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Contribución de los modelos animáles a la

compresión de la histiopatogénesis de la malaria


Crístóbal Gallardo Alba

Trabajo de métodos y técnicas experimentales en biología animal

Introducción Otras células huesped tales como leucocitos, y


las plaquetas también se encuentran en las lesiones del
cerebro y parecen estar implicados en la patogénesis de
La malaria es la enfermedad tropical más
la enfermedad.
importante en humanos, siendo la causa de una enorme El estado de diferenciación y desarrollo de los
debilitación y mortalidad en las áreas donde es esporocitos (la forma infectiva) se genera en el
endémica. Globalmente, en número de casos que se mosquito vector y la transferencia de los esporocitos al
recogen en los aproximadamente los 90 paises donde es interior del huésped humano ocurre durante la succión
común se estima en 250-500 millones , con un mayor de la sangre. Los esporocitos migran al hígado y dentro
impacto en el África subsahariana, donde provoca la de las células parenquimáticas inician la fáse hepática
muerte de 1'5 - 2 millones de niños cada año. de la enfermedad. Dentro de los hepatocitos, los
La enfermedad esta causada por un parásito parasitos se desarrollan al estado de esquizontes
prozotoo del género Plasmodium, transmitido através de maduros, cada uno de los cuales contiene
la mordedura de el mosquito hembra Anopheles. aproximadamente 40.000 merozoitos. Cada merozoito
Cuatro especies de Plasmodium son causantes es capaz de invadir un glóbulo rojo para iniciar la fase
de enfermedades en humanos, P. vivax, P. ovale, eritrocítica de la infección. Esta es la fase cíclica en
P.malarie y P.falciparum, siendo éste último el más que los merozoitos desarrollan dentro de los globulos
virulento y el que causa una mayor mortalidad, rojos inicialmente como formas de anillo, progresando a
provocando la llamada malaria cerebral, caracterizada trofozoitos y eventualmente a esquizoitos maduros, los
por el secuestro de globulos rojos parasitados, sobretodo cuales liberarán una nueva generación de merozoitos
en las profundidades de los lechos vasculares cerebrales, que continuarán la invasión de los eritrocitos.
y por niveles elevados de citoquinas proinflamatorias.

Imagen 1: Ciclo vital de Plasmodium

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Para P. falciparum la duración de cada ciclo humano, los diferentes modelos permiten representar
eritrocítico es aproximadamente 48h. La ruptura de los fielmente ciertos aspectos de la malaria cerebral
eritrocitos provocada por los esquizontes esta humana.
acompañada por la liberación de toxinas dentro de la
circulación y la activación de respuestas inmunes, lo
que provoca los signos y síntomas de la enfermedad. Monos como modelos de estudio
Tras una serie de ciclos eritrocíticos, y
presumiblemente cuando el ambiente del hospedador se Las infecciones de malaria en los hospedores
vuelve hostil para el parásito, los merozoitos se primates naturales son usualmente leves y sin
diferencian en gametocitos preparados para ser implicaciones cerebrales. Por ejemplo, P.knowlesi y
absorbidos por la picadura de los mosquitos y completar P.coatneyi llegan a producir infecciones moderadas en
así su ciclo de vida. macacos (Macaca facicularis) pero, las infecciones de
P.knowlesi, P.coatneyi o P.fragile son severas en los
macacos rhesus (M.mulatta), el huesped experimental.
Malaria cerebral P. knowlesi en los macacos rhesus induce un síndrome
cerebral, pero es atribuido a la liberación de quininas y
La malaria cerebral es definida como un coma otras aminas vasoactivas que provoca la ruptura de
irreversible no atribuible a otras causas en pacientes con la barrera hematoencefálica y el subsecuente edema
P. falciparum. En los niños africanos, el coma suele cerebral. Este escenario no es comun en la malaria
estar acompañado de fiebre, convulsiones, acidosis cerebral humana, aunque puede ocurrir durante los
metabólica e hipoglucemia. Una proporción significante estadios terminales. Sin embargo, P. coatneyi en los
de los supervivientes presentan permanentes macacos rhesus exhibe algunas de las características
complicaciones neurológicas incluyendo desordenes comunmente asociadas con la patologia en humanos.
cognitivos y del habla, anormalidades motoras y Algunos otros modelos monos-parásitos han sido ya
ceguera cortical. desarrollados .

La regulación al alza de las moleculas de


adhesión (CD36, trombospodin y ICAM-1) es una de
Modelos experimentales para la malaria las características comunes a todos los modelos. La
implicación multiorganica ha sido también demostrada
Los modelos de la malaria cerebral han sido en el modelo de P. coatneyi-mono rhesus.
desarrollados en monos, ratas y ratones y, aunque
ninguno de ellos mimetiza exactamente el síndrome

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Contribución de los modelos animáles a la compresión de la histiopatogénesis de la malaria

Tabla 1: Modelos experimentales de la malaria cerbral en monos y sus característics

Tabla 1: Modelos experimentales de la malaria cerbral en monos y sus característics

El estudio más reciente de P.coatneyi en los El desarrollo de la forma hepática de parásito


monos rhesus mustra una clara asociación entre el ha sido demostrada 6 y 7 dias despues de la inyección
desarrollo de malaria severa en animales, altos niveles directa de esporozoitos dentro del hígado, así como
de citoquinas proinflamatorias (IL-1B, TNF y IFN- despues de la inoculación intravenosa de 10 6
gamma) y la inducción de iNOS en el cerebro y el esporozoitos de P.falciparum. Además,la transmisión de
cerebelo. Sin embargo, solo uno de los animales la malaria de mono a mono a sido conseguida con éxito
realmente se volvió comatoso. Estos recientes através de mosquitos infectados con esporozoitos.
desarrollos en los modelos en monos muestran fuertes Muchas especies de mosquito y de diferentes
similaridades con la malaria cerebral humana, sin parásitos aislados son capaces de transmitir la infección
embargo , la naturaleza impredecible de la malaria a Aotus, sin embargo, la infección de Aotus lemurinus
cerebral en monos es un problema para el desarrollo de griseimembra con la cepa de P. falciparum adaptada
estudios cinéticos, que son cruciales para entender los Santa Lucia a mostrado ser muy reproducible. Este
eventos moleculares que llevan a la patología cerebral. parásito no se desarrolla bien en cultivos pero es capaz
de producir gran cantidad de gametocitos maduros e
infectivos en la sangre periferia en Aotus. En contraste,
Género Aotus como modelo de estudio P.falciparum NF54, que produce fácilmente gametocitos
in vitro ,no ha podido ser adaptada a los monos.
El género Aotus esta compuesto por nueve También se ha conseguido exitosamente
especies de monos ámpliamente distribuidas por desarrollar el estado hepático de P.falciparum en
Améria central y Sudamerica. Aunque no se han cultivos primarios de hepatocitos de monos Aotus y
encontrado en la naturaleza ningun individuo infectado Saimiri. Aunque A.l.griseimembra, A. vociferans y
con parasitos que provocan la malaria en humanos, son A.lemurinus lemurinus son susceptibles de la infección
áltamente susceptibles a infecciones experimentales. con esporocitos, algunas de esas especies requieren
Desde las primeras infecciones con P.vivax y esplectomias para desarrollar infección sanguinea
P.falciparum que fueron realizadas en 1960, diferentes despues de la inoculación con esporozoitos.
especies de Aotus han sido usadas para el screening de
fármacos antimaláricos, para el desarrollo de vacunas y Estos modelos han permitido demostrar que
más recientmente como modelos para la fisiopatología las respuestas citolíticas mediadas por linfocitos CD8+
de la malaria. son críticas para la protección contra el desarrollo de
No todos los Plasmodum crecerán en los formas hepáticas de la malaria. Dado que el bazo es
monos Aotus: sin embargo, una vez que el parásito uno de los organos donde los linfocitos se acumulan, los
aislado ha sido adaptado a una especie puede ser animales con bazos intactos permitirian una evaluación
facilmente transmitida a las demás. La esplectenomía mas fiables de las respuestas inducidas por vacunación.
(extracción del bazo) es esencial para la adaptación y el
manteniminto de infecciones a largo plazo así como Muchas especies de Aotus son también
para la producción de un gran número de gametocitos susceptibles a infección con P.vivax El tránsito cíclico
infectivos. de P. vivax de mono a mono, humano a mono y
Las esquizogonias hepáticas pueden ser viceversa ha sido logrado por inoculación de
fácilmente obtenidas con P.falciparum sin necesidad de esporozoitos obtenidos por disección de mosquitos o
adaptación previa de los monos, sin embargo, el por infección por una picadura. Después de la
desarrollo de la parasitémia desarrollada tras el estado inoculación de los esporozoitos, la infección se produce
esporocito ,ya sea via inyección intravenosa o por en periodos que oscilan entre 11 y 55 dias dependiendo
picadura de mosquito ,son inferiores a las alcanzadas de la especie de mono. Es bien conocido qu la invasión
después de la inoculación intravenosa del estado de los eritrocitos humanos requiere la interacción de
sanguíneo de la infección , y no todos los animales muchos ligandos de los parásitos con multiples
inoculados con esporozoitos se tornan infectados. receptores del huesped.

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El hecho de que P. falciparum y P. vivax Limitaciones en el uso de primates no humanos en


pueden invadir a células de primates no humanos lleva a investigaciones biomédicas
la asución que la la estructura de las moléculas
implicadas puede ser la misma o estar estrechamente El desarrollo de vacunas esta obstaculizado por
relacionada a la de los humanos, lo que otorga una el descenso de la disponibilidad de primates para
mayor bondand a estos. Es sabido que ,mientras investigaciones biomédicas. Varias razones contribuyen
P.falciparum usa muchos receptores para invadir a los a ello. En primer lugar, los primates estan sujetos a una
globulos rojos, la invasión del merozoito de P.vivax gran presión en sus habitats naturales debido al
depende completamente de la presencia del receptor progreso de las comunidades humanas. En segundo
Duffy y su interacción por la proteina de unión a Duffy lugar, serias restricciones para la exportación de
del parásito. La diversidad genética del parásito y del animales han sido introducidas en algunos países. En
huesped puede explicar porque todos los parásitos tercer lugar, hay una falta de instalaciones adecuadas y
humanos no pueden ser facilmente adaptados a los de entrenamiento científico en los paises tropicales de
monos Aotus. donde los monos son originarios, para llevar a cabo las
P.falciparum tiene un ciclo de 48 h. en los invstigacions bajo las normas de Buenas Practicas de
individuos del género Aotus,semejante a lo que se da en Laboratorio (GLP) necesarias para el desarrollo de
humanos, pero existen marcadas diferencias tanto en el fármacos. Por último, muchos países ,principalmente en
desarrollo de la parasitémia como en el desarrollo de los Europa, han incrementado la regulación para la
gamtocitos infectivos, dependiendo de la cepa de importación y el uso de primates para investigaciones
parásito y de la especie de Aotus. La infección con biomédicas y las organizaciones proteccionistas ejercen
ciertas cepas de parásitos puede ser asincrónica y todos fuerte presión contra ello.
los etapas sanguíneas del parásito puede ser vistas en la Con todo ello, la mayoría de los modelos
sangre periférica. disponibles de pequeños primates, particularmente
Muchas cepas de P.falciparum como Vietnam Aotus, representan los sistemas disponibles para probar
Oak Knoll, Santa Lucia, Uganda Palo Alto, Indochina vaculas contra la malaria, componentes antimaláricos y
1/CDC, Malayan IV, Camp, Cambodian I, FCH/4, para entrender las interacciones parásito hospepador y
Montagnard S-1, West Africa I, Haitian I/II o Panama II consecuentemente para proporcionar una visión acerca
han sido adaptadas en los monos Aotus. En individuos de los mecanismos involucrados en la fisiopatogénesis.
A.l. grisemembra , la cepa P. falciparum Vietnam Oak
Knoll desarrolla un patron de infección muy
reproducible, con un rápido incremento de la Malaria cerebral murina
parasitémia hasta niveles letales (10%), apartir del sexto
dia de infección, las cepas P.falciparum Palo Alto La disponibilidad de diferentes cepas de
producen periodo de parasitémia prolongado y ligero. ratones, incluyendo varios cepas knockout, ha permitido
La susceptibilidad de las diferentes subespecies de profundizar en los mecanismos moleculares implicados
Aotus a morir despues de la infección también es en la patología cerebral. La mayor contribución a la
variable. Así, en A.l. Griseimembra el riesgo de morir investigación de la quimioterápia de la malaria fué dada
de parasitémia es aproximadamente del 5%, mientras en 1948 por el parasitólogo belga Ignace Vincke, y fué
que en otras especies puede exceder el 90%. el descubrimiento de un parásito en las ratas de
El ciclo de P.vivax en Aotus tiene variaciones matorran de la región de Katanga del entonces Congo
en cuanto al tiempo de desarrollo, los niveles de Belga. Éste parásito, Plasmodium berghei, que puede
parasitémia y la infectividad de los gametocitos, lo cual ser infectivo para ratones de laboratorio, ratas y hamster,
depende de la cepa, de la especie de mono y de si al ha sido ampliamente explotado en los ultimos 50 años,
animal se le ha extirpado el bazo. Las infecciones no solo para investigación quimioterápica, sino también
inducidas por inoculación de 105 eritrocitos parasitados para inmunología. Este parasito, sin embargo, difiere de
de la cepa P.vivax Salvador I, y/o P.vivax VCC4 han P. vivax y P.ovale en qu no posee un estado hipnozoito
mostrado un prepatente periodo a los 12 dias en la en el higado, con lo que para el estudio de la actividad
mayoría de los animales, un periodo similar al hipzoitocidal , el único model válido es P. cynomolgi en
observado en infecciones en humanos. Otras cepas de los monos rhesus (Macaca mulatta). Así, las malarias en
P.vivax han sido exitosamente adaptadas en Aotus: roedores han sido aprovechadas principalmente para el
Chesson, Brazil I, AMRU-1, Indonesia XIX, Indonesia I estudio de los esquizoitos sanguineos. Posteriormente se
Mauritania I/II Vietnam Palo Alto, Thai III, etc. descubrieron otras especies infectivas de roedores,
El desarrollo de maduros e infectivos como P. yoelii.
gametocitos de P.falciparum y P. vivax los monos Aotus
permite su uso para iniciar el ciclo de esporogonias en Los experimentos de malaria cerebral se
mosquitos alimentados experimentalmente. La desarrollaron por primera vez en roedores en 1960, con
transmisión de P.vivax y P.falciparum ha sido la demostración de una asociación entre las células T y
conseguida con muchas especies de mosquito: la neuropatología. La timectonia neonatal previene de la
Anopheles albimanus, An. Freeborni, An. Maculatus y malaria cerebral en hamster mientras que el tratamiento
An. Stepensi. El desarrollo de gametocitos maduros e con anticuerpos anti-timocitos previene de la
infectivos de P.falciparum y P.vivax en los monos enfermedad tanto en hamster como en ratas.
Aotus permite también el ensayo de la
inmunogenididad y la eficacia de vacunas.

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Los estudios murinos siguieron en 1980, y Aunque no es necesario el uso especifico de


establecieron firmemente dos caracteristimas muy animales SPF, es esencial que los ratones deban
importantes de la malaria cerebral. Primero, mostraron proceder de colonias de cría bien controladas en las que
una asociación entre los signos clínicos (ataxia, no exista contaminación por orgnismos como
convulsiones y coma) y el secuestro de leucocitos Eperythrozoom coccides, Haemobartonella muris u
dentro de la microvasculatura del cerebro. En segundo otros patógenos víricos o bacterianos comunes de
lugar, y en acuerdo con los tempranos estudios con ratones. E.coccides, que es transmitido por ectoparásitos
hamsters y ratas, establecieron el rol de las células T en del raton, es un patógeno particularmente indeseable ,
la neuropatología. Los ratones BALB/C nu/nu ya que puede estar presente en las colonias de ratones
deficientes en celulas T eran resistentes a las malaria sin ser detectado y solo sale a la luz cuando los animales
celebral, mientras que 10-70% de las camadas normales son infectados con malaria. Los organismos son
nu/+ eran altamente susceptibles. En ambos estudios, el frecuentemente confundidos por el investigador cuando
taponamiento vascular y la presencia de micro- emplea la tinción de Romanowsky.
hemorragias en lesiones cerebrales de animales con Si la sangre infectada de malaria procedente de
malaria cerebral fueron descritos. un raton contaminado con E.coccoides es usado para
infectar un nuevo animal o es criopreservado, los
contaminantes seran llevados con el plasmodio y se
Mantenimiento y tratamiento de los animales extenderán a los nuevos huespedes. El efecto más obvio
que provocan en el huesped es la hemolisis de los
La infección de malaria en los ratones resulta eritrocitos a los que se adjuntan. También actúan como
en una rápida caída de su temperatura corporal, lo cual un estimulante del sistema inmune. Dado que el curso
debe ser contrarrestado por el mantenimiento de una de la infección de la malaria intraeritrocitaria está
suficientemente alta temperatura ambiental y humedad, influenciada por las proporciones de normocitos y de los
preferiblemente entre 20 ± 2 ºC y humedad relativa de reticulocitosen la circulación, los animales
55% . La naturaleza de la dieta es muy importante dado contaminados con E.coccides o H. muris muestran una
que debe contener una cantidad adecuada de ácido p- gran diversidad en los niveles de parasitemia entre un
aminobenzoico para permitir el desarrollo de los raton y otro. Revisiones críticas de muchas
parásitos, pero no tan elevada como para antagonizar la publicacionse recientes en quimioterápia y inmunidad
acción de componenten tales como sulfonamidas o en malaria murina sugieren que muchos resultados
sulfonas. extraños son probablemente atribuibles al
desconocimiento de los autores acerca de la presencia
de estos contaminantes.

Tabla 1: Modelos experimentales de la malaria cerbral en monos y sus característics

Tabla 2: Especies de Plasmodium utilizadas como modelo para investigación en roedores

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Contribución de los modelos animáles a la compresión de la histiopatogénesis de la malaria

Modelos de malaria cerebral murina Así, la imperfecta aproximación clínica, las


diferencias en la infección de las especies de
El empleo de Plasmodium parásitos de Plasmodium y las diferencias entre los sistemas
roedores como modelo para el estudio de la malaria inmunes de ratones y humanos conllevan que la
humana ofrece muchas ventajas frente a modelos extrapolación de los resultados de los resultados
similares, como el hecho de que estos animales son obtenidos mediante estudios en malaria murina deba
baratos y fáciles de mantener, poseen un sistema inmune hacerse con cautela.
bien caracterizado, además del hecho de que una gran
cantidad de estudios no son eticamente admisibles de La enorme mejora de los estudios de la malaria
realizar en seres humanos, o factibles en primates no cerebral murina se han centrado en comparaciones
humanos. entre cepas de ratones resistentes (ejemplo BALB/c) y
Existen importantes diferencias entre los susceptibles (ejemplo CBA, C57BL) (tabla 3).
modelos de estudio de la malaria cerebral murina y la
humana, siendo la mas importante el hecho de que La susceptibilidad a la malaria cerebral es
P.falciparum , la especie que en humanos provoca la altamente dependiente del fondo genético del raton. Los
patología, no es infecciosa en ratones, con lo que en fenotipos susceptibles y resistentes se piensa que estan
éstos se emplean otras especies de Plasmodium, como determinados por diferencias en la sensibilidad del
P. berghei o P.yoelii. La diferencia clave entre esos endotelio microvastular al a la activación por TNF, el
parásitos y P.falciparum es que su infección en ratones cual regula al alza la presenciad de receptores de
produce primariamente la adherencia de leucocitos al membrana (p55 y p75) en las células del endotelio
endotelio vascular, mientras que P.falciparum en microvascular del cerebro en ratones suceptibles pero
humanos induce la adherencia de los globulos rojos no en los resistentes.
infectados.
Otras diferencias de estos modelos son los Interesantemente, los ratones (BALB/c x
signos clínicos y neurológicos que los parásitos C57BL/6)F1 constitiyen una cepa de gran interés debido
provocan en su huesped, lo cual ha sido parcialmente a que en los ratones infectados se desarrolla un
solventado mendiante el uso de combinaciones de secuestro generalizado de globulos rojos parasitados en
especies específicas de Plasmodium (PbA) y de cepas la microvasculatura cerebral, además de exhibir tanto
específicas de ratón. Sin embargo, el 100% de los fenotipos resistentes como susceptibles dependiendo de
ratones que contraen la malaria cerebral mueren, la edad, siendo evidente el efecto de TNF y ICAM-1 en
mientras que la tasa de mortalidad en humanos ronda el los cerebros de los ratones que desarrollan la malaria
40%; se han desarrollado modelos en los que los que cerebral . Aunque éste modelo parece ideal para el
ratones de la cepa DBA son inoculados con PbA, estudio de la inmunopatogénesis de la malaria cerebral,
desarrollando síntomas neurológicos como la parálisis el modelo PbA-C57BL/6 ha sido el modelo elegido en
transitoria de los miembros, pudiendo recuperarse de la la mayoría de los laboratorios.
enfermedad, sin embargo, esos ratones nunca
desarrollan coma, el síntoma distintivo de la malaria
cerebral humana.

Imagen 2: Ejemplos de los efectos patológicos de la infección por Plasmodium berghei ANKA en modelos de roedorse

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Los ratones DBA/2 desarrollan una versión ha sido recientemente observada en la ya nombrada
más suave de los síntomas neurológicos, pero mueren (BALB/c x C57BL/6) F1, que muestran una
despues de una severa anémia. El parásito más susceptibilidad relacionada con la edad a la malaria
empleado ha sido P.berghei (cepas ANKA [Pba] o K173 cerebral.
[Pbk]) debido a su habilidad para secuestrar globulos También es interesante anotar que algunas
rojos parasitados en el interior de la microcirculación. especies de Plasmodium que no secuestran globulos
Ratones susceptibles infectados con P.berghei rojos infectados tambien dan lugar a malaria cerebral en
desarrollan signos neurológicos y síntomas típicos de la algunas cepas, como por ejemplo, la cepa letal P.yoelii
malaria cerebral humana (como el estado de coma), y 17XL induce la enfermedad en ratones Swiss y BALB/c.
mueren despues de 8-10 dias después de la infección. El En el caso de la malaria cerebral inducida en ratones
analisis histiopatológico revela taponamiento vascular, BALB/c por P.yoelii 17XL esta caracterizada por
hemorragias petequiales y secuestro de leucocitos con convulsiones, ataxia y coma, y acompañada por una alta
un secuestro relativamente bajo de globulos rojos parasitemia. Sin embargo, la obstrucción microvascular
infectados. Cepas no susceptibles de ratones a la que se parece ocurrir en ausencia de inflamación en el cerebro,
les suministra la misma dosis de infección no siendo útil en el estudio del fenómeno de
desarrollan los la malaria cerebral pero mueren despues citoadherencia.
de 21 dias debido a una severa anemia y Así, existen muchas similitudes entre la
hiperparasitemia. malaria cerebral humana y la murina con especial
La anemia cerebral inducida por P.berguei esta atención a las lesiones patológicas (secuestración,
limitada a cepas de raton (CBA, C57BL/6) que se saben hemorragias e infarto, y síntomas clínicos), ataxia y
que estan genéticamente predeterminadas a generar una coma. Sin embargo, en la malaria murina el secuestro
intensa respuesta proinflamatoria, confirmando la de los globulos rojos infectados tiende a ocurrir en
asociación en humanos entre las citoquinas ausencia de las protusiones en la superficie, que son
proinflamatorias y la malaria cerebral. Otras especies de evidentes en los globulos rojos infectados humanos.
Plasmodium empleadas para los modelos de malaria
murina son P.chabaudi (subespecies chabaudi y adami),
P.vinckei y P.yoelii (tabla 2). Knockout de genes en la investación de la malaria

P. chabaudi chabaudi es un parásito La primera investigación de knockout de genes


particularmente apropiado para los estudios de la en la malaria cerebral murina mostro que ratones
respuesta inmune del estado sanguineo de la malaria, defectuosos en TNF/LTA (linfotoxina A, un miembro
dado que presenta algunas características muy similares relacionado de la familia TNF, que existe como un
a P. falciparum: la etapa sanguinea infecta a normocitos, homodímero soluble y como un heterodímero LTA/LTB
muestra sincronía de su ciclo vital in vivo, provoca la asociado a la membrana, y permite la unión de los
retirada periférica de los glóbulos rojos infectados mas receptores TNF) infectados con P. berghei eran
maduros, trofozoitos tardios y esquizoitos, y las en las completamente resistentes a la patología letal. Debido a
cepas de ratones resistentes que se recuperan de una la estrategia del doble knockout, la resistencia no podia
parasitemia aguda aparecen uno o mas reapariciones de ser atribuida especificamente a uno de los dos genes
la enfermedad por parásitos con una antigenicidad ausentes.
diferente al fenotipo de la infección inicial. Poco después el rol de los receptores TNF en la
Existen otras limitaciones que hacen que los malaria cerebral de raton fué estudiado, y una
modelos en roedores sean muy útiles frente a los significante regulación al alza del receptor TNF-2
modelos en humanos, siendo una de las razones obvias (TNFR2), pero no de TNFR1, fue encontrado en ratones
la enorme posibilidad de estudiar la enfermedad en susceptibles. Los mismos estudios examinaron el
distintas estadios de desarrollo. desarrollo de la malaria cerebral en ratores deficientes
Sin embargo,como ya hemos apuntado, esos en TNFR2 y TNFR1, usando la misma cepa de ratoes y
modelos no reproducen de forma precisa la mayoría de parásitos que en los estudios con TNF/LTA, y
las características histiopatológicas de la malaria demostraron que los ratones que carecian de TNFR2,
cerebral en humanos, como en secuestro de dentro del pero no TNFR1, estaban protegidos contra la malaria
cerebro de globulos rojos infectados. Esta característica cerebral.

Tabla 1: Modelos experimentales de la malaria cerbral en monos y sus característics

Tabla 3: Modelos experimentales de la malaria cerebral murina y las características de varias combinaciones raton-parásito

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Curiosamente, la TNF de membrana, pero lo la Los ratones fueron infectados por inyección de
soluble, y su intracción con TNRF2 era crucial para la 106 eritrocitos parasitados con P.bergei anka, existiendo
regulación al alza mediada por TNF , de las moleculas al menos 8 animales en cada grupo experimental, y los
de adhesión en las células del endotelio microvascular. experimentos fueron repetidos dos veces con resultados
Un estudio relevante en ratones deficientes en TNF o similares.
LTA mostró que LTA, y no TNF, era el principal
mediador en la malaria cerebral en ratones. Este
descubrimiento llamó la atención de los investigadores
y llevó sugerir un rol crítico para LTA en el control de
la malaria letal en los humanos.
Un estudio reciente de ratones deficientes en
TNF infectados con P.chabaudi apoya el papel de TNF
en el control de la parasitemia. Los ratones deficientes
mostraton los mayores niveles de parasitemia, indicando
que la producción de TNF puede controlar la
proliferación de el parasito en el torrente sanguineo, En este estudio se demostró que las dos lineas
como habia sido sugerido previamente in analisis distintas de ratonse Tg-CuZnSOD eran más vulnerables
genéticos en humanos. a la infección por Plasmodium que los individuos
Apesar de todo, teniendo en cuenta la control . Aunque la tasa de mortalidad de Tg-CuZnSOD
naturaleza de los parasitos de humanos y de ratones, la era significativamente mayor que en los ratones control,
comparación de la asociación de TNF con el control de los niveles de parasatemia observados eran similares, y
la parasitemia debe ser analizado en mas profundidad. de acuerdo con esto, el desarrollo de Plasmodium en
ratones transgénicos parasitados era inhibido por el
Así, los estudios de knockout de genes en extress oxidativo en la misma medida qu los ratonres
ratons puede ser usado en analisis comparativos con los control infectados, lo cual indica que la mayor
datos en humanos, y sugiren nuevas estrategias para vulnerabilidad de los ratones trasngénicos a la infección
entender los tratamientos de la malaria, permitiendo no era debida a un desarrollo acelerado de la invasión
confirmar o sugerir el rol de mediadores potenciales de parasitaria, sino a un incremento de la sensibilidad del
la malaria cuando los resultados son adecuadamente husped a la infección, debido a diversos factores, dado
interpretados y apoyados con estudios adicionales en que los elevados niveles de SOD pueden afectar a la
humanos y ratones. Los estudios de knockout ofrecen homeostasis del cobre y del zinc, que pueden resultar en
también la oportunidad de medir severas defectos en la alteración de varios enzimas que utilizan esos metales
parámetros y niveles de expresión de proteinas que no como cofactores.
pueden ser medidos en humanos.
Otro ejemplo del empleo de animales
transgénicos para el estudio de la malaria lo
Ratones transgénicos en el estudio de la malaria encontramos en un nuevo modelo de diseñado por el
National Institute for Medical Research de Londres,
basado en la modificación genética del parásito de
La generación de animales transgénicos es otra rodedores Plasmodium berguei para MSP119 (el
de los métodos empleados para el estudio de los fragmento de 19kDa de la proteína 1 expresada en la
mecanismos moleculares implicados en el desarrollo de superficie de los merozoitos de P.falciparum) . Este
la malaria; un ejemplo es el empleo de ratones parásito transgénico fué inyectado dentro de un raton
trasgénicos con elevados niveles del enzima cobre/zinc también habia sido modificado geneticamente para
superoxido dismutasa (CuZnSOD), la cual cataliza la expresar receptores de anticuerpos humanos FcγRI .
conversión del ión superóxido a peróxido de hidrógeno, Los investigadores también crearon un
como un modelo para analizar el efecto de las especies anticuerpo humano específico para P.falciparum,
reactivas de oxigeno en el desarrollo de la enfermedad. generados a partir de sangre de adultos de Gambia con
Así, a partir de cepas TgHS 69 y TgHS se inmunidad natural para la malaria. Cuando los
generaron ratones trasngénicos para el gen humano investigadores injectaron los anticuerpos en el raton
CunSOD, por microinyección de huevos en pronucleos transgenicos, éstos se unian específicamente a la
masculinos de embriones tempranos de un fragmento proteina de P. falciparum del parásito del roedor, así
lineal de DNA de 14,5 kb que contenía el gen completo como a los receptores de antucuperpos humanos de las
de la cobre/zing superoxido dismutasa, incluyendo las células del raton, pudiendose comprobar que los ratones
secuencias reguladoras. Para el experimento se transgénicos eran capaces de destruir y eliminar al
emplearon tanto machos como hembras, los cuales se parásito, mientras que en el grupo control los parásitos
mantuvieron en condiciones libres de patógenos. Todos crecian sin impedimentos.
los experimentos fueron llevados a cabo Los resultados obtenidos permitieron poner de
simultaneamente con Tg-CuZnSOD y con ratones con manifiesto la importancia de la eliminación mediada por
edades emparejadas a los individuos control. Ambas FcγRI de los parásitos opsonizados por IgG1 específica
cepas estudiadas, TgHS 69 y TgHS 70, contenian de 2 a para MSP119 .
4 copias del gen humano CuZnSOD en su genoma y
expresaban el transgen como una enzima activa.

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Contribución de los modelos animáles a la compresión de la histiopatogénesis de la malaria

Estudios similares han permitido estudiar la Además también se vió que los niveles de la
potencial importancia de antigenos como AMA-1 respuesta de CD8+ CTL y IFN-γ inducida por la
(apical membrane antigen-1), EBA-175 (erythrocyte- inmunización por DNA era significativamente superior
binding antigen 175), y PfEMP1 (Plasmodium a los niveles inducidos por inmunización proactiva con
falciparum erythrocyte membrane protein 1). esporozoitos irradiados. También se provó que la
inmunización de los ratones con un plasmido de DNA
que codificaba para otro antígeno, PyHEP17, podía
Vacunas de DNA en modelos animales tambien proteger contra el estado esporozoito; además
la inmunización con una mezcla de plásmidos de DNA
Las vacunas de ADN consisten en un plásmido podía eludir la restricción genética de la protección
bacteriano diseñado para expresar un gen (o genes) de observada tras la inmunización con cada vacuna. Todos
interés que codifiquen, por ejemplo, para una proteína estos datos proporcionaron un soporte experimental
inmunogénica de un patógeno determinado, contra la para el desarrollo de una vacuna multivalente contra la
cual se desea inducir una respuesta inmune protectora malaria, y la base para el enfoque basado en el DNA
en el individuo vacunado. Las secuencias de interés se para el desarrollo de una vacuna antimalárica.
insertan en el vector plasmídico que vehiculizará la Posteriormente, se estableció la
introducción de la información genética de interés al inmunogenicidad para cuatro vacunas diferentes de
interior de las células del hospedador, de manera que se DNA para cuatro estadios pre-eritrocíticos de distintas
logre su expresión, procesamiento y presentación al especies de Plasmodium en ratones y en monos rhesus ,
sistema inmune, en lo que sería una imitación de lo que solas y en combinación, observando que no existia un
ocurre durante la infección con el patógeno completo. efecto importante de la mezcla de vacunas, ni en la
Los componentes básicos de un vector que inducción de las respuestas de CTL, ni en la
garantizan la óptima expresión en células eucarióticas, producción de anticuerpos. Estos datos proporcionaron
pero no la multiplicación del plásmido en el hospedero las bases para la transición de una serie de ensayos
son: origen de replicación procariótico para la clínicos en humanos.
amplificación y propagación del plásmido en bacteria; Las diferncias interespecificas en el uso de los
gen de resistencia a antibióticos (generalmente codones son el principal obstaculo para el desarrollo de
kanamicina o ampicillina), como marcador de selección vacunas de DNA, lo que requiere modificación de la
de las células bacterianas que portan el plásmido; secuencia de DNA de la vacuna de para que la
promotor eucariótico fuerte que garantice altos niveles información sea traducida de forma correcta en los
de transcripción del gen de interés en la célula eucariota mamíferos (optimización de codones).
(se han empleado exitosamente promotores virales
como el promotor inmediatamente temprano del
citomegalovirus humano); sitio de múltiple clonaje Ventajas y limitaciones de los modelos en roedores
inmediatamente después del promotor para insertar la
secuencia de interés; secuencia de terminación de la La principal ventaja de la malaria en roedores
transcripción y secuencia estabilizadora del ARN esta relacionada con los paralelismos de sus ciclos de
mensajero transcrito, dada por una cola de poliadenina vida con los de las especies de Plasmodium que afectan
derivada del virus simio 40 o del gen que codifica para a humanos, así como consideraciones prácticas como el
la hormona de crecimiento bovina. coste y la facil manipulación. Así, los ciclos de ciclos
La inmunización puede llevarse a cabo de vida de todas las especies que afectan a roedores es
utilizando la inyección con aguja (parenteral) o por esencialmente el mismo, tanto en la duración como en
métodos biolísticos con pistola de genes. Este último las diferentes etapas, con P. falciparum y P.malarie,
método garantiza una mayor eficiencia, puesto que el pero difiere de P.vivax y P.ovale en la ausencia de un
ADN penetra al interior celular, a diferencia de la estado hipnozoito. La identificación de nuevos
inyección donde queda en el medio intersticial y por antimaláricos efectivos contra P.falciparum resistente a
tanto expuesto a la acción de nucleasas. Debido a ello se farmacos múltiples es uno de los objetivos principales, y
requieren dosis hasta 100 veces menores cuando se la disponibilidad de diferentes cepas fármaco-resistentes
inmuniza con pistola de genes . Además se ha empleado derivadas de P.berguei , P. yoelii y P.chabaudi es una
la microencapsulación del ADN, lo cual estimula la marcada ventaja de estos modelos. Además , la facilidad
respuesta inmune tanto celular como humoral o dificultad para desarrollar líneas resistentes a nuevos
compuestos se ha demostrado como una valioso
En 1994 se publicó el primer trabajo instrumento para el pronóstico de la potencialidad de
demostrando que la inmunización en ratones con DNA desarrollar resistencia a los fármacos en los parásitos
plasmidico podía proteger contra un patógeno parásito que afectan a la especie humana.
complejo. En dicha investigación los investigadores
inmunizaron un razon con un plasmido de DNA que La facilidad para mantener y manejar los
codificaba un antigeno de Plasmodium yoelii ratones es otra clara ventaja respecto a otros huéspedes
perteneciente a una etapa pre-eritrocítica, PyCSP, lo vertebrados. Los parásitos malaricos de aves, los cuales
cual inducía a los linfocitos T citotóxicos CD8+ tienen un ciclo de vida diferente, han sido ya
antígeno-específicos (CTL) y la respuesta de abandonados debido a estas y otras razones.
anticuerpos, conferiendo protección contra los
esporozoitos.

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Contribución de los modelos animáles a la compresión de la histiopatogénesis de la malaria

Los modelos en roedores tienen severas del gen dihidrofolato reductasa timidilato sintasa
desventajas también, particularmente relacionadas con (DHFR/TSR ) procedente de P. berghei o Toxoplasma
el metabolismo de los fármacos. gondii con mutaciones puntuales ques confiere
Un ejemplo clásico es el proguanil, que es resistencia al antimalárico pirimetamina (pyr). El gen
rápidamente ciclado en el higado a una triazina activa, DHFR/TSR de T.gondii es preferido generalmente por
el cicloguanil. A diferencia de lo que ocurre en reducir la posibilidad de recombinación no deseada con
humanos, la vida media del suero del cicloguanil en el el gen DHFR/TS endógeno, y porque confiere
raton es mucho mayor que la del proguanil, mientras resistencia a mayores niveles de resistencia a pyr.
que en humanos en cicloguanil es rápidamente La expresión del gen marcador seleccionable
excretado. Un segundo ejemplo que muestra la situación en asexual P.berghei puede ser controlado por el
contraria es la mefloquina, que tiene una prolongada 5'( delecciones de la región del promotor de 3.5 y 2.2 kb
vida media biológica en los humanos, mientras que en ) y en 3' ( delecciones progresivas de 1.0 y 0.55 kb en
los ratones la duración de su actividad es corta. 3') UTR del gen DHFR/TS de P.berghei y por una
Otra desventaja adicional es que la respuesta a región truncada (0.6 kb) del promotor de DHFR/TS de
fármacos de varias especies de roedores a ciertos tipos P. chabaudi. Además, una región promotora truncada
de antimaláricos puede ser diferente. Un ejemplo son de 0.5 kb de P.berghei del antigeno de superfície Pbs21
los queladores de hierro y los inhibidores de síntesis de del estado sexual al que le falta el control estado-
fosfolípidos. Todo ello puede requerir el empleo de más específico puede también ser incorporado dentro de
de una especie de Plasmodium que afecte a roedores a construcciones para la transfección de las etapas
la hora de realizar un screening. asexuales de P. berghei. Una larga región del promotor
(1.4 kb) sexo y estadio específica para Pbs21
( equivalente al gen Pgs28) es también disponible,
Transfección de parásitos como modelo de facilitando la expresión específica del transgén en
estudio gametocitos femenitos. Por otro lado, una región de 1.5
kb del gen AMA-1 de P.berghei puede ser usado
La transfección estable de parásitos permite el también para la expresión directa en el último estado de
análisis funcional de genes y ofrece posibilidades para esquizogonia.
la generación de parásitos atenuados através de
manipulaciones especificas del genoma por expresión Para P. knowlesi, las secuencias útiles en los
de transgenes, knockout o modificación de genes in situ. experimentos de transfección son enteramente
heterólogas ( y por lo tanto no deberian recombinar
Promotores y marcadors de selección fálsamente en el genoma del parásito), y incluye las
regions regulatorias de la proteina rica en histidina
La selección de parásitos P.berguei y (hrp) y el DHFR/TS UTRs de P. berghei descrito
P.knowlesi recombinantes esta basada en la introducción anteriormente.

Imagen 3: Vectorse de expresión para la transfección estable de Plasmodium berghei y Plasmodium knowlesi

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Contribución de los modelos animáles a la compresión de la histiopatogénesis de la malaria

Vectores para la transfección entre si, y ayudando a decidir quien era admitido en el
proyecto y a quien se le podia otorgar la libertad
Una serie de nuevos vectores ha sido condicional anticipada como resultado de su
desarrollado para P.berghei y P.knowlesi. Estos vectores participación.
permiten la expresión génica mediante las secuencias La idea fué propuesta inicialmente por Michel
reguladoras descritas en el apartado anterior y se Foucault, cuya idea de un “transparente” y sutil estilo de
ensamblan en una estructura de cassette para que cada castigar llevó al arquitecto Jeremy Benthams a diseñar
uno de los componentes puedan ser reemplazados un estilo de prisión en la cual las celdas se disponian
fácilmente por secuencias de prueba. alrededor de una torre de vigilancia.
Pueden ser de dos tipos: vectores para la
selección (pS vectors) o vectores para la selección y la
expresión (pSE vectors) de una segundo marco abierto Bibliografía
de lectura (ORF). El vector pS contine un gen marcador
seleccionable flanqueado por diferentes elementos de Maria Hernandez-Valladares,Jan Naessens and Fuad A. Iraqi - Gene-
control y son útiles para probar supuestos marcadores knockout mice in malaria research: useful or misleading?
de selección y genes reporteros, para diseccionar
Valery Combes, J. Brian De Souza,Laurent Renia, Nicholas H. Hunt,
secuencias reguladoras y para integrar construcciones o Georges E. Grau - Cerebral malaria: Which parasite? Which
vectores de reemplazamiento para manipulación model?
genética. Esos vectores ha sido usados para la
integración directa dentro del genoma de P.berghei. J.Brian de Souza, Eleanor M. Riley - Cerebral malaria: the
contribution of studies in animal models to our understanding of
Además de el cassete de marcador de immunopathogenesis
selección , el vector pSE contiene elementos que
permiten la expresión o sobreexpresión constitutiva de Catherine Ivory and Kris Chadee - DNA vaccines: designing
un segundo ORF. Los parásitos transformados con la strategies against parasitic infections
construcción circular pueden mantener hasta 20 copias Andrew W. Taylor-Robinson - Regulation of immunity to
del vector de replicación episomal en el núcleo y Plasmodium: Implications from mouse models for blood stage
transcribir el gen marcador en niveles elevados. Por malaria vaccine design
contra, cuando un vector se ha integrado dentro del
Lars Hviid and Lea Barfod - Malaria vaccines: immunity, models and
genoma de P.berguei , el marcador de selección es monoclonal antibodies
transcrito en patrones etapa-específicos de forma
similar a la copia del gen de los parásitos salvages. Nathaniel Comfort - The prisoner as model organism: malaria
Algunos de esas construcciones pSE serán research at Stateville Penitentiary
útiles para la construcción de bibliotecas de expresión Socrates Herrera, Blanca Liliana Perlaza, Anilza Boneloa, Myriam
de Plasmodium. Recientemente, el DHFR/TS ORF de Arevalo-Herrer - Aotus monkeys: their great value for anti-
T.gondii ha sido mutagenizado para eliminar los sitios malaria vaccines and drug testing
de restricción EcoRI y KpnI para facilitar la clonación
Anthony A. Holder - Malaria Vaccines: Where Next?
y la manipulación.
A.M. Tomas, A.M. van der Wel, A.W. Thomas, C.J. Janse and A.P.
Debido a que el vector pS pD B.DTm.DB permite Waters - Transfection Systems for Animal Mode l of Malaria
la transfección estable tanto de P.berghei como de
Chandy C. John, M.D. - Cerebral Malaria Pathogenesis What Can We
P.knowlesi y el vector pDT.Tg23 permite la Learn from Microarray Analysis?
transfección estable de P. falciparum y P.knowlesi, el
primer vector transbordador entre diferentes especies de Jacob Golenser – Mira Peled-Kamar,Elischwartz, Ilanit
Plasmodium es ahora posible. El valor de estos vectores Friedman,Yoram Groner and Yaakov Pollac – Transgenic mice
with elevated level of CuZnSOD are highly susceptible to
en la investigación de la malaria es considerable, malarian infection
permitiendo comparaciones de la biología de
componentes genéticos idénticos en diferents fondos Juan Carlos Díaz David, Maritza Barrera Valle - Las vacunas de
genéticos de parásitos y huespedes. ADN: una promisoria medicina para el paciente veterinario

Nayanah Siva - New animal model for malaria

Prisioneros como modelo de estudio J. Golenser,J. McQuillan,L. Hee,A.J. Mitchell,N.H. Hunt


Conventional and experimental treatment of cerebral malaria
-

En un proyecto de investigación militar


iniciado durante la segunda guerra mundial, presos de la Denise L. Doolana,b,*, Stephen L. Hoffman - DNA-based vaccines
penitenciaría Stateville en Illinois fueron infectados con against malaria: status and promise of the Multi-Stage Malaria
DNA Vaccine Operation
malaria y tratados con fármacos experimentales que en
muchas ocasiones provocaron graves efectos adversos. W. Peters and B. L. Robinson - Malaria
Ellos se convirtieron en reservorios de la
enfermedad y proporcionaron un aporte alimenticio
para el cultivo de mosquitos, actuando como secretarios
y técnicos, recopilando datos entre ellos, contando las
picaduras de mosquitos, administrandos los fármacos

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