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Mémoire
Présenté en vue de l’obtention du Diplôme de
MAGISTER
Spécialité : Biologie.
Option : Microbiologie Appliquée.
Devant le jury:
Président Mr HAMDI AISSA B. Professeur (U.K.M.O)
Examinateur Mr HACINI M. Maitre de conférences A (U.K.M.O)
Examinateur Mme SIBOUKEUR O. Maitre de conférences A (U.K.M.O)
Encadreur Mme OULD EL HADJ-KHELIL A. Maitre de conférences A (U.K.M.O)
Invité Mr ARROUSSI A. Chef département Analyses CRD (HMD)
Mémoire
Présenté en vue de l’obtention du Diplôme de
MAGISTER
Spécialité : Biologie.
Option : Microbiologie Appliquée.
Devant le jury:
Président Mr HAMDI AISSA B. Professeur (U.K.M.O)
Examinateur Mr HACINI M. Maitre de conférences A (U.K.M.O)
Examinateur Mme SIBOUKEUR O. Maitre de conférences A (U.K.M.O)
Encadreur Mme OULD EL HADJ-KHELIL A. Maitre de conférences A (U.K.M.O)
Invité Mr ARROUSSI A. Chef département Analyses CRD (HMD)
Remerciements
Résumé
Abstarat
Liste des figures
Liste des photos
Liste des tableaux
Introduction 1
I. Biodétection…………………………………………………………………….................
I.1. Matériel biologique……………………………………………………………………... 22
I.2. Méthodes………………………………………………………………………………... 22
I.2.1. Echantillonnage………………………………………………………………………. 22
I.2.2. Caractérisation des sols……………………………………………………………….. 22
a. Analyse physiques…………………………………………………………………. 23
a1. Analyse granulométrique……………………………………………………….. 23
a2. Hygrométrie …………………………………………………………………….. 23
b. Analyses physico-chimiques ……………………………………………………… 23
b1. Potentiel d’hydrogène (pH)……………………………………………………. 23
b2. Conductivité électrique (CE)…………………………………………………... 23
c. Analyses chimiques ……………………………………………………………….. 23
c1. Dosage du phosphore ………………………………………………………….. 24
c2. Dosage des nitrates …………………………………………………………….. 24
c3. Dosage des nitrites …………………………………………………………….. 24
c4. Dosage des hydrocarbures totaux ……………………………………………... 24
d. Evaluation du taux de biodégradabilité des hydrocarbures………………………... 25
d1. Détermination de la demande chimique en oxygène (DCO)…………………... 25
d2. Détermination de la demande biologique en oxygène (DBO5)………………... 25
e. Analyses microbiologiques ………………………………………………………... 26
e1. Dénombrement de la microflore bactérienne…………………………………… 26
e2. Isolement des bactéries susceptibles de dégrader les hydrocarbures…………… 26
e3. Purification et conservation des bactéries……………………………………… 27
α. Purification……………………………………………………………………. 27
β. Conservation des souches purifiées…………………………………………... 27
e4. Préidentification des souches purifiées…………………………………………. 28
α. Etude morphologique…………………………………………………………. 28
α1. Aspect macroscopique……………………………………………………... 28
α2. Aspect microscopique……………………………………………………... 28
β. Analyses biochimiques………………………………………………………. 28
β1. Études des enzymes respiratoires…………………………………………. 29
β2. Métabolisme des glucides…………………………………………………. 29
β3. Étude du métabolisme protéique…………………………………………… 30
γ. Sélection des bactéries par utilisation de milieux de culture spécifiques…….. 31
γ1.Croissance sur Cétrimid agar………………………………………………. 33
γ2.Croissance sur milieu King (King A et King B)…………………………... 33
II. Bioremédiation…………………………………………………………………………... 33
II.1. Matériel ……………………………………………………………………………….. 34
II.1.1. Sol……………………………………………………………………………………. 34
II.1.2. Inoculum bactérien…………………………………………………………………... 34
II.1.3. Biosurfactant…………………………………………………………………………. 34
II.1.4. Solution nutritive…………………………………………………………………….. 34
II.1.5.Solution d'urée………………………………………………………………………... 34
II.2. Méthodologie : bioprocédé «Landferming»………………………………………….. 34
II.2.1. Biostimulation…………………………………………………………………. 35
II.2.2. Bioaugmentation……………………………………………………………………. 35
a. Sélection d'isolats………………………………………………………………… 35
b. Préparation de l'inoculum…………………………………………………………. 36
36
PARTIE 3 : Résultats et discussions
Résumé
L’impact de la pollution des sols par les hydrocarbures sur la distribution des bactéries
telluriques (Biodétection) et l’évaluation de leur pouvoir dégradant de ces polluants (Bioremédiation)
ont fait l’objet de notre travail.
L’utilisation des souches bactériennes telluriques autochtones dans des conditions favorables
(aération, humidité ….) pourrait contribuer à la bioremédiation des sols contaminés par les
hydrocarbures dans les zones d’exploitations pétrolières.
ملخص
موضوع عملنا ھذا يتمحور حول البحث عن اثر تلوث التربة بالنفط على توزع البكتيريا الترابية )االكتشاف الحيوي( وتقدير
استطاعتھا االستھالكية لھذه الملوث )معالجة بيولوجية(.
غ من التر بة( في العينة /وم م 108بكتيرية ممثلة بكتلة حيوية 9 6.4سالالت كشف التشخيص البيولوجي للتربة عن وجود
األقل تلوث وھذا التنوع البيولوجي يتناسب عكسيا مع زيادة نسبة النفط في التربة الملوثة حيث تم عزل ساللة واحدة فقط في العينة
وم م /غ( وھي متواجدة في جميع عينات التربة المدروسة 1.1.104/.ممثلة بكتلة حيوية قدرھا ) Micrococcus luteusاألكثر تلوث
كغ من النفط /غ 123.4الملوثة بـ (E1في المعالجة البيولوجية لعينة من التربة Landfarmimgتطبيق الطريقة البيولوجية )
باستعمال الساللة الترابية األصلية أدى إلى استھالك كبير للملوثات توضح بانخفاض تركيزھم اختيرت ھذه الساللة الترابية األصلية
أدى إلى استھالك كبير للملوثات توضح بانخفاض تركيزھم اختبرت ھذه الساللة لقصر مدة تكاثرھا باإلضافة Bacillus megaterium
%خالل 28يوم من التجريب في العينة المزودة بيولوجيا و المحرضة بـجزيئات 98.43إلى كفاءتھا العالية نظرا لنسب إزالة النفط
%خالل 35يوم في العينة المزودة بيولوجيا و المحرضة باليوري %86.1 ،خالل 35يوم في العينة المزودة بيولوجيا ,السطح 98.22
و المحرضة بمحلول مغذي.
استعمال السالالت البكتيرية األرضية األصلية في ظل ظروف مواتية )التھوية – الرطوبة (...يساھم في المعالجة البيولوجية
للتربة الملوثة بالنفط في مناطق التنقيب عن النفط.
Micrococcus luteus –Bacillusالكلمات الدالة :تربة – محروقات – تلوث -االكتشاف الحيوي -معالجة بيولوجية
جزيئات السطح -اليوريmegaterium .
The use of terrestrial indigenous bacterial strains in the biodetection and the bioremediation of oil
contaminated soils.
Abstract
The impact of soil pollution by oil on the distribution of soil bacteria (Biodetection) and
evaluation of their power degrading these pollutants (bioremediation) have been the subject of our work.
The use of terrestrial indigenous bacterial strains under favorable conditions (ventilation,
humidity ....) Could contribute to the bioremediation of contaminated soils by hydrocarbons in the areas
of oil exploration.
Figure 3: Schéma général des voies métaboliques de dégradation des n-alcanes et des
isoalcanes…………………………………………………………………………...
20
Figure 4 : Différents produits issus de l’oxydation du toluène………………………..
21
Figure 5 : Voie de l’oxydation du toluène…………………………………………….
21
Figure 6: Localisation des sites d’étude……………………………………………….
22
Figure 7 : Principe de détermination des teneurs en HCT dans le sol par distillation
dans un four……………………………………………………………… …………….
25
Figure 8 : Schéma d’isolement et dénombrement des bactéries telluriques…………..
26
Figure 9 : Stratégie de bioremédiation ……………............................................
30
Figure 10 : Préparation d'inoculum bactérienne………………………………………...
35
Figure 11 : Résultats d’analyse granulométrique des six sols étudiés………………….
38
Figure 12: Triangle textural……………………………………………………………..
38
Figure 13: Taux d'humidité des six sols étudié…………………………………………
39
Figure 14 : Potentiel d’hydrogène et conductivité électrique des six sols étudies……...
39
Figure 15: Teneurs de nitrate, nitrite et phosphore dans échantillons de sols
étudiés.………………......................................................................................................
(Annexe 04)
Liste des photos
Photos 4: Aspects macroscopique (a) et microscopique (b) (G x 100) des souches SI, SJ
et SK……………………………………………………………………………………
Tableau VII: Résultats des tests biochimiques des souches bactériennes isolées…………... 45
Tableau VIII : Distribution des souches bactériennes préidentifiées dans les différents sols
étudiés………………………………………………………………………………………..
52
Liste des abréviations
Le phénomène de pollution par les hydrocarbures a une importance de plus en plus grande
sur les plans environnemental, sanitaire et économique. Cette pollution peut avoir un impact
soit direct ou indirect, sur la santé humaine et l’équilibre des écosystèmes aussi bien marins
que continentaux. La qualité des sols peut également en être altérée (MBONIGABA et al .,
2009).
Les effets dévastateurs de l'industrialisation pétrolière et leur impact ont été évalués
sur l’environnement. En effet, de nombreux dégâts réels ont été constatés lors d’accidents
(fuite de pétrole …etc.), de rejets ou de déversements volontaires, pouvant entraîner des
catastrophes écologiques irréversibles (SOLTANI, 2004).
Il est donc nécessaire de trouver des outils capables d’aborder de manière aussi
globale et intégrée que possible ces problèmes, dans le souci d’améliorer les connaissances et
le contrôle des phénomènes mis en cause.
Compte tenu des limites présentées par les analyses physico-chimiques, il est
nécessaire de faire appel à des moyens biologiques pour surveiller les effets de ces polluants
émis par les décharges dans le sol. Le recours aux microorganismes présente l’intérêt
d’observer la vie sous ses différentes formes et permet de servir, dans les conditions de
perturbation, de signal d’alarme. Le développement de la bio-indication ouvre ainsi la voie à
une surveillance écologique plus large intégrant les effets sur l’environnement grâce à des
organismes sentinelles (GARREC et VAN HALUWYN, 2002).
Par ailleurs, le problème majeur rencontré dans les sols pollués par les produits
pétroliers est l’atteinte de la nappe phréatique affectant ainsi la qualité des eaux. Leur
décontamination peut nécessiter soit l’intervention de procédés physicochimiques ou alors
biologiques (SCOW, 2003).
14
[Tapez le titre du document]
la plus demandée car la mieux maîtrisée et la moins coûteuse (VOGEL, 2001). Il s’agit là
d’une technique douce dont le principe repose sur la minéralisation complète des produits
pétroliers qui ne génèrent aucun sous produit toxique ; contrairement aux procédés
physicochimiques qui consistent souvent en un transfert de la pollution d’un milieu à un autre
ou encore à son confinement (VANDERCASTEEL, 2005).
C’est dans ce contexte que s’insère notre travail qui consiste en une contribution à la
restauration des sols pollués par les hydrocarbures en utilisant des bactéries telluriques
autochtones des zones sahariennes.
Deux approches sont adoptées. Par la première, les relations pouvant exister entre le
degré de pollution des sols par les hydrocarbures et la distribution des bactéries telluriques
autochtones susceptibles de les dégrader sont recherchées (Biodétection). La seconde
approche concerne l’évaluation de la capacité des bactéries détectées à dégrader les
hydrocarbures lorsqu’elles sont intégrées dans l’un des procédés de traitement d’un sol pollué
(Bioremédiation).
La réalisation de cette étude se base sur des procédés biologiques impliquant des
méthodologies appropriées.
15
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Partie : 1
Synthèse bibliographique
16
PARTIE : 1 Synthèse bibliographique
I. Hydrocarbures pétroliers
I.1. Définition
Les hydrocarbures sont des composés organiques contenant exclusivement des atomes
de carbones (C) et d'hydrogène (H) (FRNENNEC et al ., 1988).
I.2. Classification
Les hydrocarbures constituent la fraction la plus importante d'un brut pétrolier, ils
représentent entre 65 et 95 % de la plupart des pétroles bruts. Ces hydrocarbures peuvent être
classés en quatre familles principales qui sont présentes en proportions variables selon leur
origine: les hydrocarbures saturés (30 à 70 %), les hydrocarbures aromatiques et
polyaromatiques (20 à 40 %), les composés polaires (5 à 25 %) et les asphaltènes (0 à 10 %)
(NEFF, 1979).
Selon SOLTANI (2004), les hydrocarbures pétroliers sont classés comme suit:
d. Alcanes linéaires
Les alcanes linéaires (n-alcanes, CnH2n+2), dont la longueur de leur chaîne varie de 7
à 40 atomes de carbone constituent une des classes les plus abondantes (10 à 40 % des
hydrocarbures totaux d'un brut pétrolier).
e. Alcanes ramifiés
Les alcanes ramifiés les plus abondants sont les iso-alcanes (groupement méthyle en
position 2). Les autres composés ramifiés antéiso (groupement méthyle en position 3) ou
polyramifiés tels que les isoprénoïdes (exemple: pristane, phytane) sont beaucoup moins
nombreux. Ces composés se trouvent dans le pétrole brut à des proportions sensiblement
égales à celles des n-alcanes.
1
PARTIE : 1 Synthèse bibliographique
f. Cycloalcanes
Les dérivés soufrés sont dans la plupart des cas plus abondants que les composés
oxygénés ou azotés.
I.2.4. Asphaltènes
2
PARTIE : 1 Synthèse bibliographique
I.3.1 Evaporation
L'évaporation est un phénomène qui touche les fractions de faible poids moléculaire et
dépend des conditions atmosphériques (vent, vagues, température,…). Les hydrocarbures les
plus légers, ayant de 4 à 12 atomes de carbone (T° eb < 270 °C), qui représentent
généralement prés de 50 % des hydrocarbures totaux d’un brut moyen, sont éliminés
rapidement dès les premiers jours, pouvant conduire à une pollution de l’atmosphère
(SOLTANI, 2004).
I.3.2 Solubilisation
La solubilité des hydrocarbures dans l’eau est très faible. Un hydrocarbure est
d’autant plus soluble que sa masse moléculaire est faible et que sa polarité est élevée. Il est
important de noter que ces hydrocarbures solubles sont parmi les plus dangereux pour
l’environnement. Ils sont difficiles à éliminer et sont adsorbés par la faune et la flore
(GOSWAMI et SINGH, 1991;BOUCHEZ et al ,1995).
I.3.3. Emulsification
Deux types d’émulsions peuvent se former : eau dans l'huile appelée "mousse
Chocolat" et huile dans l'eau. Les émulsions eau dans l'huile sont constituées par des
hydrocarbures de haut poids moléculaires. Ces émulsions difficilement dégradables sont les
précurseurs des résidus goudronneux retrouvés sur les plages, alors que les émulsions « huile
dans l'eau » facilitent l’élimination des hydrocarbures (SOLTANI, 2004).
I.3.4. Sédimentation
I.3.5. Photo-oxydation
3
PARTIE : 1 Synthèse bibliographique
1989). Ainsi, la photooxydation touche plus particulièrement les composés aromatiques qui
sont plus photosensibles que les composés aliphatiques. Parmi ces derniers, les composés
ramifiés sont plus facilement photo-oxydés que les n-alcanes (RONTANI et GIUSTI, 1987).
I.3.6. Biodégradation
Les impacts de la pollution par les hydrocarbures sont multiples. Les aspects les plus
évidents sont les grandes catastrophes très médiatisés (SOLTANI, 2004).
Les sols contaminés par les hydrocarbures présentent un danger lors d'un contact direct
avec l'Homme ou l'animal ou lors de leur transfert dans les chaines alimentaires. C'est le
phénomène de bioaccumulation avec le piégeage par les végétaux et les animaux des
polluants ou de leurs produits de dégradation jusqu'à des teneurs atteignant les seuils de
toxicité (SCRIBAN, 1999).
4
PARTIE : 1 Synthèse bibliographique
5
PARTIE : 1 Synthèse bibliographique
Plusieurs auteurs ont étudié la répartitions des dégradeurs des HAP dans
l'environnement (KAISTNER et al.1994 ; MAHMOOD et RAMA RAO, 1994 ; MULLER et
al., 1997) . La plupart de ces études ont trait aux bactéries des sols.
Les études de la microflore des sols pollués par les hydrocarbures ont mis en évidence
plusieurs points relatifs à l'activité des bactéries aérobie. Ces études ont notamment souligné
l'intérêt physiologique et écologique de la croissance microbienne, la grande diversité de la
5
PARTIE : 1 Synthèse bibliographique
SHI et al. (1999) ont montré que la composition de la microflore des sols est modifiée
par la venue d'une pollution par des carburants, avec un enrichissement en ß-protéobactéries
et/ou y- protéobactéries. GREENE et al. (2000) ont mis en évidence 55 génotypes différents
dans la communauté d'un site contaminé par BTX, styrène et naphtalène. Ces génotypes
correspondent à des bactéries possédant des capacités de dégradation des hydrocarbures
différentes et plus ou moins larges selon les souches bactériennes.
Les résultats de KIYOHARA et al. (1992) montrent que la plupart des bactéries
utilisant les HAP ont été trouvées dans des environnements ou une activité humaine non
négligeable a amené des contaminations par HAP. Les auteurs, notent également la rareté des
souches dégradant l'anthracène et le kérosène ainsi que l'ubiquite remarquable des souches
dégradant le phénanthrène. Il n'est pas exclu que cette études complaise aussi certains cas de
dégradation des HAP par cométabolisme.
Si les bactéries capables de dégrader le naphtalène sont observées dans tous les sols
en quantité non négligeables, c'est –à- dire supérieures à 104 UFC/g, les bactéries dégradant
les HAP à trois ou quatre cycles ne sont au contraire présentes en quantités importantes (de
103à 106UFC g-1 de sol) que dans les sols contaminés par les HAP. Des observations
analogues ont été rapportées, dans le cas des bordures d'autoroute, par (TUHACKOVA et al.,
2001 ; KASTNER et al., 1994).
MULLER et al. (1997) ont effectué une comparaison incluant les caractères
physiologiques (analyses des acides gras des phospholipides et détermination de l'éventail de
substrats de croissance) et les caractères phylogéniques (séquence d'ARN r16S) d'une série de
bactéries. Les souches étaient isolées des sols géographiquement divers contaminés par la
créosole et étaient sélectionnés pour leur croissance sur phénanthrène ou fluoranthène. Les
auteurs ont observé une prédominance de bactéries Gram négatives, sans doute favorisées par
leur vitesse de croissance plus élevée que celle des bactéries Gram positives.
6
PARTIE : 1 Synthèse bibliographique
KAISTNER et al. (1994) ont par ailleurs précisé qu'aucune bactérie utilisant le
pérylène, le chrysène ou le benzopyrène comme seule source de carbone et d'énergie n'avait
pu être détectée, quel que soit le type de sol.
Les hydrocarbures sont connus pour représenter un risque certain pour la santé
humaine et les écosystèmes, si leur concentration et leur mobilité sont trop importantes. Afin
d’éviter la diffusion des HCP des sites contaminés vers les profondeurs des sols, des mesures
doivent être prises en considération. Le choix d’une méthode particulière de dépollution va
dépendre, au préalable, de certains paramètres comme le type de polluant et de la variabilité
de son comportement (volatilité, adsorbabilité, polarité…), de la diversité des conditions
locales (nature du sol, de la nappe, accessibilité, disponibilité de surfaces utilisables à
proximité, zone urbaine ou non), de voir s’il s’agit d’une pollution récente ou ancienne, de
son étendue ou non. En plus, les exigences économiques et administratives sont à prendre en
compte. Tout ceci nécessite donc, au préalable, un diagnostic (VOGEL, 2001).
En fonction de ces différents aspects, trois catégories d'actions peuvent être menées :
- Les méthodes ex situ qui consistent en l'excavation des sols contaminés. On parlera de
méthode "hors site" si le sol est évacué vers un centre de traitement spécialisé, ou de
méthode "sur site" si le sol excavé est redéposé sur le site pour être traité,
- Les méthodes in situ pour lesquelles l'opération de dépollution s'effectue sans excavation du
sol. Cette option est souvent choisie pour traiter des sites en activité ou lorsque la zone
polluée est trop étendue pour avoir recours à l'excavation (BALLERINI et
VANDECASTEELE, 1999).
I. 6.1.Traitements physiques
7
PARTIE : 1 Synthèse bibliographique
technologies consistent à utiliser les hautes températures pour réduire les polluants en CO2 et
H2O (LECOMTE, 1995).
Les traitements chimiques ont pour but de détruire les polluants ou de les transformer
en une forme moins nocive pour l'environnement ; et ceci par l’intermédiaire de réactions
chimiques se produisant entre le polluant et le réactif ajouté. Ils peuvent être applicables in
situ ou après excavation des sols. La majorité des procédés exigent que les sols soient sous
forme de boues ou que les contaminants soient mobilisés dans un milieu liquide (MASTEN et
DAVIES, 1997).
I.6.4.Traitements biologiques
Les procédés biologiques permettent de dégrader les polluants par l'action des
organismes (bactéries, champignons, levures, plantes). Ils peuvent être utilisés seuls ou en
complément d'une autre technique. La décontamination par voie biologique consiste donc à
stimuler un phénomène naturel pour en augmenter le rendement afin de détruire le polluant
organique qui sera utilisé comme source de carbone (COLIN, 2000).
a. Traitement in situ
b. Traitement en réacteur
8
PARTIE : 1 Synthèse bibliographique
c. Biotertre et Landfarming
Pour se faire, le sol est étalé après excavation sur une grande surface imperméable, sur
une épaisseur de quelques dizaines de centimètres. Ensuite la terre est retournée avec
d'éventuels ajouts favorisant la biodégradation (LECOMTE, 1995).
Lorsque le taux d’élimination n'est pas suffisamment élevé, la biostimulation peut être
effectuée par ajout de nutriments spécifiques et/ou bioaugmenté par ajout de bactéries
adaptées à la pollution. STRAUBE et al. (2003) ont constaté une réelle amélioration des taux
a. Phytoremédiation
10
PARTIE : 1 Synthèse bibliographique
5
PARTIE : 1 Synthèse bibliographique
5
PARTIE : 1 Synthèse bibliographique
• Biodégradation ultime; qui exprime le stade au quel la ou les molécules sont totalement
transférées en CO2 (conditions aérobie) ou en CH4 (conditions anaérobie), soit en constituant
de la biomasse, soit en éléments minéraux (ex: minéralisation de l'azote organique en nitrate,
ammonium…) (BOUILLON, 2003).
• Activité microbienne.
11
PARTIE : 1 Synthèse bibliographique
Le sol est composé de matière minérale provenant de l'érosion des roches et de matière
organiques (l’humus) provenant de la décomposition partielle des végétaux (DOVET, 1996).
La capacité de se développer sur les hydrocarbures ne se limite pas uniquement sur les
bactéries, certains sites contaminés contiennent également de nombreux champignons et
levure capables de les dégrader (VANDECASTEELE, 2005).
Bactéries Champignons
Parmi les microorganismes aptes à se développer sur les hydrocarbures, les bactéries
restent qualitativement et quantitativement prépondérantes pour métaboliser ces substrats
12
PARTIE : 1 Synthèse bibliographique
(BERTRAND et MILLE, 1989). On peut y retrouver tous les types de bactéries, des
autochtones, des hétérotrophes, des aérobies ; des anaérobies ; des mésophiles ; des
psychrophiles et des thermophiles (ZHENPENG et al., 2002).
Plusieurs hypothèses sur l'origine des bactéries dans le sou sol sont émises:
- Migration depuis la surface soit par un processus naturel géologique soit par les
opérations de forage.
- Migration latérale ou verticale avec l'eau de surface via les infiltrations, les flux
hydrodynamiques et les mouvements d'eau profonde.
- Capture dans les sédiment lors de leur formation (LENAITRE et al., 1998).
D'après CHAINEAU et al. (1995), un sol qui contient des hydrocarbures modifie
l’activité des microorganismes. Ceux-ci doivent donc adapter leur activité enzymatique afin
de pouvoir s’y attaquer. Les bactéries et les champignons vont ensuite subir une période de
forte croissance au cours de laquelle ils seront capables d'assimiler les produits de la
dégradation des hydrocarbures. Cette biodégradation peut prendre plusieurs mois. Une fois
qu’ils ont consommé les composés les plus facilement dégradables, leur nombre diminue
jusqu'à atteindre de nouveau la taille d’une population normale. Parfois, seule une partie des
polluants est dégradés car les hydrocarbures se lient partiellement à la matière organique du
sol et deviennent alors moins accessibles aux microorganismes.
Les bioprocédé s’appliquent à une grande variété de sol. Pour cela, il est important
connaitre la structure et la nature de sol (LECOMTE, 1995).
NAM et al. (2003) ont observé que les agrégats de sols réduisaient la biodégradation.
II.4.3.Humidité
13
PARTIE : 1 Synthèse bibliographique
II.4.4.Température
II.4.5.Salinité
L'activité microbienne est largement influencée par le pH. Il doit être situé entre 5 et 9
avec un optimum aux alentours de 7 (GABET, 2004). Si le pH est acide, il peut favoriser la
solubilisation des métaux lourds qui sont très toxiques pour les bactéries (ABUL-KASSIM et
SIMONIETE, 2001).
II.4.7.Taux d'oxygène
14
PARTIE : 1 Synthèse bibliographique
digestive par les organismes et favoriser la croissance des populations de bactéries. Les plus
importants sont l'azote et le phosphore (N, P) (BAROAAH et BORTHAKOR, 1999).
Ce modèle est celui généralement accepté pour la plupart des substrats. Une fois le
substrat dissout assimilé, la bactérie ne peut utiliser que les molécules se solubilisant dans
l’eau. Par exemple, il a été démontré que la solubilité et la vitesse de dissolution du
naphtalène limitent la croissance d’une souche Alcaligenes NP-ALK. Au début de la
croissance, la faible densité cellulaire de la culture initiale permet une croissance
exponentielle puisque la concentration de naphtalène dissous suffit aux besoins métaboliques.
Si la densité cellulaire augmente à un niveau où les exigences nutritionnelles surpassent la
vitesse de dissolution, la biodisponibilité deviendra alors limitante et la croissance linéaire.
Cette dernière va dépendre alors de la vitesse de dissolution du naphtalène (COMEAU, 1999).
15
PARTIE : 1 Synthèse bibliographique
produire pendant la croissance sur des alcanes ; et peuvent dans certains cas, représenter le
moyen d’augmenter l’association cellulaire avec la phase d’hydrocarbure. Un système actif de
transport employé par Acinetobacter HO1-N cultivé sur n-hexadécane a été décrit par
KAPPELI et FINNERTY (1979), où des gouttelettes d’hydrocarbure ont été encapsulées dans
les microvésicules de la membrane finissant alors par pénétrer dans la cellule.
Des biosurfactants sont produits par les bactéries. Ils ne sont pas indispensables au
transfert qui s’effectue comme dans le cas précédent mais ils vont l’accélérer de façon
importante en augmentant l’aire interfaciale entre les phases hydrophobe et hydrophile
(émulsification) (BALLERINI et VANDECASTEELE, 1999).
16
PARTIE : 1 Synthèse bibliographique
Les espèces les plus importantes sont celles appartenant au genre Pseudomonas
produisant les rhamnolipides et les espèces du genre Torulopsis produisant les sophorolipides.
Les biosurfactants de ces différentes espèces sont extrêmement efficaces et créent les niveaux
de tension superficielle les plus bas et ceci pour des concentrations inférieures à celles
requises pour les agents tensioactifs synthétiques (VANDECASTEEL, 2005).
Les alcanes à chaîne moyenne (C5-C10) sont utilisés notamment par des espèces de
bactéries du genre Pseudomonas comme P.aeruginosa, P. putida et P. oleovorans qui ont
été particulièrement étudiées (KAISTNER et al.1994 ; VANDECASTEELE, 2005).
Les alcanes à chaîne longue (C10-C20) sont très bien utilisés par lesmicroorganismes,
plus rapidement que les alcanes moyens. Les bactéries remplissant ce rôle appartiennent en
particulier aux groupes des Corynebacterium, Mycobacteruim et Nocardia (CMN);
notamment au genre Rhodococcus, c’est le cas de la souche Rhodococcus Q15 capable
d’utiliser une large gamme des alcanes (C10 à C21) et à des températures allant de 0 °Cà
30°C, (WHYTE et al., 1998).
De plus, les alcanes à très longue chaîne (>C20) sont également dégradés par les
microorganismes, mais l’utilisation de ces substrats solides à température ambiante a été
moins étudiée (BALLERINI et VANDECASTEELE, 1999).
17
PARTIE : 1 Synthèse bibliographique
En ce qui concerne les alcènes, le cas des doubles liaisons terminales a été étudié. Ces
alcènes sont biodégradables et leur métabolisme est proche de celui des alcanes. Plusieurs
modes d’attaques ont été mis en évidence, mais l’oxydation du groupement méthyle terminal
est considérée comme le mécanisme majeur (BALLERINI et VANDECASTEELE, 1999).
18
PARTIE : 1 Synthèse bibliographique
Le mode d’attaque dépend des groupements alkyles substituant mais pour un même composé
va dépendre également de la souche bactérienne. Cinq voies distinctes ont été
19
PARTIE : 1 Synthèse bibliographique
Figure 3 : Schéma général des voies métaboliques de dégradation des n-alcanes et des
isoalcanes (BALLERINI et VANDECASTEELE, 1999).
11
PARTIE : 1 Synthèse bibliographique
Toluène
11
PARTIE : 1 Synthèse bibliographique
décrites pour la dégradation aérobie du toluène. Toutes les voies démarrent avec
l’oxydation du toluène, mais cinq produits différents d’oxydation sont formés (figure 4). Le
mode d’attaque très utilisé par une dioxygénase sur le noyau aromatique est la voie de
dihydrodiol, avec la molécule du toluène (figure 5).
Quelques HAP sont classés comme polluants prioritaires par la plupart des agences de
protection de l’environnement et en particulier, celle des Etats-Unis et ceci en raison de leur
persistance dans l’environnement (KANALY et al., 2000 ; KANALY ET HARAYAMA,
2000 ; WANG et al., 2000 ; KANALY et al., 2002 ; ERIKSSON et al., 2003).
Il a été observé que la dégradation des HAP dans le sol est dominée par des souches
bactériennes appartenant à un nombre très limité de groupes taxonomiques, tels que
Sphingomonas, Burkholderia, Pseudomonas et Mycobactérie ; y compris d’autres genres
comme Acidovorax, Bordetella, Bacillus et Variovorax (JOHNSEN et al., 2005 ; YU et al.,
2005). Parmi ces groupes taxonomiques, des isolats appartenant aux Sphingomonadaceae
représentent la proportion la plus élevée. Ces isolats ont été classés dans différents genres :
Sphingomonas, Sphingobium, Novosphingobium et Sphingopyxis. Les membres de ces genres
apparaissent êtres spécialisés dans la dégradation des produits chimiques aromatiques, et dont
certains sont même considérés comme des oligotrophes strictes (JOHNSEN et al., 2005).
En revanche, la majorité des travaux ont porté sur l’étude des espèces de
mycobactéries. La raison principale est leur capacités à dégrader les HAP ; soit par
cométabolisme, ou alors par minéralisation. Dans ce cadre, la plupart des voies biochimiques
des mycobactéries et de leurs métabolites ont été identifiés (KANALY et HARAYAMA,
2000; CHEUNG et KINKLE, 2001; KHAN et al., 2001; MOODY et al., 2001 ; REHMANN
et al., 2001; VILA et al., 2001; BOGAN et SULLIVAN, 2003).
Les voies de dégradation des HAP ont été caractérisées sur la base des structures des produits
intermédiaires de dégradation identifiés. Le schéma général est comparable à celui des
hydrocarbures monoaromatiques. Après la double hydroxylation du premier noyau, une étape
d’oxygénation supplémentaire est nécessaire pour chaque ouverture de cycle (MENN et al.,
1993 ; SANSEVERINO et al., 1993 ; WANG et al., 2000 ; MOODY et al., 2001 ;FERRERO
et al., 2002).
Partie : 2
Matériel et méthodes
بركاوي
Berkaoui
I. Biodétection
Pour la réalisation de nos expériences, nous avons utilisé des échantillons de sols
prélevés de trois bourbiers pollués par des rejets de forage au niveau des champs de Hassi
Messaoud, Haoud Berkaoui et un échantillon accidentellement pollué au niveau de Bamendil.
D'autres échantillons sont prélevés de deux sols n'ayant pas subit de rejets pétroliers, il s'agit
de Bamendil et l''exploitation agricole de l'université de Ouargla (figure 6).
I.2. Méthodes
I.2.1. Echantillonnage
22
Partie 2 Matériel et méthodes
échantillons de sols sont conservés au frais (environ 4°C) car un stress hydrique peut
perturber les mesures biologiques (CHAUSSOD et al, 1992 ; FARDOUX et al, 2000).
a. Analyse physiques
La texture d’un sol est révélée par son analyse granulométrique dont le principe est
basé sur la vitesse de sédimentation des particules séparées et dispersées par destruction de la
matière organique par une attaque à l’eau oxygénée. Le fractionnement de ces particules se
fait par l’intermédiaire de la pipette de Robinson qui permet la détermination des fractions
argileuses et limoneuses fines. Ensuite, les sables fins et grossiers sont mesurés par tamisage
(BAIZE, 2000).
b. Analyses physico-chimiques
Le pH est déterminé selon la norme AFNOR X 31-103 (AFNOR, 1994) par la mesure
du pH d'une suspension de sol dans l'eau à 2/5 (rapport masse/volume) après 1 heure
d'agitation puis décantation à l'aide d’un pH mètre de type Inolab MLM .
La conductivité électrique est mesurée sur l’extrait de sol dilué au 1/5. Elle doit être
exprimée en dicisiemens par mètre (ds/m) (BAIZE, 2000). Elle a été déterminée par un
conductimètre de type Inolab cond 720.
c. Analyses chimiques
23
Partie 2 Matériel et méthodes
Le dosage de ce dernier nécessite une mise en œuvre d'une réaction colorée spécifique
de l'élément recherché selon le schéma suivant (Norme NFT 90-032):
Le dosage des nitrates nécessite une mise en œuvre préliminaire d'une réaction colorée
spécifique de l'élément recherché selon la réaction suivante (Normes NFX 31 160):
Ce dosage par spectrophotomètre est effectué à une longueur d'onde de 400nm pour
les faibles concentrations et de 500nm pour les fortes concentrations.
Le dosage des nitrites nécessite une mise en œuvre préliminaire d'une réaction colorée
spécifique de l'élément recherché. Dans ce cas, la réaction dépend de la teneur en nitrites.
Pour les faibles concentrations, la réaction est la suivante (Norme NFT 90-013):
Les teneurs des sols en hydrocarbures sont mesurées par Retord qui est un four
conçu pour déterminer la saturation en huile et en eau des échantillons solides (roches, déblais
de forage) par un procédé thermique dans lequel l'huile et l'eau contenue dans un échantillon
frais de matériau broyé sont vaporisés, condensés et recueillis dans un tube en verre gradué.
Les échantillons sont progressivement chauffés pour éliminer l'eau et ensuite l’huile à une
température allant jusqu’à jusqu'à 650°C (1200°F)(ANONYME, 2001) (figure 07).
Selon la norme ISO 9 408, le taux de biodégradabilité est calculé selon la formule
suivante:
25
Figure 7 : Principe de détermination des teneurs en HCT
HC dans le sol par distillation
dans un four(ANONYME,
four 2001)
Partie 2 Matériel et méthodes
Selon la norme NFT 90-103, la mesure de la DBO repose sur la quantification de l'O2
consommé après 5 jours d’incubation de l'échantillon.
Une oxydation lente par voie chimique des composés organiques et minéraux.
Une métabolisation des matières organiques assimilables.
e. Analyses microbiologiques
26
1g d'échantillon de sol
Suspension mère
ml1
10-n
10-2
10-3
-4
10
Après 24h d'incubation à 30°C, les colonies développées sont dénombrées à l'aide
d'un compteur de colonies de type Funke Gebber Colony Star.
Selon MARCHAL et BOURDON (1982), le nombre de germes par gramme de sol est
déterminé en calculant la moyenne arithmétique des résultats obtenus et en tenant compte des
facteurs de dilution, selon la formule:
N = n / d. v
d: dilution.
À partir d'un échantillon de sol, 1 g est prélevé puis mélangé à 9 ml de milieu minéral
(BH) (Annexe 01). Le milieu est additionné de pétrole brut de 2% considéré comme seule
source de carbone à raison de 2 %. Le mélange est ensuite incubé à 30°C sous agitation à
raison de 150 tours/min.
Après l’étape de pré enrichissement, nous avons procédé à la préparation des dilutions
variant de 10-1 à 10-9, et à l’ensemencement sur un milieu de gélose nutritive "GN".
L'incubation se fait à 30°C pour une durée de 24 heures (JOHNSEN, 2005).
α. Purification
La sélection des colonies est basée sur l'aspect macroscopique des colonies à savoir
la couleur, la forme, le diamètre, l’opacité. Un échantillon de chaque type de colonie est
prélevé et ensuite purifié par repiquages successifs selon la méthode de stries (DELARRAS,
2008)
27
Partie 2 Matériel et méthodes
Les souches isolées sont conservées dans des tubes à essai contenant de la gélose
nutritive (GN) inclinée. Les souches sont ensemencées sur la pente des tubes par la méthode
des stries, puis incubées à 30°C pendant 24 heures. Les tubes dans lesquels il y a eu une
croissance seront bouchés et conservés à 4°C pour une durée de 4 à 6 semaines. Afin de
pouvoir toujours disposer de souches viables, la réactivation doit se faire tous les mois
(MARCHAL et BOURDON, 1982).
L'identification des souches isolées est réalisée en se basant sur les études
morphologique et biochimique.
α. Etude morphologique
28
Partie 2 Matériel et méthodes
Coloration de Gram
C'est une double coloration qui nous permet de connaître la forme, l'arrangement, la
pureté ainsi que la nature biochimique de la paroi des cellules purifiées. Cette coloration est
réalisé systématiquement sur les différentes colonies purifiés pour préciser le caractère Gram+
ou Gram-. Avec cette coloration double, les bactéries Gram positive apparaissent en violet
foncé tandis que les bactéries Gram négatives sont colorées en rose ou en rouge
(DELARRAS, 2008).
Recherche de spores
β. Analyses biochimiques
Cette approche nous oriente sur le métabolisme suivit par les bactéries et les enzymes
qu'elles possèdent. Certains tests ont été réalisés en utilisant la galerie API 20E (Annexe03).
Catalase
H2O2 H2 O + ½ O2
Sur une lame et à l’aide d’une pipette Pasteur, on dépose une colonie bactérienne à
laquelle on ajoute de l'eau oxygénée (à 10 volumes). La présence d'une catalase est révélée
immédiatement par des bulles de gaz qui correspondent à l'oxygène dégagé (MARCHAL et
BOURDON, 1982).
Recherche de l'oxydase
Ce test détecte un type de chaine respiratoire, qui comporte en fin des chaine un
cytochrome C et une oxydase associée. Les bactéries qui possèdent une telle chaine peuvent
oxyder les composés chimiques comme le réactive oxydase. Les électrons sont transférés de
ce réactif au cytochrome C et de là, via l'oxydase, à l'oxygène. Ainsi oxydé, le réactif
29
Partie 2 Matériel et méthodes
développe une coloration violette sur le disque d'oxydase imbibé par la suspension
bactérienne, cela indique que le test est positif (SINGLETON, 1999).
L'utilisation d'un glucide (ose, diholoside, polyoside) se traduit par une acidification
du milieu par le CO2 ou par les acides organiques produits. En règle générale, c'est un
indicateur de pH qui permettra la visualisation de l'acidification par l'apparition de
chromogène jaune (JOFFIN et LEYRAL, 2006).
ß -galactosidase
Le milieu utilisé est le citrate de Simmons (de couleur verte), qui ne contient que le
citrate (C6H5O7) comme seule source de carbone qui est le citrate de sodium. Seules les
bactéries possédant une enzyme citrate perméase seront donc capables de se développer sur ce
milieu. L'utilisation de citrate provoque l'alcalinisation du milieu selon la réaction suivante
(MARCHAL et BOURDON, 1982):
Citrate perméase
30
Partie 2 Matériel et méthodes
Décarboxylase
Il s'agit d'enzymes induites dont la synthèse est favorisée par un pH acide (pH entre
3.5 et 5.5) et des conditions d'anaérobiose (MARCHAL et BOURDON. ,1982).
31
Partie 2 Matériel et méthodes
Recherche de l'uréase
NH2 Uréase
C=O + H2O H –COO- NH2 + NH3
NH2
NH2 Uréase
C =O + H2O CO2 + NH3
NH2
.
Le CO2 et le NH3 en présence d'eau se combinent en donnant le carbonate
d'ammonium selon la réaction:
Production de H2S
La production d'H2S est révélé par les ions F3+ qui forme avec le sulfure d'hydrogène
un précipité noire de sulfure de fer. Le précipité peut être redisous en milieu acide (JOFFIN
et LYERAL, 2006).
Production d'indole
TDA
Tryptophane + H2O acide indol-pyruvique + NH3+ 2H++ 2é
32
Partie 2 Matériel et méthodes
La gélatine peut être incorporé dans un milieu de culture afin mettre en évidence sa
dégradation par certaines bactéries possédants une gélatinase: c'est le test gélatinase. Cette
enzyme hydrolyse le collagène en acides aminés ou en peptides (JOFFIN et LYERAL, 2006).
Les milieux King A et King B (Annexe 01) permettent la différenciation entre les
espèces de Pseudomonas par la mise en évidence de leurs pigments spécifiques. La
production de pigments est favorisée par la composition du milieu (MARCHAL et
BOURDON, 1982).
II. Bioremédiation
Le traitement biologique des sols consiste à utiliser des organismes pour transformer
des substances chimiques toxiques en substances non toxiques (ABDELLY, 2006).
II.1. Matériel
II.1.1. Sol
L'inoculum bactérien est constitué par une biomasse bactérienne préparée à partir de
la souche ayant le temps de génération le plus court. Il est utilisé pour bioaugmenter la
microflore indigène du sol.
33
Partie 2 Matériel et méthodes
II.1.3. Biosurfactant
Le sol (échantillon E1) est étalé sur huit bacs dans plastique de dimensions:
B5:Bac bioaugmenté par l'ajout d'un inoculum d'une souche bactérienne sélectionnée.
B6:Bac bioaugmenté par une souche bactérienne sélectionnée et stimulé par solution
nutritive ;
B7:Bac bioaugmenté par une souche bactérienne sélectionnée et stimulé par biosurfactant.
B8:Bac bioaugmenté par une souche bactérienne sélectionnée et stimulé par urée (6g/l).
34
Partie 2 Matériel et méthodes
II.2.1. Biostimulation
La stimulation de la microflore de notre sol est réalisée par le moyen soit de 200ml de
solutions contenant soit 2% de la solution de biosurfactant, soit 18.51g/l de NH4NO3 et
3.7g/l de K2HPO4 ou 6 g/l solution d’urée.
35
Bioaugmentation
Inoculum
bactérienne
Biostimulation Bioaugmentation+ Biostimulation
B.5
2kg de sol
B.8
B.4 B.7
B.2 biosurfactant
Solution nutritive
27
Figure 9: Stratégie de bioremédiation.
Partie 2 Matériel et méthodes
II.2.2. Bioaugmentation
a. Sélection d'isolats
La cinétique de croissance des souches isolées de l'échantillon de sol (E1) sur milieu
BH additionné de 2% de pétrole comme seule source de carbone, a été suivie pendant 8
heures en mesurant chaque deux heures la concentration bactérienne (RODRIGO et al, 2005).
Où : µ=N/t G=t/N
La souche ayant montré le temps de génération le plus court à été choisie pour
augmenter l’échantillon destiné à la bioremédiation.
b. Préparation de l'inoculum
L'inoculum est constituée par une biomasse bactérienne de 3.41 1011 UFC/ml.
36
250 ml de milieu
BH(2% de pétrole)
1Colonnie
Incubation pendant
Pendant 10 mn
Culot
Afin d'estimer la vitesse de dégradation des hydrocarbures par les bactéries telluriques
à partir des prélèvements effectués de témoin et des bacs bioaugmentés et/ou biostimulés
hebdomadairement pendant 5 semaines, un suivi des différents paramètres en relation avec la
concentration bactérienne évaluée par simple dénombrement sur le milieu GN et celle des d’
hydrocarbures résiduels, les taux d'élimination des ces polluants et le pH a été effectué.
37
PARTIE : 3
Résultats et discussion
1E 2E 3E
%7 14
43 %6 12 37
%41 %9 %
%11 % % %
14
% 16
%16 25 26 %
%23 % %
4E 6E 13
%15
5E %7 39 % 17
%15 %13 % %
%42 %42
%14
%24
%16 %12 20 11
% %
37
Partie 3 : Résultats et discusion
D'après la figure11, l’analyse granulométrique montre que la fraction prépondérante est celle
des sables (plus de 50%).
D’après la figure12, les horizons étudiés sont donc classés comme des horizons
sableux limoneux pour E1, E2, E3 et E5 et sableux argilo- limoneux- pour E4 et E6 selon le
triangle textural du Groupement d'Études des Problèmes de Pédologie Appliquée : GEPPA
La structure sableuse des sols étudiés suggère une circulation facile des fluides
contenant les nutriments et l'oxygène qui sont d'autant accessibles aux microorganismes que
le milieu est perméable (LEGOMTE, 1995).
ERIKSON et al. (2001) ont montré l'influence de la structure du sol sur le transport de
l'oxygène dans ce dernier. Ces auteurs indiquent que plus un sol est dense, moins les
nutriments et l'O2 sont transportés vers la flore indigène du milieu, responsable de la
biodégradation. De même, NAM et al. (2003) ont observé que les agrégats de sols réduisaient
la biodégradation. Cependant, dans les zones arides où le sable est la fraction dominante, les
micro-organismes et leurs produits de synthèse sont faiblement reliés aux particules du sol
(DOMMERGUES ET MANGENOT, 1970).
Plusieurs études ont été effectuées dans le but de comprendre le mode d'action de
l'argile en présence de composés organiques et de bactéries. WARR et al,.(2008) ont souligné
que l'action bactérienne sur les hydrocarbures est nettement améliorée en présence des
smectites de Ca2+ échangeables. Les cations divalents Ca2+ et Mg 2+ agissent comme des ponts
entre l'argile chargée négativement et les biofilms se trouvant aux surfaces des bactéries.
38
Partie 3 : Résultats et discusion
%20
%18
%16
%14
H(%) %12
%10
%8
%6
%4
%2
%0
1E 2E 3E 4E 5E 6E
Echantillons
pH
9 CE (dS/m) à 25°C
8
7
6
5
4
3
2
1
0
1E 2E 3E 4E 5E 6E
Echantillons
Les échantillons de sols étudiés sont aussi caractérisés par une humidité relative
variant de 6 à 17%. Les valeurs les plus élevées sont celles de l'échantillon de HBK E2 (17%)
et de Bamendil E4 (14%), l’échantillon E1 et E3 présentent la valeur d'humidité la plus faible
soit 6% (figure13).
Les faibles teneurs en eau des échantillons peuvent d'une part être expliquées par les
faibles humidités relatives des sols sahariens (MONOD, 1999) et d'autre part par les
déversements des fluides de forage dans le cas de l’échantillon de HBK et la richesse du sol
en argile (14.8%) dans le cas de l'échantillon de Bamendil (E4). Toutefois, il est à noter qu'un
faible taux d’humidité peut avoir un effet négatif sur l’activité microbienne en limitant le
contact microorganisme / polluant et en inhibant le processus de dégradation enzymatique
(LECOMTE, 1995).
Dans un sol sableux suffisamment humide, La continuité d’un film liquide autour des
particules assure une propagation rapide de l’activité microbienne (MOREL, 1989).
Dans les régions arides, les sols sont généralement alcalins (7,5< pH <8,5) (KOULL,
2007).
Le pH alcalin des échantillons prélevés de bourbiers (E1, E2, E3) est influencé par
celui des boues rejetées qui présentent des pH alcalins nécessaires afin d’éviter la corrosion
du matériel de production.
Selon GABET (2004), l'activité microbienne est plus affectée par le pH. Il doit être
compris entre 5 et 9 et avoir un alentour de 7.
Selon l'échelle de salinité (RICHARD et al., 1954) démontre que la majorité des sols
sont moyennement salés, le sol prélevé de l'exploitation de l'université (E5) qui est hyper salé.
39
Partie 3 : Résultats et discusion
40
Partie 3 : Résultats et discusion
30
25
(Nitrite (mg/l
20 (Nitrate (mg/l
(Phosphate (mg/l
15
10
0
1E 2E 3E 4E 5E 6E
Echantillons
Les résultats des certains paramètres chimiques étudiés sont donnés dans la
figure15.
Les concentrations des deux formes d’azote mesurées (nitrate et nitrite) sont très
variables dans les six échantillons de sols. Les nitrites sont très concentrés dans l’échantillon
E3 (11.67mg/l) et E4 (26.3mg/l), moyennement concentrés dans E2 (14.3mg/l) et E3
(11.67mg/l) et plus faibles dans les autres échantillons (figure15).
Par ailleurs, le nitrate est généralement présent à des valeurs faibles et presque
semblables dans tous les échantillons à l'exception de E3 et E4 qui contiennent les plus forts
teneures 1.03mg /l et 1.5mg/l respectivement (figure15).
Selon ECKFORD et al. (2002), la pollution des sols par les hydrocarbures a pour
conséquence un déficit en azote et en phosphore, ce qui peut limiter la biodégradation des
hydrocarbures. Pour tout traitement biologique, un enrichissement du sol avec ces éléments
sera donc nécessaire. L’azote et le phosphore sont des facteurs limitant la biodégradation des
hydrocarbures dans les sols (MOHN et STEWART, 2000).
Par ailleurs, il est connu que la flore microbienne a besoin d’éléments minéraux pour
sa croissance, en particulier d’azote et de phosphore, dont les proportions optimales,
généralement admises, sont de 10g d’azote et 1g de phosphore pour 100g de carbone
(BALLERINI, 1999). Ces éléments rentrent dans l’édification des constituants cellulaires lors
de la multiplication des microorganismes (synthèse d’ADN, protéines…etc.).
SCOW et al. (2003) rapportent que dans les environnements aérobies les éléments
limitant les plus susceptibles sont l’azote et le phosphore. Ainsi, dans de telles conditions, il
est probable quel a biodégradation soit limitée
41
Partie 3 : Résultats et discusion
300
250
teneurs en HCT (g/kg de sol)
200
150
100
50
0
E1 E2 E3 E4 E5 E6
Echantillons
12
10
6
B(%)
.
4
0
E1 E2 E3 E4
Echantillons
Figure 17: Valeurs de taux de biodégradabilité (B%) dans les échantillons pollués.
Partie 3 : Résultats et discusion
Les résultats de dosage des hydrocarbures totaux obtenus sont représentés par la figure
16.
D'après la figure 16, nous constatons que l’échantillon E2 (HBK) est le plus chargé en
hydrocarbures totaux (247.12g/kg de sol) comparé aux échantillons E1 (HH), E3 (C.I.S) et
E4 (B1) qui ont des concentrations en hydrocarbures de 123.43g/kg de sol, 156.02g/kg de sol
et 134.4g/kg de sol respectivement. Les échantillons E5 et E6 n'ont révélé que des traces
d'hydrocarbures totaux.
Les teneurs en hydrocarbures totaux des échantillons (E1, E2, E3 et E4) sont
largement supérieures à la valeur fixée par la norme hollandaise (0.1 g/kg de sol) (GABET,
2004). Ces résultats confirment bien la pollution de ces sols par les hydrocarbures, sachant
que la variation du taux de pollution des échantillons par les hydrocarbures peut être attribuée
à l'historique de contamination.
Par railleur, les faibles teneures en hydrocarbures inferieures à 0,1g/kg de sol indique
que les échantillons E5 et E6 ne sont pas pollués.
Nous pouvons constater que les taux de biodégradabilité (B%) des hydrocarbures
dans les échantillons pollués varient de 2.26 à 9.6% (figure 17).
Les résultats du dénombrement sur gélose nutritive obtenus pour les différents échantillons
des sols étudiés testés, sont représentés par la figure 18.
42
Partie 3 : Résultats et discusion
10
Concentration bactérienne(log UFC /g de sol)
0
1E 2E 3E 4E 5E 6E
Echantillons
HCT
Concentration des HCT(g/kg de sol)
250
8
7
200
6
150 5
4
100
3
2
50
1
0 0
1E 2E 3E 4E 5E 6E
Echantillons
Il en ressort de cette figure qu’il y a présence d’une microflore dans les six
échantillons, mais la comparaison des concentrations en microflore bactérienne totale des
sols nous permet d’avancer que l'échantillon E2 étant le plus récemment pollué présente la
plus faible microflore avec une valeur de 1,1 .104UFC/g de sol par rapport aux échantillons
E1, E3 et E4 présentant des concentrations bactériennes de 6,41.108 UFC/g de sol, de 2,29 107
UFC/g de sol et de 3,1 .108 UFC/g de sol respectivement. Les échantillons E5 et E6 (sols non
pollués) ont des valeurs de 3,09.106UFC/g de sol et 3, 38.107 UFC/g de sol respectivement
(figure18).
On registre une variation nette de la densité bactérienne dans les deux échantillons
E4 (HCT: 137.4g /kg de sol) et E6 (non pollué) sachant que ces derniers sont prélevés de
même zone (Bamendil) (figure19)
Les bactéries capables de dégrader les hydrocarbures sont observées dans le sol en
quantité non négligeables, c'est –à- dire supérieures à 104UFC/g de sol (TUHACKOVA et
al.2001).
Le rejet des produits pétroliers dans les milieux marins ou terrestres entraîne une
prolifération des microorganismes aptes à se développer sur les hydrocarbures et leurs
produits de dégradation. Leur nombre est beaucoup plus important dans les zones polluées de
façon chronique et s’accroît après un apport d’hydrocarbures dans les sites dépourvus de
contamination (ATLAS, 1993).
43
Partie 3 : Résultats et discusion
Critère
Diamètre
Chromogénèse Forme Elévation Contour Opacité Surface Consistance
souche (mm)
a. Etude macroscopique
Les clonies des bactéries sont généralement lisses et ont un diamètre de plus de 1mm
(tableau V).
D’après ROGER et GARCIA (2001), de tous les microorganismes du sol, les bactéries
sont les plus nombreuses et les plus petites : la taille de leurs colonies ne dépasse pas en
général, 0.5 à 2 mm de diamètre.
44
Partie 3 : Résultats et discusion
b. Etude microscopique
L'observation microscopique a été réalisée suivant deux étapes : après une observation
à l'état frais et après coloration de Gram et au bleu de méthylène. Les résultats obtenus sont
donnés dans le tableau VI.
Les résultats consignés dans le tableau VI, montrent une variété de types bactériens.
Les bactéries isolées sont généralement mobiles (11/17). Elles présentent différentes formes :
bacille, coccobacille ou cocci. Elles sont assemblées en différents arrangements soit en paire,
en amas, en chainettes ou même isolées. Elles présentent aussi une paroi de Gram positive ou
négative. La coloration au bleu de méthylène a révélé la présence de spore uniquement chez
les bacilles, les coques et les colibacilles en sont dépourvus.
Les bactéries du sol ont une grande variété de formes. Elles peuvent être mobiles ou
immobiles, et posséder ou non des formes de résistance (spores, kystes) (DOMMERGUES,
1977).
Le caractère mobile des bactéries isolées peut être expliqué par le phénomène de
chimiotactisme, il est important dans la dégradation de nombreuses classes d’hydrocarbures.
Il donne en effet aux bactéries mobiles l'avantage de pouvoir localiser des composés comme
le toluène (VANDECASTEEL, 2005).
Les souches les plus fréquemment décrites dans la biodégradation des hydrocarbures
appartiennent aux genres de Gram positif. D’autres souches Gram négatives ont la capacité de
dégradation des hydrocarbures assez large (VANDERCASTEELE, 2005).
45
Partie 3 : Résultats et discusion
c. Tests biochimiques
Les résultats des tests biochimiques sont représentés dans le tableau VII
Tableau VII: Résultats des tests biochimiques des souches bactériennes isolées.
SA SB SC SD SE SF SG SH SI SJ SK SL Sm SN SO SP SQ Souches/Tests
+ + + + + + + + + + + + + + + + + Catalase
respiratoires
Enzymes
- - - - - - - - + + + - - - + - - Oxydase
+ + + - - - + + - - - - + + + + + Glu
+ + + - - - + - - + - - + + + + - Sac
- + + - - - + + - - - - - + + - - Ara
Métabolismes glucidique
+ + - + + + - - + - - + + + - - + Mannitol
- - - - - - - + - - - - - + - - - H2S
- - + + + - + + - - - - + + + - - (ONPG)
Citrate
+ + + - - - + + + + + + - - - + + perméase
+ + - + - - + - - - - - - - - + + VP
- - - - - - - - - - - - - + + - - LDC
- - - - - - + - + + + + - + - - - ADH
- + + + + + - - + - - - - + - + - Uréase
- - - + - + - - - - - - - - - - - TDA
- - - - - - + - + + - - + - - + - IND
+ + - - - + - - - + - - - - + + GEL
- - - - - - - - + - - - - - - - - King A
- - - - - - - + + + - - - - - - - King B
D'après les résultats présentés dans le tableau VII, la totalité des souches sont
catalase positive alors que le caractère oxydase négative n'est pas un critère général, il ya des
souches qui sont oxydase positive
46
Partie 3 : Résultats et discusion
SA
SB SC
(a)
(b)
SD SE SF
(a)
Bacillaceae
La souche SA a une gélatinase positive, ONPG, ADH, LDC et ODC négatives, elle
oxyde le glucose et le saccharose, ne produit pas H2S (tableau VII), les spores sont sous
forme cylindrique centrées. D'après ces caractéristiques, cette souche pourrait être B. firmus
(BERGEY, 1984 ; LEYRAL et JOFFIN, 1998).
D'après les résultats biochimiques de la souche SC à ONPG positive, elle oxyde les
sucres, citrate perméase, uréase positive, elle peut être B.megateruim. (BERGEY, 1984 ;
LEYRAL et JOFFIN, 1998).
Micrococcaceae
D'après les résultats des tests biochimiques et par comparaison avec ceux établis par
BERGEY (1984), il est probable que la souche SD correspondrait à l’espèce M.varians.
La souche SE ne dégrade pas les protéines et les sucres et présente une uréase
positive. Selon BERGEY'S (1994) cette souche pouvait être Miccrococcus lylae .
47
Partie 3 : Résultats et discusion
(a) SG SH
(b)
Enterobacteriaceae
En se basant sur les tests biochimiques de cette souche, LDC et uréase négatives,
citrate positif, oxyde les sucres, ne produit pas l'H2S, indole et VP positifs (tableauVII), nous
pouvons supposer que la souche SG appartienne à l’espèce E. cloacae (LEYRAL et JOFFIN,
1998).
48
Partie 3 : Résultats et discusion
SI SJ SK
(a)
(b)
Pseudomonaceae
Les colonies de la souche SK sont incolores dans le milieu King A et elles sont de
couleur jaune dans le milieu King B. A coté de ce paramètre, les caractères biochimiques
permettent de déduire que cette souche correspondrait à P.fleoresens. (LEYRAL et JOFFIN,
1998).
Les alcanes de chaines moyennes (C5-C10) sont utilisés notamment par des bactéries
de genre Pseudomonas (VANDECASTEELE, 2005).
49
Partie 3 : Résultats et discusion
(a) (b)
(a) (b)
Rhodococaceae
Selon GURTLER et al. (2004), plusieurs espèces du genre Rhodococcus sont isolées
des sols pollués. Ceci est dû à leur versatilité métabolique. Les mono- et dioxygénases sont
caractérisées biochimiquement et génétiquement chez beaucoup d’espèces de ce genre.
Neisseriaceae
(a) (b)
(b)
(a)
STACK: