Procedimientos y observaciones

A) Recibimos un homogenizado filtrado por parte de nuestros docentes, el cual se obtuvo de la

siguiente manera:

 Se dejó en inanición un ratón una noche antes del experimento.

 Se mató al ratón adulto por dislocación cervical y de la cavidad peritoneal se extrajo

rápidamente su hígado desde la cavidad peritoneal (sin la vesícula biliar).Por último se dejó el
hígado en 50 ml de Buffer IBc frío en un pequeño vaso precipitado; esto permite simular las
condiciones fisiologicas normales en las que funcionan las células hepáticas.

 Se picó minuciosamente el hígado en pequeños pedazos utilizando tijeras, con el fin de que el
funcionamiento de la maquina Ultra Turrax no se atasque. Mientras se cortaba, se limpió con
suero fisiológico para liberarlo de los eritrocitos que estaban adosados al órgano durante varias
ocasiones para que estos no entorpecieran el desarrollo del experimento. Se realizó mientras se
mantenía el vaso en una fuente con hielo.

 Se vertió Ibc frío fresco y se enfrió durante cinco minutos para inhibir la acción de proteasas y
fosfolipasas y luego se transfirió la suspensión al tubo de homogenizado (mortero). Se trabajó a
1600 RPM mezclándolo de 3 a 4 veces.

 Se trasfirió el homogenizado a un tubo Falcon de polipropileno y se centrifugó a 600 g (2500

RPM aprox.) durante 10 minutos a 4ºC.

 Luego de ello, se transfirió el primer sobrenadante a otro tubo de centrifugación, y se

resuspendió el primer precipitado (Fracción nuclear) en 3 ml de IBc, guardándolo en hielo.
Luego se centrifugó el sobrenadante a 7000 g (6000 RPM aprox.) durante 20 min. a una
temperatra de 4ºC.

 Por último se transfirió el segundo sobrenadante (Fracción microsomal) a otro tubo, y se

resuspendió el precipitado (Fracción mitocondrial) en 3 ml de IBc. Se mantuvo ambos tubos en
hielo.

Evaluación del fraccionamiento subcelular mediante marcadores moleculares.

B)

 Utilizando el homogeneizado; se busco identificar cada organelo identificando las enzimas que
lo caracterizan: para esto se vertió en un portaobjetos limpio y seco una gota de nuestra
suspensión de núcleos (rotulada como P1) y sobre ella se colocó un cubreobjetos. Se observó la
preparación al microscopio usando un aumento de 40X. Se adicionó azul de tripán, que es una
molecula marcadora de núcleos y se observó la preparación. Se registraron resultados.

 Se realizó el mismo procesimiento con la fracción enriquecida en mitocondrias (rotulada como

P2), adicionandole el mismo marcador. Se registraron resultados.
C)

En 4 tubos de ensayo por separado se vertió nuestro homogeneizado, se les rotúló y se colosó en el
hielo para que estuvieran frios para que la acción de las enzimas hepáticas no se activase. En cada uno
de los tubos de ensayo que agregó los siguientes compuestos:

El azul de metileno es un marcador mitocondrial que en su forma oxidadada se torna azul, y en su

forma reducida es transparente. Para evitar que se oxidase por la presencia del oxigeno atmosférico se
agregó sobre cada tubo vaselina líquida. Luego para que se produjeran las reacciones entre las enzimas
y los marcadores se llevaron a bañomaría a una temperatura de 37 grados (temperatura corporal) en
dónde se activan las enzimas y reaccionan con los marcadores permitiendonos distinguir los organelos
que están presentes en nuestro homogeneizado de acuerdo a la coloración adquirida. Se registraron
resultados.

ACTIVIDAD Nº 2: Observación de un corte de hígado de Rattus norvegicus (Berkenhout) utilizando

el objetivo de inmersión.

 Se observó la muestra de hígado de rata utilizando los objetivos de 4, 10 y 40X del microscópio
óptico.

 Se enfocó la muestra con el objetivo seco de aumento mayor (40X), y se giró el revólver
portaobjetivos para que quedase en una posición intermedia entre el objetivo mayor seco y el de
inmersión.

 Se depositó cuidadosamente sobre el cubreobjetos de la muestra una gota de aceite de

inmersión.

 Se giró el revolver de modo que el objetivo de inmerción quedase inmerso en el aceite

pudiendose observar a un aumento de 100X.

 Por último se reguló el micrometrico para observar la muestra. Se registró lo observado.

Discusión:
Actividad 2) Pudimos observar que utilizando el aceite de inmersión se podía observar mejor las
preparaciones en el aumento de 100X, esto lo atribuimos al mayor índice de refracción que este posee
respecto al aire: (entre 1.5 a 1.52 a 23ºC respecto a 1,00029 del aire a la misma temperatura) esto
significa que los rayos de luz provenientes de la muestra sufren una menor desviación hacia los lentes
de los objetivos permitiendonos observar la muestra con mas detalles.

(Bibliografía: http://www.2spi.es/catalog/ltmic/cargille-index.html)