IV Mostra Interna de Trabalhos de Iniciação Científica do Cesumar

20 a 24 de outubro de 2008

SEQÜENCIAMENTO AUTOMÁTICO DE PARTE DA REGIÃO 3’ DO GENE

C3-22 DE RHYNCHOSCIARA AMERICANA (DIPTERA: SCIARIDAE)

Cláudia Regina das Neves Saez1; Paulo Henrique Marquiori Visacre1; Fabiana de
Souza Gouveia2; Maria Aparecida Fernandez3; Adriana Fiorini4

RESUMO: O seqüenciamento de ácidos nucléicos permite determinar a ordem das bases nucleotídicas na
molécula do DNA. O seqüenciamento automático é feito pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
utilizando, além dos deoxinucleotídeos normais (dNTPs), os dideoxinucleotídeos (ddNTPs), que são
marcados com material fluorescente, uma cor para cada base, permitindo a detecção de diferentes
fragmentos durante a migração pela eletroforese capilar. O seqüenciamento é apenas a primeira etapa de
um processo cujo resultado final poderá resultar em novos métodos de análise sobre as características
funcionais e estruturais do DNA. O objetivo deste trabalho foi realizar a preparação dos clones de DNA
contendo fragmentos pertencentes à região 3’ do gene C3-22 de R. americana e a reação de
seqüenciamento destes clones, pelo método didesoxi. O gene C3-22 do sciarídeo Rhynchosciara americana
está localizado em uma região amplificada do pufe de DNA C3 e estima-se que o produto do gene C3-22
seja uma proteína de secreção, que parece estar envolvida na formação do casulo pupal de R. americana.
Para esta análise, o DNA recombinante (plasmídeo + inserto) foi introduzido em linhagem DH5-α de E. coli,
através de choque térmico, multiplicado in vivo e extraído destas células pelo método de extração de DNA
plasmidial utilizando o reagente CTAB. Após a extração, as amostras foram quantificadas por
espectrofotometria de luz U.V. e submetidas à reação de seqüenciamento. As seqüências serão
posteriormente processadas em equipamento Mega Bace e os dados analisados através de ferramentas de
bioinformática.

PALAVRAS-CHAVE: Gene C3-22; Rhynchosciara americana; Seqüenciamento automático.

1 INTRODUÇÃO

O seqüenciamento do genoma de diversos organismos vem sendo realizado cada

vez mais nos grandes centros de pesquisa. A técnica de seqüenciamento é utilizada para
determinar em que ordem as bases contidas no DNA se encontram.
O trabalho de seqüenciamento começa com a preparação das chamadas
bibliotecas de DNA (BROWN, 2003). Nessa fase, o genoma a ser mapeado é cortado em
inúmeros fragmentos. Esses pequenos trechos de DNA são então clonados, ou seja, cada
trecho é ligado a uma estrutura que possui a capacidade de se multiplicar chamada
plasmídeo. Estes plasmídeos são inseridos em bactérias que são crescidas em meios
específicos para multiplicação dos trechos originais do genoma em estudo. Só após esse
procedimento é iniciado o seqüenciamento do genoma propriamente dito (FRANÇA et al.,
2002). Existem duas maneiras de se seqüenciar o DNA: o seqüenciamento manual e o
seqüenciamento automático.

1
Acadêmicos do Curso de Ciências Biológicas do Centro Universitário de Maringá – CESUMAR. Programa de Bolsas de
Iniciação Científica do CESUMAR (PROBIC). claursaez@hotmail.com , phmv_bio@hotmail.com
2
Mestre em Genética e Melhoramento. Universidade Estadual de Maringá. Maringá – PR. fabi.gouveia@gmail.
3 a a
Prof . Dr . da Universidade Estadual de Maringá. Coordenadora da Central de Biologia Molecular, Estrutural e
Funcional – CBM/COMCAP – UEM. aparecidafernandez@gmail.com
4
Orientadora e docente do Curso de Ciências Biológicas do Centro Universitário de Maringá – CESUMAR.
fiorini@cesumar.br

IV Mostra Interna de Trabalhos de Iniciação Científica do Cesumar

ISBN 978-85-61091-01-9
CESUMAR – Centro Universitário de Maringá
Maringá – Paraná - Brasil
 Atualmente, a técnica mais utilizada para o seqüenciamento de DNA é a de
Sanger, nome dado ao pesquisador que propôs a técnica (MARTIN, 1989). A síntese de
DNA é iniciada por um oligonucleotídeo, sendo que depois a DNA polimerase continua ao
longo da seqüência molde, incorporando os nucleotídeos e sintetizando a fita nova, sendo
realizada, portanto, através da amplificação por PCR (Reação em Cadeia da Polimerase
(MULLIS, 1986). Nessa técnica existem dois tipos de nucleotídeos: os normais (deoxi) –
dATP, dGTP, dCTP e dTTP; e os dideoxinucleotídeos (não tem o grupo hidroxila no
carbono 3’) – ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP, que são marcados com material
fluorescente. Estes últimos são denominados de terminadores de cadeia, por impedir a
adição de novos nucleotídeos à cadeia de DNA em crescimento (BARNES, 1987).
A polimerização do DNA prossegue, com a inclusão dos nucleotídeos “normais”,
até que, por acaso, a DNA polimerase insere um dideoxinucleotídeo, o que interrompe a
polimerização. Ao final desse processo, se observam fragmentos de tamanhos diferentes.
Essa reação é então colocada em um gel poroso, no qual, após a eletroforese, se observa
a migração dos fragmentos – os menores migram mais rapidamente.
No seqüenciamento automático, não são mais empregados géis de poliacrilamida e
sim eletroforese capilar (KARGER et al., 1991, EELTINK e SVEC, 2007). Os fragmentos
de DNA são sugados para os capilares e migram em eletroforese através deste polímero,
e são lidos automaticamente por lasers, com o auxílio de softwares para leitura dos
dados.
O material para o seqüenciamento é colocado em placas de 96 poços (placas de
microtitulação) e retirado dali diretamente. São obtidos no final cromatogramas com picos
em 4 cores correspondendo aos 4 nucleotídeos. O seqüenciamento é apenas a primeira
etapa de um processo cujo resultado final poderá resultar em novos métodos de
diagnóstico, na formulação de novos medicamentos, vacinas, na prevenção e tratamentos
mais eficazes contra doenças ou pragas, etc. (KIMURA e BAÍA, 2002).
A partir da seqüência de bases definida, o pesquisador tem que saber onde
começam e terminam os genes. Para isso, existem softwares especializados. Exemplos
destes tipos de programas são BLAST, CLUSTAL, PHRED, PHRAP, CONSED, CAP3,
dentre outros. O pacote Phred/Phrap/Consed (NICKERSON et al., 1997) é utilizado para a
leitura de cromatogramas, atribuição de bases, atribuição de qualidade a cada base
(Phred), montagem de seqüências (Phrap), visualização, edição e finalização das
montagens (Consed).
Neste trabalho foram submetidos à reação de seqüenciamento automático clones
pertencentes à região a jusante 3’ da unidade de transcrição do gene C3-22 do sciarídeo
Rhynchosciara americana, como objetivo de concluir o seqüenciamento desta região
amplificada.

2 MATERIAL E MÉTODOS

2.1 OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS DE DNA

Os clones recombinantes contendo insertos de 400 pb, 800 pb, 1100 pb, 1308 pb,
2000 pb e 4000 pb, comportando a região a ser seqüenciada, encontravam-se clonados
em plasmídeo pBluescript II (Stratagene). Estes DNAs recombinantes foram introduzidos
em bactérias competentes E. coli da linhagem DH5-α por choque térmico, para se obter
quantidades suficientes de DNA para a reação de seqüenciamento. Estes clones foram
gentilmente cedidos por Maria Albertina M. Soares, Ann J. Stocker e Francisco J. S. Lara,
da USP-SP e pela Dra Maria Aparecida Fernandez – UEM. Após a seleção das colônias
recombinantes, estas foram inoculadas em meio LB com ampicilina e a cultura foi
incubada sob agitação a 37ºC durante a noite. As bactérias foram coletadas por
centrifugação e o DNA recombinante foi obtido pelo método de preparação de DNA
IV Mostra Interna de Trabalhos de Iniciação Científica do Cesumar
ISBN 978-85-61091-01-9
CESUMAR – Centro Universitário de Maringá
Maringá – Paraná - Brasil
plasmidial utilizando o reagente CTAB (DEL SAL et al., 1989).

2.2 SUBCLONAGEM DO FRAGMENTO DE 1254 PB

O clone pHH 4.0 foi submetido à clivagem com a enzima de restrição DraI para
gerar o fragmento de 1254 pb. Este fragmento compreende os clones de 400 e 800 pb.
Após a clivagem e confirmação em eletroforese de gel de agarose a 0,7%, o DNA
recombinante foi purificado pelo método de fenol e clorofórmio. O inserto de 1254 pb (DraI
+ DraI) foi eluído de um gel de agarose a 0,8% e clonado em um plasmídeo pT7T3
previamente clivado com a enzima de restrição SmaI.
A reação de ligação foi utilizada para a transformação de bactérias por choque
térmico. Após a confirmação da clonagem, o DNA recombinante ficou pronto para as
etapas seguintes.

2.3 QUANTIFICAÇÃO DOS CLONES RECOMBINANTES

Alíquotas de 5 µl do DNA recombinante purificado foram diluídas em 1000µl de

água estéril e quantificadas em espectrofotômetro de luz U.V. A leitura foi realizada nos
comprimentos de onda de 260 e 280 nm. A concentração do DNA foi estimada utilizando
como padrão o valor de 50 µg/mL para 1 ABS.
Para a comparação dos resultados de quantificação obtidos por espectrofotometria,
uma alíquota do DNA purificado foi analisada por eletroforese em gel de agarose a 0,7% ,
utilizando o tampão de corrida TBE 1x (45mM Tris-borato; 1mM EDTA, pH 8.0). Após a
migração, os géis foram fotografados em sistema digital sob UV.

2.4 REAÇÃO DE SEQÜENCIAMENTO PELO MÉTODO DIDEOXI

Para a reação de seqüenciamento dos clones recombinantes, foi utilizada a

concentração de 500 ng de DNA. A reação consistiu dos seguintes componentes (DNA
recombinante, primers “reverse” e “universal” e o kit DYEnamic ET Dye Terminator Kit
(Amersham Bioscience). As reação de seqüenciamento foi processada em Termociclador
Eppendorf e posteriormente as amostras foram precipitadas com acetato de amônio e
etanol absoluto.
As análises e o alinhamento das seqüências serão feitos utilizando os seguintes
programas: PHRED (Versão: 0.020425.c, 1993-2002 por Phil Green e Brent Ewing;,
PHRAP e CROSS_MATCH (versão 0.990319, 1994-999 por Phil Green; CONSED
(versão 14.0, Gordon, 2004, com o propósito de fazer o múltiplo alinhamento de
seqüências de DNA).

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

O método de extração de DNA plasmidial por CTAB forneceu quantidades

suficientes de DNA, em nanogramas por µL, para a reação de seqüenciamento e
integridade das amostras. Os valores obtidos após quantificação por espectrofotometria
de luz U.V. estão apresentados na Tabela 1.
A subclonagem do fragmento de 1254 pb foi eficiente, sendo positiva para 5
colônias bacterianas transformadas. Após a seleção dos clones recombinantes, o DNA foi
extraído e a confirmação da clonagem foi realizada pela clivagem do DNA com as
enzimas de restrição EcoRI e HindIII, liberando o vetor plasmidial e produzindo dois
fragmentos de ~800 e 400 pb na análise eletroforética (Figura 1). Este resultado indica
que os insertos de 800 e 400 pb já subclonados, pertencem a este subfragmento.

IV Mostra Interna de Trabalhos de Iniciação Científica do Cesumar

ISBN 978-85-61091-01-9
CESUMAR – Centro Universitário de Maringá
Maringá – Paraná - Brasil
Tabela 1. Resultado da quantificação, por espectrofotometria de luz U.V. a 260 nm, das amostras
de DNA recombinante extraídas pelo método de CTAB. Todas as amostras apresentaram
quantidades suficientes de DNA para a reação de seqüenciamento.
Clones nanogramas/µL
pHN 2.0 210
1308 120
1254 170
1100 240
800 160
400 270

Kb
M 1 2 3 4
9
6
4
2,3
2,2

800 pb
0,5

400 pb

Figura 1. Análise eletroforética em gel de agarose a 0,7% da reação de clivagem dos clones
selecionados como recombinantes, após a transformação bacteriana. As raias 1, 2 e 4
correspondem ao padrão de clivagem que confirma a subclonagem. A raia 3 representa uma
amostra negativa para a subclonagem. M: marcador de tamanho molecular λ HindIII.

4 CONCLUSÃO

O sucesso no seqüenciamento de fragmentos de DNA requer que o DNA a ser

seqüenciado seja cuidadosamente processado, durante as etapas de subclonagem,
extração de DNA e quantificação do DNA extraído. As etapas seguintes consistem na
leitura e alinhamento das seqüências geradas. Nesse trabalho, a clonagem do fragmento
de 1254 pb consistiu em uma etapa crucial para se conseguir “contigs” da região já
seqüenciada, permitindo a obtenção completa da seqüência de ~ 4.000 pb pertencente à
unidade de transcrição do gene C3-22 de R. americana e região a 3’.

REFERÊNCIAS

BARNES, W. M. Sequencing DNA with dideoxyribonucleotides as chain terminators: hints

and strategies for big projects. Methods in Enzymology, v. 152, p. 538-556, 1987.

BROWN, T. A. Clonagem gênica e análise de DNA: Uma introdução. 4ª ed. Porto

Alegre: Artmed, p. 376, 2003.

IV Mostra Interna de Trabalhos de Iniciação Científica do Cesumar

ISBN 978-85-61091-01-9
CESUMAR – Centro Universitário de Maringá
Maringá – Paraná - Brasil
DEL SAL, G.; MANFIOLETTI, G.; SCHNEIDER, C. The CTAB-DNA precipitation method: a
common mini-scale preparation of template DNA from phagemids, phages or plasmids
suitable for sequencing. Biotechniques, v. 7, p. 514-520, 1989.

EELTINK, S.; SVEC, F. Recent advances in the control of morphology and surface
chemistry of porous polymer-based monolithic stationary phases and their application in
CEC. Electrophoresis, v. 28, n. 1-2, p.137-147, 2007.

FRANÇA, L.T.; CARRILHO, E.; KIST, T. B. A review of DNA sequencing techniques.

Quarterly Reviews of Biophysics, v. 35, n. 2, p. 169-200, 2002.

KARGER, A. E.; HARRIS, J. M. GESTELAN, R. F. Multiwavelength fluorescence detection

for DNA sequencing using capillary electrophoresis. Nucleic Acids Research, v. 19, n. 18,
p. 4955-4962, 1991.

KIMURA, E. T.; BAÍA, G. S. Rede ONSA e o Projeto Genoma Humano do Câncer:

Contribuição ao Genoma Humano. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia e
Metabolismo, v. 46, n. 4, p. 325-329, 2002.

MARTIN, W. J. New technologies for large-genome sequencing. Genome, v. 1, n. 2,

p.1073-80, 1989.

MULLIS, K. B.; FALOONA F.; SCHARF, S.; SAIKI R. K.; HOM, G. T.; ERLICH H. A.
Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the
polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology,
v. 51, Pt. 1, p. 263–273, 1986.

NICKERSON, D. A.; TOBE, V. O.; TAYLOR, S. L. PolyPhred: automating the detection and
genotyping of single nucleotide substitutions using fluorescence-based resequencing.
Nucleic Acids Research, v. 25, n. 14, p. 2745-2751, 1997.

IV Mostra Interna de Trabalhos de Iniciação Científica do Cesumar

ISBN 978-85-61091-01-9
CESUMAR – Centro Universitário de Maringá
Maringá – Paraná - Brasil