (activité spécifique) de la récolte
valable si plus de 20 pour cent des cultures témoins sont monovalente purifiée se situe dans les limites approuvées
rejetées pour des raisons non spécifiques accidentelles. pour le produit considéré.

4260 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 Vaccin poliomyélitique inactivé

INACTIVATION ET RÉCOLTE MONOVALENTE Teneur en antigène D. Déterminez la teneur en antigène D


INACTIVÉE par une méthode immunochimique appropriée (2.7.1).
Avant de procéder à l’inactivation, il est possible de mélanger La teneur se situe dans les limites approuvées pour la
plusieurs récoltes monovalentes purifiées de même type. préparation considérée.
Afin d’éviter les défauts d’inactivation dus à la présence VRAC FINAL
d’agrégats viraux, on procède à une filtration avant et Le vrac final peut être préparé soit directement à partir de la
pendant le procédé d’inactivation. Le procédé d’inactivation récolte des monovalents inactivés de virus poliomyélitiques
est déclenché dans un délai approprié suivant la filtration humains de type 1, 2 et 3, soit à partir d’un mélange trivalent
préalable ; ce délai est de préférence inférieur à 24 h et de récoltes monovalentes inactivées. Un stabilisant et un
dans tous les cas doit être inférieur à 72 h. La suspension conservateur antimicrobien appropriés peuvent être ajoutés.
virale est inactivée par une méthode validée dont il a été
Seul un vrac final qui satisfait aux spécifications suivantes
démontré qu’elle permet d’inactiver le virus poliomyélitique
peut être utilisé dans la préparation du lot final.
sans compromettre le pouvoir immunogène ; pendant les
études de validation, une courbe d’inactivation représentant Stérilité (2.6.1). Le vrac final satisfait à l’essai de stérilité.
la diminution dans le temps de la concentration en virus Utilisez 10 ml de préparation pour chaque milieu.
vivant résiduel avec au moins 4 mesures (par exemple : Conservateur antimicrobien. Déterminez dans les cas
temps 0 h, 24 h, 48 h et 96 h) est établie. Si le formaldéhyde appropriés la teneur en conservateur antimicrobien par une

TE
est employé pour l’inactivation, la présence d’un excès de méthode chimique ou physico-chimique appropriée. Elle
formaldéhyde libre à la fin de l’inactivation est vérifiée. Les n’est pas inférieure à 85 pour cent ni supérieure à 115 pour
essais de cinétique d’inactivation mentionnés ci-dessous sont cent de la teneur voulue.
effectués sur chaque lot pour s’assurer de la régularité du
LOT FINAL
procédé d’inactivation.
Seule une récolte monovalente inactivée qui satisfait aux Seul un lot final satisfaisant à chacun des essais décrits sous
essais suivants peut être utilisée dans la préparation d’un Identification, Essai et Activité peut être libéré. Si les essais
concentré trivalent ou d’un vrac final. de formaldéhyde libre et de conservateur antimicrobien et
la détermination d’activité in vivo ont été effectués avec des
Essai d’inactivation. Après neutralisation du formaldéhyde
LÈ résultats satisfaisants sur le vrac final, ils peuvent ne pas
par le bisulfite de sodium (si nécessaire), vérifiez, par être effectués sur le lot final.
inoculation de cultures cellulaires appropriées, l’absence de Le titrage d’activité in vivo peut ne pas être effectué s’il a
virus poliomyélitique vivant résiduel dans 2 échantillons été démontré sur un produit donné et pour chaque type de
de chaque récolte monovalente inactivée correspondant au poliovirus, que les critères d’acceptation de la détermination
moins à 1500 doses humaines. Les cellules utilisées pour de la teneur en antigène D sont tels qu’ils fournissent les
cet essai doivent être de sensibilité optimale par rapport au mêmes résultats que le titrage d’activité in vivo en termes
virus poliomyélitique infectieux résiduel. Par exemple, des d’acceptation ou de rejet d’un lot. Cette démonstration doit
cellules rénales provenant de certaines espèces de singes comprendre des essais sur des lots à activité altérée, produits
(Macaca, Cercopithecus ou Papio) ou des cellules Hep-2 de manière expérimentale si nécessaire via un traitement
peuvent être utilisées. Si d’autres cellules sont utilisées, il
O
par la chaleur par exemple ou d’autres moyens permettant
doit avoir été démontré qu’elles sont de sensibilité au moins de diminuer l’activité immunogène. En cas de modification
égale à celle des cellules spécifiées ci-dessus. Un échantillon significative du procédé de production des antigènes ou de
est prélevé au plus tard aux 3/4 de l’opération et l’autre à la leur formulation, l’impact sur les titrages d’activité in vivo
fin de la période d’inactivation. Inoculez les 2 échantillons et in vitro devra être évalué, et le besoin de revalidation
sur des cultures cellulaires de façon que la dilution du vaccin devra être considéré.
BS

dans le liquide nutritif ne dépasse pas 1/4 et que la surface


de la couche cellulaire soit d’au moins 3 cm2 par millilitre Si l’essai de sérum-albumine bovine a été effectué avec des
d’inoculum. Mettez de côté, pour servir de boîtes témoins résultats satisfaisants sur le mélange trivalent de récoltes
non inoculées contenant le même milieu, une ou plusieurs monovalentes inactivées ou sur le vrac final, il peut ne pas
boîtes de cultures. Les boîtes de cultures cellulaires sont être effectué sur le lot final.
maintenues en observation pendant au moins 3 semaines. IDENTIFICATION
Procédez au minimum à 2 repiquages à partir de chaque
boîte, l’un à la fin de la période d’observation et l’autre Il est démontré que le vaccin contient les virus
1 semaine avant la fin de cette période. Les repiquages sont poliomyélitiques humains de type 1, 2 et 3, par une
effectués à partir du surnageant des cultures et l’inoculation méthode immunochimique appropriée (2.7.1) telle que la
détermination de l’antigène D par immunoadsorption à
O

est faite de la même manière que pour l’échantillon d’origine.


Maintenez les repiquages en observation pendant au enzyme conjuguée (ELISA).
moins 2 semaines. Aucun signe de multiplication du virus ESSAI
poliomyélitique n’est observé dans les cultures cellulaires.
A la fin de la période d’observation, la sensibilité de la Formaldéhyde libre (2.4.18) : au maximum 0,2 g/l.
culture cellulaire utilisée est éprouvée au moyen d’un virus Conservateur antimicrobien. Déterminez dans les cas
poliomyélitique vivant du même type que celui présent dans appropriés la teneur en conservateur antimicrobien par
la récolte monovalente inactivée. une méthode chimique ou physico-chimique appropriée.
Cinétiques d’inactivation. Des cinétiques d’inactivation Elle n’est pas inférieure à la valeur établie comme seuil
sont établies et approuvées par l’Autorité compétente. Des d’efficacité ni supérieure à 115 pour cent de la valeur
données appropriées relatives aux cinétiques d’inactivation indiquée sur l’étiquette.
sont obtenues et la régularité du procédé d’inactivation est Teneur en azote protéique (2.5.33, Méthode B) : au
contrôlée. maximum 10 μg par dose humaine unitaire.
Stérilité (2.6.1). La récolte monovalente inactivée satisfait à Sérum-albumine bovine : au maximum 50 ng par
l’essai de stérilité. Utilisez 10 ml de préparation pour chaque dose humaine unitaire, déterminé par une méthode
milieu. immunochimique appropriée (2.7.1).
Stérilité (2.6.1). Le vaccin satisfait à l’essai de stérilité.

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4261
Vaccin varicelleux vivant PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

Endotoxines bactériennes (2.6.14) : moins de 5 UI par dose Le procédé de production fait l’objet d’une validation
humaine unitaire. permettant de démontrer que le produit satisferait à l’essai
de toxicité anormale des immunosérums et vaccins pour
ACTIVITÉ usage humain (2.6.9), s’il lui était appliqué.
Teneur en antigène D. Afin de contrôler la régularité de la SUBSTRAT POUR LA MULTIPLICATION DU VIRUS
production, déterminez la teneur en antigène D pour les virus Le virus est multiplié dans des lignées de cellules diploïdes
poliomyélitiques humains de type 1, 2 et 3 par une méthode humaines (5.2.3).
immunochimique appropriée (2.7.1), en utilisant une
préparation de référence étalonnée en Unités Pharmacopée LOT DE SEMENCE
Européenne d’antigène D. Pour chaque type, la teneur La souche de l’herpèsvirus humain 3 utilisée sera identifiée
mesurée, exprimée par rapport à la teneur en antigène D comme étant la souche appropriée par des données
indiquée sur l’étiquette, se situe dans les limites approuvées historiques y compris des informations sur son origine et
pour le produit considéré. Le vaccin poliomyélitique sa manipulation ultérieure. Le virus ne devra en aucun
inactivé PBR, étalonné en Unités Pharmacopée Européenne, cas avoir subi un passage dans une lignée continue de
est destiné à être utilisé pour la détermination de la teneur cellules. Les lots de semence sont préparés dans le même
en antigène D. L’Unité Pharmacopée Européenne et l’unité type de cellules que celles utilisées pour la production du
internationale sont équivalentes. vaccin final. Les lots de semence de virus sont préparés

TE
Essai in vivo. Le vaccin satisfait au titrage in vivo du vaccin en quantités importantes et conservés à des températures
poliomyélitique inactivé (2.7.20). inférieures à − 20 °C s’ils sont cryodesséchés ou inférieures
à − 60 °C s’ils ne le sont pas.
ÉTIQUETAGE Seul un lot de semence qui satisfait aux essais ci-après peut
L’étiquette indique : être utilisé pour la multiplication du virus.
— les types de virus poliomyélitique présents dans le vaccin, Identification. Le lot de semence primaire et le lot de
— la quantité nominale du virus de chaque type (1, 2 semence de travail sont identifiés comme contenant
et 3), exprimée en Unités Pharmacopée Européenne l’herpèsvirus humain 3 par un essai de séroneutralisation en
d’antigène D, par dose humaine unitaire, culture cellulaire, à l’aide d’anticorps spécifiques.

— le substrat cellulaire utilisé pour la préparation du vaccin. Concentration en virus. La concentration en virus
infectieux dans les lots de semence primaire et de travail est
déterminée comme prescrit sous Dosage, afin de s’assurer
de la régularité de la production.
01/2009:0648 Agents étrangers (2.6.16). Le lot de semence de travail
satisfait aux exigences pour les lots de semence des vaccins
VACCIN VARICELLEUX VIVANT viraux vivants ; utilisez 50 ml dans l’essai effectué sur
cultures cellulaires.
O
Vaccinum varicellae vivum MULTIPLICATION ET RÉCOLTE
Toutes les manipulations effectuées sur la banque de cellules
DÉFINITION et les cultures cellulaires dérivées sont conduites dans
Le vaccin varicelleux vivant est une préparation des conditions aseptiques dans des locaux où ne sont pas
cryodesséchée obtenue à partir de la souche atténuée manipulés simultanément d’autres cellules ou d’autres virus.
BS

appropriée de l’herpèsvirus humain 3. Le vaccin, reconstitué Un sérum animal approuvé (à l’exclusion du sérum humain)
immédiatement avant l’emploi d’après les indications peut être utilisé dans la composition des milieux de culture.
figurant sur l’étiquette, se présente sous forme d’un liquide Il est démontré que le sérum et la trypsine utilisés dans
limpide qui peut être coloré en raison de la présence d’un la préparation des suspensions de cellules et des milieux
indicateur de pH. de culture sont exempts d’agents étrangers. Le milieu de
culture cellulaire peut contenir un indicateur de pH, tel que
PRODUCTION le rouge de phénol, et des antibiotiques approuvés à la plus
La production du vaccin est basée sur un système de lot de faible concentration efficace. Il est souhaitable d’utiliser
semence viral et un système de banque de cellules. Il aura un substrat exempt d’antibiotiques pendant la production.
été démontré que ces systèmes donnent de façon constante 5 pour cent, mais au minimum 50 ml, des cultures cellulaires
O

des vaccins varicelleux vivants d’un pouvoir immunogène utilisées pour la production de vaccin sont gardés comme
et d’une innocuité adéquats pour l’homme. Le virus dans cellules témoins non ensemencées. Les cellules infectées
le vaccin final ne devra pas avoir subi de passage dans des provenant d’une même récolte sont lavées, dégagées de la
cultures cellulaires, au-delà d’un nombre défini de passages surface du support et mélangées. La suspension de cellules
approuvé par l’Autorité compétente, à partir du virus original est lysée par traitement aux ultrasons.
isolé. Seule une récolte de virus qui satisfait aux essais ci-après
La neurovirulence potentielle de la souche vaccinale est peut être utilisée dans la préparation du vrac final.
considérée lors du développement préclinique, sur la base
des données épidémiologiques disponibles concernant Identification. La récolte de virus est identifiée comme
la neurovirulence et le neurotropisme, principalement contenant l’herpèsvirus humain 3 par un essai de
celles pour le type sauvage du virus. A la lumière de ces séroneutralisation en culture cellulaire, à l’aide d’anticorps
considérations, une analyse de risque est effectuée. Si spécifiques.
nécessaire, et selon les disponibilités, un essai est effectué Concentration en virus. La concentration en virus dans
sur la souche vaccinale en utilisant un modèle animal qui les récoltes de virus est déterminée comme prescrit sous
différencie le type sauvage du virus atténué ; les essais sur Dosage afin de s’assurer de la régularité de la production
les souches d’atténuation intermédiaire peuvent également et de déterminer la dilution à utiliser dans la préparation
être requis. du vrac final.

4262 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 Vaccin vivant du zona

Agents étrangers (2.6.16). Utilisez 50 ml dans l’essai L’essai est répété si l’intervalle de confiance (P = 0,95)
effectué sur cultures cellulaires. de la concentration en virus combinée du vaccin est
Cellules témoins. Les cellules témoins de la culture cellulaire supérieur à ± 0,3 log UFP ; seules les données provenant
de production dont dérive la récolte unique satisfont à un de titrages valides sont combinées par les méthodes
essai d’identification et à l’essai des agents étrangers (2.6.16). statistiques habituelles (5.3, par exemple) pour le calcul de
la concentration en virus de l’échantillon. L’intervalle de
VRAC FINAL confiance (P = 0,95) de la concentration en virus combinée
Les récoltes de virus qui satisfont aux essais prescrits n’est pas supérieur à ± 0,3 log UFP.
ci-dessus sont mélangées et clarifiées afin d’éliminer les Dans les cas justifiés et autorisés, des titrages de conceptions
cellules. Un stabilisant approprié peut être ajouté et le différentes peuvent être utilisés, ce qui peut impliquer
mélange de récoltes peut être dilué de façon appropriée. l’application de critères de validité ou d’acceptation
Seul un vrac final qui satisfait à l’essai ci-après peut être différents. Cependant, le vaccin doit être conforme, s’il est
utilisé dans la préparation du lot final. contrôlé comme décrit ci-dessus.
Contamination bactérienne et fongique. Le vrac final
ÉTIQUETAGE
satisfait à l’essai de stérilité (2.6.1), effectué en utilisant
10 ml pour chaque milieu. L’étiquette indique :
LOT FINAL — la souche du virus utilisée pour la préparation du vaccin,

TE
Le vrac final est réparti aseptiquement dans des récipients — le type et l’origine des cellules utilisées pour la préparation
stériles à fermeture inviolable et cryodesséché jusqu’à une du vaccin,
teneur en eau dont il est démontré qu’elle favorise la stabilité — la concentration minimale en virus,
du vaccin. Les récipients sont alors fermés pour éviter la — que le contact entre le vaccin et les désinfectants doit être
contamination et l’introduction d’humidité. évité,
Seul un lot final qui satisfait à l’essai Eau et à chacun des — que le vaccin ne doit pas être administré aux femmes
essais décrits ci-dessous sous Identification, Essai et Dosage enceintes.
peut être libéré. Si l’essai de sérum-albumine bovine a été
effectué avec des résultats satisfaisants sur le vrac final, il

peut ne pas être effectué sur le lot final. 01/2009:2418
Eau (2.5.12). Déterminée par semi-microdosage, la teneur
en eau n’est pas supérieure à la quantité approuvée par VACCIN VIVANT DU ZONA
l’Autorité compétente et pour laquelle la stabilité du vaccin
a été démontrée.
Vaccinum zonae vivum
IDENTIFICATION
DÉFINITION
Lorsque le vaccin reconstitué d’après les indications figurant
Le vaccin vivant du zona est une préparation cryodesséchée
sur l’étiquette est mélangé à des anticorps spécifiques
O
obtenue à partir de la souche atténuée appropriée
de l’herpèsvirus humain 3, il n’infecte plus des cultures
de l’herpèsvirus humain 3. Le vaccin, reconstitué
cellulaires sensibles.
immédiatement avant l’emploi d’après les indications
ESSAI figurant sur l’étiquette, se présente sous forme d’un
liquide limpide ou légèrement opalescent, d’une suspension
Contamination bactérienne et fongique. Le vaccin sensiblement blanche ou d’un liquide jaune pâle qui peut
BS

reconstitué satisfait à l’essai de stérilité (2.6.1). être coloré en raison de la présence d’un indicateur de pH. Il
Sérum-albumine bovine : au maximum 0,5 μg par dose est destiné à la vaccination des adultes.
humaine, déterminé par une méthode immunochimique
appropriée (2.7.1). PRODUCTION
La production du vaccin est basée sur un système de lot de
DOSAGE semence viral et un système de banque de cellules. Il aura été
démontré que ces systèmes donnent de façon constante des
Titrez le virus infectieux du vaccin en utilisant au moins vaccins vivants du zona d’un pouvoir immunogène et d’une
3 flacons séparés . Titrez en triple 1 flacon de préparation innocuité adéquats pour l’homme. Le virus dans le vaccin
de référence appropriée de virus pour valider chaque titrage. final ne devra pas avoir subi de passage dans des cultures
O

La concentration en virus de la préparation de référence est cellulaires, au-delà d’un nombre défini de passages approuvé
suivie à l’aide d’une carte de contrôle et un titre est établi par l’Autorité compétente, à partir du virus original isolé.
par chaque laboratoire à partir des données historiques.
La neurovirulence potentielle de la souche vaccinale est
Calculez la concentration individuelle en virus pour chaque
considérée lors du développement préclinique, basée sur
flacon de vaccin et pour chaque échantillon répliqué de la
les données épidémiologiques disponibles concernant
préparation de référence ainsi que les concentrations en
la neurovirulence et le neurotropisme, principalement
virus combinées correspondantes en utilisant les méthodes
celles pour le type sauvage du virus. A la lumière de ces
statistiques habituelles (5.3, par exemple). La concentration
considérations, une analyse de risque est effectuée. Si
combinée estimée en virus pour les 3 flacons de vaccin n’est
nécessaire, et selon les disponibilités, un essai est effectué
pas inférieure à la valeur minimale indiquée sur l’étiquette.
sur la souche vaccinale en utilisant un modèle animal qui
L’essai n’est pas valable si : différencie le type sauvage du virus atténué ; des essais sur
— l’intervalle de confiance (P = 0,95) de la concentration les souches d’atténuation intermédiaire peuvent également
estimée en virus de la préparation de référence pour être requis.
les 3 échantillons répliqués combinés est supérieur Le procédé de production fait l’objet d’une validation
à ± 0,3 log UFP ; permettant de démontrer que le produit satisferait à l’essai
— la concentration en virus de la préparation de référence de toxicité anormale des immunosérums et vaccins pour
diffère de plus de 0,5 log UFP par rapport au titre établi. usage humain (2.6.9), s’il lui était appliqué.

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4263
Vaccin vivant du zona PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

SUBSTRAT POUR LA MULTIPLICATION DU VIRUS VRAC FINAL


Le virus est multiplié dans des lignées de cellules diploïdes Les récoltes de virus qui satisfont aux essais prescrits
humaines (5.2.3). ci-dessus sont mélangées et clarifiées afin d’éliminer les
cellules. Un stabilisant approprié peut être ajouté et le
LOT DE SEMENCE
mélange de récoltes peut être dilué de façon appropriée.
La souche de l’herpèsvirus humain 3 sera identifiée comme
étant la souche appropriée par des données historiques y Seul un vrac final qui satisfait à l’essai ci-après peut être
compris des informations sur son origine et sa manipulation utilisé dans la préparation du lot final.
ultérieure. Le virus ne devra en aucun cas avoir subi un Contamination bactérienne et fongique. Effectuez l’essai
passage dans une lignée continue de cellules. Les lots de de stérilité (2.6.1) en utilisant 10 ml pour chaque milieu.
semence sont préparés dans le même type de cellules que LOT FINAL
celles utilisées pour la production du vaccin final. Les lots de Le vrac final est réparti aseptiquement dans des récipients
semence de virus sont préparés en quantités importantes et stériles à fermeture inviolable et cryodesséché jusqu’à une
conservés à des températures inférieures à − 20 °C s’ils sont teneur en eau dont il est démontré qu’elle favorise la stabilité
cryodesséchés ou inférieures à − 60 °C s’ils ne le sont pas. du vaccin. Les récipients sont alors fermés pour éviter la
Seul un lot de semence qui satisfait aux essais ci-après peut contamination et l’introduction d’humidité.
être utilisé pour la multiplication du virus. Seul un lot final qui satisfait à l’essai Eau et à chacun des

TE
essais décrits ci-dessous sous Identification, Essai et Dosage
Identification. Le lot de semence primaire et le lot de
peut être libéré. Si l’essai de sérum-albumine bovine a été
semence de travail sont identifiés comme contenant
effectué avec des résultats satisfaisants sur le vrac final, il
l’herpèsvirus humain 3 par un essai de séroneutralisation en
peut ne pas être effectué sur le lot final.
culture cellulaire, à l’aide d’anticorps spécifiques.
Eau (2.5.12). Déterminée par semi-microdosage, la teneur
Concentration en virus. La concentration en virus infectieux en eau n’est pas supérieure à la quantité approuvée par
dans le lot de semence primaire et le lot de semence de l’Autorité compétente et pour laquelle la stabilité du vaccin
travail est déterminée comme prescrit sous Dosage, afin de a été démontrée.
s’assurer de la régularité de la production.

Agents étrangers (2.6.16). Le lot de semence de travail IDENTIFICATION
satisfait aux exigences pour les lots de semence des vaccins Lorsque le vaccin reconstitué d’après les indications figurant
viraux vivants ; utilisez 50 ml dans l’essai effectué sur sur l’étiquette est mélangé à des anticorps spécifiques
cultures cellulaires. de l’herpèsvirus humain 3, il n’infecte plus des cultures
cellulaires sensibles.
MULTIPLICATION ET RÉCOLTE
Toutes les manipulations effectuées sur la banque de ESSAI
cellules et les cultures cellulaires dérivées sont conduites Contamination bactérienne et fongique. Le vaccin
dans des conditions aseptiques dans des locaux où ne sont reconstitué satisfait à l’essai de stérilité (2.6.1).
pas manipulés simultanément d’autres cellules ou d’autres
O
virus. Du sérum animal approuvé (mais non humain) peut Sérum-albumine bovine : au maximum 0,65 μg par dose
être utilisé dans les milieux de culture. Il est démontré humaine, déterminé par une méthode immunochimique
que le sérum et la trypsine utilisés dans la préparation appropriée (2.7.1).
des suspensions de cellules et des milieux sont exempts DOSAGE
d’agents étrangers. Le milieu de culture cellulaire peut
Titrez le virus infectieux du vaccin en utilisant au moins
contenir un indicateur de pH, tel que le rouge de phénol, et
BS

3 flacons séparés. Titrez en triple 1 flacon de préparation de


des antibiotiques approuvés à la plus faible concentration
référence appropriée du virus pour valider chaque titrage.
efficace. Il est souhaitable d’utiliser un substrat exempt
La concentration en virus de la préparation de référence est
d’antibiotiques pendant la production. 5 pour cent, mais au
suivie à l’aide d’une carte de contrôle et un titre est établi
minimum 50 ml, des cultures cellulaires utilisées pour la
par chaque laboratoire à partir des données historiques.
production de vaccin sont gardés comme cellules témoins
Calculez la concentration individuelle en virus pour chaque
non ensemencées. Les cellules infectées provenant d’une
flacon de vaccin et pour chaque échantillon répliqué de la
même récolte sont lavées, dégagées de la surface du support
préparation de référence ainsi que les concentrations en
et mélangées. La suspension de cellules est lysée par
virus combinées correspondantes en utilisant les méthodes
traitement aux ultrasons.
statistiques habituelles (5.3, par exemple). La concentration
O

Seule une récolte de virus qui satisfait aux essais ci-après combinée estimée en virus pour les 3 flacons de vaccin n’est
peut être utilisée dans la préparation du vrac final. pas inférieure à la valeur minimale indiquée sur l’étiquette.
Identification. La récolte de virus est identifiée comme L’essai n’est pas valable si :
contenant l’herpèsvirus humain 3 par un essai de — l’intervalle de confiance (P = 0,95) de la concentration
séroneutralisation en culture cellulaire, à l’aide d’anticorps estimée en virus de la préparation de référence pour
spécifiques. les 3 échantillons répliqués combinés est supérieur
à ± 0,3 log UFP ;
Concentration en virus. La concentration en virus dans
les récoltes de virus est déterminée comme prescrit sous — la concentration en virus de la préparation de référence
Dosage afin de s’assurer de la régularité de la production diffère de plus de 0,5 log UFP par rapport au titre établi.
et de déterminer la dilution à utiliser dans la préparation L’essai est répété si l’intervalle de confiance (P = 0,95)
du vrac final. de la concentration en virus combinée du vaccin est
supérieur à ± 0,3 log UFP ; seules les données provenant
Agents étrangers (2.6.16). Utilisez 50 ml dans l’essai de titrages valides sont combinées par les méthodes
effectué sur cultures cellulaires. statistiques habituelles (5.3, par exemple) pour le calcul de
Cellules témoins. Les cellules témoins de la culture cellulaire la concentration en virus de l’échantillon. L’intervalle de
de production dont dérive la récolte unique satisfont à un confiance (P = 0,95) de la concentration en virus combinée
essai d’identification et à l’essai des agents étrangers (2.6.16). n’est pas supérieur à ± 0,3 log UFP.

4264 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 Vaccin vivant du zona

Dans des cas justifiés et autorisés, des titrages de conceptions — la souche du virus utilisé pour la préparation du vaccin,
différentes peuvent être utilisés, ce qui peut impliquer — le type et l’origine des cellules utilisées pour la préparation
l’application de critères de validité ou d’acceptation du vaccin,
différents. Cependant, le vaccin doit être conforme, s’il est — la concentration minimale en virus,
contrôlé comme décrit ci-dessus.
— que le contact entre le vaccin et les désinfectants doit être
évité,
ÉTIQUETAGE
— que le vaccin ne doit pas être administré aux femmes
L’étiquette indique : enceintes.

TE

O
BS
O

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4265
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

TE

O
BS
O

4266 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

PRÉPARATIONS
RADIOPHARMACEUTIQUES
Pentétate (calcium) de sodium pour préparations Technétium (99mTc) (pyrophosphate d’étain et de), solution
radiopharmaceutiques..........................................................4269 injectable de............................................................................ 4274
Technétium (99mTc) (macrosalb-), suspension Technétium (99mTc) (sulfure de rhénium colloïdal et de),
injectable de............................................................................4270 solution injectable de............................................................4275
Technétium (99mTc) (mébrofénine-), solution injectable Tétra-O-acétyl-mannose (triflate de) pour préparations
de...............................................................................................4271 radiopharmaceutiques.......................................................... 4276
Technétium (99mTc) (microsphères-),

TE
suspension injectable de.. ....................................................4273


O
BS
O

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4267
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

TE

O
BS
O

4268 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 Pentétate (calcium) de sodium pour préparations radiopharmaceutiques

01/2009:2353 Solution témoin (a). Dissolvez 0,100 g de calcium édétate


de sodium R dans le mélange de solvants et complétez à
25,0 ml avec le mélange de solvants.
PENTÉTATE (CALCIUM) DE
Solution témoin (b). Dissolvez 40,0 mg d’acide
SODIUM POUR PRÉPARATIONS nitrilotriacétique R (impureté A) dans le mélange de solvants
RADIOPHARMACEUTIQUES et complétez à 100,0 ml avec le mélange de solvants. A
10,0 ml de solution, ajoutez 1 ml de solution témoin (a) et
Natrii calcii pentetas ad radiopharmaceutica complétez à 100,0 ml avec le mélange de solvants. Prélevez
1,0 ml de cette solution et complétez à 10,0 ml avec le
mélange de solvants.
Colonne :
— dimensions : l = 0,10 m, Ø = 4,6 mm,
— phase stationnaire : carbone graphité pour
chromatographie R1 (5 μm) à particules sphériques
présentant une surface spécifique de 120 m2/g et un
diamètre de pores de 25 nm.

TE
Phase mobile : dissolvez 50 mg de sulfate ferrique
pentahydraté R dans 50 ml d’acide sulfurique 0,5 M et
ajoutez 750 ml d’eau R. Ajustez à pH 1,5 avec de l’acide
sulfurique 0,5 M ou de l’hydroxyde de sodium 1 M, ajoutez
20 ml d’éthylèneglycol R et complétez à 1000 ml avec de
l’eau R.
C14H18CaN3Na3O10,xH2O Mr 497,4 (substance anhydre)
Débit : 1 ml/min.
DÉFINITION Détection : spectrophotomètre à 273 nm.
[1,1′,1″,1′′′-[[(Carboxylatométhyl)imino]bis(éthylènenitri-
LÈ Injection : 20 μl de solution à examiner et de solution
lo)]tétraacétato]calciate(3-) de trisodium. témoin (b) ; filtrez les solutions et injectez immédiatement.
Le calcium pentétate de sodium pour préparations Enregistrement : 4 fois le temps de rétention du complexe
radiopharmaceutiques est une matière première pour la de fer et d’impureté A.
préparation de solution injectable de pentétate-technétium Temps de rétention : complexe de fer et d’impure-
(99mTc). té A = environ 5 min ; complexe de fer et d’acide
Teneur : 98,0 pour cent à 102,0 pour cent (substance édétique = environ 10 min ; le complexe de fer et d’acide
anhydre). pentétique elue avec le volume mort.
Conformité du système : solution témoin (b) :
CARACTÈRES — résolution : au minimum 7 entre les pics dus au complexe
O
Aspect : poudre ou cristaux blancs ou sensiblement blancs, de fer et d’impureté A et au complexe de fer et d’acide
hygroscopique. édétique,
Solubilité : facilement soluble dans l’eau, pratiquement — rapport signal/bruit : au minimum 50 pour le pic dû au
insoluble dans l’éthanol à 96 pour cent. complexe de fer et d’impureté A.
Limite :
BS

IDENTIFICATION — impureté A : au maximum la surface du pic correspondant


A. Spectrophotométrie d’absorption dans l’infrarouge dans le chromatogramme obtenu avec la solution
(2.2.24). témoin (b) (0,1 pour cent).
Comparaison : calcium pentétate de sodium SCR. Impureté B : au maximum 1,0 pour cent.
B. Incinérez. Le résidu donne la réaction (b) du calcium Dissolvez 5,0 g de substance à examiner dans 250 ml d’eau R.
(2.3.1). Ajoutez 10 ml de solution tampon chlorure d’ammonium
C. La substance à examiner donne la réaction (a) du sodium pH 10,0 R et 50 mg de mélange composé au mordant noir
(2.3.1). 11 R. Le virage au violet de l’indicateur ne nécessite pas plus
de 1,3 ml de chlorure de magnésium 0,1 M.
O

ESSAI Chlorures : au maximum 0,1 pour cent.


Solution S. Dissolvez 5,0 g de substance à examiner dans Dissolvez 0,7 g de substance à examiner dans de l’eau R
de l’eau exempte de dioxyde de carbone R et complétez à et complétez à 20 ml avec le même solvant. Ajoutez 30 ml
25,0 ml avec le même solvant. d’acide nitrique dilué R, laissez reposer pendant 30 min et
Aspect de la solution. La solution S est limpide (2.2.1) et filtrez. Prélevez 10 ml de filtrat et complétez à 50 ml avec de
incolore (2.2.2, Procédé II). l’eau R. Utilisez cette solution comme solution à examiner.
Préparez le témoin avec 0,40 ml d’acide chlorhydrique
pH (2.2.3) : 8,0 à 9,5 pour la solution S. 0,01 M, ajoutez 6 ml d’acide nitrique dilué R et complétez à
Impureté A. Chromatographie liquide (2.2.29). Effectuez 50 ml avec de l’eau R. Filtrez les 2 solutions si nécessaire.
l’essai à l’abri de la lumière. Ajoutez, à chacune des solutions, 1 ml de solution nitrate
Mélange de solvants. Dissolvez 10 g de sulfate ferrique d’argent R2, mélangez et laissez reposer pendant 5 min à
pentahydraté R dans 20 ml d’acide sulfurique 0,5 M et l’abri de la lumière. Si la solution à examiner présente une
ajoutez 780 ml d’eau R. Ajustez à pH 2,0 avec de l’hydroxyde opalescence, celle-ci n’est pas plus prononcée que celle de la
de sodium 1 M et complétez à 1000 ml avec de l’eau R. solution témoin.
Solution à examiner. Dissolvez 0,100 g de substance à Fer (2.4.9) : au maximum 20 ppm.
examiner dans le mélange de solvants et complétez à 25,0 ml Prélevez 2,5 ml de solution S et complétez à 10 ml avec
avec le mélange de solvants. de l’eau R. A la solution à examiner et au témoin, ajoutez

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4269
Technétium (99mTc) (macrosalb-), suspension injectable de PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

0,25 g de chlorure de calcium R avant l’addition d’acide obtenus par dénaturation d’une solution aqueuse d’albumine
thioglycolique R. humaine. Les particules sont marquées au technétium-99m.
Métaux lourds (2.4.8) : au maximum 20 ppm. La suspension injectable contient des substances réductrices
telles que des sels d’étain à une concentration maximale
1,0 g de substance à examiner satisfait à l’essai F. Pour lade 3 mg de Sn par millilitre. La suspension peut contenir
minéralisation, remplacez l’acide sulfurique R par de l’acide
un tampon approprié tel qu’un tampon acétate, citrate ou
nitrique R. Préparez la solution témoin avec 2 ml de solution
phosphate ainsi que de l’albumine humaine non dénaturée
à 10 ppm de plomb (Pb) R. et un conservateur antimicrobien tel que l’alcool benzylique.
Eau (2.5.12) : au maximum 15,0 pour cent, déterminé sur L’albumine humaine utilisée est conforme aux exigences
0,100 g de substance à examiner. de la monographie Solution d’albumine humaine (0255).
Endotoxines bactériennes (2.6.14) : moins de 0,1 UI/mg, La suspension contient au minimum 90,0 pour cent et
si la substance à examiner est destinée à la fabrication de au maximum 110,0 pour cent de la radioactivité due au
préparations parentérales sans autre procédé approprié technétium-99m indiquée à la date et à l’heure figurant sur
d’élimination des endotoxines bactériennes. l’étiquette. 90 pour cent au minimum de la radioactivité est
due au technétium-99m qui se trouve lié aux particules de
DOSAGE la suspension comme le démontre l’essai de la radioactivité
Dissolvez 0,100 g de substance à examiner dans de l’eau R des particules non filtrables. Les particules ont un diamètre

TE
et complétez à 50,0 ml avec le même solvant. A 25,0 ml type de 10 μm à 100 μm. La radioactivité spécifique
de solution, ajoutez 80 ml d’eau R. Ajustez à pH 2,3 n’est pas inférieure à 37 MBq de technétium-99m par
avec de l’acide nitrique dilué R. Titrez par le nitrate de milligramme d’agrégats d’albumine à la date et à l’heure de
bismuth 0,01 M en présence de 0,1 ml d’une solution de l’administration.
xylénolorange R à 1 g/l comme indicateur. La coloration de La suspension injectable de macrosalb-technétium
la solution vire du jaune au rouge. (99mTc) est préparée à partir de la solution injectable de
1 ml de nitrate de bismuth 0,01 M correspond à 4,974 mg pertechnétate (99mTc) de sodium, obtenu ou non par fission,
de C14H18CaN3Na3O10. à l’aide de réactifs appropriés, stériles, compte tenu des
proportions d’impuretés radionucléidiques par rapport à la
CONSERVATION LÈ date et à l’heure de l’administration.
En récipient étanche, à l’abri de la lumière.
CARACTÈRES
ÉTIQUETAGE Suspension blanche qui peut se séparer au repos.
L’étiquette recommande de contrôler la substance dans un Le technétium-99m a une période de 6,02 h et émet des
essai de production avant de l’utiliser pour la fabrication rayonnements gamma.
de préparations radiopharmaceutiques. Ceci permet
de s’assurer que, dans des conditions de production IDENTIFICATION
spécifiées, la substance permet de produire une préparation A. Enregistrez le spectre du rayonnement gamma à l’aide
radiopharmaceutique de qualité spécifiée et en quantité d’un appareil approprié et comparez avec le spectre
O
souhaitée. d’une préparation étalon de technétium-99m ou à
IMPURETÉS l’aide d’un appareil étalonné au moyen d’une telle
solution. Les préparations étalons de technétium-99m
Impuretés spécifiées : A, B. et de molybdène-99 peuvent être obtenues auprès
de laboratoires officiellement désignés par l’Autorité
BS

compétente. Le spectre de la suspension à examiner


ne diffère pas d’une manière significative de celui de la
préparation étalon. L’énergie du photon gamma principal
A. acide nitrilotriacétique, du technétium-99m est de 0,140 MeV.
B. L’essai de la radioactivité des particules non filtrables
et l’essai de la taille des particules contribuent à
l’identification de la préparation.
C. Dans un tube à centrifugation, introduisez 1 ml de
suspension à examiner et centrifugez à 2500 g pendant
5 min à 10 min. Rejetez le liquide surnageant et
O

ajoutez au culot de centrifugation 5 ml de solution


B. acide [[(carboxyméthyl)imino]bis(éthylènenitrilo)]tétra
cupri-tartrique R2. Mélangez et laissez reposer pendant
acétique (acide pentétique).
10 min. Si nécessaire, chauffez pour dissoudre les
particules. Laissez refroidir. Ajoutez rapidement 0,5 ml de
01/2009:0296 réactif phosphomolybdotungstique dilué R et mélangez
immédiatement. Il se développe une coloration bleue.
TECHNÉTIUM (99mTc) (MACROSALB-), ESSAI
SUSPENSION INJECTABLE DE pH (2.2.3). Le pH de la suspension à examiner est de 3,8 à
7,5.
Technetii (99mTc) macrosalbi Radioactivité des particules non filtrables. Déposez 0,2 ml
suspensio iniectabilis de suspension à examiner sur une membrane filtrante d’un
diamètre de 13 mm à 25 mm : cette membrane est constituée
DÉFINITION par un film de polycarbonate, d’une épaisseur de 10 μm,
La suspension injectable de macrosalb-technétium (99mTc) présentant des pores circulaires de 3 μm et elle est placée
est une suspension stérile d’albumine d’origine humaine se dans un support approprié. Filtrez en ajoutant 20 ml d’une
présentant sous forme d’agrégats irréguliers et insolubles, solution de chlorure de sodium R à 9 g/l. Déterminez

4270 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 Technétium (99mTc) (mébrofénine-), solution injectable de

la proportion d’activité sur le filtre. La radioactivité des après l’injection. Prélevez le foie, la rate et les poumons.
particules non filtrables ne représente pas moins de 90 pour Mesurez la radioactivité de ces organes à l’aide d’un appareil
cent de la radioactivité totale de la suspension à examiner. approprié. Mesurez la radioactivité du reste du corps, y
Taille des particules. Examinez au microscope. Diluez si compris le sang, de chaque animal après avoir prélevé la
nécessaire la suspension à examiner de façon à obtenir une queue. Déterminez le pourcentage de radioactivité dans le
densité en particules suffisamment faible pour distinguer foie, la rate et les poumons à l’aide de l’expression suivante :
individuellement les particules. A l’aide d’une seringue
munie d’une aiguille d’un diamètre intérieur d’au moins
0,35 mm, déposez un volume approprié de suspension
à examiner dans une cellule appropriée telle qu’un A = radioactivité de l’organe considéré,
hémocytomètre, en prenant soin de ne pas trop remplir la
cellule. Laissez reposer pendant 1 min, puis déposez avec B = radioactivité totale du foie, de la rate, des
précaution une lamelle sans écraser l’échantillon. Examinez poumons et du reste du corps de l’animal.
par balayage au microscope un champ correspondant au Dans au moins 2 des 3 rats, 80 pour cent au moins de la
moins à 5000 particules. 10 particules au maximum ont une radioactivité se trouve dans les poumons et au total 5 pour
dimension supérieure à 100 μm, mais aucune particule ne cent au plus dans le foie et dans la rate. La suspension peut
présente de dimension supérieure à 150 μm. être libérée avant la fin de l’essai.

TE
Agrégats d’albumine Stérilité. La suspension à examiner satisfait à l’essai
Solution à examiner. Dans un tube à centrifugation, de stérilité prescrit dans la monographie Préparations
introduisez un volume de suspension à examiner radiopharmaceutiques (0125). Elle peut être libérée avant
correspondant à 1 mg environ d’agrégats d’albumine et la fin de l’essai.
centrifugez à 2500 g environ pendant 5 min à 10 min.
Rejetez le liquide surnageant et remettez le culot en Endotoxines bactériennes (2.6.14) : moins de 175/V UI/ml,
suspension dans 2,0 ml de solution de chlorure de sodium R V étant la dose maximale recommandée en millilitres.
à 9 g/l. Centrifugez à nouveau à 2500 g pendant 5 min
à 10 min. Rejetez le liquide surnageant et remettez le
LÈ RADIOACTIVITÉ
culot en suspension dans 5,0 ml de solution de carbonate Mesurez la radioactivité à l’aide d’un compteur approprié
de sodium R1. Chauffez dans un bain-marie de 80 °C à et comparez-la à celle d’une préparation étalon de
90 °C jusqu’à dissolution des agrégats d’albumine. Laissez technétium-99m ou à l’aide d’un appareil étalonné au moyen
refroidir, transvasez dans une fiole jaugée et complétez à d’une telle préparation.
10,0 ml avec la solution de carbonate de sodium R1.
Solutions de référence. Préparez une gamme de solutions ÉTIQUETAGE
contenant, dans la solution de carbonate de sodium R1, de L’étiquette indique :
0,05 mg à 0,2 mg d’albumine humaine par millilitre. — si la préparation en contient, la concentration d’étain
Introduisez respectivement 3,0 ml de chaque solution exprimée en milligrammes par millilitre,
O
dans une fiole de 25 ml. Dans chaque fiole, ajoutez
— que la préparation doit être agitée avant l’emploi,
15,0 ml de solution cupri-tartrique R2, mélangez et laissez
reposer pendant 10 min. Ajoutez rapidement 1,5 ml de — que la préparation ne doit pas être utilisée si, après
réactif phosphomolybdotungstique dilué R et mélangez agitation, la suspension ne paraît pas homogène.
immédiatement. Laissez reposer pendant 30 min. Mesurez
l’absorbance (2.2.25) de chaque solution à 750 nm en
BS

utilisant comme liquide de compensation la solution de


01/2009:2393
carbonate de sodium R1. A partir des absorbances obtenues
avec chaque solution de référence, construisez la courbe
d’étalonnage et calculez la concentration en agrégats TECHNÉTIUM (99mTc)
d’albumine de la suspension à examiner. (MÉBROFÉNINE-), SOLUTION
Etain INJECTABLE DE
Solution à examiner. A 1,0 ml de suspension à examiner,
ajoutez 1,0 ml d’acide chlorhydrique 2 M. Chauffez au
bain-marie pendant 30 min. Refroidissez et centrifugez à Technetii (99mTc) mebrofenini solutio
O

300 g pendant 10 min. Prélevez 1,0 ml du liquide surnageant iniectabilis


et complétez à 25,0 ml avec de l’acide chlorhydrique 1 M.
Solution témoin. Dissolvez 0,115 g de chlorure stanneux R
dans de l’acide chlorhydrique 1 M et complétez à 1000,0 ml
avec le même acide.
A 1,0 ml de chaque solution, ajoutez 0,4 ml d’une solution
de laurilsulfate de sodium R à 20 g/l, 0,05 ml d’acide
thioglycolique R, 0,1 ml de réactif au dithiol R et
3,0 ml d’acide chlorhydrique 0,2 M. Mélangez. Mesurez
l’absorbance (2.2.25) de chaque solution à 540 nm en
utilisant de l’acide chlorhydrique 0,2 M comme liquide de DÉFINITION
compensation. L’absorbance de la solution à examiner n’est Solution stérile d’un complexe de technétium-99m et de
pas supérieure à celle de la solution témoin (3 mg de Sn par mébrofénine. Elle peut contenir des stabilisants et des
millilitre). additifs inertes.
Distribution physiologique. Injectez dans une veine caudale Teneur : 90 pour cent à 110 pour cent de la radioactivité due
de 3 rats, pesant chacun de 150 g à 250 g, 0,2 ml au plus de au technétium-99m indiquée à la date et à l’heure figurant
suspension à examiner. Euthanasiez les animaux 15 min sur l’étiquette.

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4271
Technétium (99mTc) (mébrofénine-), solution injectable de PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

PRODUCTION Détection : déterminez la distribution de la radioactivité à


99m l’aide d’un détecteur approprié.
La solution injectable de mébrofénine-technétium ( Tc)
est préparée en dissolvant, en présence d’un agent Facteur de retardement : impureté A = 0-0,1.
réducteur comme un sel stanneux, de l’acide [[[(3-bromo- Conformité du système : le facteur de retardement du pic
2,4,6-triméthylphényl)carbamoyl]méthyl]imino]diacétique principal du chromatogramme obtenu avec la solution
(mébrofénine) dans de la Solution injectable de témoin (a) n’excède pas 0,1. Le facteur de rétention du
pertechnétate (99mTc) de sodium, obtenu par fission (0124) pic principal du chromatogramme obtenu avec la solution
ou dans de la Solution injectable de pertechnétate (99mTc) témoin (b) est supérieur à 0,7.
de sodium, non obtenu par fission (0283).
Autres impuretés radiochimiques. Chromatographie liquide
(2.2.29).
CARACTÈRES
Solution à examiner. La préparation à examiner.
Aspect : solution limpide, incolore.
Solution témoin. Utilisez la solution témoin (b) de l’essai
Période et nature du rayonnement du technétium-99m : de l’impureté A.
voir le chapitre général 5.7. Tableau des caractéristiques
des radionucléides. Colonne :

TE
— dimensions : l = 0,25 m, Ø = 4,0 mm,
IDENTIFICATION — phase stationnaire : gel de silice octadécylsilylé pour
A. Spectrométrie gamma. chromatographie, à groupements polaires incorporés,
postgreffé R (5 μm).
Résultats : l’énergie du photon gamma principal du
technétium-99m est de 0,141 MeV. Phase mobile A : solution d’acétate d’ammonium R à
3,85 g/l.
B. Examinez le chromatogramme obtenu dans l’essai des
autres impuretés radiochimiques (voir Essai). Phase mobile B : acétonitrile R.
Résultats : le pic principal du chromatogramme
LÈ Intervalle Phase mobile A Phase mobile B
obtenu avec la solution à examiner est semblable (min) (pour cent V/V) (pour cent V/V)
quant à son temps de rétention au pic dû à la 0 - 20 70 30
mébrofénine-technétium-99m dans le chromatogramme 20 - 25 70 → 0 30 → 100
obtenu avec la solution témoin.
25 - 30 0 100
ESSAI
Débit : 1,0 ml/min.
pH (2.2.3) : 4,0 à 7,5.
Détection : détecteur de radioactivité.
Stérilité. La préparation à examiner satisfait à l’essai
O
de stérilité prescrit dans la monographie Préparations Injection : 20 μl.
radiopharmaceutiques (0125). Elle peut être libérée pour Rétention relative par rapport à la mébrofénine-
emploi avant la fin de l’essai. technétium-99m (temps de rétention = environ 20 min) :
Endotoxines bactériennes (2.6.14) : moins de 175/V UI/ml, impureté B = environ 0,17.
V étant la dose maximale recommandée en millilitres. Limites :
BS

PURETE RADIOCHIMIQUE — mébrofénine-technétium-99m : au minimum 94 pour


Impureté A. Chromatographie sur couche mince (2.2.27). cent de la radioactivité totale.
Solution à examiner. La préparation à examiner. Calculez le pourcentage de radioactivité due à la
mébrofénine-technétium-99m à l’aide de l’expression
Solution témoin (a). Dans un flacon fermé, ajoutez 2 ml suivante :
de solution injectable de pertechnétate (99mTc) de sodium
(obtenu ou non par fission) à 1 ml d’une solution de chlorure
stanneux R à 1 g/l dans l’acide chlorhydrique 0,05 M.
Utilisez cette préparation dans les 30 min qui suivent sa A = pourcentage de radioactivité due à l’impureté A
O

préparation. déterminé dans l’essai de l’impureté A sous


Solution témoin (b). Dissolvez 40 mg de mébrofénine SCR Pureté radiochimique,
dans 2 ml d’eau R et ajustez à pH 6,5 avec une solution T = proportion de la surface du pic dû à la
d’hydroxyde de sodium R à 40 g/l. A cette solution, ajoutez mébrofénine-technétium-99m par rapport à la
25 μl d’une solution de chlorure stanneux R à 20 mg/ml surface totale des pics dans le chromatogramme
dans l’acide chlorhydrique 0,05 M et 400 MBq de solution obtenu avec la solution à examiner.
injectable de pertechnétate (99mTc) de sodium (obtenu ou
non par fission) dans un volume de 2 ml. Laissez reposer RADIOACTIVITÉ
pendant 15 min.
Déterminez la radioactivité à l’aide d’un appareil étalonné.
Plaque : plaque au gel de silice pour CCM R; utilisez une
feuille de fibre de verre. IMPURETÉS
Phase mobile : , eau R, acétonitrile R (40:60 V/V).
Dépôt : environ 5 μl. A. technétium-99m sous forme colloïdale,
Développement : immédiatement, sur les 4/5 de la plaque.
Séchage : à l’air. B. ion [99mTc]pertechnétate.

4272 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 Technétium (99mTc) (microsphères-), suspension injectable de

01/2009:0570 particules. Laissez refroidir. Ajoutez rapidement 0,5 ml


de réactif phosphomolybdotungstique dilué R ; mélangez
immédiatement. Il se développe une coloration bleue.
TECHNÉTIUM (99mTc)
(MICROSPHÈRES-), ESSAI
SUSPENSION INJECTABLE DE pH (2.2.3). Le pH de la suspension à examiner est de 4,0 à
9,0.
Technetii (99mTc) microsphaerarum Radioactivité des particules non filtrables. Déposez 0,2 ml
de suspension à examiner sur une membrane filtrante d’un
suspensio iniectabilis diamètre de 13 mm à 25 mm : cette membrane est constituée
par un film de polycarbonate, d’une épaisseur de 10 μm,
DÉFINITION
présentant des pores circulaires de 3 μm et elle est placée
La suspension injectable de microsphères-technétium (99mTc) dans un support approprié. Filtrez en ajoutant 20 ml d’une
est une suspension stérile d’albumine d’origine humaine qui solution de chlorure de sodium R à 9 g/l. Déterminez
a été dénaturée de façon à former des particules sphériques la proportion d’activité sur le filtre. La radioactivité des
insolubles. Les particules sont marquées au technétium-99m. particules non filtrables ne représente pas moins de 95 pour
La suspension injectable contient des substances réductrices cent de la radioactivité totale de la suspension à examiner.

TE
telles que des sels d’étain à une concentration maximale
de 3 mg de Sn par millilitre. La suspension peut contenir Taille des particules. Examinez au microscope. Diluez si
un tampon approprié tel qu’un tampon acétate, citrate ou nécessaire la suspension à examiner de façon à obtenir une
phosphate et des additifs tels que des agents mouillants. densité en particules suffisamment faible pour distinguer
L’albumine humaine utilisée est conforme aux exigences individuellement les particules. A l’aide d’une seringue
de la monographie Solution d’albumine humaine (0255). munie d’une aiguille d’un diamètre intérieur d’au moins
La suspension contient au minimum 90,0 pour cent et 0,35 mm, déposez un volume approprié de suspension
au maximum 110,0 pour cent de la radioactivité due au à examiner dans une cellule appropriée telle qu’un
technétium-99m indiquée à la date et à l’heure figurant sur hémocytomètre, en prenant soin de ne pas trop remplir la

l’étiquette. 95 pour cent au minimum de la radioactivité est cellule. Laissez reposer pendant 1 min, puis déposez avec
due au technétium-99m qui se trouve lié aux particules de précaution une lamelle sans écraser l’échantillon. Examinez
la suspension comme le démontre l’essai de la radioactivité par balayage au microscope un champ correspondant au
des particules non filtrables. Les particules ont un diamètre moins à 5000 particules. Les particules ont un aspect
type de 10 μm à 50 μm. La radioactivité n’est pas inférieure sphérique uniforme. 10 particules au maximum ont une
à 185 MBq de technétium-99m par million de particules à la dimension supérieure à 75 μm, mais aucune d’elles ne
date et à l’heure de l’administration. présente de dimension supérieure à 100 μm.
La suspension injectable de microsphères-technétium Nombre de particules. Examinez au microscope. Remplissez
(99mTc) est préparée à partir de la solution injectable de une cellule appropriée telle qu’un hémocytomètre d’une
O
pertechnétate (99mTc) de sodium, obtenu ou non par fission, dilution appropriée de la suspension à examiner en veillant à
à l’aide de réactifs appropriés, stériles, compte tenu des ce que les particules ne se déposent pas pendant le transfert.
proportions d’impuretés radionucléidiques par rapport à la Dénombrez les particules dans la cellule. Répétez 2 fois cette
date et à l’heure d’administration. opération et calculez le nombre de particules par millilitre
de suspension à examiner.
CARACTÈRES Etain
BS

Suspension de particules blanches à jaunes ou Solution à examiner. A 1,0 ml de suspension à examiner,


artificiellement colorées, qui peut se séparer au repos. ajoutez 0,5 ml d’acide sulfurique R et 1,5 ml d’acide
Le technétium-99m a une période de 6,02 h et émet des nitrique R. Chauffez et évaporez jusqu’à obtention
rayonnements gamma. d’un volume de 1 ml environ. Ajoutez 2 ml d’eau R et
évaporez de nouveau jusqu’à obtention d’un volume de
IDENTIFICATION 1 ml environ. Répétez 2 fois cette opération, refroidissez et
A. Enregistrez le spectre du rayonnement gamma à l’aide complétez à 25,0 ml avec l’acide chlorhydrique 1 M.
d’un appareil approprié et comparez avec le spectre Solution témoin. Dissolvez 0,115 g de chlorure stanneux R
d’une préparation étalon de technétium-99m ou à dans de l’acide chlorhydrique 1 M et complétez à 1000,0 ml
O

l’aide d’un appareil étalonné au moyen d’une telle avec le même acide.
solution. Les préparations étalons de technétium-99m A 1,0 ml de chaque solution, ajoutez 0,4 ml d’une solution
et de molybdène-99 peuvent être obtenues auprès de laurilsulfate de sodium R à 20 g/l, 0,05 ml d’acide
de laboratoires officiellement désignés par l’Autorité thioglycolique R, 0,1 ml de réactif au dithiol R et
compétente. Le spectre de la suspension à examiner 3,0 ml d’acide chlorhydrique 0,2 M. Mélangez. Mesurez
ne diffère pas de manière significative de celui de la l’absorbance (2.2.25) de chaque solution à 540 nm en
préparation étalon. L’énergie du photon gamma principal utilisant comme liquide de compensation de l’acide
du technétium-99m est de 0,140 MeV. chlorhydrique 0,2 M. L’absorbance de la solution à examiner
B. L’essai de la radioactivité des particules non filtrables n’est pas supérieure à celle de la solution témoin (3 mg de
et l’essai de la taille des particules contribuent à Sn par millilitre).
l’identification de la préparation. Distribution physiologique. Injectez dans une veine caudale
C. Dans un tube à centrifugation, introduisez 1 ml de de 3 rats pesant chacun de 150 g à 250 g, 0,2 ml au plus de
suspension à examiner et centrifugez à 2500 g pendant suspension à examiner. Euthanasiez les animaux 15 min
5 min à 10 min. Décantez le liquide surnageant et après l’injection. Prélevez le foie, la rate et les poumons.
ajoutez au culot de centrifugation 5 ml de solution Mesurez la radioactivité de ces organes à l’aide d’un appareil
cupri-tartrique R2. Mélangez et laissez reposer pendant approprié. Mesurez la radioactivité du reste du corps, y
10 min. Si nécessaire, chauffez pour dissoudre les compris le sang, de chaque animal et l’urine excrétée, après

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4273
(99mTc) (pyrophosphate d’étain et de), solution injectable de PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

avoir prélevé la queue. Déterminez le pourcentage de la CARACTÈRES


radioactivité dans le foie, la rate et les poumons à l’aide de Solution limpide et incolore.
l’expression suivante :
Le technétium-99m a une période de 6,02 h et émet des
rayonnements gamma.
IDENTIFICATION
A = radioactivité de l’organe considéré, A. Enregistrez le spectre des rayonnements gamma de la
solution à examiner à l’aide d’un appareil approprié et
B = radioactivité totale du foie, de la rate, des comparez avec le spectre d’une préparation étalon de
poumons et du reste du corps de l’animal, y technétium-99m ou à l’aide d’un appareil étalonné au
compris l’urine excrétée. moyen d’une telle solution. Les préparations étalons
Dans au moins 2 des 3 rats, 80 pour cent au moins de la de technétium-99m et de molybdène-99 peuvent être
radioactivité se trouve dans les poumons et au total 5 pour obtenues auprès de laboratoires officiellement désignés
cent au plus dans le foie et la rate. La suspension peut être par l’Autorité compétente. Le spectre de la solution à
libérée avant la fin de l’essai. examiner ne diffère pas de manière significative de celui
Stérilité. La suspension à examiner satisfait à l’essai de la préparation étalon. L’énergie du photon gamma
de stérilité prescrit dans la monographie Préparations principal du technétium-99m est de 0,140 MeV.

TE
radiopharmaceutiques (0125). Elle peut être libérée avant B. Examinez les chromatogrammes obtenus dans l’essai de
la fin de l’essai. pureté radiochimique. La répartition de la radioactivité
contribue à l’identification de la préparation.
Endotoxines bactériennes (2.6.14) : moins de 175/V UI/ml,
V étant la dose maximale recommandée en millilitres. C. A 1 ml de la solution à examiner, ajoutez 1 ml
d’acide acétique R. Chauffez au bain-marie pendant
1 h. Après refroidissement, ajoutez 10 ml du réactif
RADIOACTIVITÉ nitro-molybdovanadique R. Laissez reposer pendant
Mesurez la radioactivité à l’aide d’un compteur approprié 30 min. Il se développe une coloration jaune.
et comparez-la à celle d’une préparation étalon de
LÈ D. A 1 ml de la solution à examiner, ajoutez 2 ml d’une
technétium-99m ou à l’aide d’un instrument étalonné au solution d’acide sulfurique R à 30 pour cent V/V,
moyen d’une telle préparation. 1 ml d’acide chlorhydrique R, 0,05 ml d’acide
ÉTIQUETAGE thioglycolique R, 0,4 ml d’une solution de laurilsulfate
de sodium R à 20 g/l et 0,1 ml du réactif au dithiol R.
L’étiquette indique : Laissez reposer pendant 30 min. Il se développe une
— si la préparation en contient, la concentration d’étain coloration rose.
exprimée en milligrammes par millilitre,
— que la préparation doit être agitée avant l’emploi. ESSAI
pH (2.2.3). Le pH de la solution à examiner est de 6,0 à 7,0.
O
Pyrophosphate de sodium
01/2009:0129
Solution à examiner. Utilisez 1 ml de la solution à examiner
ou d’une dilution appropriée de celle-ci.
TECHNÉTIUM ( Tc) 99m
Solutions de référence. A partir d’une solution contenant du
(PYROPHOSPHATE D’ÉTAIN ET DE), pyrophosphate de sodium R et du chlorure stanneux R dans
BS

SOLUTION INJECTABLE DE les mêmes proportions que la solution à examiner, préparez


une gamme de dilutions et complétez au même volume final
Stanni pyrophosphatis et technetii ( Tc) avec de l’eau R.
99m
A la solution à examiner et à 1 ml de chaque solution de
solutio iniectabilis référence, ajoutez successivement 10 ml d’une solution
DÉFINITION de phosphate disodique R à 1 g/l, 10 ml de solution à
8 ppm de fer (Fe) R, 5 ml d’acide acétique glacial R et
La solution injectable de pyrophosphate d’étain et de 5 ml d’une solution de chlorhydrate d’hydroxylamine R à
technétium (99mTc) est une solution stérile qui peut être 1 g/l. Complétez chaque solution à 40 ml avec de l’eau R.
O

préparée à partir de la solution injectable de pertechnétate Chauffez au bain-marie à 40 °C pendant 1 h. A chaque


(99mTc) de sodium obtenu ou non par fission et de solutions solution, ajoutez 4 ml d’une solution de chlorhydrate de
de pyrophosphate de sodium et de chlorure d’étain. La phénanthroline R à 1 g/l et complétez à 50,0 ml avec de
solution contient au minimum 90,0 pour cent et au maximum l’eau R. Mesurez l’absorbance (2.2.25) de chaque solution
110,0 pour cent de la radioactivité due au technétium-99m à 515 nm en utilisant comme liquide de compensation un
indiquée à la date et à l’heure figurant sur l’étiquette. blanc réactif contenant, au lieu de la solution à 8 ppm de
90 pour cent au minimum de la radioactivité est due au fer (Fe) R, de l’acide chlorhydrique à 1,1 g/l en HCl. A
technétium-99m qui se trouve sous la forme d’un complexe partir des absorbances obtenues avec chaque solution de
de pyrophosphate d’étain et de technétium-99m. La solution référence, construisez la courbe d’étalonnage et calculez la
contient une concentration variable de pyrophosphate concentration en pyrophosphate de sodium de la solution à
de sodium (Na4P2O7,10H2O) allant de 1 mg à 50 mg par examiner.
millilitre. Il contient une concentration variable d’étain (Sn)
ne dépassant pas 3,0 mg par millilitre. Etain
La solution est préparée à partir de la solution injectable de Solution à examiner. Utilisez 1 ml de la solution à examiner
99m
pertechnétate ( Tc) de sodium, obtenu ou non par fission, ou d’une dilution appropriée de celle-ci.
à l’aide de réactifs stériles, compte tenu des proportions Solutions de référence. A partir d’une solution d’acide
d’impuretés radionucléidiques par rapport à la date et à chlorhydrique à 6,2 g/l en HCl contenant du pyrophosphate
l’heure de l’administration. de sodium R et du chlorure stanneux R dans les mêmes

4274 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 (99mTc) (Sulfure de rhénium colloïdal et de), solution injectable de

proportions que la solution à examiner, préparez une gamme — la concentration de pyrophosphate de sodium exprimée
de dilutions et complétez au même volume final avec de en milligrammes par millilitre,
l’acide chlorhydrique à 6,2 g/l en HCl. — la concentration d’étain exprimée en milligrammes par
A la solution à examiner et à 1 ml de chaque solution de millilitre.
référence, ajoutez 2 ml d’une solution d’acide sulfurique R
à 300 g/l, 1 ml d’acide chlorhydrique R, 0,05 ml d’acide
thioglycolique R, 0,4 ml d’une solution de laurilsulfate de 01/2009:0126
sodium R à 20 g/l, 0,1 ml de réactif au dithiol R et complétez
à 15 ml avec de l’acide chlorhydrique à 6,2 g/l en HCl. Laissez TECHNÉTIUM (99mTc) (SULFURE
reposer les solutions pendant 30 min. Mesurez l’absorbance
(2.2.25) de chaque solution à 530 nm en utilisant comme DE RHÉNIUM COLLOÏDAL ET DE),
liquide de compensation un blanc réactif contenant la même SOLUTION INJECTABLE DE
proportion de pyrophosphate de sodium R que la solution à
examiner. A partir des absorbances obtenues avec chaque
solution de référence, construisez la courbe d’étalonnage et
Rhenii sulfidi colloidalis et technetii (99mTc)
calculez la concentration en étain de la solution à examiner. solutio iniectabilis
Stérilité. La solution à examiner satisfait à l’essai de

TE
DÉFINITION
stérilité prescrit dans la monographie Préparations (99mTc) (Sulfure de rhénium colloïdal et de), solution
radiopharmaceutiques (0125). Elle peut être libérée avant injectable de
la fin de l’essai.
La solution injectable de sulfure de rhénium colloïdal et
Endotoxines bactériennes (2.6.14) : moins de 175/V UI/ml, de technétium (99mTc) est une dispersion colloïdale stérile
V étant la dose maximale recommandée en millilitres. de sulfure de rhénium dont les micelles sont marquées
au technétium-99m. Elle est stabilisée par addition de
PURETÉ RADIOCHIMIQUE gélatine. La solution contient au minimum 90,0 pour cent
(a) Opérez par chromatographie sur couche mince (2.2.27) et au maximum 110,0 pour cent de la radioactivité due au
en utilisant une feuille de fibre de verre recouverte d’une

phase mobile de migrer sur une distance de 10 cm à 15 cm
en 10 min environ.
technétium-99m indiquée à la date et à l’heure figurant sur
couche de gel de silice. Chauffez la plaque à 110 °C pendant l’étiquette. 92 pour cent au minimum de la radioactivité
10 min. La plaque utilisée doit être telle qu’elle permette à la est due au technétium-99m qui se trouve sous forme
colloïdale. Le pH de la solution peut être ajusté par addition
d’un tampon approprié tel que la solution tampon citrate.
Déposez sur la plaque 5 μl à 10 μl de la solution à examiner Suivant le procédé de fabrication, la solution contient une
et faites sécher dans un courant d’azote. Développez sur un concentration variable de sulfure de rhénium colloïdal ne
parcours de 10 cm à 15 cm avec de la méthyléthylcétone R. dépassant pas 0,22 mg de rhénium (Re) par millilitre.
Immédiatement avant l’utilisation de ce réactif, faites La solution est préparée à partir de la solution injectable de
O
passer dans la méthyléthylcétone placée dans la chambre pertechnétate (99mTc) de sodium, obtenu ou non par fission,
à chromatographie un courant d’azote pendant 10 min. à l’aide de réactifs appropriés, stériles, compte tenu des
Laissez sécher la plaque. Déterminez la répartition de la proportions d’impuretés radionucléidiques par rapport à la
radioactivité à l’aide d’un détecteur approprié. Le complexe date et à l’heure de l’administration.
pyrophosphate d’étain et de technétium-99m reste au point
de départ ; l’ion pertechnétate migre avec un RF de 0,95 à 1,0. CARACTÈRES
BS

(b) Opérez par chromatographie sur couche mince (2.2.27) Liquide brun clair.
en utilisant une feuille de fibre de verre recouverte de gel Le technétium-99m a une période de 6,02 h et émet des
de silice. Chauffez la plaque à 110 °C pendant 10 min. La rayonnements gamma.
plaque utilisée doit être telle qu’elle permette à la phase
IDENTIFICATION
mobile de migrer sur une distance de 10 cm à 15 cm en
10 min environ. A. Enregistrez le spectre du rayonnement gamma à l’aide
d’un appareil approprié et comparez avec le spectre
Déposez sur la plaque 5 μl à 10 μl de la solution à examiner. d’une préparation étalon de technétium-99m ou à
Développez immédiatement sur un parcours de 10 cm à l’aide d’un appareil étalonné au moyen d’une telle
15 cm avec une solution d’acétate de sodium R à 136 g/l. solution. Les préparations étalons de technétium-99m
O

Laissez sécher la plaque. Déterminez la répartition de et de molybdène-99 peuvent être obtenues auprès
la radioactivité à l’aide d’un détecteur approprié. Les de laboratoires officiellement désignés par l’Autorité
impuretés sous forme colloïdale restent au point de départ ; compétente. Le spectre de la solution à examiner ne
le complexe pyrophosphate d’étain et technétium-99m et diffère pas d’une manière significative de celui de la
l’ion pertechnétate migrent avec un RF de 0,9 à 1,0. préparation étalon. L’énergie du photon gamma principal
La somme des pourcentages de la radioactivité due aux du technétium-99m est de 0,140 MeV.
impuretés dans les chromatogrammes obtenus dans les B. Examinez le chromatogramme obtenu dans l’essai de
essais (a) et (b) n’est pas supérieure à 10 pour cent. pureté radiochimique. La répartition de la radioactivité
contribue à l’identification de la préparation.
RADIOACTIVITÉ
C. A 1 ml de la solution à examiner, ajoutez 5 ml d’acide
Mesurez la radioactivité à l’aide d’un compteur approprié chlorhydrique R, 5 ml d’une solution de thiourée R à
et comparez-la à celle d’une préparation étalon de 50 g/l et 1 ml d’une solution de chlorure stanneux R à
technétium-99m ou à l’aide d’un appareil étalonné au moyen 200 g/l dans l’acide chlorhydrique R. Il se développe
d’une telle solution. une coloration jaune.
ÉTIQUETAGE ESSAI
L’étiquette indique : pH (2.2.3). Le pH de la solution à examiner est de 4,0 à 7,0.

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4275
Tétra-O-acétyl-mannose (triflate de) pour prép. radiopharm. PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

Rhénium RADIOACTIVITÉ
Mesurez la radioactivité à l’aide d’un compteur approprié
Solution à examiner. Utilisez 1 ml de la solution à examiner. et comparez-la à celle d’une préparation étalon de
technétium-99m ou à l’aide d’un appareil étalonné au moyen
Solutions de référence. A partir d’une solution contenant d’une telle solution.
100 μg de perrhénate de potassium R [correspondant
à 60 ppm de rhénium (Re)] et 240 μg de thiosulfate de ÉTIQUETAGE
sodium R par millilitre, préparez une gamme de dilutions et L’étiquette indique la concentration de rhénium exprimée en
complétez au même volume final avec de l’eau R. milligrammes par millilitre.
A la solution à examiner et à 1 ml de chaque solution de
référence, ajoutez 5 ml d’acide chlorhydrique R, 5 ml d’une
solution de thiourée R à 50 g/l et 1 ml d’une solution de 01/2009:2294
chlorure stanneux R à 200 g/l dans l’acide chlorhydrique R,
puis complétez à 25,0 ml avec de l’eau R. Laissez reposer
pendant 40 min. Mesurez l’absorbance (2.2.25) de chaque
TÉTRA-O-ACÉTYL-MANNOSE
solution à 400 nm en utilisant un blanc réactif comme (TRIFLATE DE) POUR PRÉPARATIONS

TE
liquide de compensation. A partir des absorbances obtenues RADIOPHARMACEUTIQUES
avec chaque solution de référence, construisez la courbe
d’étalonnage et calculez la concentration en rhénium de la
solution à examiner. Tetra-O-acetylmannosi triflas
Distribution physiologique. Injectez dans une veine caudale ad radiopharmaceutica
de 3 souris, pesant chacune de 20 g à 25 g, 0,2 ml au plus
de la solution à examiner. Euthanasiez les animaux 20 min
après l’injection. Prélevez le foie, la rate et les poumons.
Mesurez la radioactivité de ces organes à l’aide d’un appareil

approprié. Mesurez la radioactivité du reste du corps de
chaque animal après avoir prélevé la queue. Déterminez
le pourcentage de radioactivité dans le foie, la rate et les
poumons à l’aide de l’expression suivante :

C15H19F3O12S Mr 480,4
A = radioactivité de l’organe considéré, DÉFINITION
O
B = radioactivité totale du foie, de la rate, des 1,3,4,6-Tétra-O-acétyl-2-O-trifluorométhanesulfonyl-β-D-
poumons et du reste du corps de l’animal. mannopyranose.
Teneur : 97,0 pour cent à 102,0 pour cent (substance
Dans chaque souris, 80 pour cent au moins de la radioactivité desséchée).
se trouvent dans le foie et dans la rate et 5 pour cent au plus
BS

dans les poumons. Si, dans une seule souris, la distribution CARACTÈRES
de la radioactivité n’est pas conforme, répétez l’essai sur Aspect : poudre cristalline, blanche ou sensiblement blanche,
3 autres souris. La solution à examiner satistait à l’essai si la hygroscopique.
distribution de la radioactivité correspond aux proportions
prescrites ci-dessus dans 5 des 6 souris utilisées. La solution Solubilité : pratiquement insoluble dans l’eau, très soluble
peut être débitée avant la fin de l’essai. dans l’acétonitrile, facilement soluble dans le chlorure de
méthylène, peu soluble dans l’éthanol à 96 pour cent.
Stérilité. La solution à examiner satisfait à l’essai de
stérilité prescrit dans la monographie Préparations IDENTIFICATION
radiopharmaceutiques (0125). Elle peut être libérée avant Spectrophotométrie d’absorption dans l’infrarouge (2.2.24).
la fin de l’essai.
O

Comparaison : triflate de tétra-O-acétyl-mannose SCR.


Endotoxines bactériennes (2.6.14) : moins de 175/V UI/ml,
V étant la dose maximale recommandée en millilitres. ESSAI
Pouvoir rotatoire spécifique (2.2.7) : − 18,0 à − 22,0
PURETÉ RADIOCHIMIQUE (substance desséchée), mesuré à 25 °C .
Opérez par chromatographie ascendante sur papier (2.2.26). Dissolvez 40,0 mg de substance à examiner dans du chlorure
Déposez sur le papier 10 μl de la solution à examiner. de méthylène R et complétez à 10,0 ml avec le même solvant.
Développez immédiatement sur un parcours de 10 cm Point de fusion (2.2.14) : 117 °C à 122 °C.
à 15 cm avec une solution de chlorure de sodium R à Substances apparentées. Chromatographie liquide (2.2.29).
9 g/l. Laissez sécher le papier. Déterminez la répartition Préparez les solutions extemporanément.
de la radioactivité à l’aide d’un détecteur approprié. Le
technétium-99m sous forme colloïdale reste sur le point Solution à examiner. Dissolvez 10,0 mg de substance à
de départ ; l’ion pertechnétate migre avec un RF voisin de examiner dans de l’acétonitrile R et complétez à 5,0 ml avec
0,6. Il peut apparaître d’autres impuretés d’un RF voisin le même solvant.
de 0,8 à 0,9. La radioactivité due au technétium-99m sous Solution témoin (a). Dissolvez 10,0 mg de triflate de
forme colloïdale représente au moins 92 pour cent de la tétra-O-acétyl-mannose SCR dans de l’acétonitrile R et
radioactivité totale du chromatogramme. complétez à 5,0 ml avec le même solvant.

4276 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 Tétra-O-acétyl-mannose (triflate de) pour prép. radiopharm.

Solution témoin (b). Prélevez 1,0 ml de solution à examiner Solution témoin (a). Dissolvez 10,0 mg de triflate de
et complétez à 10,0 ml avec de l’acétonitrile R. Prélevez tétra-O-acétyl-mannose SCR dans de l’acétonitrile
1,0 ml de cette solution et complétez à 100,0 ml avec de deutérié R et complétez à 5,0 ml avec le même solvant.
l’acétonitrile R. Solution témoin (b). Dissolvez 2,0 mg de
Solution témoin (c). Dissolvez 10 mg de trifluorométhanesulfonate de lithium R (sel de
1,3,4,6-tétra-O-acétyl-β-D-mannopyranose R (impureté A) lithium de l’impureté B) dans de l’acétonitrile deutérié R et
dans 5 ml d’acétonitrile R. Mélangez 1 ml de cette solution complétez à 5,0 ml avec le même solvant.
et 1 ml de solution témoin (a). Solution témoin (c). Mélangez 1,0 ml de solution témoin (a)
Colonne : et 10 μl de solution témoin (b).
— dimensions : l = 0,25 m, Ø = 4,0 mm, Limite : la surface du pic identifié dans le spectre obtenu
— phase stationnaire : gel de silice octadécylsilylé pour avec la solution à examiner à − 78 ppm est inférieure à
chromatographie R (5 μm), celle du pic identifié dans le spectre obtenu avec la solution
témoin (c) pour un même déplacement chimique (0,2 pour
— température : 25 °C. cent).
Phase mobile : Perte à la dessiccation : au maximum 0,6 pour cent,
— phase mobile A : eau R, déterminé par thermogravimétrie (2.2.34) sur 25 mg de

TE
— phase mobile B : acétonitrile R1, substance à examiner. Chauffez jusqu’à 80 °C, en élevant la
température de 2,5 °C/min.
Intervalle Phase mobile A Phase mobile B
(min) (pour cent V/V) (pour cent V/V) DOSAGE
0-1 80 20 Chromatographie liquide (2.2.29) selon les indications de
1 - 20 80 → 55 20 → 45 l’essai des substances apparentées, avec la modification
suivante.
20 - 35 55 45
Injection : solution à examiner et solution témoin (a).
35 - 45 55 → 0 45 → 100 Calculez la teneur pour cent en C15H19F3O12S en
45 - 50

Débit : 1 ml/min.
0

Détection : spectrophotomètre à 220 nm.


LÈ 100

Injection : 20 μl de solution à examiner et des solutions


tenant compte de la teneur déclarée du triflate de
tétra-O-acétyl-mannose SCR.
CONSERVATION
A une température de 2 °C à 8 °C, en récipient étanche, à
l’abri de la lumière.
témoins (b) et (c).
Rétention relative par rapport au triflate de ÉTIQUETAGE
tétra-O-acétyl-mannose (temps de rétention = environ L’étiquette recommande de contrôler la substance dans un
29 min) : impureté A = environ 0,2. essai de production avant de l’utiliser pour la fabrication
O
Conformité du système : solution témoin (c) : de préparations radiopharmaceutiques. Ceci permet
de s’assurer que, dans des conditions de production
— résolution : au minimum 5,0 entre les pics dus au triflate
spécifiées, la substance permet de produire une préparation
de tétra-O-acétyl-mannose et à l’impureté A.
radiopharmaceutique de qualité spécifiée et en quantité
Limites : souhaitée.
BS

— impureté A : au maximum 2 fois la surface du pic principal


du chromatogramme obtenu avec la solution témoin (b) IMPURETÉS
(0,2 pour cent), Impuretés spécifiées : A, B.
— toute autre impureté : pour chaque impureté, au
maximum la surface du pic principal du chromatogramme
obtenu avec la solution témoin (b) (0,1 pour cent),
— total : au maximum 5 fois la surface du pic principal du
chromatogramme obtenu avec la solution témoin (b)
(0,5 pour cent),
O

— limite d’exclusion : 0,5 fois la surface du pic principal


du chromatogramme obtenu avec la solution témoin (b)
(0,05 pour cent).
Impureté B. Spectrométrie de résonance magnétique A. 1,3,4,6-tétra-O-acétyl-β-D-mannopyranose,
nucléaire (2.2.33), en utilisant la RMN 19F. Préparez les
solutions extemporanément.
Solution à examiner. Dissolvez 10,0 mg de substance à
examiner dans de l’acétonitrile deutérié R et complétez à
5,0 ml avec le même solvant. B. acide trifluorométhanesulfonique.

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4277
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

TE

O
BS
O

4278 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

A
Acémétacine.. ............................................................................ 4281 Amidon de riz.. .........................................................................4297
N-Acétyltryptophane................................................................4282 Amidon prégélatinisé.. ............................................................4297
Adénosine.. ................................................................................4284 Amiodarone (chlorhydrate d’).. .............................................4298
Agar-agar....................................................................................4286 Amitriptyline (chlorhydrate d’).. ...........................................4299
Air médicinal.. ...........................................................................4286 Amphotéricine B.. .................................................................... 4301
Alginique (acide).. ....................................................................4288 Aprotinine..................................................................................4303
Almagate.. ..................................................................................4289 Aprotinine (solution concentrée d’).....................................4306
Aluminium (oxyde d’) hydraté............................................... 4291 Arnica (fleur d’).. ......................................................................4309
Aluminium (phosphate d’), gel de.. ...................................... 4291 Arnica (teinture d’).. ................................................................ 4311
Aluminium (silicate d’) et de magnésium.. .........................4292 Artichaut (feuille d’), extrait sec de...................................... 4312
Aluminium (silicate d’) et de sodium...................................4293 Ascorbate sodique.................................................................... 4313
Amidon de blé...........................................................................4294 Ascorbique (acide).. ................................................................. 4315

TE
Amidon de maïs........................................................................4295 Atropine.. ................................................................................... 4316
Amidon de pois.........................................................................4296 Atropine (sulfate d’)................................................................. 4318
Amidon de pomme de terre.. .................................................4296 Azithromycine...........................................................................4320


O
BS
O

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4279
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

TE

O
BS
O

4280 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 Acémétacine

04/2008:1686 — phase stationnaire : gel de silice octadécylsilylé


corrigé 6.3 postgreffé pour chromatographie R à particules
sphériques (5 μm),
ACÉMÉTACINE — température : 40 °C.
Phase mobile :
Acemetacinum — phase mobile A : dissolvez 1,0 g de phosphate
monopotassique R dans 900 ml d’eau R, ajustez à pH 6,5
avec de l’hydroxyde de sodium 1 M et complétez à
1000 ml avec de l’eau R,
— phase mobile B : acétonitrile pour chromatographie R,
Intervalle Phase mobile A Phase mobile B
(min) (pour cent V/V) (pour cent V/V)
0-5 95 5
5-9 95 → 65 5 → 35
C21H18ClNO6 Mr 415,8
9 - 16 65 35

TE
[53164-05-9]
16 - 28 65 → 20 35 → 80
DÉFINITION
28 - 34 20 80
Acide [[[1-(4-chlorobenzoyl)-5-méthoxy-2-méthyl-1H-indol-3-
yl]acétyl]oxy]acétique. Débit : 1,0 ml/min.
Teneur : 99,0 pour cent à 101,0 pour cent (substance Détection : spectrophotomètre à 235 nm.
desséchée).
Injection : 20 μl.
CARACTÈRES Identification des impuretés :
Aspect : poudre cristalline, jaune ou jaune-vert.
LÈ — utilisez le chromatogramme fourni avec le mélange
Solubilité : pratiquement insoluble dans l’eau, soluble dans d’impuretés d’acémétacine SCR et le chromatogramme
l’acétone, peu soluble dans l’éthanol anhydre. obtenu avec la solution témoin (e) pour identifier les pics
L’acémétacine présente le phénomène du polymorphisme dus aux impuretés C, D, E et F,
(5.9). — utilisez le chromatogramme obtenu avec la solution
témoin (b) pour identifier le pic dû à l’impureté B.
IDENTIFICATION
Rétention relative par rapport à l’acémétacine (temps de
Spectrophotométrie d’absorption dans l’infrarouge (2.2.24). rétention = environ 15 min) : impureté A = environ 0,7 ;
Comparaison : acémétacine SCR. impureté B = environ 0,9 ; impureté F = environ 1,2 ;
O
Si les spectres obtenus à l’état solide présentent des impureté C = environ 1,3 ; impureté D = environ 1,5 ;
différences, dissolvez séparément la substance à examiner impureté E = environ 2,2.
et la substance de référence dans de l’acétone R, évaporez Conformité du système : solution témoin (d) :
à siccité et enregistrez de nouveaux spectres à partir des
résidus. — rapport pic/vallée : au minimum 15, avec Hp = hauteur
au-dessus de la ligne de base du pic dû à l’impureté B et
BS

ESSAI Hv = hauteur au-dessus de la ligne de base du point le


plus bas du tracé entre ce pic et celui dû à l’acémétacine.
Substances apparentées. Chromatographie liquide (2.2.29).
Solution à examiner. Dissolvez 0,100 g d’acémétacine dans Limites :
de l’acétonitrile pour chromatographie R et complétez à — facteurs de correction : pour le calcul des teneurs,
20,0 ml avec le même solvant. multipliez la surface du pic des impuretés suivantes par le
Solution témoin (a). Prélevez 5,0 ml de solution à facteur de correction correspondant : impureté C = 1,3 ;
examiner et complétez à 50,0 ml avec de l’acétonitrile impureté D = 1,4 ; impureté F = 1,3 ;
pour chromatographie R. Prélevez 1,0 ml de cette solution — impureté E : au maximum 3 fois la surface du pic principal
et complétez à 100,0 ml avec de l’acétonitrile pour du chromatogramme obtenu avec la solution témoin (a)
O

chromatographie R. (0,3 pour cent) ;


Solution témoin (b). Dissolvez 5,0 mg d’impureté A — impureté B : au maximum la surface du pic correspondant
d’acémétacine SCR et 10,0 mg d’indométacine SCR dans le chromatogramme obtenu avec la solution
(impureté B) dans de l’acétonitrile pour chromatographie R témoin (c) (0,2 pour cent) ;
et complétez à 50,0 ml avec le même solvant. — impureté A : au maximum la surface du pic correspondant
Solution témoin (c). Prélevez 1,0 ml de solution témoin (b) dans le chromatogramme obtenu avec la solution
et complétez à 20,0 ml avec de l’acétonitrile pour témoin (c) (0,1 pour cent) ;
chromatographie R. — impuretés C, D, F : pour chaque impureté, au maximum
Solution témoin (d). A 1 ml de solution témoin (b), ajoutez la surface du pic principal du chromatogramme obtenu
10 ml de solution à examiner et complétez à 20 ml avec de avec la solution témoin (a) (0,1 pour cent) ;
l’acétonitrile pour chromatographie R. — impuretés non spécifiées : pour chaque impureté, au
Solution témoin (e). Dissolvez le contenu d’un flacon de maximum la surface du pic principal du chromatogramme
mélange d’impuretés d’acémétacine SCR (contenant les obtenu avec la solution témoin (a) (0,10 pour cent) ;
impuretés C, D, E et F) dans 1,0 ml de solution à examiner.
— total : au maximum 4 fois la surface du pic principal du
Colonne : chromatogramme obtenu avec la solution témoin (a)
— dimensions : l = 0,25 m, Ø = 4 mm, (0,4 pour cent) ;

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4281
N-Acétyltryptophane PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

— limite d’exclusion : 0,5 fois la surface du pic principal D. R1 = H, R2 = C(CH3)3, R3 = CH2-CO2H : acide
du chromatogramme obtenu avec la solution témoin (a) [[[1-(4-chlorobenzoyl)-6-(1,1-diméthyléthyl)-5-méthoxy-2-
(0,05 pour cent). méthyl-1H-indol-3-yl]acétyl]oxy]acétique,
Métaux lourds : au maximum 20 ppm. E. R1 = R2 = H, R3 = CH2-CO-O-C(CH3)3 : [[[1-(4-
Mélange de solvants : méthanol R, acétone R (10:90 V/V). chlorobenzoyl)-5-méthoxy-2-méthyl-1H-indol-3-
Solution à examiner. Dissolvez 0,250 g d’acémétacine dans yl]acétyl]oxy]acétate de 1,1-diméthyléthyle,
20 ml de mélange de solvants. F. R1 = R2 = H, R3 = CH2-CO-O-CH2-CO2H : acide
Solution témoin. Prélevez 0,5 ml de solution à 10 ppm [[[[[1-(4-chlorobenzoyl)-5-méthoxy-2-méthyl-1H-indol-3-
de plomb (Pb) R et complétez à 20 ml avec le mélange de yl]acétyl]oxy]acétyl]oxy]acétique.
solvants.
Solution à blanc : 20 ml de mélange de solvants. 01/2009:1383
Solution de contrôle. Dissolvez 0,250 g d’acémétacine dans
0,5 ml de solution à 10 ppm de plomb (Pb) R et complétez à N-ACÉTYLTRYPTOPHANE
20 ml avec le mélange de solvants.
A chaque solution, ajoutez 2 ml de solution tampon
N-Acetyltryptophanum

TE
pH 3,5 R. Mélangez et ajoutez à 1,2 ml de réactif au
thioacétamide R puis mélangez immédiatement. Filtrez les
solutions sur un filtre à membrane (diamètre nominal des
pores 0,45 μm) (2.4.8). Comparez les taches obtenues sur les
filtres avec les différentes solutions. L’essai n’est valable que
si la solution témoin montre une légère coloration brune
comparée à la solution à blanc. La substance à examiner
satisfait à l’essai si la coloration brune de la tache résultant C13H14N2O3 Mr 246,3
de la solution à examiner n’est pas plus intense que la tache [87-32-1]
résultant de la solution témoin. LÈ
Perte à la dessiccation (2.2.32) : au maximum 0,5 pour cent, DÉFINITION
déterminé à l’étuve à 105 °C sur 1,000 g d’acémétacine. Acide (RS)-2-acétylamino-3-(1H-indol-3-yl)propanoïque.
Cendres sulfuriques (2.4.14) : au maximum 0,1 pour cent, Teneur : 99,0 pour cent à 101,0 pour cent (substance
déterminé sur 1,0 g d’acémétacine. desséchée).

DOSAGE PRODUCTION
Le tryptophane utilisé pour la production du
Dissolvez 0,350 g d’acémétacine dans 20 ml d’acétone R N-acétyltryptophane satisfait à l’essai de l’impureté A
et ajoutez 10 ml d’eau R. Titrez par l’hydroxyde de
O
et autres substances apparentées de la monographie
sodium 0,1 M. Déterminez le point de fin de titrage par Tryptophane (1272).
potentiométrie (2.2.20).
1 ml d’hydroxyde de sodium 0,1 M correspond à 41,58 mg CARACTÈRES
de C21H18ClNO6. Aspect : poudre cristalline, blanche ou sensiblement blanche,
ou cristaux incolores.
BS

CONSERVATION Solubilité : peu soluble dans l’eau, très soluble dans


A l’abri de la lumière. l’éthanol à 96 pour cent. Le N-acétyltryptophane se dissout
dans les solutions diluées d’hydroxydes alcalins.
IMPURETÉS
F : environ 205 °C.
Impuretés spécifiées : A, B, C, D, E, F.
IDENTIFICATION
Première identification : A, B.
Seconde identification : A, C, D, E.
A. Angle de rotation optique (voir Essai).
O

B. Spectrophotométrie d’absorption dans l’infrarouge


(2.2.24).
A. acide 4-chlorobenzoïque, Comparaison : N-acétyltryptophane SCR.
C. Chromatographie sur couche mince (2.2.27).
Solution à examiner. Dissolvez 50 mg de
N-acétyltryptophane dans 0,2 ml d’ammoniaque
concentrée R et complétez à 10 ml avec de l’eau R.
Solution témoin (a). Dissolvez 50 mg de
N-acétyltryptophane SCR dans 0,2 ml d’ammoniaque
concentrée R et complétez à 10 ml avec de l’eau R.
Solution témoin (b). Dissolvez 10 mg de tryptophane R
dans la solution à examiner et complétez à 2 ml avec la
B. R1 = R2 = R3 = H : indométacine, solution à examiner.
C. R1 = Cl, R2 = H, R3 = CH2-CO2H : acide Plaque : plaque au gel de silice F254 pour CCM R.
[[[1-(3,4-dichlorobenzoyl)-5-méthoxy-2-méthyl-1H- Phase mobile : acide acétique glacial R, eau R, butanol R
indol-3-yl]acétyl]oxy]acétique, (25:25:50 V/V/V).

4282 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 N-Acétyltryptophane

Dépôt : 2 μl. Intervalle Phase mobile A Phase mobile B


Développement : sur un parcours de 10 cm. (min) (pour cent V/V) (pour cent V/V)
0 - 10 100 0
Séchage : à l’étuve à 100-105 °C pendant 15 min.
10 - 45 100 → 0 0 → 100
Détection : examinez en lumière ultraviolette à 254 nm.
45 - 65 0 100
Conformité du système : solution témoin (b) :
65 - 66 0 → 100 100 → 0
— le chromatogramme présente 2 taches nettement
séparées. 66 - 80 100 0
Résultats : la tache principale du chromatogramme Débit : 0,7 ml/min.
obtenu avec la solution à examiner est semblable quant
à sa position et ses dimensions à la tache principale du Détection : spectrophotomètre à 220 nm.
chromatogramme obtenu avec la solution témoin (a). Injection : 20 μl de solution à examiner et des solutions
témoins (a) et (c).
D. Dissolvez environ 2 mg de N-acétyltryptophane
dans 2 ml d’eau R. Ajoutez 2 ml de solution de Temps de rétention : N-acétyltryptophane = environ 29 min ;
diméthylaminobenzaldéhyde R6. Chauffez au 1,1′-éthylidènebis(tryptophane) = environ 34 min.
bain-marie. Il se développe une coloration bleue ou Conformité du système : solution témoin (c) :

TE
bleu-vert. — résolution : au minimum 8,0 entre les pics dus au
E. Le N-acétyltryptophane donne la réaction de l’acétyle N-acétyltryptophane et au 1,1′-éthylidènebistryptophane ;
(2.3.1). Procédez comme décrit pour les substances si nécessaire, ajustez la durée de l’élution (une
difficilement hydrolysables. augmentation de la durée d’élution avec la phase mobile A
allonge les temps de rétention et conduit à une meilleure
ESSAI résolution).
Aspect de la solution. La solution est limpide (2.2.1) et n’est — facteur de symétrie : au maximum 3,5 pour le pic dû au
pas plus fortement colorée que la solution témoin J7 ou JV7 1,1′-éthylidènebistryptophane dans le chromatogramme
(2.2.2, Procédé II). LÈ obtenu avec la solution témoin (c).
Dissolvez 1,0 g de N-acétyltryptophane dans une solution Limites :
d’hydroxyde de sodium R à 40 g/l et complétez à 100 ml — impuretés A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L : pour chaque
avec la même solution alcaline. impureté, au maximum 0,25 fois la surface du pic principal
du chromatogramme obtenu avec la solution témoin (a)
Angle de rotation optique (2.2.7) : − 0,1° à + 0,1°. (0,25 pour cent),
Dissolvez 2,50 g de N-acétyltryptophane dans une solution — total : au maximum 0,5 fois la surface du pic principal
d’hydroxyde de sodium R à 40 g/l et complétez à 25,0 ml du chromatogramme obtenu avec la solution témoin (a)
avec la même solution alcaline. (0,5 pour cent),
O
Substances apparentées. Chromatographie liquide (2.2.29). — limite d’exclusion : 0,01 fois la surface du pic principal
Préparez la solution à examiner et les solutions témoins du chromatogramme obtenu avec la solution témoin (a)
extemporanément. (0,01 pour cent).
Solution tampon pH 2,3. Dissolvez 3,90 g de phosphate Ammonium (2.4.1, Procédé B) : au maximum 200 ppm,
monosodique R dans 1000 ml d’eau R. Ajoutez environ déterminé sur 0,10 g de N-acétyltryptophane.
700 ml d’une solution d’acide phosphorique R à 2,9 g/l et
BS

Préparez le témoin avec 0,2 ml de solution à 100 ppm


ajustez à pH 2,3 avec la même solution acide. d’ammonium (NH4) R.
Mélange de solvants : acétonitrile R, eau R (10:90 V/V). Fer (2.4.9) : au maximum 10 ppm.
Solution à examiner. Dissolvez 0,10 g de Dissolvez, en chauffant à 50 °C, 1,0 g de N-acétyltryptophane
N-acétyltryptophane dans un mélange de 50 volumes dans 50 ml d’acide chlorhydrique R1. Laissez refroidir.
d’acétonitrile R et de 50 volumes d’eau R, puis complétez à Dans une ampoule à décantation, agitez la solution avec
20,0 ml avec le même mélange de solvants. 3 fois 10 ml de méthylisobutylcétone R1 pendant 3 min
Solution témoin (a). Prélevez 1,0 ml de solution à examiner chaque fois. Agitez les phases organiques réunies avec 10 ml
et complétez à 100,0 ml avec le mélange de solvants. d’eau R pendant 3 min. Examinez la phase aqueuse.
O

Solution témoin (b). Prélevez 4,0 ml de solution témoin (a) Métaux lourds (2.4.8) : au maximum 10 ppm.
et complétez à 100,0 ml avec le mélange de solvants. 2,0 g de N-acétyltryptophane satisfont à l’essai C. Préparez
Solution témoin (c). Dissolvez le contenu d’un flacon de la solution témoin avec 2 ml de solution à 10 ppm de
1,1′-éthylidènebistryptophane SCR dans 1 ml de solution plomb (Pb) R.
témoin (b). Perte à la dessiccation (2.2.32) : au maximum 0,5 pour
Colonne : cent, déterminé à l’étuve à 105 °C sur 1,000 g de
N-acétyltryptophane.
— dimensions : l = 0,25 m, Ø = 4,6 mm,
Cendres sulfuriques (2.4.14) : au maximum 0,1 pour cent,
— phase stationnaire : gel de silice octadécylsilylé pour déterminé sur 1,0 g de N-acétyltryptophane.
chromatographie R (5 μm),
— température : 40 °C. DOSAGE
Dissolvez 0,200 g de N-acétyltryptophane dans 5 ml de
Phase mobile :
méthanol R. Ajoutez 50 ml d’éthanol anhydre R. Titrez par
— phase mobile A : acétonitrile R, solution tampon pH 2,3 l’hydroxyde de sodium 0,1 M. Déterminez le point de fin de
(115:885 V/V), titrage par potentiométrie (2.2.20).
— phase mobile B : acétonitrile R, solution tampon pH 2,3 1 ml d’hydroxyde de sodium 0,1 M correspond à 24,63 mg
(350:650 V/V), de C13H14N2O3.

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4283
Adénosine PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

CONSERVATION
A l’abri de la lumière.
IMPURETÉS
Impuretés spécifiées : A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L.

A. tryptophane,

J. R = CHOH-CH2-OH : acide (S)-2-amino-3-[2-[2,3-dihydroxy-


1-(1H-indol-3-yl)propyl]-1H-indol-3-yl]propanoïque,

K. R = H : acide (S)-2-amino-3-[2-(1H-indol-3-ylméthyl)-1H-
indol-3-yl]propanoïque,
B. acide (S)-2-amino-3-[(3RS)-3-hydroxy-2-oxo-2,3-dihydro-1H-
indol-3-yl]propanoïque (dioxyindolylalanine),

TE
C. R = H : acide (S)-2-amino-4-(2-aminophényl)-4-
oxobutanoïque (kynurénine),

E. R = CHO : acide (S)-2-amino-4-[2-(formylamino)phényl]-4-
oxobutanoïque (N-formylkynurénine),
L. acide 1-(1H-indol-3-ylméthyl)-1,2,3,4-tétrahydro-9H-β-
carboline-3-carboxylique.

01/2009:1486

ADÉNOSINE
O
D. acide (S)-2-amino-3-(5-hydroxy-1H-indol-3-yl)propanoïque Adenosinum
(5-hydroxytryptophane),
BS

F. acide (S)-2-amino-3-(phénylamino)propanoïque
(3-phénylaminoalanine),

C10H13N5O4 Mr 267,2
[58-61-7]
O

DÉFINITION
9-β-D-Ribofuranosyl-9H-purin-6-amine.
G. acide (S)-2-amino-3-(2-hydroxy-1H-indol-3-yl)propanoïque Teneur : 99,0 pour cent à 101,0 pour cent (substance
(2-hydroxytryptophane), desséchée).
CARACTÈRES
Aspect : poudre cristalline, blanche ou sensiblement blanche.
Solubilité : peu soluble dans l’eau, soluble dans l’eau
chaude, pratiquement insoluble dans l’éthanol à 96 pour
cent et dans le chlorure de méthylène. L’adénosine se
dissout dans les acides minéraux dilués.
H. R = H : acide (3RS)-1,2,3,4-tétrahydro-9H-β-carboline-3- F : environ 234 °C.
carboxylique, IDENTIFICATION
I. R = CH3 : acide 1-méthyl-1,2,3,4-tétrahydro-9H-β- Spectrophotométrie d’absorption dans l’infrarouge (2.2.24).
carboline-3-carboxylique, Comparaison : adénosine SCR.

4284 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 Adénosine

ESSAI — impureté G : au maximum la surface du pic principal


Solution S. Mettez en suspension 5,0 g d’adénosine dans du chromatogramme obtenu avec la solution témoin (a)
100 ml d’eau distillée R et chauffez à ébullition. Laissez (0,1 pour cent) ;
refroidir, filtrez sous vide et complétez à 100 ml avec de — impuretés non spécifiées : pour chaque impureté, au
l’eau distillée R. maximum la surface du pic principal du chromatogramme
Aspect de la solution. La solution S est incolore (2.2.2, obtenu avec la solution témoin (a) (0,10 pour cent) ;
Procédé II). — total : au maximum 5 fois la surface du pic principal du
chromatogramme obtenu avec la solution témoin (a)
Acidité ou alcalinité. A 10 ml de solution S, ajoutez 0,1 ml
(0,5 pour cent) ;
de solution de pourpre de bromocrésol R et 0,1 ml d’acide
chlorhydrique 0,01 M. La solution est jaune. Ajoutez 0,4 ml — limite d’exclusion : 0,5 fois la surface du pic principal
d’hydroxyde de sodium 0,01 M. La solution est bleu-violet. du chromatogramme obtenu avec la solution témoin (a)
(0,05 pour cent).
Pouvoir rotatoire spécifique (2.2.7) : − 45 à − 49 (substance
desséchée). Chlorures (2.4.4) : au maximum 100 ppm.
Dissolvez 1,25 g d’adénosine dans de l’acide Prélevez 10 ml de solution S et complétez à 15 ml avec de
chlorhydrique 1 M et complétez à 50,0 ml avec le l’eau R.

TE
même acide. Examinez dans les 10 min qui suivent la mise Sulfates (2.4.13) : au maximum 200 ppm, déterminé avec
en solution. la solution S.
Substances apparentées Ammonium (2.4.1, Procédé B) : au maximum 10 ppm,
déterminé sur 0,5 g d’adénosine.
Chromatographie liquide (2.2.29). Préparez le témoin avec 5 ml de solution à 1 ppm
Mélange de solvants. Dissolvez 6,8 g de sulfate d’ammonium (NH4) R.
monopotassique R et 3,4 g d’hydrogénosulfate de Perte à la dessiccation (2.2.32) : au maximum 0,5 pour cent,
tétrabutylammonium R dans de l’eau R, ajustez à pH 6,5 déterminé à l’étuve à 105 °C sur 1,000 g d’adénosine.
avec une solution d’hydroxyde de potassium R à 60 g/l

et complétez à 1000 ml avec le même solvant. Utilisez un Cendres sulfuriques (2.4.14) : au maximum 0,1 pour cent,
mélange de solvants récemment préparé. déterminé sur 1,0 g d’adénosine.
Solution à examiner. Dissolvez 20 mg d’adénosine dans la DOSAGE
phase mobile et complétez à 20 ml avec la phase mobile.
Dissolvez, en chauffant légèrement si nécessaire, 0,200 g
Solution témoin (a). Prélevez 1,0 ml de solution à examiner d’adénosine dans un mélange de 20 ml d’anhydride
et complétez à 100,0 ml avec la phase mobile. Prélevez 1,0 ml acétique R et de 30 ml d’acide acétique anhydre R. Titrez
de cette solution et complétez à 10,0 ml avec la phase mobile. par l’acide perchlorique 0,1 M. Déterminez le point de fin
Solution témoin (b). Dissolvez 5 mg d’adénine R de titrage par potentiométrie (2.2.20).
O
(impureté A) et 5 mg d’inosine R (impureté G) dans la phase 1 ml d’acide perchlorique 0,1 M correspond à 26,72 mg
mobile et complétez à 50 ml avec la phase mobile. Prélevez de C10H13N5O4.
4 ml de cette solution et complétez à 100 ml avec la phase
mobile. IMPURETÉS
Colonne : Impuretés spécifiées : A, G.
BS

— dimensions : l = 0,25 m, Ø = 4,6 mm, Autres impuretés décelables (si elles sont présentes à
— phase stationnaire : gel de silice octadécylsilylé une teneur suffisante, les substances suivantes seront
postgreffé pour chromatographie R (5 μm). détectées par l’un des essais de la monographie. Elles sont
Phase mobile : eau R, mélange de solvants (40:60 V/V). limitées par le critère général d’acceptation applicable
aux autres impuretés ou impuretés non spécifiées,
Débit : 1,5 ml/min. ou par les dispositions de la monographie générale
Détection : spectrophotomètre à 254 nm. Substances pour usage pharmaceutique (2034). Il n’est
donc pas nécessaire de les identifier pour démontrer la
Injection : 20 μl. conformité de la substance. Voir également chapitre 5.10.
Enregistrement : 1,5 fois le temps de rétention de Contrôle des impuretés dans les substances pour usage
O

l’adénosine. pharmaceutique) : F, H.
Rétention relative par rapport à l’adénosine (temps de
rétention = environ 13 min) : impureté A = environ 0,3 ;
impureté G = environ 0,4. A. adénine,
Conformité du système : solution témoin (b) :
— résolution : au minimum 1,5 entre les pics dus aux
impuretés A et G.
Limites :
— facteurs de correction : pour le calcul des teneurs,
multipliez la surface du pic des impuretés suivantes par le
facteur de correction correspondant : impureté A = 0,6 ;
impureté G = 1,4 ;
— impureté A : au maximum 2 fois la surface du pic principal
du chromatogramme obtenu avec la solution témoin (a)
(0,2 pour cent) ; F. 1-β-D-ribofuranosylpyrimidine-2,4(1H,3H)-dione (uridine),

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4285
Agar-agar PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

solution se gélifie entre 35 °C et 30 °C. Le gel obtenu,


chauffé au bain-marie, ne se liquéfie qu’au-dessus de
80 °C.
ESSAI
Indice de gonflement (2.8.4) : au minimum 10 et dans les
10 pour cent de la valeur indiquée sur l’étiquette, déterminé
sur l’agar-agar pulvérisé (355) (2.9.12).
Matières insolubles : au maximum 1,0 pour cent.
A 5,00 g d’agar-agar pulvérisé (355) (2.9.12), ajoutez 100 ml
d’eau R et 14 ml d’acide chlorhydrique dilué R. Faites
G. R = H : 9-β-D-ribofuranosyl-1,9-dihydro-6H-purin-6-one bouillir doucement pendant 15 min en agitant fréquemment.
(inosine), Filtrez à chaud sur un filtre de verre fritté (160) (2.1.2) taré.
Lavez à l’eau R chaude et desséchez à 100-105 °C. La masse
H. R = NH2 : 2-amino-9-β-D-ribofuranosyl-1,9-dihydro-6H- du résidu est au maximum de 50 mg.
purin-6-one (guanosine).
Gélatine. Chauffez au bain-marie 1,00 g d’agar-agar avec

TE
100 ml d’eau R jusqu’à dissolution. Laissez refroidir à 50 °C.
A 5 ml de cette solution, ajoutez 5 ml de solution d’acide
01/2009:0310 picrique R. Il ne se forme aucun trouble dans les 10 min.
Perte à la dessiccation (2.2.32) : au maximum 20,0 pour
cent, déterminé à l’étuve à 105 °C sur 1,000 g d’agar-agar
AGAR-AGAR pulvérisé (355) (2.9.12).
Cendres totales (2.4.16) : au maximum 5,0 pour cent.
Agar Contamination microbienne
DGAT : critère d’acceptation 103 UFC/g (2.6.12).
DÉFINITION

Polyosides de diverses espèces de Rhodophyceae,
principalement du genre Gelidium. L’agar-agar est extrait
par traitement des algues à l’eau bouillante ; l’extrait est
filtré à chaud, puis concentré et desséché.
DMLT : critère d’acceptation 102 UFC/g (2.6.12).
Absence d’Escherichia coli (2.6.13).
Absence de salmonelles (2.6.13).
ÉTIQUETAGE
CARACTÈRES L’étiquette indique l’indice de gonflement.
Aspect : poudre, rubans chiffonnés d’une largeur de 2-5 mm,
ou parfois flocons, incolores ou jaune pâle, translucides,
O
plutôt résistants et difficiles à rompre, devenant cassants 01/2009:1238
au séchage.
Saveur mucilagineuse. AIR MÉDICINAL
IDENTIFICATION
Aer medicinalis
BS

A. Examinez au microscope en utilisant de l’iode 0,005 M.


L’agar-agar sous forme de bandes ou de flocons se colore DÉFINITION
en partie en violet-brun. Vu sous grossissement (100 ×), Air ambiant comprimé.
il présente les éléments suivants : de nombreux grains
minuscules, incolores, ovoïdes ou arrondis, sur un fond Teneur : 20,4 pour cent V/V à 21,4 pour cent V/V
amorphe et parfois des spores brunes, arrondies ou d’oxygène (O2).
ovoïdes, à surface réticulée, mesurant jusqu’à 60 μm. CARACTÈRES
Réduisez l’agar-agar en poudre, si nécessaire. La poudre
est blanc-jaune. Examinez au microscope en utilisant Aspect : gaz incolore.
de l’iode 0,005 M. La poudre présente des fragments Solubilité : à 20 °C et sous une pression de 101 kPa,
O

anguleux sur lesquels se trouvent de nombreux grains, 1 volume d’air médicinal se dissout dans environ 50 volumes
similaires à ceux qui sont observés dans les rubans et d’eau.
flocons ; la coloration de certains fragments vire au
violet-brun. PRODUCTION
B. Dissolvez en chauffant 0,1 g d’agar-agar dans 50 ml Dioxyde de carbone : au maximum 500 ppm V/V, déterminé
d’eau R. Refroidissez et ajoutez prudemment 3 ml à l’aide d’un analyseur infrarouge (2.5.24).
d’eau R à 1 ml de mucilage de façon à obtenir 2 phases Gaz à examiner. Filtrez l’air médicinal pour éviter les
distinctes. Ajoutez ensuite 0,1 ml d’iode 0,05 M. A la phénomènes optiques parasites.
zone de contact, il apparaît une coloration violet-brun Gaz témoin (a). Utilisez un mélange de 21 pour cent V/V
foncé. Mélangez ; le liquide devient jaune pâle. d’oxygène R et de 79 pour cent V/V d’azote R1, contenant
C. Chauffez au bain-marie 5 ml du mucilage préparé pour moins de 1 ppm V/V de dioxyde de carbone R1.
l’identification B avec 0,5 ml d’acide chlorhydrique R Gaz témoin (b). Utilisez un mélange de 21 pour cent V/V
pendant 30 min. Ajoutez 1 ml de solution de chlorure de d’oxygène R et de 79 pour cent V/V d’azote R1, contenant
baryum R1. Il se forme un trouble blanc dans les 30 min. 500 ppm V/V de dioxyde de carbone R1.
D. Chauffez au bain-marie 0,5 g d’agar-agar avec 50 ml Etalonnez l’appareil et ajustez la sensibilité à l’aide des gaz
d’eau R jusqu’à dissolution. Seuls de rares fragments témoins (a) et (b). Mesurez la teneur en dioxyde de carbone
restent insolubles. Au cours du refroidissement, la dans le gaz à examiner.

4286 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 Air médicinal

Monoxyde de carbone : au maximum 5 ppm V/V, déterminé Monoxyde d’azote et dioxyde d’azote : au maximum
à l’aide d’un analyseur infrarouge (2.5.25). 2 ppm V/V pour la somme, déterminé à l’aide d’un analyseur
Gaz à examiner. Filtrez l’air médicinal pour éviter les à chimiluminescence (2.5.26).
phénomènes optiques parasites. Gaz à examiner. L’air médicinal.
Gaz témoin (a). Utilisez un mélange de 21 pour cent V/V Gaz témoin (a). Utilisez un mélange de 21 pour cent V/V
d’oxygène R et de 79 pour cent V/V d’azote R1, contenant d’oxygène R et de 79 pour cent V/V d’azote R1, contenant
moins de 1 ppm V/V de monoxyde de carbone R. moins de 0,05 ppm V/V de monoxyde d’azote et de dioxyde
d’azote.
Gaz témoin (b). Utilisez un mélange de 21 pour cent V/V Gaz témoin (b). Utilisez un mélange contenant 2 ppm V/V
d’oxygène R et de 79 pour cent V/V d’azote R1, contenant de monoxyde d’azote R dans l’azote R1.
5 ppm V/V de monoxyde de carbone R.
Etalonnez l’appareil et ajustez la sensibilité à l’aide des gaz
Etalonnez l’appareil et ajustez la sensibilité à l’aide des témoins (a) et (b). Mesurez les teneurs en monoxyde d’azote
gaz témoins (a) et (b). Mesurez la teneur en monoxyde de et en dioxyde d’azote dans l’air médicinal.
carbone dans le gaz à examiner. Eau : au maximum 67 ppm V/V, déterminé à l’aide d’un
Dioxyde de soufre : au maximum 1 ppm V/V, déterminé hygromètre électrolytique (2.5.28), sauf si l’Autorité
à l’aide d’un analyseur à fluorescence ultraviolette compétente décide que la limite suivante s’applique à

TE
(figure 1238.-1). l’air médicinal produit sur site et distribué par un réseau
L’appareil comporte : de canalisations sous une pression ne dépassant pas
10 bars et à une température égale ou supérieure à 5 °C :
— un système de génération du rayonnement ultraviolet maximum 870 ppm V/V, déterminé à l’aide d’un hygromètre
d’une longueur d’onde de 210 nm, comprenant une électrolytique (2.5.28).
lampe ultraviolette, un collimateur et un filtre sélectif ; le
Dosage. Déterminez la teneur en oxygène à l’aide d’un
faisceau lumineux est interrompu périodiquement par un
analyseur paramagnétique (2.5.27).
obturateur tournant à grande vitesse ;
— une chambre de réaction, dans laquelle circule le gaz à IDENTIFICATION
examiner ;
LÈ Première identification : C.
— un système de détection du rayonnement émis à la Seconde identification : A, B.
longueur d’onde de 350 nm, constitué par un filtre A. Dans une fiole conique contenant de l’air médicinal,
sélectif, un photomultiplicateur et un amplificateur. placez un copeau de bois incandescent. Le copeau reste
incandescent.
Gaz à examiner. Filtrez l’air médicinal.
B. Utilisez une burette à gaz (figure 1238.-2) de 25 ml,
Gaz témoin (a). Utilisez un mélange de 21 pour cent V/V constituée d’un réservoir dont la partie centrale est
d’oxygène R et de 79 pour cent V/V d’azote R1. formée d’un tube gradué en 0,2 pour cent entre 19,0 pour
Gaz témoin (b). Utilisez un mélange de 21 pour cent V/V cent et 23,0 pour cent et isolée à ses 2 extrémités par
O
d’oxygène R et de 79 pour cent V/V d’azote R1, contenant un robinet à boisseau conique. Le robinet inférieur,
entre 0,5 ppm V/V et 2 ppm V/V de dioxyde de soufre R1. terminé par un ajutage en olive, sert à l’admission du
gaz. Un entonnoir cylindrique, situé au-dessus du robinet
Etalonnez l’appareil et ajustez la sensibilité à l’aide des gaz supérieur, sert à l’introduction de la solution absorbante.
témoins (a) et (b). Mesurez la teneur en dioxyde de soufre Lavez la burette à l’eau R et séchez. Ouvrez les 2 robinets.
dans le gaz à examiner. Reliez l’ajutage à la source d’air médicinal et réglez le
BS

Huile : au maximum 0,1 mg/m3, déterminé à l’aide du tube débit à 1 litre/min. Faites circuler l’air médicinal dans la
détecteur d’huile (2.1.6), lorsque la production est effectuée burette pendant 1 min pour la purger. Fermez le robinet
à l’aide d’un compresseur lubrifié à l’huile. inférieur puis, immédiatement après, le robinet supérieur
O

Figure 1238.-1. – Analyseur à fluorescence UV

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4287
Alginique (acide) PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

de la burette et déconnectez rapidement de la source d’air


médicinal. Faites rapidement tourner le robinet supérieur
d’un demi-tour de façon à éliminer un éventuel excès de
pression. Maintenez la burette en position verticale et
remplissez l’entonnoir avec un mélange extemporané
de 21 ml d’une solution d’hydroxyde de potassium R
à 560 g/l et de 130 ml d’une solution de dithionite
de sodium R à 200 g/l. Ouvrez doucement le robinet
supérieur ; la solution absorbe l’oxygène et s’écoule dans
la burette. Laissez reposer sans agiter pendant 10 min.
Lisez sur l’échelle graduée, en regard du ménisque, le
niveau atteint par la solution, qui indique la concentration
en oxygène de l’air médicinal en pour cent V/V. La valeur
lue est de 20,4 à 21,4.
C. L’air médicinal satisfait aux limites du dosage.

ESSAI

TE
Dioxyde de carbone : au maximum 500 ppm V/V, déterminé
à l’aide du tube détecteur de dioxyde de carbone (2.1.6).
Dioxyde de soufre : au maximum 1 ppm V/V, déterminé à
l’aide du tube détecteur de dioxyde de soufre (2.1.6).
Huile : au maximum 0,1 mg/m3, déterminé à l’aide du tube
détecteur d’huile (2.1.6), lorsque la production est effectuée
à l’aide d’un compresseur lubrifié à l’huile.
Monoxyde d’azote et dioxyde d’azote : au maximum

2 ppm V/V, déterminé à l’aide du tube détecteur de
monoxyde d’azote et de dioxyde d’azote (2.1.6).
Monoxyde de carbone : au maximum 5 ppm V/V, déterminé
à l’aide du tube détecteur de monoxyde de carbone (2.1.6).
Vapeur d’eau : au maximum 67 ppm V/V, déterminé à l’aide
du tube détecteur de vapeur d’eau (2.1.6), sauf si l’Autorité
compétente décide que la limite suivante s’applique à l’air
médicinal produit sur site et distribué par un réseau de
O
canalisations sous une pression ne dépassant pas 10 bars et
à une température égale ou supérieure à 5 °C : maximum
870 ppm, déterminé à l’aide du tube détecteur de vapeur
d’eau (2.1.6).

CONSERVATION
BS

Sous forme de gaz, en récipients appropriés conformes aux


prescriptions légales ou sous forme de gaz distribué par Figure 1238.-2. – Burette à gaz
réseaux de canalisation.

ÉTIQUETAGE
Dans les cas appropriés, l’étiquette indique la méthode de 01/2009:0591
production et l’usage éventuel d’un compresseur lubrifié à
l’huile.
ALGINIQUE (ACIDE)
O

IMPURETÉS
Acidum alginicum
A. dioxyde de carbone,
DÉFINITION
B. dioxyde de soufre, Mélange d’acides polyuroniques [(C6H8O6)n] constitués
par des résidus de l’acide D-mannuronique et de l’acide
C. monoxyde d’azote, L-guluronique, obtenu principalement à partir d’algues
appartenant à la famille des Phéophycées. Une petite
proportion des groupes carboxyle de l’acide alginique peut
D. dioxyde d’azote, être salifiée.
Teneur : 19,0 pour cent à 25,0 pour cent de groupes
E. huile, carboxyle (-CO2H) (substance desséchée).

F. monoxyde de carbone, CARACTÈRES


Aspect : poudre cristalline ou amorphe, blanche ou
G. eau. brun-jaune pâle.

4288 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 Almagate

Solubilité : très peu soluble ou pratiquement insoluble dans non obligatoire de la monographie et il n’est pas nécessaire
l’éthanol à 96 pour cent, pratiquement insoluble dans les de vérifier ces caractéristiques pour démontrer que la
solvants organiques. L’acide alginique gonfle dans l’eau substance satisfait à la monographie. Le contrôle de ces
mais ne s’y dissout pas ; il se dissout dans les solutions caractéristiques peut néanmoins contribuer à la qualité
d’hydroxydes alcalins. du médicament en améliorant la constance du procédé de
fabrication et la performance du médicament au cours de
IDENTIFICATION son utilisation. Lorsque des méthodes de contrôle sont
A. A 0,2 g d’acide alginique, ajoutez 20 ml d’eau R et citées, elles sont reconnues appropriées mais d’autres
0,5 ml de solution de carbonate de sodium R. Agitez méthodes peuvent également être utilisées. Lorsque des
et filtrez. A 5 ml du filtrat, ajoutez 1 ml de solution de résultats sont présentés pour une caractéristique donnée,
chlorure de calcium R. Il se forme une masse gélatineuse la méthode de contrôle doit être mentionnée.
volumineuse. Les caractéristiques suivantes peuvent être pertinentes
B. A 5 ml du filtrat obtenu dans l’identification A, ajoutez pour l’acide alginique utilisé comme désagrégeant et/ou
0,5 ml d’une solution de sulfate de magnésium R liant.
à 123 g/l. Il ne se forme pas de masse gélatineuse Distribution de la taille des particules (2.9.31 ou 2.9.38).
volumineuse.
Volume de sédimentation. Dans une éprouvette graduée de
C. A 5 mg d’acide alginique, ajoutez 5 ml d’eau R, 100 ml, ajoutez à 75 ml d’eau R, 1,5 g d’acide alginique par

TE
1 ml d’une solution récemment préparée de portions de 0,5 g, en agitant vigoureusement après chaque
1,3-dihydroxynaphtalène R à 10 g/l dans l’éthanol à addition. Complétez à 100,0 ml avec de l’eau R, agitez à
96 pour cent R et 5 ml d’acide chlorhydrique R. Faites nouveau jusqu’à répartition homogène de la substance et
bouillir doucement pendant 3 min, refroidissez, ajoutez laissez reposer pendant 4 h. Déterminez le volume du dépôt.
5 ml d’eau R et agitez avec 15 ml d’éther isopropylique R.
Effectuez un essai à blanc. La phase supérieure du La caractéristique suivante peut être pertinente pour
mélange obtenu avec la substance à examiner présente l’acide alginique utilisé comme gélifiant ou viscosifiant.
une coloration rouge-bleu plus intense que celle obtenue Viscosité apparente. Déterminez la viscosité dynamique en
avec l’essai à blanc. LÈ utilisant un viscosimètre rotatif (2.2.10).
Préparez une suspension d’acide alginique à 20 g/l
ESSAI (substance desséchée) et ajoutez de l’hydroxyde de sodium
Chlorures : au maximum 1,0 pour cent. 0,1 M jusqu’à obtention d’une solution.
A 2,50 g d’acide alginique, ajoutez 50 ml d’acide nitrique
dilué R. Agitez pendant 1 h, puis complétez à 100,0 ml 01/2009:2010
avec de l’acide nitrique dilué R. Filtrez. A 50,0 ml du
filtrat, ajoutez 10,0 ml de nitrate d’argent 0,1 M et 5 ml de ALMAGATE
toluène R. Titrez par le thiocyanate d’ammonium 0,1 M
en présence de 2 ml de solution de sulfate ferrique et Almagatum
O
d’ammonium R2 en agitant énergiquement à l’approche du
virage. Al2Mg6C2O20H14,4H2O Mr 630
1 ml de nitrate d’argent 0,1 M correspond à 3,545 mg de Cl. [66827-12-1]
Métaux lourds (2.4.8) : au maximum 20 ppm.
DÉFINITION
1,0 g d’acide alginique satisfait à l’essai F. Préparez
Hydroxycarbonate d’aluminium et de magnésium, hydraté.
BS

la solution témoin avec 2 ml de solution à 10 ppm de


plomb (Pb) R. Teneur :
Perte à la dessiccation (2.2.32) : au maximum 15,0 pour — aluminium : 15,0 pour cent à 17,0 pour cent (calculé
cent, déterminé à l’étuve à 105 °C pendant 4 h sur 0,1000 g en Al2O3),
d’acide alginique. — magnésium : 36,0 pour cent à 40,0 pour cent (calculé
en MgO),
Cendres sulfuriques (2.4.14) : au maximum 8,0 pour
cent (substance desséchée), déterminé sur 0,100 g d’acide — acide carbonique : 12,5 pour cent à 14,5 pour cent
alginique. (calculé en CO2).
Contamination microbienne CARACTÈRES
O

2
DGAT : critère d’acceptation 10 UFC/g (2.6.12). Aspect : poudre cristalline fine, blanche ou sensiblement
Absence d’Escherichia coli (2.6.13). blanche.
Absence de salmonelles (2.6.13). Solubilité : pratiquement insoluble dans l’eau, dans l’éthanol
à 96 pour cent et dans le chlorure de méthylène. L’almagate
DOSAGE se dissout avec effervescence et réchauffement dans les
A 0,2500 g d’acide alginique, ajoutez 25 ml d’eau R, 25,0 ml solutions diluées d’acides minéraux.
d’hydroxyde de sodium 0,1 M et 0,2 ml de solution de IDENTIFICATION
phénolphtaléine R. Titrez par l’acide chlorhydrique 0,1 M.
A. Spectrophotométrie d’absorption dans l’infrarouge
1 ml d’hydroxyde de sodium 0,1 M correspond à 4,502 mg (2.2.24).
de groupes carboxyle (-CO2H).
Comparaison : spectre de référence de l’almagate de la
CARACTÉRISTIQUES LIÉES À LA FONCTIONNALITÉ Ph. Eur.
Cette section fournit des informations sur les B. Dissolvez 0,15 g d’almagate dans de l’acide chlorhydrique
caractéristiques qui sont reconnues comme étant des dilué R et complétez à 20 ml avec le même acide. 2 ml de
paramètres de contrôle pertinents de la (ou des) fonction(s) la solution donnent la réaction de l’aluminium (2.3.1).
de la substance, lorsqu’elle est utilisée comme excipient C. 2 ml de la solution préparée sous Identification B donnent
(voir chapitre 5.15). Cette section représente une partie la réaction du magnésium (2.3.1).

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4289
Almagate PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

ESSAI Magnésium. Introduisez 10,0 ml de solution A, préparée lors


pH (2.2.3) : 9,1 à 9,7. du dosage de l’aluminium, dans une fiole conique de 500 ml,
ajoutez 200 ml d’eau R, 20 ml de triéthanolamine R en
Dispersez 4,0 g d’almagate dans 100 ml d’eau exempte de agitant, 10 ml de solution tampon chlorure d’ammonium
dioxyde de carbone R. Agitez pendant 2 min et filtrez. pH 10,0 R et 50 mg de mélange composé au mordant
Pouvoir neutralisant. Effectuez les opérations suivantes noir 11 R. Titrez par l’édétate de sodium 0,05 M jusqu’à
à 37 °C. Dispersez 0,5 g d’almagate dans 100 ml d’eau R. virage du violet au bleu franc.
Chauffez et ajoutez 100,0 ml d’acide chlorhydrique 0,1 M
1 ml d’édétate de sodium 0,05 M correspond à 2,015 mg
chauffé au préalable ; agitez la solution sans interruption.
de MgO.
Le pH (2.2.3) de la solution entre 5 min et 20 min n’est pas
inférieur à 3,0 et n’est pas supérieur à 4,5. Ajoutez 10,0 ml Acide carbonique : 12,5 pour cent à 14,5 pour cent.
d’acide chlorhydrique 0,5 M chauffé au préalable. Agitez Echantillon à examiner. Introduisez 7,00 mg d’almagate
sans interruption pendant 1 h puis titrez par l’hydroxyde de dans une capsule d’étain. Scellez la capsule.
sodium 0,1 M jusqu’à pH 3,5 ; la quantité d’hydroxyde de
sodium 0,1 M utilisée est au maximum de 20,0 ml. Echantillon témoin. Introduisez 7,00 mg d’almagate SCR
Chlorures (2.4.4) : au maximum 0,1 pour cent. dans une capsule d’étain. Scellez la capsule.
Dissolvez 0,33 g d’almagate dans 5 ml d’acide nitrique Introduisez séparément l’échantillon à examiner et

TE
dilué R et complétez à 100 ml avec de l’eau R. 15 ml de la l’échantillon témoin dans une chambre de combustion
solution satisfont à l’essai limite des chlorures. Préparez d’un analyseur CHN purgée avec de l’hélium pour
simultanément le témoin comme suit : prélevez 0,7 ml chromatographie R et maintenue à une température de
d’acide nitrique dilué R et complétez à 5 ml avec de l’eau R 1020 °C. Simultanément introduisez de l’oxygène R à une
puis ajoutez 10 ml de solution à 5 ppm de chlorure (Cl) R. pression de 40 kPa et à un débit de 20 ml/min et laissez
jusqu’à combustion complète. Faites passer les gaz de
Sulfates (2.4.13) : au maximum 0,4 pour cent.
combustion à travers un réacteur de réduction et séparez les
Dissolvez 0,25 g d’almagate dans 5 ml d’acide chlorhydrique gaz formés par chromatographie en phase gazeuse (2.2.28).
dilué R et complétez à 100 ml avec de l’eau distillée R.
15 ml de la solution satisfont à l’essai limite des sulfates.
LÈ Colonne :
Préparez simultanément le témoin en ajoutant 0,8 ml d’acide — dimensions : l = 2 m, Ø = 4 mm,
chlorhydrique dilué R à 15 ml de solution à 10 ppm de
sulfate (SO4) R. — phase stationnaire : copolymère éthylvinylbenzène-
divinylbenzène R1.
Sodium : au maximum 1,50 × 102 ppm.
Spectrométrie d’absorption atomique (2.2.23, Procédé I). Gaz vecteur : hélium pour chromatographie R.
Solution à examiner. Dissolvez 0,25 g d’almagate dans Débit : 100 ml/min.
50 ml d’une solution d’acide chlorhydrique R à 103 g/l. Température :
O
Solutions de référence. Préparez les solutions de référence
à partir de la solution à 200 ppm de sodium (Na) R, — colonne : 65 °C,
diluée avec la quantité nécessaire d’une solution d’acide — détecteur : 190 °C.
chlorhydrique R à 103 g/l.
Détection : conductivité thermique.
Métaux lourds (2.4.8) : au maximum 20 ppm.
Dissolvez 1,0 g d’almagate dans de l’acide chlorhydrique Enregistrement : 16 min.
BS

dilué R et complétez à 20,0 ml avec le même acide. 12 ml de Conformité du système :


la solution satisfont à l’essai limite A. Préparez la solution
témoin avec la solution à 1 ppm de plomb (Pb) R. — le pourcentage de carbone moyen de 5 échantillons
témoins ne doit pas s’écarter de plus de 0,2 pour cent de
Perte à la calcination : 43,0 pour cent à 49,0 pour cent, la valeur attribuée à la SCR. La différence entre la valeur
déterminé par chauffage à 900 ± 50 °C sur 1,000 g la plus faible et la plus élevée, en pourcentage de carbone,
d’almagate. doit être inférieure à 0,2 pour cent.
Contamination microbienne
Calculez la teneur pour cent en acide carbonique de
DGAT : critère d’acceptation 103 UFC/g (2.6.12). l’échantillon à examiner en appliquant la formule suivante :
O

DMLT : critère d’acceptation 102 UFC/g (2.6.12).


Absence d’Escherichia coli (2.6.13).
Absence de Pseudomonas aeruginosa (2.6.13).
DOSAGE C = teneur pour cent en acide carbonique dans
l’échantillon témoin,
Aluminium. Dissolvez 1,000 g d’almagate dans 5 ml d’acide K = valeur moyenne pour les 5 échantillons témoins
chlorhydrique R, chauffez si nécessaire. Laissez refroidir
du rapport de la masse en milligrammes à la
à température ambiante et complétez à 100,0 ml avec de
surface du pic dû à l’acide carbonique,
l’eau R (solution A). Introduisez 10,0 ml de solution A dans
une fiole conique de 250 ml, ajoutez 25,0 ml d’édétate de A = surface du pic dû à l’acide carbonique dans le
sodium 0,05 M, 20 ml de solution tampon pH 3,5 R, 40 ml chromatogramme obtenu avec l’échantillon à
d’éthanol R et 2 ml d’une solution récemment préparée examiner,
de dithizone R à 0,25 g/l dans l’éthanol R. Titrez l’excès m = masse de l’échantillon, en milligrammes.
d’édétate de sodium par le sulfate de zinc 0,05 M jusqu’à
virage du violet-vert au rose.
CONSERVATION
1 ml d’édétate de sodium 0,05 M correspond à 2,549 mg
de Al2O3. En récipient étanche.

4290 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 Aluminium (phosphate d’), gel de

01/2009:0311 Absence de bactéries gram-négatives résistantes aux sels


biliaires (2.6.13).
ALUMINIUM (OXYDE D’) HYDRATÉ Absence d’Escherichia coli (2.6.13).
DOSAGE
Aluminii oxidum hydricum Dissolvez 0,800 g d’oxyde d’aluminium hydraté dans 10 ml
DÉFINITION d’acide chlorhydrique R1 en chauffant au bain-marie.
Teneur : 47,0 pour cent à 60,0 pour cent de Al2O3 (Mr 102,0). Refroidissez et complétez à 50,0 ml avec de l’eau R. Prélevez
10,0 ml de cette solution et ajoutez de l’ammoniaque
CARACTÈRES diluée R1 jusqu’à début de précipitation. Ajoutez un
Aspect : poudre amorphe, blanche ou sensiblement blanche. minimum d’acide chlorhydrique dilué R pour dissoudre et
Solubilité : pratiquement insoluble dans l’eau. L’oxyde complétez à 20 ml avec de l’eau R. Effectuez le dosage de
d’aluminium hydraté se dissout dans les acides minéraux l’aluminium par complexométrie (2.5.11).
dilués et dans les solutions d’hydroxydes alcalins. 1 ml d’édétate de sodium 0,1 M correspond à 5,098 mg
de Al2O3.
IDENTIFICATION
La solution S (voir Essai) donne la réaction de CONSERVATION

TE
l’aluminium (2.3.1). En récipient étanche, à une température inférieure à 30 °C.
ESSAI
Solution S. Dissolvez 2,5 g d’oxyde d’aluminium hydraté 01/2009:2166
dans 15 ml d’acide chlorhydrique R en chauffant au
bain-marie et complétez à 100 ml avec de l’eau distillée R. ALUMINIUM (PHOSPHATE D’), GEL DE
Aspect de la solution. La solution S n’est pas plus fortement
opalescente que la suspension témoin II (2.2.1) et n’est pas Aluminii phosphatis liquamen
plus fortement colorée que la solution témoin JV6 (2.2.2,

Procédé II).
Impuretés alcalines. Agitez 1,0 g d’oxyde d’aluminium
hydraté avec 20 ml d’eau exempte de dioxyde de carbone R DÉFINITION
pendant 1 min, puis filtrez. A 10 ml du filtrat, ajoutez AlPO4 hydraté sous forme de gel.
0,1 ml de solution de phénolphtaléine R. S’il apparaît une Teneur : 19,0 pour cent à 21,0 pour cent de AlPO4.
coloration rose, elle disparaît par addition de 0,3 ml d’acide
chlorhydrique 0,1 M. CARACTÈRES
Pouvoir neutralisant. Effectuez les opérations suivantes Aspect : gel.
O
à 37 °C. Dispersez 0,5 g d’oxyde d’aluminium hydraté Solubilité : pratiquement insoluble dans l’eau, dans l’éthanol
dans 100 ml d’eau R. Chauffez et ajoutez 100,0 ml d’acide à 96 pour cent et dans le chlorure de méthylène. Le gel de
chlorhydrique 0,1 M chauffé au préalable ; agitez la solution phosphate d’aluminium se dissout dans les solutions diluées
sans interruption. Après 10 min, 15 min et 20 min, mesurez d’acides minéraux.
le pH (2.2.3) de la solution. Il n’est pas inférieur à 1,8,
2,3 et 3,0 respectivement, et n’est jamais supérieur à 4,5. IDENTIFICATION
BS

Ajoutez 10,0 ml d’acide chlorhydrique 0,5 M chauffé au A. La solution S (voir Essai) donne la réaction (b) des
préalable. Agitez sans interruption pendant 1 h, puis titrez phosphates (2.3.1).
par l’hydroxyde de sodium 0,1 M jusqu’à pH 3,5 ; la quantité B. La solution S donne la réaction de l’aluminium (2.3.1).
d’hydroxyde de sodium 0,1 M utilisée n’est pas supérieure
à 35,0 ml. C. La substance à examiner satisfait au dosage.
Chlorures (2.4.4) : au maximum 1 pour cent. ESSAI
Dissolvez en chauffant 0,1 g d’oxyde d’aluminium hydraté Solution S. Dissolvez 2,00 g de substance à examiner dans
dans 10 ml d’acide nitrique dilué R et complétez à 100 ml de l’acide chlorhydrique dilué R et complétez à 100 ml avec
avec de l’eau R. Prélevez 5 ml de cette solution et complétez le même acide.
à 15 ml avec de l’eau R.
O

pH (2.2.3) : 6,0 à 8,0.


Sulfates (2.4.13) : au maximum 1 pour cent.
Peroxydes : au maximum 150 ppm, exprimé en peroxyde
Prélevez 4 ml de solution S et complétez à 100 ml avec de d’hydrogène.
l’eau distillée R.
Solution à examiner. Dissolvez en chauffant 1,0 g de
Arsenic (2.4.2, Procédé A) : au maximum 4 ppm, déterminé substance à examiner dans 5 ml d’acide chlorhydrique
sur 10 ml de solution S. dilué R, puis ajoutez 5 ml d’eau R et 2 ml de solution
Métaux lourds (2.4.8) : au maximum 60 ppm. sulfurique de pentoxyde de divanadium R.
A 20 ml de solution S, ajoutez de l’ammoniaque Solution témoin. Prélevez 1,0 ml de solution diluée de
concentrée R jusqu’à neutralité en utilisant la solution de peroxyde d’hydrogène R et complétez à 200,0 ml avec de
jaune de métanile R comme indicateur externe. Filtrez l’eau R. A 1 ml de cette solution, ajoutez 9 ml d’eau R et
éventuellement et complétez à 30 ml avec de l’eau R. 12 ml 2 ml de solution sulfurique de pentoxyde de divanadium R.
de cette solution satisfont à l’essai A. Préparez la solution La solution à examiner n’est pas plus fortement colorée que
témoin avec 10 ml de solution à 1 ppm de plomb (Pb) R. la solution témoin.
Contamination microbienne Chlorures (2.4.4) : au maximum 500 ppm.
DGAT : critère d’acceptation 103 UFC/g (2.6.12). Dissolvez 1,3 g de substance à examiner dans 5 ml d’acide
DMLT : critère d’acceptation 102 UFC/g (2.6.12). nitrique dilué R et complétez à 200 ml avec de l’eau R.

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4291
Aluminium (silicate d’) et de magnésium PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

Phosphates solubles : au maximum 0,5 pour cent, exprimé CONSERVATION


en PO4. En récipient étanche.
Solution à examiner. Centrifugez 10,0 g de substance
à examiner jusqu’à obtention d’un surnageant limpide.
A 2,00 ml de surnageant, ajoutez 20,0 ml d’une solution 01/2009:1388
d’acide chlorhydrique R à 10,3 g/l, puis complétez à
100,0 ml avec de l’eau R. A 10,0 ml de cette solution, ALUMINIUM (SILICATE D’) ET
ajoutez 10,0 ml de réactif nitro-molybdovanadique R, puis DE MAGNÉSIUM
complétez à 50,0 ml avec de l’eau R. Laissez reposer à l’abri
de la lumière pendant 15 min.
Solution témoin. Ajoutez 10,0 ml de réactif
Aluminii magnesii silicas
nitro-molybdovanadique R à 10,0 ml d’une solution DÉFINITION
de phosphate monopotassique R à 143 mg/l, puis complétez Mélange sous forme de particules de taille colloïdale de
à 50,0 ml avec de l’eau R. Laissez reposer à l’abri de la montmorillonite et de saponite, exempt de grumeaux et de
lumière pendant 15 min. minerai non gonflable.
Mesurez l’absorbance (2.2.25) des solutions à 400 nm. Teneur :

TE
L’absorbance de la solution à examiner n’est pas supérieure — aluminium (Al ; Ar 26,98) : 95,0 pour cent à 105,0 pour
à celle de la solution témoin. cent de la valeur indiquée sur l’étiquette,
Sulfates (2.4.13) : au maximum 0,2 pour cent. — magnésium (Mg ; Ar 24,30) : 95,0 pour cent à 105,0 pour
Prélevez 25 ml de solution S et complétez à 100 ml avec de cent de la valeur indiquée sur l’étiquette.
l’eau distillée R.
CARACTÈRES
Aluminium soluble : au maximum 50 ppm. Aspect : poudre, granules ou paillettes, sensiblement blancs.
A 16,0 g de substance à examiner, ajoutez 50 ml d’eau R. Solubilité : pratiquement insoluble dans l’eau et dans les
Chauffez à ébullition pendant 5 min. Refroidissez.
LÈ solvants organiques.
Centrifugez puis séparez le surnageant. Lavez le résidu
avec 20 ml d’eau R et centrifugez. Séparez le surnageant et Le silicate d’aluminium et de magnésium gonfle dans l’eau
ajoutez-le au précédent. Aux surnageants réunis, ajoutez et forme une dispersion colloïdale.
5 ml d’acide chlorhydrique R et 20 ml d’eau R. Transférez IDENTIFICATION
la totalité de cette solution dans une fiole conique de 500 ml
A. Faites fondre 1 g de substance à examiner avec 2 g de
puis effectuez le titrage de l’aluminium par complexométrie
carbonate de sodium anhydre R. Chauffez le résidu avec
(2.5.11) en utilisant de l’édétate de sodium 0,01 M.
de l’eau R et filtrez. Acidifiez le filtrat avec de l’acide
Arsenic (2.4.2, Procédé A) : au maximum 1 ppm, déterminé chlorhydrique R et évaporez à siccité au bain-marie.
sur 1,0 g de substance à examiner. 0,25 g du résidu donne la réaction des silicates (2.3.1).
O
Métaux lourds (2.4.8) : au maximum 10 ppm. B. Dissolvez le résidu restant obtenu dans l’identification A
Dissolvez 4,0 g de substance à examiner dans de l’acide dans un mélange de 5 ml d’acide chlorhydrique dilué R
chlorhydrique dilué R et complétez à 20 ml avec le même et de 10 ml d’eau R. Filtrez et ajoutez de la solution
acide. 12 ml de solution satisfont à l’essai A. Préparez la tampon chlorure d’ammonium pH 10,0 R. Il se forme
solution témoin avec la solution à 2 ppm de plomb (Pb) R. un précipité blanc gélatineux. Centrifugez. Réservez le
BS

surnageant pour l’identification C. Dissolvez le précipité


Pouvoir neutralisant. Ajoutez 2,0 g de substance à examiner dans de l’acide chlorhydrique dilué R. La solution donne
à 30 ml d’acide chlorhydrique 0,1 M préalablement chauffé la réaction de l’aluminium (2.3.1).
à 37 °C et maintenez à 37 °C tout en agitant. Déterminez le C. Le liquide surnageant obtenu après centrifugation dans
pH après 15 min. Le pH (2.2.3) du mélange est de 2,0 à 2,5. l’identification B donne la réaction du magnésium (2.3.1).
Résidu à la calcination : 19,0 pour cent à 23,0 pour cent.
ESSAI
Chauffez 0,500 g de substance à examiner à 50 °C pendant
5 h puis calcinez à 500 ± 50 °C jusqu’à masse constante. pH (2.2.3) : 9,0 à 10,0.
Contamination microbienne Dispersez 5,0 g de substance à examiner dans 100 ml d’eau
exempte de dioxyde de carbone R.
O

DGAT : critère d’acceptation 103 UFC/g (2.6.12).


Arsenic (2.4.2, Procédé A) : au maximum 3 ppm.
DMLT : critère d’acceptation 102 UFC/g (2.6.12). Dans un vase à précipiter de 250 ml contenant 100 ml d’acide
Absence de bactéries gram-négatives résistantes aux sels chlorhydrique dilué R, introduisez 16,6 g de substance à
biliaires (2.6.13). examiner. Mélangez, couvrez le vase à précipiter avec un
Absence d’Escherichia coli (2.6.13). verre de montre et faites bouillir doucement, en agitant de
temps en temps, pendant 15 min. Laissez décanter et filtrez
DOSAGE le liquide surnageant sur un papier filtre à filtration rapide
dans une fiole jaugée de 250 ml tout en retenant le plus
Dissolvez en chauffant 0,300 g de substance à examiner dans possible de sédiment dans le vase à précipiter. Ajoutez 25 ml
5 ml d’acide chlorhydrique dilué R. Ajoutez 45 ml d’eau R, d’acide chlorhydrique dilué R chaud au résidu dans le vase
10,0 ml d’édétate de sodium 0,1 M et 30 ml d’un mélange à précipiter, agitez, chauffez à ébullition, laissez décanter et
à volumes égaux de solution d’acétate d’ammonium R et filtrez le liquide surnageant sur un filtre dans la fiole jaugée.
d’acide acétique dilué R. Chauffez à ébullition pendant Répétez l’extraction avec 4 fois 25 ml d’acide chlorhydrique
3 min, puis refroidissez. Ajoutez 25 ml d’éthanol à 96 pour dilué R chaud en filtrant chaque fois le liquide surnageant
cent R. Titrez par le sulfate de zinc 0,1 M. Déterminez le sur le filtre dans la fiole jaugée. Lors de la dernière extraction
point de fin de titrage par potentiométrie (2.2.20). transférez le plus possible la fraction insoluble sur le filtre.
1 ml de sulfate de zinc 0,1 M correspond à 12,2 mg d’AlPO4. Laissez refroidir les filtrats combinés à température ambiante

4292 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 Aluminium (silicate d’) et de sodium

et complétez à 250,0 ml avec de l’acide chlorhydrique par millilitre). Dans 3 fioles jaugées identiques, contenant
dilué R. Prélevez 5,0 ml de cette solution et complétez à chacune 0,20 g de chlorure de sodium R, introduisez
25,0 ml avec de l’acide chlorhydrique dilué R. respectivement 2,0 ml, 5,0 ml et 10,0 ml de cette solution et
Plomb : au maximum 15,0 ppm. complétez à 100,0 ml avec de l’eau R.
Source : lampe à cathode creuse à l’aluminium.
Spectrométrie d’absorption atomique (2.2.23, Procédé I).
Longueur d’onde : 309 nm.
Solution à examiner. Dans un vase à précipiter de 250 ml
contenant 100 ml d’acide chlorhydrique dilué R, introduisez Dispositif d’atomisation : flamme oxydante
10,0 g de substance à examiner. Mélangez, couvrez le vase à acétylène-protoxyde d’azote.
précipiter avec un verre de montre et faites bouillir pendant Magnésium. Spectrométrie d’absorption atomique (2.2.23,
15 min. Laissez refroidir à température ambiante et laissez Procédé I).
décanter. Filtrez le liquide surnageant sur un papier filtre à Solution à examiner. Prélevez 25,0 ml de solution A,
filtration rapide dans un vase à précipiter de 400 ml. Ajoutez préparée dans le dosage de l’aluminium, et complétez à
25 ml d’eau R chaude à la fraction insoluble dans le vase 50,0 ml avec de l’eau R. Prélevez 5,0 ml de cette solution,
à précipiter de 250 ml, agitez, laissez décanter et filtrez le ajoutez 20,0 ml de solution de nitrate de lanthane R et
liquide surnageant sur un filtre dans le vase à précipiter de complétez à 100,0 ml avec de l’eau R.
400 ml. Répétez 2 fois l’extraction avec 25 ml d’eau R en Solutions de référence. Dans un vase à précipiter de

TE
filtrant chaque fois le liquide surnageant sur le filtre dans le 250 ml contenant 20 ml d’eau R, introduisez 1,000 g de
vase à précipiter de 400 ml. Lavez le filtre avec 25 ml d’eau R magnésium R, puis ajoutez prudemment 20 ml d’acide
chaude en recueillant le filtrat dans le vase à précipiter chlorhydrique R et chauffez si nécessaire pour dissoudre.
de 400 ml. Evaporez les filtrats réunis à environ 20 ml en Transférez la solution dans une fiole jaugée et complétez à
chauffant légèrement. S’il apparaît un précipité, ajoutez 1000,0 ml avec de l’eau R (1 mg de magnésium par millilitre).
environ 0,1 ml d’acide nitrique R, chauffez à ébullition et Prélevez 5,0 ml de cette solution et complétez à 250,0 ml
laissez refroidir à température ambiante. Filtrez les extraits avec de l’eau R. Dans 4 fioles jaugées identiques, introduisez
concentrés sur un papier filtre à filtration rapide dans une respectivement 5,0 ml, 10,0 ml, 15,0 ml et 20,0 ml de solution,
fiole jaugée de 50 ml. Transférez le contenu restant du vase ajoutez 20,0 ml de solution de nitrate de lanthane R dans
à précipiter de 400 ml avec de l’eau R sur le filtre dans la
LÈ chacune et complétez à 100,0 ml avec de l’eau R.
fiole jaugée et complétez à 50,0 ml avec de l’eau R.
Source : lampe à cathode creuse au magnésium.
Solutions de référence. Préparez les solutions de référence
à partir de la solution à 10 ppm de plomb (Pb) R, diluée avec Longueur d’onde : 285 nm.
la quantité nécessaire d’eau R. Dispositif d’atomisation : flamme réductrice air-acétylène.
Source : lampe à cathode creuse au plomb. ÉTIQUETAGE
Longueur d’onde : 217 nm. L’étiquette indique la teneur en aluminium et en magnésium.
Dispositif d’atomisation : flamme oxydante air-acétylène.
O
Perte à la dessiccation (2.2.32) : au maximum 8,0 pour cent, 01/2009:1676
déterminé à l’étuve à 105 °C sur 1,000 g de substance à
examiner. ALUMINIUM (SILICATE D’) ET
Contamination microbienne DE SODIUM
DGAT : critère d’acceptation 103 UFC/g (2.6.12).
Aluminii natrii silicas
BS

DMLT : critère d’acceptation 102 UFC/g (2.6.12).


Absence d’Escherichia coli (2.6.13).
DÉFINITION
DOSAGE Sel d’aluminium et de sodium d’acide silicique d’origine
Aluminium. Spectrométrie d’absorption atomique (2.2.23, synthétique.
Procédé I). Teneur :
Solution à examiner. Dans un creuset de platine, mélangez — aluminium (Al ; Mr 26,98) : 2,7 pour cent à 7,9 pour cent
0,200 g de substance à examiner avec 1,0 g de métaborate (substance desséchée),
de lithium R. Chauffez lentement d’abord, puis calcinez à — sodium (Na ; Mr 22,99) : 3,7 pour cent à 6,3 pour cent
1000-1200 °C pendant 15 min. Laissez refroidir. Transférez (substance desséchée).
O

le creuset dans un vase à précipiter de 100 ml contenant


25 ml d’acide nitrique dilué R et ajoutez 50 ml d’acide CARACTÈRES
nitrique dilué R pour remplir et immerger le creuset. Placez Aspect : poudre amorphe, fine et légère, blanche ou
un barreau magnétique gainé de polytétrafluoroéthylène sensiblement blanche.
dans le creuset et agitez doucement avec un agitateur Solubilité : pratiquement insoluble dans l’eau et dans les
magnétique jusqu’à dissolution complète. Transférez le solvants organiques.
contenu dans un vase à précipiter de 250 ml et enlevez le
creuset. Chauffez cette solution, filtrez à travers un papier IDENTIFICATION
filtre à filtration rapide dans une fiole jaugée de 250 ml, lavez A. Dans un vase à précipiter de 100 ml, introduisez 1,0 g
le filtre et le vase à précipiter avec de l’eau R, puis compléter de substance à examiner, puis ajoutez 10 ml d’acide
à 250,0 ml avec de l’eau R (solution A). Prélevez 20,0 ml chlorhydrique dilué R. Mélangez, couvrez avec un verre
de solution A, ajoutez 20 ml de solution de chlorure de de montre et chauffez à ébullition pendant 15 min.
sodium R à 10 g/l et complétez à 100,0 ml avec de l’eau R. Laissez refroidir à température ambiante, mélangez et
Solutions de référence. Dissolvez 1,000 g d’aluminium R centrifugez. 2 ml du surnageant donnent la réaction de
dans un mélange de 10 ml d’acide chlorhydrique R et de l’aluminium (2.3.1).
10 ml d’eau R en chauffant légèrement. Laissez refroidir et B. 2 ml du surnageant obtenu dans l’identification A
complétez à 1000,0 ml avec de l’eau R (1 mg d’aluminium donnent la réaction (a) du sodium (2.3.1).

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4293
Amidon de blé PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

C. 0,2 g de substance à examiner donne la réaction des DMLT : critère d’acceptation 102 UFC/g (2.6.12).
silicates (2.3.1). Absence d’Escherichia coli (2.6.13).
ESSAI DOSAGE
pH (2.2.3) : 9,5 à 11,5. Aluminium. Spectrométrie d’absorption atomique (2.2.23,
Dispersez 5,0 g de substance à examiner dans 100 ml d’eau Procédé I).
exempte de dioxyde de carbone R. Mélange d’acides. A 500 ml d’eau R, ajoutez 50 ml d’acide
Arsenic (2.4.2, Procédé A) : au maximum 3 ppm. nitrique R. Dissolvez, dans cette solution, 17 g d’acide
Dans un vase à précipiter de 250 ml contenant 50 ml d’acide tartrique R et complétez à 1000 ml avec de l’eau R.
chlorhydrique dilué R, introduisez 8,3 g de substance à Solution à blanc. Dissolvez 1,4 g de métaborate de lithium
examiner. Mélangez, couvrez avec un verre de montre et anhydre R dans 60 ml du mélange d’acides et complétez à
portez à faible ébullition pendant 15 min, en agitant de 200 ml avec de l’eau R.
temps en temps. Centrifugez et filtrez le surnageant sur Solution à examiner. Dans un creuset de platine, mélangez
un papier filtre à filtration rapide, en recueillant le filtrat 0,200 g de substance à examiner et 1,4 g de métaborate
dans une fiole jaugée de 250 ml. Ajoutez 25 ml d’acide de lithium anhydre R. Chauffez d’abord lentement, puis
chlorhydrique dilué R chaud au résidu resté dans le vase calcinez à 1100 ± 25 °C pendant 15 min. Refroidissez,
à précipiter, agitez, centrifugez et filtrez le surnageant sur

TE
puis placez le creuset dans un vase à précipiter de 100 ml
le même filtre, en recueillant le filtrat dans la fiole jaugée. contenant 60 ml du mélange d’acides. Placez dans le creuset
Répétez l’extraction avec 3 fois 25 ml d’acide chlorhydrique un agitateur magnétique gainé de polytétrafluoroéthylène
dilué R chaud, en filtrant chaque fois le surnageant sur le et maintenez sous agitation douce avec un agitateur
filtre dans la fiole jaugée. Laissez refroidir les filtrats réunis magnétique pendant 16 h. Transvasez le contenu du creuset
à température ambiante et complétez à 250,0 ml avec de dans une fiole jaugée de 200 ml. Lavez à l’eau R le creuset,
l’acide chlorhydrique dilué R. Prélevez 10,0 ml de solution l’agitateur magnétique et le vase à précipiter et complétez
et complétez à 25,0 ml avec de l’eau R. à 200,0 ml avec le même solvant (solution A). A 10,0 ml de
Plomb : au maximum 5,0 ppm. cette solution, ajoutez 1,0 ml de solution de chlorure de
Spectrométrie d’absorption atomique (2.2.23, Procédé I).
LÈ lanthane R, puis complétez à 50,0 ml avec de l’eau R.
Solution à examiner. Dans un vase à précipiter de 250 ml Solutions de référence. Dans 5 fioles jaugées distinctes de
contenant 50 ml d’acide chlorhydrique dilué R, introduisez 50 ml, introduisez respectivement 1,0 ml, 2,5 ml, 5,0 ml,
5,0 g de substance à examiner. Mélangez, couvrez avec 7,5 ml et 10,0 ml de solution à 100 ppm d’aluminium (Al) R,
un verre de montre et portez à ébullition pendant 15 min. puis ajoutez 1 ml de solution de chlorure de lanthane R
Laissez refroidir à température ambiante. Centrifugez et et 10 ml de solution à blanc. Complétez à 50,0 ml avec de
filtrez le surnageant sur un papier filtre à filtration rapide, l’eau R.
en recueillant le filtrat dans un vase à précipiter de 250 ml. Source : lampe à cathode creuse à l’aluminium.
Ajoutez 25 ml d’eau R chaude au résidu insoluble, agitez Longueur d’onde : 309,3 nm.
énergiquement, puis centrifugez et filtrez le surnageant
O
sur le même filtre, en recueillant le filtrat dans le vase à Dispositif d’atomisation : flamme acétylène-protoxyde
précipiter. Répétez l’extraction avec 2 fois 25 ml d’eau R d’azote.
chaude, en filtrant chaque fois le surnageant sur le filtre dans Sodium. Spectrométrie d’émission atomique (2.2.22,
le vase à précipiter. Lavez le filtre avec 25 ml d’eau R chaude, Procédé I).
en recueillant le filtrat dans le vase à précipiter. Evaporez les Solution à examiner. A 2,0 ml de la solution A préparée
BS

filtrats réunis jusqu’à environ 15 ml en chauffant à faible pour le dosage de l’aluminium, ajoutez 1 ml d’une solution
ébullition. Ajoutez environ 0,05 ml d’acide nitrique exempt de chlorure de césium R à 12,5 g/l, puis complétez à 20,0 ml
de métaux lourds R, portez à ébullition et laissez refroidir à avec de l’eau R.
température ambiante. Filtrez les extraits concentrés sur un
Solutions de référence. Dans 5 fioles jaugées distinctes de
papier filtre à filtration rapide, en recueillant le filtrat dans
200 ml contenant chacune 10 ml d’une solution de chlorure
une fiole jaugée de 25 ml. Transférez le contenu restant
de césium R à 12,5 g/l, introduisez respectivement 1,0 ml,
du vase à précipiter dans la fiole jaugée en rinçant avec de
2,0 ml, 4,0 ml, 6,0 ml et 10,0 ml de solution à 200 ppm de
l’eau R et en filtrant et complétez à 25,0 ml avec le même
sodium (Na) R, puis complétez à 200,0 ml avec de l’eau R.
solvant.
Solutions de référence. Dans 4 fioles jaugées distinctes de Longueur d’onde : 589,0 nm.
O

100 ml, introduisez respectivement 3,0 ml, 5,0 ml, 10,0 ml et


15,0 ml de solution à 10 ppm de plomb (Pb) R, puis ajoutez
0,20 ml d’acide nitrique exempt de métaux lourds R et 01/2009:0359
complétez à 100,0 ml avec de l’eau R.
Source : lampe à cathode creuse au plomb. AMIDON DE BLÉ
Longueur d’onde : 217,0 nm.
Dispositif d’atomisation : flamme air-acétylène. Tritici amylum
Perte à la dessiccation (2.2.32) : au maximum 8,0 pour cent, DÉFINITION
déterminé à l’étuve à 105 °C pendant 4 h sur 1,000 g de
substance à examiner. L’amidon de blé est l’amidon retiré du caryopse de Triticum
aestivum L. (T. vulgare Vill.).
Perte à la calcination : 5,0 pour cent à 11,0 pour cent
(substance desséchée), déterminé par calcination à CARACTÈRES
1000 ± 25 °C jusqu’à masse constante dans un creuset de Aspect : poudre blanche ou sensiblement blanche, très fine,
platine sur 1,000 g de substance à examiner. qui crisse sous la pression des doigts.
Contamination microbienne Solubilité : pratiquement insoluble dans l’eau froide et dans
DGAT : critère d’acceptation 103 UFC/g (2.6.12). l’éthanol à 96 pour cent.

4294 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 Amidon de maïs

L’amidon de blé ne doit pas contenir de grains d’amidon 01/2009:0344


d’origine étrangère. Il peut contenir quelques fragments
tissulaires provenant de la plante d’origine, mais seulement AMIDON DE MAÏS
en quantité infime.

IDENTIFICATION Maydis amylum


A. Examiné au microscope en utilisant un mélange à volumes DÉFINITION
égaux de glycérol R et d’eau R, l’amidon de blé apparaît L’amidon de maïs est retiré du caryopse de Zea mays L.
composé de grains de grande ou de petite taille et, très
rarement, de taille intermédiaire. Les grains de grande CARACTÈRES
taille, d’un diamètre de 10-60 μm, sont discoïdes ou, Aspect : poudre d’un blanc mat à faiblement jaunâtre, très
plus rarement, réniformes (en vue de face). Le hile fine, qui crisse sous la pression des doigts.
central et les stries sont invisibles ou à peine visibles et
les grains présentent parfois des bords fissurés. Vus de Solubilité : pratiquement insoluble dans l’eau froide et dans
profil, les grains sont elliptiques, fusiformes et le hile l’éthanol à 96 pour cent.
apparaît comme une fente le long de l’axe principal. La présence de grains ayant des fentes ou des irrégularités
Les grains de petite taille, arrondis ou polyédriques, sur leur bord est exceptionnelle.

TE
ont un diamètre de 2-10 μm. Entre des plaques ou
IDENTIFICATION
prismes polarisants orientés orthogonalement, les grains
présentent distinctement le phénomène de la croix noire A. Examiné au microscope en utilisant un grossissement
centrée sur le hile. d’au moins 20 × et en utilisant un mélange à volumes
égaux de glycérol R et d’eau R, l’amidon de maïs se
B. Mettez en suspension 1 g d’amidon de blé dans présente en grains anguleux polyédriques de taille
50 ml d’eau R, chauffez à ébullition pendant 1 min et irrégulière et de diamètre compris entre environ 2 μm
refroidissez. Il se forme un empois trouble et peu épais. et environ 23 μm ou en grains arrondis ou sphéroïdaux
C. A 1 ml de l’empois obtenu dans l’identification B, ajoutez de taille irrégulière et de diamètre compris entre environ
0,05 ml de solution d’iode R1. Il apparaît une coloration
LÈ 25 μm et environ 35 μm. Ils comportent un hile central
bleu foncé qui disparaît au chauffage. formé par une cavité distincte ou par 2-5 fissures étoilées
et sont dépourvus de stries concentriques. Entre des
ESSAI plaques ou prismes polarisants orientés orthogonalement,
pH (2.2.3) : 4,5 à 7,0. ils présentent distinctement le phénomène de la croix
noire centrée sur le hile.
Agitez 5,0 g d’amidon de blé avec 25,0 ml d’eau exempte
de dioxyde de carbone R pendant 60 s et laissez reposer B. Chauffez à ébullition une suspension de 1 g d’amidon de
pendant 15 min. maïs dans 50 ml d’eau R pendant 1 min et refroidissez. Il
se forme un empois trouble et liquide.
Eléments étrangers. Examiné au microscope en utilisant
C. A 1 ml de l’empois obtenu dans l’identification B, ajoutez
O
un mélange à volumes égaux de glycérol R et d’eau R,
0,05 ml de solution d’iode R1. Il apparaît une coloration
l’amidon de blé ne présente d’éléments autres que des
rouge-orange à bleu foncé qui disparaît par chauffage.
grains d’amidon qu’à l’état de traces. Il n’y a pas de grains
d’amidon d’origine étrangère. ESSAI
Protéines totales : au maximum 0,3 pour cent (correspondant pH (2.2.3) : 4,0 à 7,0.
BS

à 0,048 pour cent de N2, facteur de conversion : 6,25) Agitez 5,0 g d’amidon de maïs avec 25,0 ml d’eau exempte
déterminé sur 6,0 g d’amidon de blé par dosage de l’azote de dioxyde de carbone R pendant 60 s et laissez reposer
après minéralisation par l’acide sulfurique (2.5.9). La pendant 15 min.
méthode est modifiée comme suit : entraînez les parcelles
solides adhérant au col du matras par lavage avec 25 ml Eléments étrangers. Examiné au microscope en utilisant
d’acide sulfurique R, continuez le chauffage jusqu’à un mélange à volumes égaux de glycérol R et d’eau R,
obtention d’une solution limpide et ajoutez 45 ml de solution l’amidon de maïs ne présente d’éléments autres que des
concentrée d’hydroxyde de sodium R. grains d’amidon qu’à l’état de traces. Il n’y a pas de grains
d’amidon d’origine étrangère.
Substances oxydantes (2.5.30) : au maximum 20 ppm,
calculé en H2O2. Substances oxydantes (2.5.30) : au maximum 20 ppm,
O

calculé en H2O2.
Dioxyde de soufre (2.5.29) : au maximum 50 ppm.
Dioxyde de soufre (2.5.29) : au maximum 50 ppm.
Fer (2.4.9) : au maximum 10 ppm.
Fer (2.4.9) : au maximum 10 ppm.
Agitez 1,5 g d’amidon de blé avec 15 ml d’acide
chlorhydrique dilué R. Filtrez. Le filtrat satisfait à l’essai. Agitez 1,5 g d’amidon de maïs avec 15 ml d’acide
chlorhydrique dilué R. Filtrez. Le filtrat satisfait à l’essai.
Perte à la dessiccation (2.2.32) : au maximum 15,0 pour
Perte à la dessiccation (2.2.32) : au maximum 15,0 pour
cent, déterminé à l’étuve à 130 °C pendant 90 min sur
cent, déterminé à l’étuve à 130 °C pendant 90 min sur
1,000 g d’amidon de blé.
1,000 g d’amidon de maïs.
Cendres sulfuriques (2.4.14) : au maximum 0,6 pour cent,
Cendres sulfuriques (2.4.14) : au maximum 0,6 pour cent,
déterminé sur 1,0 g d’amidon de blé.
déterminé sur 1,0 g d’amidon de maïs.
Contamination microbienne Contamination microbienne
DGAT : critère d’acceptation 103 UFC/g (2.6.12). DGAT : critère d’acceptation 103 UFC/g (2.6.12).
DMLT : critère d’acceptation 102 UFC/g (2.6.12). DMLT : critère d’acceptation 102 UFC/g (2.6.12).
Absence d’Escherichia coli (2.6.13). Absence d’Escherichia coli (2.6.13).
Absence de salmonelles (2.6.13). Absence de salmonelles (2.6.13).

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4295
Amidon de pois PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

01/2009:2403 01/2009:0355

AMIDON DE POIS AMIDON DE POMME DE TERRE


Solani amylum
Pisi amylum
DÉFINITION
DÉFINITION L’amidon ou fécule de pomme de terre est l’amidon retiré
L’amidon de pois est issu des graines de Pisum sativum L. des tubercules de Solanum tuberosum L.
CARACTÈRES
CARACTÈRES
Aspect : poudre blanche ou sensiblement blanche, très fine,
Aspect : poudre blanche ou sensiblement blanche, très fine. qui crisse sous la pression des doigts.
Solubilité : pratiquement insoluble dans l’eau froide et dans Solubilité : pratiquement insoluble dans l’eau froide et dans
l’éthanol à 96 pour cent. l’éthanol à 96 pour cent.
L’amidon de pomme de terre ne doit pas contenir de grains
IDENTIFICATION d’amidon d’origine étrangère. Il peut contenir quelques

TE
A. Examiné au microscope en utilisant un mélange à fragments tissulaires provenant de la plante d’origine, mais
volumes égaux de glycérol R et d’eau R, l’amidon de pois seulement en quantité infime.
apparaît composé en majorité de grands grains elliptiques
(25-45 μm), parfois irréguliers, ou réniformes. Une faible IDENTIFICATION
population de petits grains ronds de 5-8 μm est également A. Examiné au microscope en utilisant un mélange
observable. Les grains peuvent présenter des fentes ou à volumes égaux de glycérol R et d’eau R, l’amidon de
des irrégularités. Certains grains présentent des stries pomme de terre apparaît composé de grains irréguliers,
concentriques peu marquées. Quelques grains présentent soit ovoïdes ou piriformes (habituellement 30-100 μm,
également une fissure centrale. Entre des plaques ou
LÈ occasionnellement plus de 100 μm), soit ronds (10-35 μm).
prismes polarisants orientés orthogonalement, les grains On observe occasionnellement de l’amidon formé de
présentent distinctement le phénomène de la croix noire. 2-4 grains. Les grains ovoïdes ou piriformes comportent
un hile excentrique et les grains ronds un hile centré ou
B. Mettez en suspension 1 g d’amidon de pois dans légèrement excentrique. Tous les grains présentent des
50 ml d’eau R. Chauffez à ébullition pendant 1 min et stries concentriques très apparentes. Entre des plaques
refroidissez. Il se forme un empois trouble et peu épais. ou prismes polarisants orientés orthogonalement, les
C. A 1 ml de l’empois obtenu dans l’identification B, ajoutez grains présentent distinctement le phénomène de la croix
0,05 ml de solution d’iode R1. Il apparaît une coloration noire centrée sur le hile.
bleu foncé qui disparaît au chauffage. B. Mettez en suspension 1 g d’amidon de pomme de terre
O
dans 50 ml d’eau R, chauffez à ébullition pendant 1 min
ESSAI et refroidissez. Il se forme un empois épais et opalescent.
pH (2.2.3) : 5,0 à 8,0. C. A 1 ml de l’empois obtenu dans l’identification B, ajoutez
Agitez 5,0 g d’amidon de pois dans 25,0 ml d’eau exempte 0,05 ml de solution d’iode R1. Il apparaît une coloration
de dioxyde de carbone R pendant 60 s. Laissez reposer rouge-orange ou bleu foncé qui disparaît au chauffage.
BS

pendant 15 min puis mélangez à nouveau. ESSAI


Eléments étrangers. Examiné au microscope en utilisant pH (2.2.3) : 5,0 à 8,0.
un mélange à volumes égaux de glycérol R et d’eau R, Agitez 5,0 g d’amidon de pomme de terre avec 25,0 ml d’eau
l’amidon de pois ne présente d’éléments autres que des exempte de dioxyde de carbone R pendant 60 s et laissez
grains d’amidon qu’à l’état de traces. Il n’y a pas de grains reposer pendant 15 min.
d’amidon d’origine étrangère.
Eléments étrangers. Examiné au microscope en utilisant un
Substances oxydantes (2.5.30) : au maximum 20 ppm, mélange à volumes égaux de glycérol R et d’eau R, l’amidon
calculé en H2O2. de pomme de terre ne présente d’éléments autres que des
Dioxyde de soufre (2.5.29) : au maximum 50 ppm. grains d’amidon qu’à l’état de traces. Il n’y a pas de grains
O

Fer (2.4.9) : au maximum 50 ppm. d’amidon d’origine étrangère.


Agitez 1,0 g d’amidon de pois avec 50 ml d’acide Substances oxydantes (2.5.30) : au maximum 20 ppm,
chlorhydrique dilué R. Filtrez. Le filtrat satisfait à l’essai calculé en H2O2.
du fer. Dioxyde de soufre (2.5.29) : au maximum 50 ppm.
Perte à la dessiccation (2.2.32) : au maximum 16,0 pour Fer (2.4.9) : au maximum 10 ppm.
cent, déterminé à l’étuve à 130 °C pendant 90 min sur Agitez 1,5 g d’amidon de pomme de terre avec 15 ml d’acide
1,000 g d’amidon de pois. chlorhydrique dilué R. Filtrez. Le filtrat satisfait à l’essai
Cendres sulfuriques (2.4.14) : au maximum 0,6 pour cent, limite du fer.
déterminé sur 1,0 g d’amidon de pois. Perte à la dessiccation (2.2.32) : au maximum 20,0 pour
Contamination microbienne cent, déterminé à l’étuve à 130 °C pendant 90 min sur
1,000 g d’amidon de pomme de terre.
DGAT : critère d’acceptation 103 UFC/g (2.6.12).
Cendres sulfuriques (2.4.14) : au maximum 0,6 pour cent,
DMLT : critère d’acceptation 102 UFC/g (2.6.12). déterminé sur 1,0 g d’amidon de pomme de terre.
Absence d’Escherichia coli (2.6.13). Contamination microbienne
Absence de salmonelles (2.6.13). DGAT : critère d’acceptation 103 UFC/g (2.6.12).

4296 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 Amidon prégélatinisé

DMLT : critère d’acceptation 102 UFC/g (2.6.12). DMLT : critère d’acceptation 102 UFC/g (2.6.12).
Absence d’Escherichia coli (2.6.13). Absence d’Escherichia coli (2.6.13).
Absence de salmonelles (2.6.13). Absence de salmonelles (2.6.13).

01/2009:0349 01/2009:1267

AMIDON DE RIZ AMIDON PRÉGÉLATINISÉ


Oryzae amylum Amylum pregelificatum
DÉFINITION DÉFINITION
L’amidon de riz est retiré du caryopse d’Oryza sativa L. L’amidon prégélatinisé est préparé à partir d’Amidon de
CARACTÈRES maïs (0344), d’Amidon de pomme de terre (0355) ou
d’Amidon de riz (0349) par traitement mécanique en
Aspect : poudre blanche ou sensiblement blanche, très fine, présence d’eau à l’aide d’un procédé thermique ou non, pour

TE
qui crisse sous la pression des doigts. rompre tout ou partie des grains d’amidon, puis séchage. Il
Solubilité : pratiquement insoluble dans l’eau froide et dans ne contient aucune substance ajoutée mais peut être modifié
l’éthanol à 96 pour cent. pour le rendre compressible et améliorer ses caractéristiques
L’amidon de riz ne doit pas contenir de grains d’amidon de fluidité.
d’origine étrangère. Il peut contenir quelques fragments
d’albumen du fruit, mais seulement à l’état de traces. CARACTÈRES
Aspect : poudre blanche à blanc-jaune.
IDENTIFICATION L’amidon prégélatinisé gonfle dans l’eau froide.
A. Examiné au microscope en utilisant un mélange à

volumes égaux de glycérol R et d’eau R, l’amidon de IDENTIFICATION
riz présente des grains polyédriques, simples, mesurant A. Examinez au microscope en utilisant un mélange à
1-10 μm, le plus souvent 4-6 μm. Ces grains simples se volumes égaux d’eau R et de glycérol R. L’amidon
regroupent souvent en grains composés, ellipsoïdaux, prégélatinisé présente des paillettes ou des grains
de 50-100 μm de diamètre. Les grains comportent un irréguliers, translucides, blancs à blanc-jaune, dont
hile central peu apparent et sont dépourvus de stries la surface est irrégulière. Sous lumière polarisée
concentriques ; entre des plaques ou prismes polarisants (entre nicols croisés), des grains d’amidon présentant
orientés orthogonalement, ils présentent distinctement le distinctement le phénomène de la croix noire centrée sur
phénomène de la croix noire centrée sur le hile. le hile peuvent être présents.
O
B. Chauffez à ébullition une suspension de 1 g d’amidon de B. Dispersez 0,5 g d’amidon prégélatinisé dans 2 ml d’eau R
riz dans 50 ml d’eau R pendant 1 min et refroidissez. Il sans chauffer et ajoutez 0,05 ml de solution d’iode R1. Il
se forme un empois trouble et liquide. se développe une coloration violet-rouge à bleu.
C. A 1 ml de l’empois obtenu dans l’identification B, ajoutez
0,05 ml de solution d’iode R1. Il apparaît une coloration ESSAI
rouge-orange à bleu foncé qui disparaît par chauffage. pH (2.2.3) : 4,5 à 7,0.
BS

Ajoutez progressivement 3,0 g d’amidon prégélatinisé à


ESSAI
100,0 ml d’eau exempte de dioxyde de carbone R, tout en
pH (2.2.3) : 5,0 à 8,0. maintenant sous agitation constante. Déterminer le pH dès
Pendant 60 s, agitez 5,0 g d’amidon de riz avec 25,0 ml obtention d’une solution homogène.
d’eau exempte de dioxyde de carbone R. Laissez reposer Substances oxydantes (2.5.30). L’amidon prégélatinisé
pendant 15 min. satisfait à l’essai des substances oxydantes. Utilisez
Fer (2.4.9) : au maximum 10 ppm pour le filtrat. comme solvant un mélange à volume égaux d’eau R et de
Agitez 1,5 g d’amidon de riz avec 15 ml d’acide chlorhydrique méthanol R.
dilué R. Filtrez. Dioxyde de soufre (2.5.29) : au maximum 50 ppm.
O

Eléments étrangers. Examinez au microscope en utilisant Fer (2.4.9) : au maximum 20 ppm.


un mélange à volumes égaux de glycérol R et d’eau R. Dissolvez le résidu obtenu dans l’essai des cendres
L’amidon de riz ne présente de matière autre que des grains sulfuriques dans 20 ml d’acide chlorhydrique dilué R.
d’amidon qu’à l’état de traces. Aucun grain d’amidon Filtrez. Le filtrat satisfait à l’essai.
d’origine étrangère ne doit être présent.
Eléments étrangers. Examiné au microscope en utilisant un
Perte à la dessiccation (2.2.32) : au maximum 15,0 pour mélange à volumes égaux d’eau R et de glycérol R, l’amidon
cent, déterminé à l’étuve à 130 °C pendant 90 min sur 1,00 g prégélatinisé présente tout au plus, à l’état de traces, des
d’amidon de riz. fragments d’éléments autres que des grains d’amidon.
Cendres sulfuriques (2.4.14) : au maximum 0,6 pour cent, Perte à la dessiccation (2.2.32) : au maximum 15,0 pour
déterminé sur 1,0 g d’amidon de riz. cent, déterminé à l’étuve à 130 °C pendant 90 min sur
Substances oxydantes (2.5.30) : au maximum 0,002 pour 1,000 g d’amidon prégélatinisé.
cent, calculé en H2O2. Cendres sulfuriques (2.4.14) : au maximum 0,6 pour cent,
Dioxyde de soufre (2.5.29) : au maximum 50 ppm. déterminé sur 1,0 g d’amidon prégélatinisé.
Contamination microbienne Contamination microbienne
DGAT : critère d’acceptation 103 UFC/g (2.6.12). DGAT : critère d’acceptation 103 UFC/g (2.6.12).

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4297
Amiodarone (chlorhydrate d’) PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

DMLT : critère d’acceptation 102 UFC/g (2.6.12). Solution témoin (b). Mélangez 2,0 ml de solution à examiner
Absence d’Escherichia coli (2.6.13). et 2,0 ml de solution témoin (a).
Absence de salmonelles (2.6.13). Plaque : plaque au gel de silice F254 pour CCM R.
Phase mobile : acide formique anhydre R, méthanol R,
ÉTIQUETAGE
chlorure de méthylène R (5:10:85 V/V/V).
Le type d’amidon à partir duquel est préparé l’amidon
prégélatinisé est indiqué. Dépôt : 50 μl de solution à examiner et de solution
témoin (a) ; 100 μl de solution témoin (b).
Développement : sur les 2/3 de la plaque.
01/2008:0803
corrigé 6.3 Séchage : dans un courant d’air froid.
Détection : pulvérisez de la solution d’iodobismuthate
AMIODARONE (CHLORHYDRATE D’) de potassium R1, puis de la solution diluée de peroxyde
d’hydrogène R et examinez immédiatement à la lumière du
jour.
Amiodaroni hydrochloridum
Conformité du système : solution témoin (b) :
— la tache due à l’impureté H est nettement visible.

TE
Limite :
— impureté H : s’il apparaît une tache de même RF que
la tache due à l’impureté H dans le chromatogramme
obtenu avec la solution témoin (b), elle n’est pas plus
intense que la tache du chromatogramme obtenu avec la
C25H30ClI2NO3 Mr 682 solution témoin (a) (0,02 pour cent).
[19774-82-4] Substances apparentées. Chromatographie liquide (2.2.29).
DÉFINITION LÈ Solution tampon pH 4,9. A 800 ml d’eau R, ajoutez
3,0 ml d’acide acétique glacial R, ajustez à pH 4,9 avec de
Chlorhydrate de (2-butylbenzofuran-3-yl)[4-[2- l’ammoniaque diluée R1 et complétez à 1000 ml avec de
(diéthylamino)éthoxy]-3,5-diiodophényl]méthanone. l’eau R.
Teneur : 98,5 pour cent à 101,0 pour cent (substance
desséchée). Solution à examiner. Dissolvez 0,125 g de chlorhydrate
d’amiodarone dans un mélange à volumes égaux
CARACTÈRES d’acétonitrile R et d’eau R puis complétez à 25,0 ml avec le
Aspect : poudre fine, cristalline, blanche ou sensiblement même mélange de solvants.
blanche. Solution témoin. Dissolvez 5 mg d’impureté D
d’amiodarone SCR, 5 mg d’impureté E d’amiodarone SCR
O
Solubilité : très peu soluble dans l’eau, facilement soluble
dans le chlorure de méthylène, soluble dans le méthanol, et 5,0 mg de chlorhydrate d’amiodarone SCR dans du
assez soluble dans l’éthanol à 96 pour cent. méthanol R puis complétez à 25,0 ml avec le même solvant.
Prélevez 1,0 ml de cette solution et complétez à 20,0 ml avec
IDENTIFICATION un mélange à volumes égaux d’acétonitrile R et d’eau R.
A. Spectrophotométrie d’absorption dans l’infrarouge Colonne :
BS

(2.2.24). — dimensions : l = 0,15 m, Ø = 4,6 mm,


Comparaison : chlorhydrate d’amiodarone SCR.
— phase stationnaire : gel de silice octadécylsilylé pour
B. Le chlorhydrate d’amiodarone donne la réaction (b) des chromatographie R (5 μm),
chlorures (2.3.1).
— température : 30 °C.
ESSAI Phase mobile : solution tampon pH 4,9, méthanol R,
Aspect de la solution. La solution est limpide (2.2.1) et n’est acétonitrile R (30:30:40 V/V/V).
pas plus fortement colorée que la solution témoin JV5 ou Débit : 1 ml/min.
JB5 (2.2.2, Procédé II). Détection : spectrophotomètre à 240 nm.
Dissolvez 1,0 g de chlorhydrate d’amiodarone dans du
O

méthanol R et complétez à 20 ml avec le même solvant. Injection : 10 μl.


Enregistrement : 2 fois le temps de rétention de
pH (2.2.3) : 3,2 à 3,8.
l’amiodarone.
Dissolvez 1,0 g de chlorhydrate d’amiodarone dans de l’eau
exempte de dioxyde de carbone R en chauffant à 80 °C, Rétention relative par rapport à l’amiodarone (temps de
refroidissez et complétez à 20 ml avec le même solvant. rétention = environ 24 min) : impureté A = environ 0,26 ;
impureté D = environ 0,29 ; impureté E = environ 0,37 ;
Impureté H. Chromatographie sur couche mince (2.2.27). impureté B = environ 0,49 ; impureté C = environ 0,55 ;
Préparez les solutions immédiatement avant l’emploi et impureté G = environ 0,62 ; impureté F = environ 0,69.
conservez-les à l’abri d’une lumière vive.
Conformité du système : solution témoin :
Solution à examiner. Dissolvez 0,500 g de chlorhydrate
d’amiodarone dans du chlorure de méthylène R et complétez — résolution : au minimum 3,5 entre les pics dus aux
à 5,0 ml avec le même solvant. impuretés D et E.
Solution témoin (a). Dissolvez 10,0 mg de chlorhydrate Limites :
de (2-chloroéthyl)diéthylamine R (impureté H) dans du — impuretés A, B, C, D, E, F, G : pour chaque impureté,
chlorure de méthylène R et complétez à 50,0 ml avec le au maximum la surface du pic dû à l’amiodarone dans
même solvant. Prélevez 2,0 ml de cette solution et complétez le chromatogramme obtenu avec la solution témoin
à 20,0 ml avec du chlorure de méthylène R. (0,2 pour cent),

4298 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 Amitriptyline (chlorhydrate d’)

— impuretés non spécifiées : pour chaque impureté, au IMPURETÉS


maximum 0,5 fois la surface du pic dû à l’amiodarone Impuretés spécifiées : A, B, C, D, E, F, G, H.
dans le chromatogramme obtenu avec la solution témoin
(0,10 pour cent),
— total : au maximum 2,5 fois la surface du pic dû à
l’amiodarone dans le chromatogramme obtenu avec la
solution témoin (0,5 pour cent),
— limite d’exclusion : 0,25 fois la surface du pic dû à
l’amiodarone dans le chromatogramme obtenu avec la
solution témoin (0,05 pour cent).
A. R1 = R2 = R4 = H, R3 = C2H5 : (2-butylbenzofuran-3-yl)[4-
Iodures : au maximum 150 ppm.
[2-(diéthylamino)éthoxy]phényl]méthanone,
Préparez la solution à examiner et la solution témoin
simultanément. B. R1 = R2 = I, R3 = R4 = H : (2-butylbenzofuran-3-yl)[4-[2-
(éthylamino)éthoxy]-3,5-diiodophényl]méthanone,

TE
Solution A. Ajoutez 1,50 g de chlorhydrate d’amiodarone à
40 ml d’eau R à 80 °C et agitez jusqu’à dissolution complète. C. R1 = I, R2 = R4 = H, R3 = C2H5 : (2-butylbenzofuran-3-
Refroidissez et complétez à 50,0 ml avec de l’eau R. yl)[4-[2-(diéthylamino)éthoxy]-3-iodophényl]méthanone,

Solution à examiner. A 15,0 ml de solution A, ajoutez G. R1 = R2 = I, R3 = C2H5, R4 = OCH3 : [4-[2-(diéthyl-


1,0 ml d’acide chlorhydrique 0,1 M, puis 1,0 ml d’iodate de amino)éthoxy]-3,5-diiodophényl][2-[(1RS)-1-
potassium 0,05 M et complétez à 20,0 ml avec de l’eau R. méthoxybutyl]benzofuran-3-yl]méthanone,
Laissez reposer à l’abri de la lumière pendant 4 h.
Solution témoin. A 15,0 ml de solution A, ajoutez 1,0 ml

d’acide chlorhydrique 0,1 M, puis 1,0 ml d’une solution
d’iodure de potassium R à 88,2 mg/l et 1,0 ml d’iodate de
potassium 0,05 M. Complétez à 20,0 ml avec de l’eau R.
Laissez reposer à l’abri de la lumière pendant 4 h.
Mesurez l’absorbance (2.2.25) des solutions à 420 nm, en
utilisant un mélange de 15,0 ml de solution A et de 1,0 ml D. R1 = R2 = I : (2-butylbenzofuran-3-yl)(4-hydroxy-3,5-
d’acide chlorhydrique 0,1 M complété à 20,0 ml avec de diiodophényl)méthanone,
l’eau R comme liquide de compensation. L’absorbance de
E. R1 = R2 = H : (2-butylbenzofuran-3-yl)(4-
O
la solution à examiner n’est pas supérieure à la moitié de
celle de la solution témoin. hydroxyphényl)méthanone,
Métaux lourds (2.4.8) : au maximum 20 ppm. F. R1 = I, R2 = H : (2-butylbenzofuran-3-yl)(4-hydroxy-3-
iodophényl)méthanone,
1,0 g de chlorhydrate d’amiodarone satisfait à l’essai C.
Préparez la solution témoin en utilisant 2 ml de solution
BS

témoin à 10 ppm de plomb (Pb) R.


Perte à la dessiccation (2.2.32) : au maximum 0,5 pour
cent, déterminé par chauffage à 50 °C sous une pression
ne dépassant pas 0,3 kPa pendant 4 h sur 1,000 g de
chlorhydrate d’amiodarone. H. 2-chloro-N,N-diéthyléthanamine (2-chlorotriéthylamine,
(2-chloroéthyl)diéthylamine).
Cendres sulfuriques (2.4.14) : au maximum 0,1 pour cent,
déterminé sur 1,0 g de chlorhydrate d’amiodarone.

01/2008:0464
O

DOSAGE corrigé 6.3

Dissolvez 0,600 g de chlorhydrate d’amiodarone dans un AMITRIPTYLINE (CHLORHYDRATE D’)


mélange de 5,0 ml d’acide chlorhydrique 0,01 M et de
75 ml d’éthanol à 96 pour cent R. Titrez par l’hydroxyde de
sodium 0,1 M et tracez la courbe potentiométrique (2.2.20). Amitriptylini hydrochloridum
Mesurez le volume d’hydroxyde de sodium 0,1 M utilisé
entre les 2 points d’inflexion.
1 ml d’hydroxyde de sodium 0,1 M correspond à 68,18 mg
de C25H30ClI2NO3.

CONSERVATION
A l’abri de la lumière, à une température ne dépassant pas C20H24ClN Mr 313,9
30 °C. [549-18-8]

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4299
Amitriptyline (chlorhydrate d’) PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

DÉFINITION Conformité du système : solution témoin (a) :


Chlorhydrate de 3-(10,11-dihydro-5H-dibenzo[a,d][7]annulén- — résolution : au minimum 2,0 entre les pics dus à
5-ylidène)-N,N-diméthylpropan-1-amine. l’impureté B et à l’amitriptyline.
Teneur : 99,0 pour cent à 101,0 pour cent (substance Limites :
desséchée). — impureté B : au maximum la surface du pic correspondant
dans le chromatogramme obtenu avec la solution
CARACTÈRES témoin (b) (0,1 pour cent),
Aspect : poudre blanche ou sensiblement blanche ou — impureté A : au maximum 0,5 fois la surface du pic
cristaux incolores. correspondant dans le chromatogramme obtenu avec la
Solubilité : facilement soluble dans l’eau, dans l’éthanol à solution témoin (b) (0,05 pour cent),
96 pour cent et dans le chlorure de méthylène. — impuretés non spécifiées : pour chaque impureté, au
maximum la surface du pic dû à l’amitriptyline dans le
IDENTIFICATION chromatogramme obtenu avec la solution témoin (b)
A. Spectrophotométrie d’absorption dans l’infrarouge (0,10 pour cent),
(2.2.24). — total : au maximum 3 fois la surface du pic dû à
l’amitriptyline dans le chromatogramme obtenu avec la

TE
Comparaison : chlorhydrate d’amitriptyline SCR.
solution témoin (b) (0,3 pour cent),
B. 20 mg de chlorhydrate d’amitriptyline donnent la
réaction (a) des chlorures (2.3.1). — limite d’exclusion : 0,5 fois la surface du pic dû à
l’amitriptyline dans le chromatogramme obtenu avec la
ESSAI solution témoin (b) (0,05 pour cent).
Aspect de la solution. La solution est limpide (2.2.1) et n’est Métaux lourds (2.4.8) : au maximum 20 ppm.
pas plus fortement colorée que la solution témoin B7 (2.2.2, 1,0 g de chlorhydrate d’amitriptyline satisfait à l’essai F.
Procédé II). Préparez la solution témoin avec 2 ml de solution à 10 ppm
Dissolvez 1,25 g de chlorhydrate d’amitriptyline dans de
LÈ de plomb (Pb) R.
l’eau R et complétez à 25 ml avec le même solvant. Perte à la dessiccation (2.2.32) : au maximum 0,5 pour cent,
Acidité ou alcalinité. Dissolvez 0,20 g de chlorhydrate déterminé à l’étuve à 105 °C pendant 2 h sur 1,000 g de
d’amitriptyline dans de l’eau exempte de dioxyde de chlorhydrate d’amitriptyline.
carbone R et complétez à 10 ml avec le même solvant. Cendres sulfuriques (2.4.14) : au maximum 0,1 pour cent,
Ajoutez 0,1 ml de solution de rouge de méthyle R et 0,2 ml déterminé sur 1,0 g de chlorhydrate d’amitriptyline.
d’hydroxyde de sodium 0,01 M. La solution est jaune.
Ajoutez 0,4 ml d’acide chlorhydrique 0,01 M. La solution DOSAGE
est rouge. Dissolvez 0,250 g de chlorhydrate d’amitriptyline dans
O
Substances apparentées. Chromatographie liquide (2.2.29). 30 ml d’éthanol à 96 pour cent R. Titrez par l’hydroxyde
de sodium 0,1 M. Déterminez le point de fin de titrage par
Solution à examiner. Dissolvez 50,0 mg de chlorhydrate potentiométrie (2.2.20).
d’amitriptyline dans la phase mobile et complétez à 50,0 ml
avec la phase mobile. 1 ml d’hydroxyde de sodium 0,1 M correspond à 31,39 mg
de C20H24ClN.
Solution témoin (a). Dissolvez 5,0 mg de
BS

dibenzosubérone SCR (impureté A) et 5,0 mg de CONSERVATION


chlorhydrate de cyclobenzaprine SCR (impureté B) dans
A l’abri de la lumière.
5,0 ml de solution à examiner, puis complétez à 100,0 ml
avec la phase mobile. IMPURETÉS
Solution témoin (b). Prélevez 1,0 ml de solution témoin (a) Impuretés spécifiées : A, B.
et complétez à 50,0 ml avec la phase mobile.
Autres impuretés décelables (si elles sont présentes à
Colonne : une teneur suffisante, les substances suivantes seront
— dimensions : l = 0,15 m, Ø = 4,6 mm, détectées par l’un des essais de la monographie. Elles sont
— phase stationnaire : polymère d’organosilice amorphe limitées par le critère général d’acceptation applicable
O

octadécylsilylé à groupement polaire intercalé aux autres impuretés ou impuretés non spécifiées,
postgreffé R (5 μm), ou par les dispositions de la monographie générale
Substances pour usage pharmaceutique (2034). Il n’est
— température : 40 °C. donc pas nécessaire de les identifier pour démontrer la
Phase mobile : mélangez 35 volumes d’acétonitrile R et conformité de la substance. Voir également chapitre 5.10.
65 volumes d’une solution de phosphate dipotassique R Contrôle des impuretés dans les substances pour usage
à 5,23 g/l préalablement ajustée à pH 7,0 avec de l’acide pharmaceutique) : C, D, E, F, G.
phosphorique R.
Débit : 1,2 ml/min.
Détection : spectrophotomètre à 220 nm.
Injection : 10 μl.
Enregistrement : 3 fois le temps de rétention de
l’amitriptyline.
Rétention relative par rapport à l’amitriptyline (temps de
rétention = environ 14 min) : impureté B = environ 0,9 ; A. 10,11-dihydro-5H-dibenzo[a,d][7]annulén-5-one
impureté A = environ 2,2. (dibenzosubérone),

4300 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 Amphotéricine B

01/2009:1292

AMPHOTÉRICINE B
Amphotericinum B

B. 3-(5H-dibenzo[a,d][7]annulén-5-ylidène)-N,N-
diméthylpropan-1-amine (cyclobenzaprine),

TE
C. 3-(10,11-dihydro-5H-dibenzo[a,d][7]annulén-5-ylidène)-N-
méthylpropan-1-amine (nortriptyline), C47H73NO17 Mr 924
[1397-89-3]
LÈ DÉFINITION
Mélange de polyènes antifongiques élaborés par la
croissance de certaines souches de Streptomyces
nodosus ou obtenus par tout autre moyen, constitué
en majeure partie d’amphotéricine B ou acide
(1R,3S,5R,6R,9R,11R,15S,16R,17R,18S,19E,21E,23E,25E,
27E,29E,31E,33R,35S,36R,37S)-33-[(3-amino-3,6-didésoxy-β-
D-mannopyranosyl)oxy]-1,3,5,6,9,11,17,37-octahydroxy-15,16,
18-triméthyl-13-oxo-14,39-dioxabicyclo[33.3.1]nonatriaconta-
D. R = CH2-CH2-CH2-N(CH3)2 : 5-[3-(diméthylamino)propyl]- 19,21,23,25,27,29,31-heptaène-36-carboxylique.
O
10,11-dihydro-5H-dibenzo[a,d][7]annulén-5-ol, Teneur : au minimum 750 UI/mg (substance desséchée).
CARACTÈRES
Aspect : poudre jaune ou orange, hygroscopique.
G. R = H : 10,11-dihydro-5H-dibenzo[a,d][7]annulén-5-ol
Solubilité : pratiquement insoluble dans l’eau, soluble
BS

(dibenzosubérol),
dans le diméthylsulfoxyde et dans le propylèneglycol, peu
soluble dans le diméthylformamide, très peu soluble dans le
méthanol, pratiquement insoluble dans l’éthanol à 96 pour
cent.
L’amphotéricine B est sensible à la lumière dans les solutions
diluées.
IDENTIFICATION
Première identification : B, D.
O

Seconde identification : A, C.
A. Spectrophotométrie d’absorption dans l’ultraviolet et le
E. N,N-diméthyl-3-(1,2,3,4,4a,10,11,11a-octahydro-5H- visible (2.2.25).
dibenzo[a,d][7]annulén-5-ylidène)propan-1-amine, Solution à examiner. Dissolvez 25 mg d’amphotéricine B
dans 5 ml de diméthylsulfoxyde R et complétez à
50 ml avec du méthanol R. Prélevez 2 ml de solution et
complétez à 200 ml avec du méthanol R.
Région spectrale : 300-450 nm.
Maximums d’absorption : à 362 nm, 381 nm et 405 nm.
Rapports des absorbances :
— A362/A381 = 0,57 à 0,61,
— A381/A405 = 0,87 à 0,93.
B. Spectrophotométrie d’absorption dans l’infrarouge
F. (5EZ,10RS)-5-[3-(diméthylamino)propylidène]-10,11- (2.2.24).
dihydro-5H-dibenzo[a,d][7]annulén-10-ol. Comparaison : amphotéricine B SCR.

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4301
Amphotéricine B PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

Si les spectres obtenus présentent des différences, séchez Phase mobile :


la substance à examiner et la substance de référence — phase mobile A : mélangez 1 volume de méthanol R,
à 60 °C sous une pression ne dépassant pas 0,7 kPa 3 volumes d’acétonitrile R et 6 volumes d’une solution
pendant 1 h et enregistrez de nouveaux spectres. d’acide citrique R à 4,2 g/l préalablement ajustée à
C. A 1 ml d’une solution d’amphotéricine B à 0,5 g/l pH 4,7 avec de l’ammoniaque concentrée R,
dans le diméthylsulfoxyde R, ajoutez 5 ml d’acide — phase mobile B : mélangez 12 volumes de méthanol R,
phosphorique R pour former la phase inférieure, en 20 volumes d’une solution d’acide citrique R à 4,2 g/l
évitant le mélange des 2 liquides. Un anneau bleu apparaît préalablement ajustée à pH 3,9 avec de l’ammoniaque
immédiatement à l’interface des 2 liquides. Mélangez, une concentrée R et 68 volumes d’acétonitrile R,
coloration bleu intense apparaît. Ajoutez 15 ml d’eau R
et mélangez, il se développe une coloration jaune pâle. Intervalle Phase mobile A Phase mobile B
D. Examinez les chromatogrammes obtenus dans l’essai des (min) (pour cent V/V) (pour cent V/V)
substances apparentées. 0-3 100 0

Résultats : le pic principal du chromatogramme obtenu 3 - 23 100 → 70 0 → 30


avec la solution à examiner à 383 nm est semblable 23 - 33 70 → 0 30 → 100
quant à son temps de rétention au pic principal du

TE
33 - 40 0 100
chromatogramme obtenu avec la solution témoin (a).
Débit : 0,8 ml/min.
ESSAI
Détection : spectrophotomètre :
Substances apparentées. Chromatographie liquide (2.2.29). — à 303 nm : détection des tétraènes,
Gardez les solutions à l’abri de la lumière et utilisez-les dans — à 383 nm : détection des heptaènes.
les 24 h suivant la préparation, à l’exception de la solution
témoin (c), qui doit être injectée dès sa préparation. Injection : 20 μl de la solution à examiner et des solutions
témoins (b), (c), (d) et (e).
Mélange de solvants : solution d’acétate d’ammonium R à

10 g/l, N-méthylpyrrolidone R, méthanol R (1:1:2: V/V/V). Identification des impuretés : utilisez les chromatogrammes
fournis avec l’amphotéricine B pour identification des
Solution à examiner. Dissolvez 20,0 mg d’amphotéricine B pics SCR et les chromatogrammes obtenus avec la solution
dans 15 ml de N-méthylpyrrolidone R et, dans les 2 h, témoin (e) pour identifier les pics dus aux impuretés A et B.
complétez à 50,0 ml avec le mélange de solvants. Prélevez
5,0 ml de solution et complétez à 25,0 ml avec le mélange Rétention relative par rapport à l’amphotéricine B (temps
de solvants. de rétention = environ 16 min) : impureté B = environ 0,75 ;
impureté A = environ 0,8 ; nystatine = environ 0,85.
Solution témoin (a). Dissolvez 20,0 mg d’ampho-
téricine B SCR dans 15 ml de N-méthylpyrrolidone R et, Conformité du système à 383 nm : solution témoin (d) :
O
dans les 2 h, complétez à 50,0 ml avec le mélange de solvants. — résolution : au minimum 1,5 entre les 2 pics présentant
Prélevez 5,0 ml de solution et complétez à 25,0 ml avec le une rétention relative d’environ 0,7.
mélange de solvants.
Limites :
Solution témoin (b). Prélevez 1,0 ml de solution témoin (a)
et complétez à 100,0 ml avec le mélange de solvants. — impureté A à 303 nm : au maximum 2,5 fois la surface
du pic principal du chromatogramme obtenu avec la
BS

Solution témoin (c). Dissolvez 20,0 mg de nystatine SCR solution témoin (c) (5,0 pour cent) ; si l’amphotéricine est
dans 15 ml de N-méthylpyrrolidone R et, dans les 2 h, destinée à la fabrication de préparations parentérales : au
complétez à 50,0 ml avec le mélange de solvants. Prélevez maximum la surface du pic principal du chromatogramme
5,0 ml de solution et complétez à 25,0 ml avec la solution A. obtenu avec la solution témoin (c) (2,0 pour cent) ;
Prélevez 2,0 ml de cette solution et complétez à 100,0 ml
— toute autre impureté à 303 nm : pour chaque impureté,
avec le mélange de solvants.
au maximum 0,5 fois la surface du pic principal du
Solution témoin (d). Pour la préparation in situ des chromatogramme obtenu avec la solution témoin (c)
impuretés B et C, dissolvez 10 mg d’amphotéricine B dans (1,0 pour cent) ;
5 ml de N-méthylpyrrolidone R et, dans les 2 h, ajoutez
— impureté B à 383 nm : au maximum 4 fois la surface du
35 ml d’un mélange de 1 volume de méthanol R et de
O

pic principal du chromatogramme obtenu avec la solution


4 volumes d’éthanol anhydre R. Ajoutez 0,10 ml d’acide
témoin (b) (4,0 pour cent) ;
chlorhydrique dilué R. Mélangez et mettez à incuber à
25 °C pendant 2,5 h. Ajoutez 10 ml d’une solution d’acétate — toute autre impureté à 383 nm : pour chaque impureté,
d’ammonium R à 10 g/l et mélangez. au maximum 2 fois la surface du pic principal du
chromatogramme obtenu avec la solution témoin (b)
Solution témoin (e). Dissolvez 4 mg d’amphotéricine B
(2,0 pour cent) ;
pour identification des pics SCR (contenant les impuretés A
et B) dans 5 ml de N-méthylpyrrolidone R et, dans les 2 h, — total à 303 et 383 nm : au maximum 15,0 pour cent ;
complétez à 50 ml avec le mélange de solvants. — limite d’exclusion à 303 nm : 0,05 fois la surface du pic
Solution à blanc. Le mélange de solvants. principal du chromatogramme obtenu avec la solution
témoin (c) (0,1 pour cent) ;
Colonne :
— limite d’exclusion à 383 nm : 0,1 fois la surface du pic
— dimensions : l = 0,15 m, Ø = 4,6 mm, principal du chromatogramme obtenu avec la solution
— phase stationnaire : gel de silice octadécylsilylé pour témoin (b) (0,1 pour cent).
chromatographie, désactivé pour les bases, postgreffé R Perte à la dessiccation (2.2.32) : au maximum 5,0 pour cent,
(3 μm), déterminé à l’étuve à 60 °C sous une pression ne dépassant
— température : 20 °C. pas 0,7 kPa sur 1,000 g d’amphotéricine B.

4302 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 Aprotinine

Cendres sulfuriques (2.4.14) : au maximum 3,0 pour cent,


déterminé sur 1,0 g d’amphotéricine B ; si l’amphotéricine B
est destinée à la fabrication de préparations parentérales :
au maximum 0,5 pour cent.
Endotoxines bactériennes (2.6.14) : moins de 1,0 UI/mg,
si l’amphotéricine B est destinée à la fabrication de
préparations parentérales sans autre procédé approprié
d’élimination des endotoxines bactériennes.

TITRAGE
Effectuez le titrage en maintenant les solutions à l’abri de
la lumière. Dissolvez 25,0 mg d’amphotéricine B dans du
diméthylsulfoxyde R et complétez, en agitant, à 25,0 ml avec
le même solvant. En maintenant sous agitation constante
cette solution mère, diluez avec du diméthylsulfoxyde R B. amphotéricine X1 (13-O-méthyl-amphotéricine B),
pour obtenir des solutions de concentration appropriée

TE
(les concentrations suivantes conviennent : 44,4 ; 66,7 et
100 UI/ml). Préparez les solutions finales en diluant au
1/20 avec la solution tampon phosphate pH 10,5 (0,2 M)
de manière qu’elles contiennent toutes 5 pour cent V/V
de diméthylsulfoxyde. Préparez la solution témoin et les
solutions à examiner simultanément. Effectuez le titrage
microbiologique des antibiotiques (2.7.2).

CONSERVATION LÈ
A l’abri de la lumière et à une température de 2 °C à 8 °C
dans un récipient étanche. Si la substance est stérile, elle est
conservée en récipient stérile, à fermeture inviolable.

ÉTIQUETAGE
L’étiquette indique, dans les cas appropriés, que la substance C. amphotéricine X2 (13-O-éthyl-amphotéricine B).
convient à la fabrication de préparations parentérales.
O
IMPURETÉS 01/2009:0580
Impuretés spécifiées : A, B.
APROTININE
Autres impuretés décelables (si elles sont présentes à
une teneur suffisante, les substances suivantes seront Aprotininum
détectées par l’un des essais de la monographie. Elles sont
BS

limitées par le critère général d’acceptation applicable


aux autres impuretés ou impuretés non spécifiées,
ou par les dispositions de la monographie générale
Substances pour usage pharmaceutique (2034). Il n’est
donc pas nécessaire de les identifier pour démontrer la
conformité de la substance. Voir également chapitre 5.10.
Contrôle des impuretés dans les substances pour usage
pharmaceutique) : C.
O

C284H432N84O79S7 Mr 6511
DÉFINITION
L’aprotinine est un polypeptide constitué par une chaîne de
58 acides aminés. L’aprotinine possède la propriété d’inhiber
stœchiométriquement l’activité de nombreuses enzymes
protéolytiques telles que la chymotrypsine, la kallikréine,
la plasmine et la trypsine. L’aprotinine titre au minimum
3,0 U. Ph. Eur. d’activité aprotinine par milligramme, calculé
par rapport à la substance desséchée.
PRODUCTION
Les animaux à partir desquels l’aprotinine est obtenue
répondent aux exigences de santé requises par les autorités
compétentes pour les animaux destinés à la consommation
humaine.
A. amphotéricine A (28,29-dihydro-amphotéricine B),

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4303
Aprotinine PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

Le procédé de fabrication fait l’objet d’une validation Aspect de la solution. La solution S est limpide (2.2.1).
permettant de démontrer que le produit satisferait aux essais Absorbance (2.2.25) : au maximum 0,80 en mesurant au
suivants s’ils lui étaient appliqués. maximum d’absorption à 277 nm.
Toxicité anormale (2.6.9). Injectez à chaque souris une Préparez une solution d’aprotinine contenant
quantité d’aprotinine contenant 2 U. Ph. Eur. dissoute dans 3,0 U. Ph. Eur./ml.
de l’eau pour préparations injectables R pour obtenir un
volume de 0,5 ml. Des-Ala-aprotinine et des-Ala-des-Gly-aprotinine.
Histamine (2.6.10) : au maximum 0,2 μg d’histamine base Electrophorèse capillaire de zone (2.2.47) : utilisez le
pour 3 U. Ph. Eur. procédé de normalisation.
CARACTÈRES Solution à examiner. Préparez une solution d’aprotinine
dans de l’eau R, contenant au minimum 1 U. Ph. Eur./ml.
Aspect : poudre sensiblement blanche, hygroscopique.
Solution témoin. Diluez la solution d’aprotinine PBR dans
Solubilité : soluble dans l’eau et dans les solutés isotoniques, de l’eau R de façon à obtenir la même concentration que
pratiquement insoluble dans les solvants organiques. la solution à examiner.
IDENTIFICATION Capillaire :
— matériau : silice fondue non recouverte,

TE
A. Chromatographie sur couche mince (2.2.27).
Solution à examiner. Solution S (voir Essai). — dimensions : longueur utile = 45-60 cm, Ø = 75 μm.
Solution témoin. Diluez la solution d’aprotinine PBR Température : 25 °C.
dans de l’eau R de façon à obtenir une concentration de Tampon ECZ. Dissolvez 8,21 g de phosphate
15 U. Ph. Eur./ ml. monopotassique R dans 400 ml d’eau R, ajustez à pH 3,0
Plaque : plaque au gel de silice G pour CCM R. avec de l’acide phosphorique R, complétez à 500,0 ml avec
de l’eau R et filtrez sur une membrane filtrante (diamètre
Phase mobile : eau R, acide acétique glacial R, nominal des pores 0,45 μm).
(80:100 V/V) contenant 100 g/l d’acétate de sodium R.
LÈ Détection : spectrophotomètre à 214 nm.
Dépôt : 10 μl.
Rinçage avant chaque analyse : rincez le capillaire pendant
Développement : sur un parcours de 12 cm. au moins 1 min avec de l’hydroxyde de sodium 0,1 M filtré
Séchage : à l’air. sur une membrane filtrante (diamètre nominal des pores
Détection : pulvérisez une solution de 0,1 g de 0,45 μm), puis pendant 2 min avec le tampon ECZ.
ninhydrine R dans un mélange de 6 ml d’une solution de Injection : sous pression ou sous vide (par exemple, 3 s sous
chlorure de cuivre R à 10 g/l, de 21 ml d’acide acétique une pression différentielle de 3,5 kPa).
glacial R et de 70 ml d’éthanol anhydre R. Séchez la Migration : appliquez un champ électrique de 0,2 kV/cm, en
plaque à 60 °C. utilisant le tampon ECZ comme solution électrolytique dans
O
Résultats : la tache principale du chromatogramme les 2 réservoirs de tampon.
obtenu avec la solution à examiner est semblable quant Enregistrement : 30 min.
à sa position, sa coloration et ses dimensions à la tache
principale du chromatogramme obtenu avec la solution Identification des impuretés : utilisez l’électrophorégramme
témoin. fourni avec la solution d’aprotinine PBR et
l’électrophorégramme obtenu avec la solution témoin pour
B. Déterminez la capacité d’inhibition de l’activité trypsique
BS

identifier les pics dus aux impuretés A et B.


en utilisant la méthode décrite ci-dessous.
Migration relative par rapport à l’aprotinine (temps de
Solution à examiner. Prélevez 1 ml de solution S et migration = environ 22 min) : impureté A = environ 0,98 ;
complétez à 50 ml avec de la solution tampon pH 7,2 R. impureté B = environ 0,99.
Solution de trypsine. Dissolvez 10 mg de trypsine PBR Conformité du système : solution témoin après au moins
dans de l’acide chlorhydrique 0,002 M et complétez à 6 injections :
100 ml avec le même acide.
— temps de migration : aprotinine = 19,0 min à 25,0 min ;
Solution de caséine. Dissolvez 0,2 g de caséine R dans
de la solution tampon pH 7,2 R et complétez à 100 ml — résolution : au minimum 0,8 entre les pics dus aux
avec la même solution tampon. impuretés A et B ; au minimum 0,5 entre les pics dus à
O

l’impureté B et à l’aprotinine ;
Solution de précipitation : acide acétique glacial R,
eau R, éthanol anhydre R (1:49:50 V/V/V). — distribution des pics : l’électrophorégramme obtenu
est qualitativement et quantitativement semblable
Mélangez 1 ml de solution à examiner et 1 ml de solution à l’électrophorégramme fourni avec la solution
de trypsine. Laissez reposer pendant 10 min, puis ajoutez d’aprotinine PBR ;
1 ml de solution de caséine. Faites incuber la solution
à 35 °C pendant 30 min. Refroidissez dans de l’eau — hauteur du pic principal : au minimum 1000 fois celle du
glacée et ajoutez 0,5 ml de solution de précipitation. bruit de fond. Si nécessaire, ajustez la durée d’injection
Agitez et laissez reposer à température ambiante pendant pour obtenir des pics de hauteur suffisante.
15 min. La solution présente un trouble. Effectuez un Limites :
essai à blanc dans les mêmes conditions en remplaçant la — impureté A : au maximum 8,0 pour cent,
solution à examiner par de la solution tampon pH 7,2 R.
— impureté B : au maximum 7,5 pour cent.
Il ne se forme aucun trouble.
Pyroglutamyl-aprotinine et composés apparentés.
ESSAI Chromatographie liquide (2.2.29) : utilisez le procédé de
Solution S. Préparez une solution d’aprotinine contenant normalisation.
15 U. Ph. Eur./ml sur la base de l’activité indiquée sur Solution à examiner. Préparez une solution d’aprotinine
l’étiquette. dans la phase mobile A, contenant environ 5 U. Ph. Eur./ml.

4304 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 Aprotinine

Solution témoin. Dissolvez le contenu d’un flacon Rétention relative par rapport au monomère d’aprotinine
d’aprotinine pour conformité du système SCR dans la (temps de rétention = 24,5 min à 25,5 min) : dimère
phase mobile A de façon à obtenir la même concentration d’aprotinine = environ 0,9.
que la solution à examiner. Conformité du système : solution témoin :
Colonne : — résolution : au minimum 1,3 entre les pics dus au dimère
— dimensions : l = 0,075 m, Ø = 7,5 mm, et au monomère d’aprotinine,
— phase stationnaire : gel de silice échangeur de cations — facteur de symétrie : au maximum 2,5 pour le pic dû au
forts pour chromatographie R (10 μm), monomère d’aprotinine.
— température : 40 °C. Limite :
Phase mobile : — total : au maximum 1,0 pour cent.
— phase mobile A : dissolvez 3,52 g de phosphate Perte à la dessiccation (2.2.32) : au maximum 6,0 pour cent,
monopotassique R et 7,26 g de phosphate disodique déterminé sous vide sur 0,100 g d’aprotinine.
dihydraté R dans 1000 ml d’eau ; filtrez et dégazez ; Endotoxines bactériennes (2.6.14) : moins de 0,14 UI
— phase mobile B : dissolvez 3,52 g de phosphate par Unité Pharmacopée Européenne, si l’aprotinine est
monopotassique R, 7,26 g de phosphate disodique destinée à la fabrication de préparations parentérales sans
dihydraté R et 66,07 g de sulfate d’ammonium R dans autre procédé approprié d’élimination des endotoxines

TE
1000 ml d’eau ; filtrez et dégazez ; bactériennes.
Intervalle Phase mobile A Phase mobile B
TITRAGE
(min) (pour cent V/V) (pour cent V/V)
0 - 21 92 → 64 8 → 36 L’activité de l’aprotinine est évaluée par détermination de
l’action inhibitrice qu’elle exerce sur l’activité d’une solution
21 - 30 64 → 0 36 → 100 de trypsine de titre connu. Le titre de l’activité inhibitrice de
30 - 31 0 → 92 100 → 8 l’aprotinine est calculé à partir de la différence entre le titre
initial et le titre résiduel en trypsine.
31 - 40 92 8
LÈ L’activité inhibitrice de l’aprotinine est exprimée en Unités
Débit : 1,0 ml/min. Pharmacopée Européenne ; 1 U. Ph. Eur. inhibe à 50 pour
Détection : spectrophotomètre à 210 nm. cent l’activité enzymatique de 2 microkatals de trypsine.
Injection : 40 μl. Utilisez un vase à réaction d’environ 30 ml muni :
Rétention relative par rapport à l’aprotinine (temps de — d’un dispositif permettant de maintenir la température à
rétention = 17,0 min à 20,0 min) : impureté C = environ 0,9. 25 ± 0,1 °C,
Conformité du système : solution témoin : — d’un dispositif d’agitation, tel qu’un agitateur magnétique,
— résolution : au minimum 1,5 entre les pics dus à — d’un couvercle pourvu de 5 orifices pour le passage de
l’impureté C et à l’aprotinine, chaque électrode, de l’extrémité de la burette, d’un tube
O
d’adduction d’azote, et pour l’introduction des réactifs.
— facteur de symétrie : au maximum 1,3 pour le pic dû à
l’aprotinine. Un appareil à titrage automatique ou manuel peut être
utilisé ; dans le second cas, la burette est graduée en
Limites : 0,05 ml et le pH-mètre est muni d’une échelle de lecture
— impureté C : au maximum 1,0 pour cent, étendue et d’électrodes de verre et au calomel ou de
verre-argent-chlorure d’argent.
BS

— toute autre impureté : au maximum 0,5 pour cent,


— total des impuretés autres que C : au maximum 1,0 pour Solution à examiner. Préparez une solution d’aprotinine
cent. dans la solution tampon borate 0,0015 M pH 8,0 R à une
concentration présumée de 1,67 U. Ph. Eur./ml, soit 0,6 mg
Oligomères d’aprotinine. Chromatographie d’exclusion environ (m mg) par millilitre.
(2.2.30) : utilisez le procédé de normalisation.
Solution de trypsine. Préparez une solution de trypsine PBR
Solution à examiner. Préparez une solution d’aprotinine contenant approximativement 0,8 microkatal par millilitre
dans de l’eau R, contenant environ 5 U. Ph. Eur./ml. (environ 1 mg/ml) dans de l’acide chlorhydrique 0,001 M.
Solution témoin. Traitez l’aprotinine de façon à obtenir Utilisez une solution récemment préparée et maintenez-la
environ 2 pour cent d’oligomères d’aprotinine. Par exemple, dans de l’eau glacée.
O

chauffez l’aprotinine lyophilisée à environ 110 °C pendant Solution de trypsine et d’aprotinine. A 4,0 ml de solution
environ 4 h. Dissolvez ensuite dans de l’eau R de façon à de trypsine, ajoutez 1,0 ml de solution à examiner.
obtenir une concentration d’environ 5 U. Ph. Eur./ml. Complétez immédiatement à 40,0 ml avec la solution
Colonne : 3 colonnes couplées en série : tampon borate 0,0015 M pH 8,0 R. Maintenez cette solution
— dimensions : l = 0,30 m, Ø = 7,8 mm, à température ambiante pendant 10 min, puis conservez-la
— phase stationnaire : gel de silice hydrophile dans de l’eau glacée. Utilisez la solution dans les 6 h qui
pour chromatographie R de qualité appropriée suivent sa préparation.
au fractionnement des protéines globulaires de Solution de trypsine diluée. Prélevez 0,5 ml de solution de
masse moléculaire relative comprise entre 20 000 et trypsine et complétez à 10,0 ml avec de la solution tampon
10 000 000 (8 μm). borate 0,0015 M pH 8,0 R. Maintenez cette solution à
Phase mobile : acétonitrile R, acide acétique glacial R, température ambiante pendant 10 min, puis conservez-la
eau R (2:2:6 V/V/V) ; filtrez et dégazez. dans de l’eau glacée.
Débit : 1,0 ml/min. Dans le vase à réaction, maintenu sous atmosphère
d’azote et sous agitation constante, introduisez 9,0 ml
Détection : spectrophotomètre à 277 nm.
de solution tampon borate 0,0015 M pH 8,0 R et 1,0 ml
Injection : 100 μl. d’une solution extemporanée de chlorhydrate d’ester
Enregistrement : 40 min. éthylique de benzoylarginine R à 6,9 g/l. Ajustez à pH 8,0

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4305
Aprotinine (solution concentrée d’) PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

avec de l’hydroxyde de sodium 0,1 M. Lorsque l’équilibre DÉFINITION


thermique (25 ± 0,1 °C) est atteint, ajoutez 1,0 ml de La solution concentrée d’aprotinine est une solution
solution de trypsine et d’aprotinine et déclenchez un d’un polypeptide constitué par une chaîne de 58 acides
chronomètre. Maintenez à pH 8,0 par addition d’hydroxyde aminés, l’aprotinine, qui possède la propriété d’inhiber
de sodium 0,1 M et notez toutes les 30 s les volumes ajoutés. stœchiométriquement l’activité de nombreuses enzymes
Suivez la réaction pendant 6 min. Déterminez le nombre de protéolytiques telles que la chymotrypsine, la kallikréine, la
millilitres d’hydroxyde de sodium 0,1 M utilisés par seconde plasmine et la trypsine. La solution concentrée d’aprotinine
(n1 ml). Effectuez un titrage dans les mêmes conditions titre au minimum 15,0 U. Ph. Eur. d’activité aprotinine par
avec 1,0 ml de solution de trypsine diluée. Déterminez le millilitre.
nombre de millilitres d’hydroxyde de sodium 0,1 M utilisés
par seconde (n2 ml). PRODUCTION
Calculez l’activité de l’aprotinine exprimée en Unités Les animaux à partir desquels la solution concentrée
Pharmacopée Européenne par milligramme à l’aide de d’aprotinine est obtenue répondent aux exigences de santé
l’expression suivante : requises par les autorités compétentes pour les animaux
destinés à la consommation humaine.
Le procédé de fabrication fait l’objet d’une validation
permettant de démontrer que le produit satisferait aux essais

TE
L’activité mesurée n’est pas inférieure à 90 pour cent
suivants s’ils lui étaient appliqués.
ni supérieure à 110 pour cent de l’activité indiquée sur
l’étiquette. Toxicité anormale (2.6.9). Injectez à chaque souris une
quantité de la solution concentrée d’aprotinine contenant
CONSERVATION 2 U. Ph. Eur. diluée dans de l’eau pour préparations
En récipient étanche, à fermeture inviolable, à l’abri de la injectables R pour obtenir un volume de 0,5 ml.
lumière. Histamine (2.6.10) : au maximum 0,2 μg d’histamine base
ÉTIQUETAGE pour 3 U. Ph. Eur.
L’étiquette indique : LÈ CARACTÈRES
— le nombre d’Unités Pharmacopée Européenne d’activité Aspect : liquide limpide et incolore.
de l’aprotinine par milligramme,
— dans les cas appropriés, que la substance convient à la IDENTIFICATION
fabrication de préparations parentérales. A. Chromatographie sur couche mince (2.2.27).
Solution à examiner. Solution S (voir Essai).
IMPURETÉS
Solution témoin. Diluez la solution d’aprotinine PBR
dans de l’eau R de façon à obtenir une concentration de
15 U. Ph. Eur./ ml.
O
Plaque : plaque au gel de silice G pour CCM R.
Phase mobile : eau R, acide acétique glacial R
(80:100 V/V) contenant 100 g/l d’acétate de sodium R.
Dépôt : 10 μl.
Développement : sur un parcours de 12 cm.
BS

Séchage : à l’air.
Détection : pulvérisez une solution de 0,1 g de
A. Ra = H, Rb = OH : aprotinine-(1-56)-peptide, ninhydrine R dans un mélange de 6 ml d’une solution de
chlorure de cuivre R à 10 g/l, de 21 ml d’acide acétique
B. Ra = H, Rb = Gly-OH : aprotinine-(1-57)-peptide, glacial R et de 70 ml d’éthanol anhydre R. Séchez la
C. Ra = Glp, Rb = Gly-Ala-OH : (5-oxoprolyl)aprotinine plaque à 60 °C.
(pyroglutamylaprotinine). Résultats : la tache principale du chromatogramme
obtenu avec la solution à examiner est semblable quant
01/2009:0579 à sa position, sa coloration et ses dimensions à la tache
principale du chromatogramme obtenu avec la solution
O

APROTININE témoin.
B. Déterminez la capacité d’inhibition de l’activité trypsique
(SOLUTION CONCENTRÉE D’) en utilisant la méthode décrite ci-dessous.
Solution à examiner. Prélevez 1 ml de solution S et
Aprotinini solutio concentrata complétez à 50 ml avec de la solution tampon pH 7,2 R.
Solution de trypsine. Dissolvez 10 mg de trypsine PBR
dans de l’acide chlorhydrique 0,002 M et complétez à
100 ml avec le même acide.
Solution de caséine. Dissolvez 0,2 g de caséine R dans
de la solution tampon pH 7,2 R et complétez à 100 ml
avec la même solution tampon.
Solution de précipitation : acide acétique glacial R,
eau R, éthanol anhydre R (1:49:50 V/V/V).
Mélangez 1 ml de solution à examiner et 1 ml de solution
de trypsine. Laissez reposer pendant 10 min, puis ajoutez
C284H432N84O79S7 Mr 6511 1 ml de solution de caséine. Faites incuber la solution

4306 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 Aprotinine (solution concentrée d’)

à 35 °C pendant 30 min. Refroidissez dans de l’eau — hauteur du pic principal : au minimum 1000 fois celle du
glacée et ajoutez 0,5 ml de solution de précipitation. bruit de fond. Si nécessaire, ajustez la durée d’injection
Agitez et laissez reposer à température ambiante pendant pour obtenir des pics de hauteur suffisante.
15 min. La solution présente un trouble. Effectuez un Limites :
essai à blanc dans les mêmes conditions en remplaçant la — impureté A : au maximum 8,0 pour cent,
solution à examiner par de la solution tampon pH 7,2 R.
Il ne se forme aucun trouble. — impureté B : au maximum 7,5 pour cent.
Pyroglutamyl-aprotinine et composés apparentés.
ESSAI Chromatographie liquide (2.2.29) : utilisez le procédé de
Solution S. Préparez une solution contenant 15 U. Ph. Eur. normalisation.
d’aprotinine par millilitre, si nécessaire par dilution de la Solution à examiner. Préparez, à partir de la solution
solution concentrée sur la base de l’activité indiquée sur concentrée d’aprotinine, une solution dans la phase mobile A
l’étiquette. contenant environ 5 U. Ph. Eur./ml.
Aspect de la solution. La solution S est limpide (2.2.1). Solution témoin. Dissolvez le contenu d’un flacon
Absorbance (2.2.25) : au maximum 0,80 en mesurant au d’aprotinine pour conformité du système SCR dans la
maximum d’absorption à 277 nm. phase mobile A de façon à obtenir la même concentration
Préparez à partir de la solution concentrée d’aprotinine une que la solution à examiner.

TE
solution contenant 3,0 U. Ph. Eur./ml. Colonne :
— dimensions : l = 0,075 m, Ø = 7,5 mm,
Des-Ala-aprotinine et des-Ala-des-Gly-aprotinine. — phase stationnaire : gel de silice échangeur de cations
Electrophorèse capillaire de zone (2.2.47) : utilisez le forts pour chromatographie R (10 μm),
procédé de normalisation. — température : 40 °C.
Solution à examiner. Préparez, à partir de la solution Phase mobile :
concentrée d’aprotinine, une solution dans de l’eau R
contenant au minimum 1 U. Ph. Eur./ml. — phase mobile A : dissolvez 3,52 g de phosphate
monopotassique R et 7,26 g de phosphate disodique
Solution témoin. Diluez la solution d’aprotinine PBR dans

Capillaire :
— matériau : silice fondue non recouverte,

de l’eau R de façon à obtenir la même concentration que
la solution à examiner.
dihydraté R dans 1000 ml d’eau ; filtrez et dégazez ;
— phase mobile B : dissolvez 3,52 g de phosphate
monopotassique R, 7,26 g de phosphate disodique
dihydraté R et 66,07 g de sulfate d’ammonium R dans
1000 ml d’eau ; filtrez et dégazez ;
— dimensions : longueur utile = 45-60 cm, Ø = 75 μm.
Intervalle Phase mobile A Phase mobile B
Température : 25 °C. (min) (pour cent V/V) (pour cent V/V)
Tampon ECZ. Dissolvez 8,21 g de phosphate 0 - 21 92 → 64 8 → 36
monopotassique R dans 400 ml d’eau R, ajustez à pH 3,0
O
21 - 30 64 → 0 36 → 100
avec de l’acide phosphorique R, complétez à 500,0 ml avec
de l’eau R et filtrez sur une membrane filtrante (diamètre 30 - 31 0 → 92 100 → 8
nominal des pores 0,45 μm). 31 - 40 92 8
Détection : spectrophotomètre à 214 nm.
Rinçage avant chaque analyse : rincez le capillaire pendant Débit : 1,0 ml/min.
BS

au moins 1 min avec de l’hydroxyde de sodium 0,1 M filtré Détection : spectrophotomètre à 210 nm.
sur une membrane filtrante (diamètre nominal des pores Injection : 40 μl.
0,45 μm), puis pendant 2 min avec le tampon ECZ. Rétention relative par rapport à l’aprotinine (temps de
Injection : sous pression ou sous vide (par exemple, 3 s sous rétention = 17,0 min à 20,0 min) : impureté C = environ 0,9.
une pression différentielle de 3,5 kPa).
Conformité du système : solution témoin :
Migration : appliquez un champ électrique de 0,2 kV/cm, en
— résolution : au minimum 1,5 entre les pics dus à
utilisant le tampon ECZ comme solution électrolytique dans
l’impureté C et à l’aprotinine,
les 2 réservoirs de tampon.
Enregistrement : 30 min. — facteur de symétrie : au maximum 1,3 pour le pic dû à
l’aprotinine.
O

Identification des impuretés : utilisez l’électrophorégramme


fourni avec la solution d’aprotinine PBR et Limites :
l’électrophorégramme obtenu avec la solution témoin pour — impureté C : au maximum 1,0 pour cent,
identifier les pics dus aux impuretés A et B. — toute autre impureté : au maximum 0,5 pour cent,
Migration relative par rapport à l’aprotinine (temps de — total des impuretés autres que C : au maximum 1,0 pour
migration = environ 22 min) : impureté A = environ 0,98 ; cent.
impureté B = environ 0,99. Oligomères d’aprotinine. Chromatographie d’exclusion
Conformité du système : solution témoin après au moins (2.2.30) : utilisez le procédé de normalisation.
6 injections : Solution à examiner. Préparez, à partir de la solution
— temps de migration : aprotinine = 19,0 min à 25,0 min ; concentrée d’aprotinine, une solution dans de l’eau R
— résolution : au minimum 0,8 entre les pics dus aux contenant environ 5 U. Ph. Eur./ml.
impuretés A et B ; au minimum 0,5 entre les pics dus à Solution témoin. Traitez la solution concentrée d’aprotinine
l’impureté B et à l’aprotinine ; de façon à obtenir environ 2 pour cent d’oligomères
— distribution des pics : l’électrophorégramme obtenu d’aprotinine. Par exemple, chauffez l’aprotinine lyophilisée à
est qualitativement et quantitativement semblable environ 110 °C pendant environ 4 h. Dissolvez ensuite dans
à l’électrophorégramme fourni avec la solution de l’eau R de façon à obtenir une concentration d’environ
d’aprotinine PBR ; 5 U. Ph. Eur./ml.

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4307
Aprotinine (solution concentrée d’) PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

Colonne : 3 colonnes couplées en série : Solution à examiner. Préparez une dilution appropriée (D)
de la solution concentrée d’aprotinine dans la solution
— dimensions : l = 0,30 m, Ø = 7,8 mm,
tampon borate 0,0015 M pH 8,0 R de façon à obtenir une
— phase stationnaire : gel de silice hydrophile solution supposée contenir, sur la base de l’activité indiquée,
pour chromatographie R de qualité appropriée 1,67 U. Ph. Eur./ml.
au fractionnement des protéines globulaires de
masse moléculaire relative comprise entre 20 000 et Solution de trypsine. Préparez une solution de trypsine PBR
10 000 000 (8 μm). contenant approximativement 0,8 microkatal par millilitre
(environ 1 mg/ml) dans de l’acide chlorhydrique 0,001 M.
Phase mobile : acétonitrile R, acide acétique glacial R, Utilisez une solution récemment préparée et maintenez-la
eau R (2:2:6 V/V/V) ; filtrez et dégazez. dans de l’eau glacée.
Débit : 1,0 ml/min. Solution de trypsine et d’aprotinine. A 4,0 ml de solution
Détection : spectrophotomètre à 277 nm. de trypsine, ajoutez 1,0 ml de solution à examiner.
Complétez immédiatement à 40,0 ml avec la solution
Injection : 100 μl. tampon borate 0,0015 M pH 8,0 R. Maintenez cette solution
Enregistrement : 40 min. à température ambiante pendant 10 min, puis conservez-la
dans de l’eau glacée. Utilisez la solution dans les 6 h qui
Rétention relative par rapport au monomère d’aprotinine

TE
suivent sa préparation.
(temps de rétention = 24,5 min à 25,5 min) : dimère
d’aprotinine = environ 0,9. Solution de trypsine diluée. Prélevez 0,5 ml de solution de
Conformité du système : solution témoin : trypsine et complétez à 10,0 ml avec de la solution tampon
borate 0,0015 M pH 8,0 R. Maintenez cette solution à
— résolution : au minimum 1,3 entre les pics dus au dimère température ambiante pendant 10 min, puis conservez-la
et au monomère d’aprotinine, dans de l’eau glacée.
— facteur de symétrie : au maximum 2,5 pour le pic dû au Dans le vase à réaction, maintenu sous atmosphère
monomère d’aprotinine. LÈ d’azote et sous agitation constante, introduisez 9,0 ml
Limite : de solution tampon borate 0,0015 M pH 8,0 R et 1,0 ml
d’une solution extemporanée de chlorhydrate d’ester
— total : au maximum 1,0 pour cent. éthylique de benzoylarginine R à 6,9 g/l. Ajustez à
Activité spécifique du résidu sec : au minimum pH 8,0 avec de l’hydroxyde de sodium 0,1 M. Lorsque
3,0 U. Ph. Eur. d’activité d’aprotinine par milligramme de l’équilibre thermique (25 ± 0,1 °C) est atteint, ajoutez 1,0 ml
résidu sec. de solution de trypsine et d’aprotinine et déclenchez un
chronomètre. Maintenez à pH 8,0 par addition d’hydroxyde
Evaporez à siccité 25,0 ml de la solution concentrée de sodium 0,1 M et notez toutes les 30 s les volumes ajoutés.
d’aprotinine au bain-marie ; desséchez le résidu à 110 °C Suivez la réaction pendant 6 min. Déterminez le nombre de
pendant 15 h et pesez-le. A partir de la masse du résidu et de millilitres d’hydroxyde de sodium 0,1 M utilisés par seconde
O
l’activité déterminée ci-dessous, calculez le nombre d’Unités (n ml). Effectuez un titrage dans les mêmes conditions
1
Pharmacopée Européenne par milligramme de résidu sec. avec 1,0 ml de solution de trypsine diluée. Déterminez le
Endotoxines bactériennes (2.6.14) : moins de 0,14 UI par nombre de millilitres d’hydroxyde de sodium 0,1 M utilisé
Unité Pharmacopée Européenne, si la solution concentrée par seconde (n2 ml).
d’aprotinine est destinée à la fabrication de préparations
parentérales sans autre procédé approprié d’élimination des Calculez l’activité de l’aprotinine exprimée en Unités
BS

endotoxines bactériennes. Pharmacopée Européenne par millilitre à l’aide de


l’expression suivante :
TITRAGE
L’activité de l’aprotinine est évaluée par détermination de
l’action inhibitrice qu’elle exerce sur l’activité d’une solution D = facteur de dilution de la solution concentrée
de trypsine de titre connu. Le titre de l’activité inhibitrice de d’aprotinine à examiner pour obtenir une solution
l’aprotinine est calculé à partir de la différence entre le titre contenant 1,67 U. Ph. Eur./ml.
initial et le titre résiduel en trypsine.
O

L’activité mesurée n’est pas inférieure à 90 pour cent


L’activité inhibitrice de l’aprotinine est exprimée en Unités ni supérieure à 110 pour cent de l’activité indiquée sur
Pharmacopée Européenne ; 1 U. Ph. Eur. inhibe à 50 pour l’étiquette.
cent l’activité enzymatique de 2 microkatals de trypsine.
Utilisez un vase à réaction d’environ 30 ml muni :
CONSERVATION
— d’un dispositif permettant de maintenir la température à
25 ± 0,1 °C, En récipient étanche, à fermeture inviolable, à l’abri de la
lumière.
— d’un dispositif d’agitation, tel qu’un agitateur magnétique,
— d’un couvercle pourvu de 5 orifices pour le passage de
ÉTIQUETAGE
chaque électrode, de l’extrémité de la burette, d’un tube
d’adduction d’azote, et pour l’introduction des réactifs. L’étiquette indique :
Un appareil à titrage automatique ou manuel peut être — le nombre d’Unités Pharmacopée Européenne d’activité
utilisé ; dans le second cas, la burette est graduée en de l’aprotinine par millilitre,
0,05 ml et le pH-mètre est muni d’une échelle de lecture
étendue et d’électrodes de verre et au calomel ou de — dans les cas appropriés, que la substance convient à la
verre-argent-chlorure d’argent. fabrication des préparations parentérales.

4308 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3 Arnica (fleur d’)

IMPURETÉS

A. Ra = H, Rb = OH : aprotinine-(1-56)-peptide,

B. Ra = H, Rb = Gly-OH : aprotinine-(1-57)-peptide,

C. Ra = Glp, Rb = Gly-Ala-OH : (5-oxoprolyl)aprotinine

TE
(pyroglutamylaprotinine).

04/2008:1391
corrigé 6.3

ARNICA (FLEUR D’) LÈ


Arnicae flos
DÉFINITION
A. Epiderme de la corolle des E. Epiderme de la corolle avec cuticule
Capitule, entier ou brisé, séché, d’Arnica montana L. fleurs ligulées avec poil tecteur vu striée et poil sécréteur bisérié vu de
Teneur : au minimum 0,40 pour cent m/m de sesquiterpènes de face (Aa) et vu de profil (Ab) face (Ea) et vu de profil (Eb)
lactoniques totaux, exprimés en tiglate de dihydrohélénaline B. Poil sécréteur à tête F. Poil tecteur de l’ovaire vu de face
(drogue desséchée). pluricellulaire (Fa) et vu de profil (Fb)
O
C. Soies du calice G. Poil sécréteur de l’ovaire
CARACTÈRES D. Grain de pollen
Odeur aromatique. Figure 1391.-1. – Dessin pour l’identification de la fleur
Le capitule, étalé, a un diamètre d’environ 20 mm et une d’arnica (voir Identification B)
profondeur d’environ 15 mm et possède un pédoncule B. Séparez les différentes parties du capitule. Examinez
de 2-3 cm de longueur. L’involucre est constitué de
BS

au microscope en utilisant de la solution d’hydrate de


18-24 bractées lancéolées, allongées, aiguës à leur sommet, chloral R. La poudre présente les éléments suivants :
disposées sur 1-2 rangées ; les bractées sont longues les épidermes des bractées de l’involucre présentent
d’environ 8-10 mm, vertes et possèdent des poils externes des stomates et des poils, ceci avec une fréquence
vert-jaune, visibles à la loupe. Le réceptacle convexe, d’un plus grande sur la face externe (abaxiale). Les poils
diamètre d’environ 6 mm, possède des alvéoles et est garni sont de plusieurs types : poils tecteurs unisériés,
de poils. Il porte sur son pourtour une vingtaine de fleurons pluricellulaires, de longueur variable de 50-500 μm,
ligulés mesurant 20-30 mm de long et, sur son disque, un particulièrement abondants sur les bords de la bractée ;
nombre plus considérable de fleurons tubulés mesurant poils sécréteurs à pied pluricellulaire, uni ou bisérié, à
environ 15 mm de long. L’ovaire mesure 4-8 mm de long ; tête globuleuse, pluricellulaire, mesurant environ 300 μm
O

il est surmonté d’un pappus de soies blanchâtres mesurant de long, abondants sur la face externe de la bractée ;
4-8 mm de long. Quelques akènes, bruns, surmontés ou non poils sécréteurs, à pied pluricellulaire, unisérié, à tête
du pappus, peuvent être présents. globuleuse, pluricellulaire, mesurant environ 80 μm
de long, fréquents sur la face interne de la bractée.
IDENTIFICATION L’épiderme de la corolle ligulée est constitué par des
A. L’involucre est composé de bractées ovales-allongées et cellules lobées ou allongées, quelques stomates et des
aiguës à leur sommet ; leur bord est cilié. Le fleuron poils de différents types : poils tecteurs à extrémité
ligulé a un calice réduit surmonté d’une couronne de très effilée, dont la longueur peut dépasser 500 μm,
soies blanchâtres, fines et brillantes, revêtues de petits constitués par 1-3 cellules proximales à parois épaissies
poils rudes. La corolle jaune orangé porte 7-10 nervures et 2-4 cellules distales, à parois fines ; poils sécréteurs
parallèles et se termine par 3 petits lobes. Les étamines à tête pluricellulaire bisériée ; poils sécréteurs à pied
à anthères libres sont incomplètement développées. pluricellulaire et à tête globuleuse pluricellulaire.
L’ovaire, étroit, brun, est surmonté du stigmate divisé en L’extrémité de la ligule porte des cellules en papilles
2 branches incurvées vers l’extérieur. Le fleuron tubulé arrondies. L’épiderme de l’ovaire est recouvert de
est actinomorphe. L’ovaire et le calice sont semblables poils : poils sécréteurs à pied court et tête globuleuse
à ceux de la fleur ligulée. La corolle, courte, possède 5 pluricellulaire ; poils tecteurs géminés et constitués, le
lobes triangulaires réfléchis ; les 5 étamines fertiles sont plus souvent, par 2 cellules accolées longitudinalement,
soudées par les anthères. la paroi commune étant ponctuée ; leur extrémité est

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 4309
Arnica (fleur d’) PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 6.3

effilée et parfois bifide. Les épidermes du calice sont Chauffez, en agitant, dans un bain-marie à 60 °C pendant
constitués par des cellules allongées portant des poils 5 min. Refroidissez et filtrez.
tecteurs courts, unicellulaires, orientés vers l’extrémité Solution témoin. Dissolvez 2,0 mg d’acide caféique R,
supérieure de la soie. Les grains de pollen, d’un diamètre 2,0 mg d’acide chlorogénique R et 5,0 mg de rutine R dans
d’environ 30 μm, sont arrondis, à exine échinulée ; ils du méthanol R et complétez à 30 ml avec le même solvant.
présentent 3 pores germinatifs.
Plaque : plaque au gel de silice pour CCM R.
Phase mobile : acide formique anhydre R,
eau R, méthyléthylcétone R, acétate d’éthyle R
(10:10:30:50 V/V/V/V).
Dépôt : 15 μl, en bandes.
Développement : sur un parcours de 15 cm.