UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS AGRONOMICAS

CICLO BASICO
BIOQUÍMICA

BIOSÍNTESIS
DE LAS
MOLECULAS
DE LA VIDA

ALEJANDRO RIQUELME

2001
 2

SINTESIS O DUPLICACIÓN DEL ADN

Molécula de la vida.

El ADN es la molécula de la herencia en todos los organismos vivos

(procariontes y eucariontes). Sin embargo, en el caso de los virus, el
material genético puede ser ADN o ARN.

Todos los ADN están formados por dos muy largas cadenas
helicoidales de bases nitrogenadas, que son:

A : adenina
Purinas
G : guanina
T : timina
C : citosina Pirimidinas

Estas bases se encuentran enrolladas a lo largo de un eje común.

Las dos hebras de la doble hélice están dispuestas en direcciones
opuestas, es decir, mientras una tiene dirección 5´  3´ la otra
tiene dirección 3´  5´.

Ejemplo de una molécula de ADN: 5´ ACTCGGAATGC 3´

3´ TGAGCCTTACG 5´

Las dos cadenas permanecen juntas por enlaces de hidrógeno entre

los pares de bases:

- Adenina siempre se aparea con Timina (unidas por dos

enlaces de hidrógeno)
- Guanina está siempre apareada con Citosina (unidas por
tres enlaces de hidrógeno).

De esto se desprende que una de las hebras de la molécula de ADN

es la complementaria de la otra.

Toda la información genética o de la herencia es codificada por una

secuencia precisa de bases a lo largo de la hebra de ADN.

La mayoría de las moléculas de ADN tienen la característica de ser

circulares.
 3

Además el eje de la doble hélice de un ADN circular puede girar en

sí mismo, formándose una superhélice. Esta estructura recibe el
nombre de ADN sobreenrrollado, que es una forma más compacta
que una molécula relajada (sin giro sobre su propio eje).

ADN relajado ADN sobrenrollado

Durante el proceso de duplicación de la molécula de ADN, lo primero

que debe ocurrir es el desenrollamiento del ADN sobrenrollado y
luego las dos hebras del ADN son separadas para que se pueda
sintetizar una nueva molécula de ADN. Cada hebra padre actúa
como patrón para la formación de la nueva hebra complementaria.

Experimento para probar que el ADN es el material genético.

Meselson y Stahl, en 1958, comprobaron que la duplicación del

ADN es semi-conservativa, esto quiere decir, que cada molécula hija
recibe una de las hebras del ADN padre.

Los investigadores crecieron bacterias en un medio que contenía

N-15 (nitrógeno 15; un isótopo de nitrógeno) y luego las bacterias
fueron transferidas a un medio con N-14 (nitrógeno 14; el isótopo
normal de nitrógeno), después ellos analizaron el ADN extraído en
cada generación obtenida (es decir, extrajeron el ADN después de
los ciclo reproductivo). Los resultados indicaron que el ADN de las
bacterias crecidas con N-15 estaban marcadas con N-15. En la
generación siguiente, después de ser transferidas al medio que
contenía N-14, ellos obtuvieron un ADN híbrido, marcado tanto con
N-14 como con N-15. Y en la siguiente generación encontraron una
mezcla de dos tipos de ADN; una molécula de ADN marcada con N-
14 y la otra molécula correspondió a un ADN híbrido (mezcla de N-
14 y N-15)
 4

Si tenemos que N-15 =  y N-14 = ▌

Generaciones

0 1 2

 ▌ ▌ ▌ ▌▌ ▌▌ ▌
 ▌ ▌ ▌ ▌▌ ▌▌ ▌
 ▌ + ▌ ▌ + ▌▌ + ▌▌ + ▌
 ▌ ▌ ▌ ▌▌ ▌▌ ▌
 ▌ ▌ ▌ ▌▌ ▌▌ ▌
doble hebra de ADN 2 ADN marcado con 2 ADN marcados con N-14 y N-15
marcada con N-15 N-14 y N-15 2 ADN con N-14

Figura 1. Esquema del experimento de Meselson y Stahl

demostrando que la duplicación es semi-conservativa.

Requerimientos para la duplicación del ADN.

En todos los organismos los requerimientos generales para la

síntesis de ADN son los mismos:

- una hebra de ADN como molde, en otras palabras una

sección de ADN que será copiado.

- la enzima encargada de copiar el ADN, llamada ADN

polimerasa.

El proceso de síntesis puede ser resumido como sigue:

Mg+2
d (NMP)n + d NTP d (NMP)n+1 + PPi

ADN polimerasa
 5

donde d NTP es el deoxirribonucleósido trifosfato y d (NMP)n se

refiere a un polímero de n deoxirribonucleotidos. El pirofosfato (PPi)
generado por la reacción anterior es hidrolizado a fosfato inorgánico
conduciendo la reacción hacia la derecha ( PPi 2Pi) .

Enzimas que participan en la duplicación.

En procariontes.-
La duplicación es un proceso complejo en la que participan muchas
proteínas. En bacterias, como E.coli, existen 3 polimerasas
(Tabla I) y una ADN ligasa.

- ADN polimerasa I.

Es una de las enzimas que es capaz de catalizar la síntesis

de ADN.
Posee una sola cadena polipetídica de 109 kDa.
Contiene un átomo de zinc como cofactor.
Esta enzima sintetiza en la dirección 5´-->3´ ( ver fig. 2).

Todas las ADN polimerasas poseen una actividad exonucleasa;

esto corresponde a la actividad de hidrolizar el ADN de hebra simple,
removiendo deoxirribonucleotidos terminales desde el extremo 3´
(actividad exonucleasa 3´ 5´) o desde el extremo 5´ (actividad
exonucleasa 5´ 3´).

- ADN polimerasa II

Esta enzima sintetiza ADN en forma similar a la ADN polimerasa I,

pero no tiene actividad exonucleasa 5´ 3´.

-ADN polimerasa III

La enzima esta compuesta por lo menos por 10 subunidades. Todas

las subunidades son requeridas para que la enzima exprese su
 6

actividad total. Esta enzima es la responsable de la síntesis de

ADN en E.coli.

Tabla I. ADN polimerasas de E. coli.

Base
Polimerasa Mr (kDa) Moléculas sintetizada Dirección
por célula por a) polimer.
segundo b) exonucl.

I 109 400 16-20 a) 5’ 3’

b) 3’ 5’
y 5’ 3’

II 120 17-100 2-5 a) 5’ 3’

b) 3’ 5’

III 180 10 250-1000 a) 5’ 3’

b) 3’ 5’
y 5’ 3’

Origen de duplicación.

La síntesis del cromosoma de E.coli siempre comienza en el mismo

punto, llamado sitio ori C, una región de 245 pares de bases.

oriC
 7

Enzimas que participan en la síntesis de ADN en Eucariontes.

Por otro lado, existen cinco polimerasas en eucariontes son

conocidas como alfa , beta , gamma , delta y épsilon. Todos ellas
tienen mecanismos de acción similares a las enzimas en
procariontes (E.coli).
- Las ADN polimerasas alfa y delta son las encargadas de la
duplicación del ADN cromosomal.
- La ADN polimerasa beta consistente de una sola cadena
polipeptídica es la responsable de la reparación del ADN.
- La ADN polimerasa gamma se encuentra en mitocondrias
y es responsable de la duplicación del ADN mitocondrial.
- La ADN polimerasa épsilon, enzima recientemente
descubierta y su actividad es similar a la polimerasa delta.

Proceso General de Síntesis de ADN (Fig. 2).

Las hebras de ADN son antiparalelas y la cadena del ADN que va

en dirección 3´  5´ es copiada directamente por la enzima ADN
polimerasa III. La hebra hija sintetizada (5´ 3´) es llamada
HEBRA PRINCIPAL o ADELANTADA.

La otra hebra del ADN padre que tiene la dirección opuesta, 5´ 3´,
no puede ser copiada directamente, debido que no es sustrato para
la enzima y solamente puede ser sintetizada hasta que una parte
del ADN se ha desdoblado. La hebra hija resultante se llama
HEBRA RETRASADA y es sintetizada en forma discontinua.

Esta síntesis discontinua resulta de la formación de cortas secciones

de ADN de aproximadamente 1000 a 2000 nucleótidos que reciben
el nombre de FRAGMENTOS DE OKASAKI. Estas secciones son
unidas por la acción de la enzima ADN ligasa produciendo una
hebra de ADN continua, que algunas veces se conoce como ADN+.

ADN girasa (reduce los giros)

Proteinas SSB (cubren ADN de
una hebra)
 8

Helicasas
(desdobla ADN) Primosoma (hace el “primer”)

Holopolimerasa III
Primer (agrega dNTPs)

Topoisomerasa
(relaja tensión) El primer es
removido y
llenado el
espacio
Hebra Hebra
Adelantada Retrasada Pol I

Ligasa

Figura 2. Proceso de síntesis de ADN.

Previo a la síntesis.

Previo al proceso de síntesis del ADN propiamente tal, el ADN

padre de doble hebra debe desenrollarse, para lo cual se requiere la
acción de la proteína REP o HELICASA que necesita energía
proveniente del ATP. Además en este proceso de desenrollamiento
participa la enzima ADN girasa, que actúa dando giros negativos al
ADN padre cuando este se encuentra sobre enrollado.

Etapa inicial de la síntesis.

Para comenzar la síntesis de ADN se requiere la presencia de

doble hebra como patrón-cebador. La segunda hebra corresponde
a una hebra de ARN, llamada “PRIMER” o PARTIDOR y es
sintetizada por una enzima llamada PRIMASA. La forma activa de
esta enzima requiere una serie de proteínas. Entre estas proteínas
se encuentra la PROTEINA N o dnaB, que selecciona el sitio en
que la primasa actuará. El complejo formado entre la primasa y las
proteínas auxiliares recibe el nombre de PRIMOSOMA.

Regla para la Síntesis.

La regla principal para la actividad de la ADN polimerasa es que

cataliza la formación de un enlace fosfodiester solamente si la base
 9

entrante es complementaria al nucleótido de la hebra padre. En otras

palabras las ADN polimerasas son enzimas dirigidas por la hebra
patrón o padre.

Como mencionamos anteriormente las ADN polimerasas I. II y III

poseen la actividad exonucleasa que permite aumentar la fidelidad
de la duplicación o replicación del ADN, removiendo los nucleótidos
que fueron puestos erradamente.

Proceso de Síntesis en procariontes

Una vez desenrollado la doble hebra de ADN, la enzima primasa

coloca el ARN partidor y de ahí comienza la síntesis de la hebra
hija por la acción de la enzima ADN polimerasa III. Recordemos que
esta enzima es la responsable de la duplicación, mientras que la
ADN polimerasa I actúa como enzima auxiliar sacando la hebra de
ARN partidor y luego sintetizando el trozo faltante, además ella
también participa en la reparación del ADN.

Durante el proceso de duplicación del ADN circular (E.coli) se

produce una estructura característica, formada por dos horquillas (o
frentes) de duplicación.
Dirección de la
replicación

La velocidad de síntesis en E.coli , es de 800 bases por segundo.

Otras proteínas del proceso de síntesis.

A continuación describiremos otras proteínas que participan en el

proceso de duplicación del ADN:

- HELICASA: son enzimas requeridas para desdoblar y abrir

la molécula de ADN padre debido que esto no ocurre
espontáneamente. Las helicasas requieren ATP como
cofactor.
 10

Dos diferentes helicasas han sido descritas, una de ellas se

mueve en dirección 3´ 5´ del ADN padre y recibe el
nombre de REP o HELICASA II o COPOL III ( subunidad
beta de la ADN polimerasa III) y las otras se mueve en
dirección 5´ 3´, llamadas HELICASA I y III.

- PROTEINAS QUE SE UNEN A HEBRA SIMPLE (SSB):

Las hebras simples de ADN generadas por las helicasas
son mantenidas separadas por la unión de las proteínas
SSB a la hebra de ADN. (ver figura 3 y Tabla II)

- ADN LIGASA es una enzima que cataliza la formación de

enlaces fosfodiester entre polinucleótidos preformados. La
ADN ligasa esta involucrada en la síntesis de ADN
discontinua, uniendo los fragmentos de OKASAKI una vez
que se ha reemplazado el partidor de RNA. Ellas también
están involucradas en los mecanismos de reparación del
ADN dañado. Existe un solo tipo de ADN ligasa en
procariontes y dos en eucariontes; ambas funcionan en el
núcleo.

Tabla II. Principales proteínas de la duplicación de E.coli.

Proteínas Funciones

Proteína N o dnaB Capacita a la primasa para comenzar la

duplicación
Primasa Sintetiza el ARN partidor.

Helicasas Desdobla la doble hélice.

Proteínas SSB Estabiliza regiones de hebra simple.

ADN girasa Introduce giros a la superhélice.

 11

ADN polimerasa III Sintetiza el ADN.

ADN polimerasa I Saca la hebra partidora y completa los

espacios.
ADN topoisomerasa I Corta una hebra de ADN.

ADN topoisomerasa II Corta ambas hebras de ADN.

ADN ligasa Une los extremos de los polinucleotidos

preformados.

Duplicación del ADN en Eucariontes.

El mecanismo de síntesis del ADN en eucariontes es probablemente

similar al proceso en procariontes.
La velocidad de las polimerasas en eucariontes es mucho menor
que en procariontes. Para compensar esto, las células eucarioticas
contienen más de 20.000 moléculas de enzimas. Además, las
células eucarioticas tienen un gran número de horquillas de
duplicación y fragmentos de Okasaki mas pequeños de 40 - 300
bases. De esta forma la velocidad de duplicación del ADN es mayor
en eucariontes.

La ADN polimerasa delta es la encargada de sintetizar la hebra

principal o adelantada y la polimerasa alfa la hebra retrasada. El
ADN en eucariontes esta unido con histonas, por lo tanto la
duplicación involucra dos pasos extras;
- Primero el ADN se debe disociar de las histonas para
comenzar la duplicación.
- La síntesis de histonas tiene lugar al mismo tiempo que la
síntesis de ADN y las histonas se deben unir al nuevo
ADN.

Algunos virus poseen otra forma de sintetizar ADN, debido que

tienen una enzima llamada TRANSCRIPTASA REVERSA capaz de
usar como hebra molde la molécula de ARN.
 12

5’ 3’

3’ Procariontes
3’

3’ 5’ 3’ 5’

Hebra Hebra
adelantada retrasada

Figura 3. Esquema que muestra el loop que se forma en la hebra

retrasada para que la ADN polimerasa III tenga la misma
posibilidad de actuar en ambas hebras.

5'
Primasa

Pol α
3'

5'

Helicasa
 13

PCNA

Pol δ

Figura 4. Síntesis de ADN en eucariontes.

Mutaciones

Las mutaciones son causadas por cambios en la secuencia de

bases de ADN. Los principales tipos son sustitución, supresión e
inserción. La sustitución de un par de bases por otra es la más
común mutación. Una transición es el reemplazo de una purina
por otra purina ( lo mismo ocurre con las pirimidinas). Una
transversión es el reemplazo de una purina por una pirimidina o
viceversa.
Muchos potenciales cancerígenos pueden ser detectados por su
acción mutagénica en bacterías.

Gen Salvaje 5'- CGACTGT-3'

3'- GCTGACA-5'

Transición ( cambio del par A-T por G-C)

5'- CGGCTGT-3'
3'- GCCGACA-5'

Transversión (cambio del par A-T por T-A)

5'- CGTCTGT-3'
3'- GCAGACA-5'

Inserción (colocar un par extra ej: G-C)

5'- CGAGCTGT-3'
 14

3'- GCTCGACA-5'

Supresión (suprimir el par A-T)

5'- CGCTGT-3'
3'- GCGACA-5'

TRANSCRIPCIÓN DE ADN Ó SINTESIS DE ARN

El flujo de la información genética en las células normalmente es:

ADN → ARN → Proteína

La síntesis de ARN usando un ADN patrón es llamada

transcripción, mientras que la síntesis de proteína a partir de un
ARN patrón es llamado traducción.

Clases de ARN.

Existen tres clases de ARN:

- ARN mensajero (mARN)

- ARN de transferencia (tARN)
- ARN ribosomal (rARN)

En general, todos estos ARN son de hebra simple, pero el ARN de

transferencia y ARN ribosomal contienen extensas regiones de
doble hélice (la cadena de nucleótidos se dobla formando una
horquilla o loop).

Los ARN más pequeños son los tARNs, que contienen alrededor de
75 nucleótidos, mientras que el más grande esta entre los mARN,
que pueden tener más de 5.000 nucleótidos.

Enzima de la síntesis
 15

Todos los ARN celulares son sintetizados por la ARN polimerasa de

acuerdo a las instrucciones dadas por un ADN-patrón (o molde),
empleando ribonucleósido-5’-trifosfatos como sustrato. La
dirección de la síntesis de ARN es 5’→3’, similar a la síntesis de
ADN.

La actividad de la ARN polimerasa es diferente a la actividad de la

ADN polimerasa porque no necesita una secuencia partidora o
“primer” y no posee una actividad nucleasa. Otra diferencia es que el
ADN patrón es totalmente conservado después de la síntesis de
ARN.

La secuencia de ADN transcrito por la ARN polimerasa en ARN es

llamado UNIDAD DE TRANSCRIPCIÓN y el producto de la
síntesis (ARN) es el TRANSCRIPTO PRIMARIO.

La ARN polimerasa de E. coli (procariontes) esta formada por sub-

unidades α2ββ‘σ y un peso molecular cercano al medio millón de
dalton (450 kDa).

El corazón de la enzima consiste de α2ββ‘ (enzima núcleo). La

sub-unidad sigma ( σ ) aumenta la velocidad y especificidad de la
transcripción, debido que ayuda a la ARN polimerasa a reconocer la
señal de inicio en el ADN-patrón. La sub-unidad sigma estaría
reconociendo una región particular del ADN, que se encuentra a 35
bases antes del sitio de inicio de la transcripción. Esta región del
ADN recibe el nombre de región PROMOTORA y además de esta
región, en E. coli existe otra región promotora a 10 bases antes del
inicio de la transcripción y está región del ADN esta relacionada con
el lugar donde se une la enzima núcleo.

Región Promotora (E.coli)

-35 -10 +1
(ADN) ------- TTGACA ------- TATAAT ----------------------------
Inicio de la
transcripción
El signo negativo indica que las bases se encuentran antes
del sitio de inicio de la transcripción
 16

Proceso de síntesis

La unión de la ARN polimerasa a estas regiones promotoras

permiten un desenrollamiento local de 17 pares de bases de la
molécula de ADN - patrón (llamada burbuja de transcripción). La
síntesis de ARN siempre comienzan con GTP ó ATP, es decir, con
una base purina. La sub-unidad sigma se disocia desde la
holoenzima cuando se han trascrito 12 bases. Esta subunidad una
vez suelta puede unirse a otra enzima núcleo, permitiendo el inicio
de una nueva síntesis.

ARN polimerasa
+ 1 punto de inicio

-35 -10
3’ 5’
ADN
5’ 3’

Enzima núcleo
Subunidad
(a) Sigma

+1 punto de inicio
-35 -10
5'
ppp ⊥

3'

(b)
 17

5'
p
p
ARN en p
crecimiento

ppp ⊥ NTP

-35 -10

Subunidad sigma
disociada

(c)

Figura 5. Inicio y elongación de la cadena de ARN (transcripción).

(a) Unión de la holoenzima a la región promotora (complejo cerrado)
(b) Separación de la doble hebra (complejo abierto)
(c) Elongación en dirección 5'  3' , a los 12 nucleótidos transcritos
la subunidad sigma se disocia.

Las regiones promotoras afectan la frecuencia de inicio de la

transcripción. Lo anterior es reflejado en los siguientes ejemplos:
en cada célula de E. coli contiene solamente 12 moléculas de
“represor lac” y su gen es transcrito una vez cada 30 minutos. Por
otro lado, el gen de ARN ribosomal es transcrito una vez por
segundo aproximadamente.

Terminación de la Transcripción.
 18

La terminación de la transcripción es tan controlado como su

iniciación. El ADN-patrón contiene señales de detención para la
transcripción. Existen dos mecanismos de terminación en E. coli:
uno es dependiente de una proteína auxiliar llamada factor rho y otro
independiente de este factor.

Terminación independiente del factor rho. Esto es distinguido por

la presencia de una secuencia rica GC en el ADN seguido por cinco
o seis adeninas. EL ARN transcriptos lógicamente también posee
esta región rica en GC, región que es capaz de formar un “loop” o
estructura de horquilla como resultado de interacción entre bases
complementarias. Además seguido de esta región rica en GC, en el
extremo 3’ del ARN aparece una secuencia rica en uracilo. Se ha
observado que la unión Uracilo con Adenina de la hebra de ADN
molde es menos estable y así el ARN es capaz de disociarse ( ver
fig. 6 ). Por consiguiente el duplex ADN-ARN se suelta y se libera el
ARN sintetizado.
C
U C

U C
G -- C
A -- U
C -- G
C -- G
C -- G
C -- G
C -- G
C -- G
G --- C 3'
5' U - A - A - U - C - C - C - A - C - A - G A - U - U - U - U - OH

Figura 6. Estructura secundaria del ARN sintetizado (señal de

termino).

Terminación dependiente del factor rho. También requiere la

presencia de la estructura de horquilla (región rica en GC). Sin
embargo, la secuencia rica en U está ausente. El factor rho, es una
proteína compuesta por seis sub-unidades idénticas de 46 KDa y
tiene una alta afinidad por ARN de hebra simple. Cuando se une al
ARN, el factor rho hidroliza ATP y la energía liberada es capaz de
mover este complejo proteico (factor rho) a lo largo del ARN que se
esta sintetizando en dirección de la burbuja de transcripción.
 19

Cuando llega a dicha burbuja, el factor rho disocia el híbrido ADN-

ARN por un mecanismo desconocido, liberando el ARN al
citoplasma (ver fig. 7).

ARN polimerasa

Factor rho

ADP + Pi
5' ATP + H2O

Figura 7. Terminación dependiente de rho

La transcripción puede ser bloqueada por inhibidores específicos,

llamados comúnmente antibióticos. Por ejemplo, el antibiótico
rifampicina inhibe la iniciación de la síntesis de ARN, mientras que
la actinomicina D bloquea la elongación del ARN.

Transcripción en eucariotes

La maquinaria transcripcional de eucariontes es lejos más complejo

que en procariontes. Una importante consideración es que en
eucariontes superiores solamente una pequeña proporción del
genoma es expresada a ARN (cerca de 10% como máximo). Una
considerable proporción del genoma de eucariontes existe
permanentemente como cromatina (ADN cromosomal) altamente
condensada y es transcripcionalmente inerte. Adicionalmente,
 20

hay proteínas accesorias específicas llamadas FACTORES DE

TRANSCRIPCIÓN y son requeridos para una transcripción eficiente
de todos los genes de eucariontes.

Diferente al factor bacterial sigma (σ), los factores de transcripción

no se unen a la polimerasa directamente. Ellos forman complejos
con la cromatina (ADN cromosomal) antes del inicio de la
transcripción y actúa como un regulador positivo de la transcripción.

Enzimas de la trancripción en eucariontes.

El núcleo de eucariontes contiene tres tipos de ARN polimerasas:

- ARN polimerasa I (localizada en el nucléolo) transcribe los genes

de ARN ribosomal. El transcrito primario producido corresponde a
un pre-rARN que posteriormente sufre algunas modificaciones para
transformarse en una rARN maduro.

-ARN polimerasa II (se encuentra en el nucleoplasma) transcribe

los genes que codifican para proteína y el transcrito primario
corresponde a un ARN nuclear heterogéneo (hnARN), que son los
precursores del ARN mensajeros citoplasmático.

-ARN polimerasa III (nucleoplasmática) transcribe el rARN 5S (ARN

ribosomico) y los tARNs (ARN de transferencia).

La reacción catalizada por todas las polimerasas en eucariontes es

bioquímicamente la misma que la reacción de las enzimas de E.
coli (procariontes).

Todas las polimerasas eucarionticas son grandes moléculas con

masas que exceden los 500 kDa. Ellas contienen dos sub-
unidades con masas superiores a 100 kDa, cada una de las cuales
es una polimerasa específica y además poseen 12 sub-unidades
menores, algunas de las cuales son comunes a los tres tipos de
polimerasas. La precisa función de cada sub-unidad es aún
desconocida.

Región promotora para la actividad de ARN polimerasa I

 21

Para el caso particular de la ARN polimerasa I que sintetiza el ARN

ribosomal. En el gen (ADN) para el rARN presenta una región
promotora de 150 pares de bases, ubicada en la posición -142 y
+6.
Sin embargo, existen copias imperfectas del largo total del promotor
en posiciones -1200 y -2300 pares desde el sitio de inicio de la
transcripción y entre estas regiones hay múltiples copias de 60 ó 81
pares de bases de la región promotora ( ver Fig. 8).

Las copias 60/81 estimulan la transcripción del verdadero promotor y

puede estar involucrado en la unión de un factor presente en
cantidades limitadas. Las copias totales de los promotores pero
imperfectos son capaces de iniciar la síntesis de ARN, pero este
efecto termina antes de alcanzar la verdadera región promotora.

Punto de inicio

repeticiones Promotor
gen Promotor de 60/81 bp del gen Gen
28S rARN espaciador 18S rARN

-4000 -2000 +1

Figura 8. Región promotora del gen de rARN, con una región

promotora verdadera ( ) y con copias imperfectas de ella ( . ).

Región promotora para la ARN polimerasa II.

Los genes transcritos por la polimarasa II producen los ARN

mensajeros. Estos incluyen los genes que codifican a las proteínas
que son expresadas constitutivamente (que siempre son
expresadas) en todos los tejidos y aquellos genes que solamente
son expresados en un tejido particular de un organismo multicelular
o que esta regulado por la presencia o ausencia de un sustrato
particular, hormona o estímulo ambiental.

Los promotores para la ARN polimerasa II están localizados en el

lado 5’ del sitio de inicio de la transcripción.
 22

-80 -25 inicio

--CAAT----------GGGCCCGGG------GGGCCGGG---------TATA--------

Estas secuencias tienen la función de unir los factores de

transcripción específicos en vez de dirigir los puntos de contacto con
la ARN polimerasa II, como ocurre en procariontes. Varios
promotores que están relativamente cercanos al punto de inicio de la
transcripción, son necesarios pero normalmente insuficientes para
que se realice una eficiente expresión de los genes por la enzima
ARN polimerasa II.

Además existen otros tipos de secuencias en el ADN molde

llamadas “ ENHANCER” que no tienen actividad promotora por si
mismas, pero que pueden estimular la transcripción y pueden
actuar sobre considerables distancias de varios kilobases del sitio de
inicio de la transcripción. Una característica de los “enhancer” es que
realizan su acción independiente de la orientación que ellos tengan
(Fig. 9)

-8,000 +1
Enhancer Promotor
Sitio de inicio

Figura 9. Esquema de la posición del “Enhancer” con respecto al

promotor.

El transcrito primario de la ARN polimerasa II, son conocidas

colectivamente como ARNs nucleares heterogéneos. Ellas pueden
llegar a ser grandes moléculas (sobre 10 kilobases) debido que
contiene aún los intrones (secuencia que no son traducidas a
 23

proteína) en la secuencia de ARN, pero ellas no estarán presente

en el ARN maduro.

SINTESIS DE ARN MENSAJEROS

La síntesis de un mARN en eucariontes (ver fig. 10):

- (1) Comienza la transcripción de un ADN cuando una ARN
polimerasa se encuentra a 20 o 30 nucleótidos después de la
secuencia TATA.
- (2) Cuando el transcrito (ó ARN) ha alcanzado 30 nucleótidos de
largo, en su extremo 5’ es colocado una guanosina unido a un
grupo trifosfato que además es metilado.
- (3) La ARN polimerasa se nueve a lo largo del ADN
transcribiendo tanto exones como intrones. Hasta que se
transcribe la secuencia AAUAAA, después de cerca de 20
nucléotidos de esta secuencia, el transcrito es cortado; la
reacción probablemente involucra una pequeña
ribonucleoproteína nuclear (snRNP) que contiene una
molécula de ARN ( “U1 ARN”) rico en uracilo.
- (4) Una enzima adiciona una secuencia de 150 a 200 adeninas
en el extremo 3’ de la hebra de ARN naciente.
- (5) El transcrito es procesado y son cortados los intrones,
probablemente con la ayuda de otras snRNPs; y nuevamente U1
ARN se une a una secuencia complementaria (que incluye GU)
en el comienzo del intron, también en este proceso participan
otras 6 moléculas de ARN (denominadas U2,U3,...U7)
- (6) Los intrones son doblados y cortados
- (7) Los exones son unidos para formar finalmente el ARN
mensajero maduro

La mayoría de los genes en eucariontes superiores son

discontínuos. Las secuencias que se codificaran en estos genes
(exones) son separadas por secuencias que no son traducidas
(intrones), que son removidos en la conversión del transcripto
primario a mARN maduro.

(1) ARN Polimerasa II

ADN
TATA
 24

(2)
TATA

+CH3
Transcrito primario
G -P-P-P
Enzima

(3)

CH3
AAUAAA
G -P-P-P

snRNP
A

U1 ARN
Enzima Poli (A)

(4)
 25

CH3
! AAUAAA
G - P-P-P AAAA...

(5)

snRNP

U1 ARN
CH3
! GU GU
G - P-P-P AAAA...

(6)

CH3
GU

GU

!
G - P-P-P AAAA...

(7)
GU
GU

CH3
!
G - P-P-P AAAA...

Figura 10. Transcripción de un mARN en Eucariontes (las

explicaciones se encuentran en el texto).
 26

ARN Polimerasa III

Los genes transcritos por la ARN polimerasa III ( rARN 5S, tARN y
varios ARNs nucleares y citoplasmáticos pequeños) usualmente
contiene menos de 300 nucléotidos. Genes de rARN 5S no
contienen intrones mientras que muchos genes de tARN poseen
pequeños intrones.

Región Promotora para la acción ARN polimerasa III.

El control de transcripción mejor estudiada es del gen rARN 5S, que

inesperadamente tiene una secuencia promotora dentro de su
secuencia transcrita. Se ha determinado que la región interna
promotora esta entre las posiciones + 50 y + 84, que mostró ser
esencial para la transcripción de los genes rARN 5S (fig. 11). En la
regulación de las síntesis de rARN 5S existen factores llamados :
TFIIIA, TFIIIC, que son requeridos para una transcripción eficiente.

Gen 5S rARN
Región
Promotora

5' 3'

5S rARN

-80 -40 0 +40 +80 +100

Figura 11. Localización de la región promotora del gen 5S rARN de

X. laevis.

Modificaciones Post Transcripcionales

Muchos ARNs son modificados químicamente (Ej. metilados) y

escindidos o cortados después de la transcripción. Los mARNs son
 27

modificados por acoplamiento de una larga cadena de poli-A a su

extremo 3’. Los rARNs se generan a partir de una larga cadena
precursora que finalmente es escindida para rendir los ARNs
maduros.

CÓDIGO GENÉTICO

La secuencia de bases de un gen es colineal con la secuencia

aminoacídica de su producto polipeptídico. El código genético es la
relación entre la secuencia de bases en el ADN (o su ARN
transcrito) y la secuencia de aminoácidos en una proteína.

Los aminoácidos son codificados por un grupo de tres bases

(llamadas codones) comenzando de un punto determinado (ver
fig. 12).

Se pueden definir cuatro características generales del código

genético:

1) El código no requiere de puntuación ni señal alguna para indicar

el final de un triplete y el comienzo del siguiente, es decir el
código genético no tiene “comas”. Únicamente requiere de una
molécula de mARN que este ubicada correctamente para su
lectura (5´→3´) además de contar con el codón de inicio, AUG
(en procariontes codifica la incorporación de N-formilmetionina y
en eucariontes metionina).

2) 61 de 64 codones especifican algún aminoácido en particular.

De esta forma, para la mayoría de los aminoácidos hay más de
 28

un triplete (o codón). En otras palabras, el código es

DEGENERADO. Codones que especifican el mismo aminoácido
son llamados sinónimos. La mayoría de los sinónimos difieren
solamente en la última base del triplete. Esto presenta una
ventaja, debido a que la mayoría de las mutaciones conducen a
la formación de tripletes sinónimos no provocando un cambio en
la secuencia peptídica.

3) La tercera base de los tripletes es menos especifica que las dos

primeras. La degeneración implica solamente la tercera base en
la mayoría de los casos (excepto para Arginina, Leucina y
Serina).

4) 3 de los 64 tripletes no codifican para aminoácido alguno y estos

son UAG, UAA y UGA llamados originalmente codones “sin
sentido” que constituyen las señales de termino de la síntesis de
la cadena polipeptídica.

SEGUNDA LETRA

U C A G

UUU Phe UCU Ser UAU Tyr UGU Cys

UUC Phe UCC Ser UAC Tyr UGC Cys
U
UUA Leu UCA Ser UAA Stop UGA Stop
PRIMERA LETRA

UUG Leu UCG Ser UAG Stop UGG Trp

CUU Leu CCU Pro CAU His CGU Arg
CUC Leu CCC Pro CAC His CGC Arg
C
CUA Leu CCA Pro CAA Gln CGA Arg
CUG Leu CCG Pro CAG Gln CGG Arg
AUU Ile ACU Thr AAU Asn AGU Ser
AUC Ile ACC Thr AAC Asn AGC Ser
A
AUA Ile ACA Thr AAA Lys AGA Arg
AUG Met ACG Thr AAG Lys AGG Arg
GUU Val GCU Ala GAU Asp GGU Gly
GUC Val GCC Ala GAC Asp GGC Gly
G
GUA Val GCA Ala GAA Glu GGA Gly
GUG Val GCG Ala GAG Glu GGG Gly
 29

Figura 12. Código genético.

SÍNTESIS DE PROTEÍNAS

La síntesis de proteínas tienen lugar en la superficie de los

ribosomas. Dicha síntesis requiere que los aminoácidos sean
“activados” en el citoplasma por la acción de aminoacil- tARN-
sintetasas, que catalizan la formación de ésteres de aminoácidos
de tARN homólogos (unión de un aminoácido con su tRNA
respectivo) y en forma conjunta en el proceso de activación se
hidroliza ATP produciendo AMP y pirofosfato. Las aminoacil-tARN-
sintetasas son altamente específicas tanto para el aminoácido como
para su correspondiente tARN.

Aminoacido + ATP aminoacil – AMP + PPi

Aminoacil- AMP + tARN aminoacil-tARN + AMP

Aminoacido + ATP + tARN aminoacil –tARN + AMP + PPi

El aminoácido se une al extremo 3’ del tARN que posee la secuencia

CCA, mientras que el anticodón esta a 80 Å de distancia en el otro
extremo (ver fig. 13).
 30

Sitio de unión
al aminoácido
3’
A
C
5’ C

Loop DHU Loop TΨC

anticodón

Figura 13. Estructura de hoja de trébol característica de un tARN

El ARN mensajero reconoce el anticodón de un tARN en vez de

reconocer el aminoácido. Un codón en mARN se aparea con el
anticodón en el tARN. Algunos tARNs reconocen más de un codón
porque la tercera base que se aparea de un codón es menos
especifica que las otras dos ( ver código genético).

Los Ribosomas.

La síntesis de proteína tiene lugar en los ribosomas, que están

formados por una subunidad mayor y una menor, cada una de las
cuales están compuestas de dos tercios de ARNs y un tercio de
proteínas. En E. coli, por ejemplo, el ribosoma 70 S ( 2.500 kdal)
está formado por una sub-unidad de 30 S y una de 50 S. En
 31

cambio en eucariontes el ribosoma es de 80 S, formado por uno de

40 S y uno de 60 S.

- El coeficiente de sedimentación de macromoléculas biológicas

son expresadas en unidades Svedberg (abreviada como S).
1 S = 10-13 seg.

Hay tres fases en la síntesis de proteína: inicio, elongación y

termino.

CADENA NASCIENTE

40 S

5'

STOP
3'
INICIO

INICIO
ELONGACION TERMINO
40 S 60 S
60S

40 S

60 S

Figura 14. Ciclo de la síntesis de proteína.

Inicio.

En procariontes el ARN mensajero, la formilmetionina- tARN y la

sub-unidad ribosomal 30 S, forman el complejo iniciación de la
síntesis (en cambio para eucariontes este complejo está formado por
mARN, metionina-tARN y la sub-unidad 40 S, ver fig. 14).
La señal de inicio en el mARN es AUG y esta precedida por una
secuencia rica en purina que puede aparearse con el rARN 16 S de
la sub-unidad 30 S del ribosoma. La subunidad mayor ribosomal de
50 S se une a este complejo para formar un complejo de iniciación
de 70 S, (ver fig. 15) que esta listo para la siguiente fase
 32

(elongación). En el proceso de iniciación están participando una

serie de factores proteícos que son descritos en la Tabla IV.

mARN

fMet.tARNMet
30S
IF-1 IF-3 IF-1 IF-3
IF-2 GTP

IF-2·GTP·fMet-tARN Met GDP +Pi

IF1
IF2

50 S

30 S

Complejo de inicio 70 S

Figura 15. Fase de inicio de la síntesis de proteína en baterias

(procariontes). 30S y 50 S son la subunidad menor y mayor del
ribosoma respectivamente. IF, son factores proteicos de inicio.

Elongación.

El ciclo de elongación consiste en (ver fig. 16) :

1) La unión de aminoacil-tARN (reconocimiento del codón).
2) Formación del enlace peptídico.
3) Transposición.
 33

También durante la elongación se requiere la presencia de factores

proteicos que son descritos en la Tabla V.

La dirección de lectura del mARN es de 5´→ 3´y el crecimiento de la

cadena polipeptidica es hecho desde el extremo amino al extremo
carboxilo.

Sitio E f-Met Arg

f- Met
Ingreso del
Sitio A aminoacil-
tARN al sitio A

Sitio P GTP GDP

+
Pi

AUG- CGA- GCU------------3’ ----------------AUG.CGA -

Inicio de un
nuevo ciclo Formación del
enlace peptídico
catalizado por la
f- Met Sitio A peptidil transferasa
| vació f- Met
Arg |
| Arg
|

Translocación

GDP GTP
+
-AUG-CGA-GCU------ Pi ----------------- AUG-CGA-GCU

Figura 16. Fase de elongación de la cadena peptídica: unión del

aminoacil-tARN, formación del enlace peptídico y translocación.
 34

Termino.

La síntesis de proteína es terminada por factores de liberación, que

reconocen los codones de terminación UAA, UGA y UAG
provocando la hidrólisis entre el polipeptido y el tARN (Tabla VI).

La energía requerida tanto en la formación del complejo de

iniciación son 70 S como en la unión del aminoacil- tARN al
ribosoma, y en la transposición son obtenidos de la hidrólisis del
GTP ( ver Tabla VII ).

Varios pasos en la síntesis de proteína son específicamente inhibida

por toxinas y antibióticos. Por ejemplo, puromicina inhibe la
síntesis de la cadena peptídica por su interacción con el peptidil -
tARN en la ribosoma, formando peptidil- puromicina que libera el
complejo ribosomal ( ver Tabla VIII).

Por otro lado, los polirribosomas, también denominados

polisomas, consisten en moléculas de mARN a las que están
adheridos muchos ribosomas, cada uno de los cuales, leen el
mARN independientemente y construyen una cadena polipeptídica.
En las células eucarióticas, la síntesis proteíca puede tener lugares
en ribosomas libres, o bién, en los ribosomas unidos al retículo
endoplasmático.

También existe síntesis proteíca en las mitocondrias y en los

cloroplastos, los cuales poseen mARNs, tARNs específicos,
aminoacil- tARN-sintetasas y ribosomas.

Anexo 1.
 35

TABLA IV. FACTORES DE INICIACIÓN DE PROCARIONTES Y

EUCARIONTES

FACTOR FACTOR FUNCIÓN

BACTERIAL EUCARIONTES

IF- 1 elF - 1 Los roles no están claros

IF- 2 elF - 2 Une Met- tARN (o fMet - tARN ) a los
ribosomas en el complejo con GTP.

IF- 3 elF -3 Impide la reasociación de las sub-unidades

ribosomales.

elF -4A Un grupo de factores liberados respon-

elF -4B sables de la unión al extremo bloqueado
elF -4E del mARN y desdoblar alguna estructura
elF -4F secundaria para capacitar a los ribosomas
en el reconocimiento del codón de inicio.

elF -5 Libera elF-2 y elF-3 del ribosoma y

permite la unión de la sub-unidad 60 S

elF -6 Involucrada en la disociación del ribosoma

en sus sub-unidades.

GEF (Factor de intercambio de la guanina:

recicla elF-2 mediado por intercambio de
GDP por ATP en un proceso análogo que
para reciclar EF.Ts)

TABLA V. FACTORES DE ELONGACIÓN

 36

FACTOR FACTOR FUNCIÓN

BACTERIAL EUCARIOTICO

ED-Tu EF - 1α Unir aminoacil- tARN al sitio A del

(43 kDa) (53 kDa ) ribosoma como por ejemplo, complejo
(EF-1 GTP, aminoacil-tARN).

EF - Ts EF - 1βγ Reciclar EF -Tu o EF - 1α respectivamente

( 30 kDa) (50/38 kDa)

EF - G EF -2 Involucrado en los pasos de translocación

de los ciclos de elongación.
--------------------------------------------------------------------------------------------------------

TABLA VI. FACTORES DE TERMINACIÓN (O LIBERACIÓN)

BACTERIA ( E. coli ) EUCARIOTES

RF -1 ( Para UAA o UAG) eRF ( con los tres

codones de termino)

RF-2 ( Para UAA o UGA )

RF-3 (estimula RF-1 y RF-2)

TABLA VII. REQUERIMIENTOS ENERGETICOS PARA LA TRADUCCION:

LA ORGANIZACION REQUIERE EL INGRESO DE ENERGIA LIBRE DESDE
LA HIDROLISIS DEL ATP O GTP
 37

PROCARIONTES EUCARIONTES

Aminoacilación ATP → AMP + PPi ATP →AMP + PPi

del tARN (e.i. 2 enlaces de alta energía por aminoácido)

Iniciación GTP →GDO + Pi, GTP →GDP + Pi,

asociado con IF-2 asociado con elF-2

ATP →ADP + Pi,

asociado con el extremo
de guanina y el
desdoblamiento del
mARN. (no esta claro
cuantos ATPs son
usados)

Elongación GTP →GDP + Pi, GTP →GDP + Pi,

asociado con EF-Tu asociado con EF-1

GTP →GDP + Pi, GTP →GDP + Pi

asociado con EF-G asociado con EF-2

Terminación Probablemente no GTP →GDP + Pi

requiere energía

TABLA VIII. INHIBIDORES DE TRADUCCIÓN

INHIBIDOR SELECTIVIDAD ACCIÓN

--------------------------------------------------------------------------------------------------------
 38

Cloramfenicol Procariontes Elongación: inhile

peptidil
transferasa.

Cicloheximida Eucariontes Elongación: mecanismo

incierto.

Eritromicina Procariontes Elongación: inhibe

transpeptidación

Ácido Fusidico Ambos Elongación: bloquea la

liberación del complejo
EF-G o EF-2 GDP.

Kanamicina Ambos Elongación:causa error en la

lectura.

Neomicina Ambos Iniciación y elongación:

causa error de lectura del
mARN.

Puromicina Ambos Elongación: causa

prematura
terminación.

Sparsamicina Ambos Elongación: inhibe peptidil-

transferasa.

Spectinomicina Procariontes Elongación: inhibe transpep-

tidación.

Treptomicina Procariontes Elongación: se une a la sub-

unidad 30 S e interfiere
con
la interacción codón-antico-
dón causando error de
lectu-
del mARN.

Tetramicina Procariontes Elongación: bloquea la

unión
de aa- tARN al sitio A.

Anexo 2.
EJERCICIOS
 39

1.- Escribir la secuencia complementaria en dirección 5’ →3’

a) 5’- GATCAA- 3’
b) 3’- ACTGGCCTAA -5’
c) 5’- ACCTAGGGTA -5’
d) 3’- CCTGGATTAAG -5’

2.- Compare la ADN polimerasa I y la ARN polimerasa de E.coli en

cuanto a:

a) estructura de subunidades.
b) precursores activados
c) dirección de elongación de la cadena
d) actividad exonucleasae) conservación del
ADN molde
f) necesidad de una hebra particular.
d) energética de la reacción de elongación

3.- Escribir las secuencias de los mARN sintetizados de los

siguientes ADNs

a) 3’- ATTGCCATGCTA-5’
b) 5’- AGCTACTTAACG-3’
c) 3’-GGACCTACGTT.5’

Además indique cuales son los codones sin sentido presentes.

4.- Cuantos aminoácidos pueden ser codificados de las siguiente

secuencia de mARN.

a) Asumiendo que comienza la lectura en el extremo 5’

inmediatamente.
b) Comenzando en forma normal establecida por el código genético.

4. 1- 5’- UUGCCUAUGGAUUGGAUG-3´
4. 2- 3’-AUGUAGGUAAAGGUAGGCC-5’
4. 3- 3’- AGCGCCAGUGACCAUGUA-5’

5.- Que secuencia es formado por la adición de un poli (UUAC) a

un sistema de síntesis de proteínas.
 40

6.- El ARN transcrito de una región del ADN del fago G4

conteniendo la siguiente secuencia ( este tipo de ADN tiene una
traducción superpuesta)

5’ - TCCTCATTT - 3’

Esta región codifica para diferentes proteínas. cuales son sus

secuencias.