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La revue

Ingénierie métabolique des usines


d'antibiotiques : nouveaux outils de production
d'antibiotiques chez les actinomycètes
Tilmann Weber1, Pep Charusanti1,2, Ewa Maria Musiol-Kroll1, Xinglin Jiang1, Yaojun
Tong1, Hyun Uk Kim1,3, et Sang Yup Lee1,3
1 Centre de la Fondation Novo Nordisk pour la biodurabilité, Université technique du Danemark, Kogle Alle 6, Hørsholm, Danemark
2Département de bioingénierie, Université de Californie, San Diego, La Jolla, Californie, États-Unis
3Laboratoire national de recherche en génie métabolique et biomoléculaire, Département de génie chimique et biomoléculaire (programme BK21

Plus), Centre de biotechnologie des systèmes et de synthèse, Institut pour le biosiècle, Centre de recherche en bioinformatique et Centre de
recherche en génie des procédés biologiques, Institut coréen avancé des sciences et technologies ( KAIS),
Daejeon 305-701, République de Corée

Les actinomycètes sont d'excellentes sources de nouveaux composés conditions, l'extraction des métabolites et l'analyse de l'extrait pour la
bioactifs, qui servent de candidats médicaments potentiels pour le bioactivité (par exemple, l'activité antimicrobienne) dans un dosage
développement d'antibiotiques. Alors que les efforts industriels pour choisi. Une fois qu'un extrait bioactif est identifié, une analyse plus
trouver et développer de nouveaux antimicrobiens ont été détaillée est effectuée, impliquant normalement une séparation par
considérablement réduits au cours des deux dernières décennies, la chromatographie des constituants individuels, pour identifier les
menace croissante des agents pathogènes multirésistants et le molécules bioactives spécifiques. Très souvent, cependant, cet énorme
développement de nouvelles technologies pour trouver et produire de effort conduit à la redécouverte de molécules connues, un fait qui a
tels composés ont de nouveau suscité l'intérêt dans ce domaine. Sur la refroidi l'enthousiasme pour la découverte de produits naturels à partir
base des améliorations du séquençage du génome entier, de nouvelles d'actinomycètes au cours des deux dernières décennies.
méthodes ont été développées pour identifier les groupes de gènes Bien que cette stratégie générale soit toujours appliquée
biosynthétiques des métabolites secondaires par extraction du aujourd'hui, plusieurs développements récents ont renouvelé
génome, pour les cloner et les exprimer dans des hôtes hétérologues à l'enthousiasme pour la découverte de produits naturels à partir
un débit beaucoup plus élevé qu'auparavant. Ces technologies d'actinomycètes. L'analyse de la séquence du génome de plusieurs
permettent désormais aux approches d'ingénierie métabolique actinomycètes indique que chaque bactérie peut produire environ 10
d'optimiser les rendements de production et de manipuler directement fois plus de métabolites secondaires que ce qui a été détecté lors des
les voies pour générer des produits modifiés. efforts de dépistage avant la disponibilité des données sur la séquence
du génome. Pour cette raison, les actinomycètes continuent d'être des
Les actinomycètes comme sources de nouveaux médicaments sources prometteuses de nouveaux composés bioactifs[2]. De plus, la
Depuis plus de 70 ans, les actinomycètes (ordreactinomycétales) disponibilité de nouvelles stratégies d'ingénierie métabolique fournit
ont été reconnus comme des sources importantes de composés désormais des approches alternatives pour rationaliser et accélérer la
naturels bioactifs. Sur les quelque 18 000 composés bactériens découverte et la production de produits naturels bioactifs à partir de
bioactifs connus, plus de 10 000 ont été décrits à partir de sources microbiennes ou métagénomiques. L'ingénierie métabolique
bactéries du genre actinomycèteStreptomyces[1]. De nombreux est une discipline bien établie qui conçoit systématiquement des
antibiotiques bien connus, tels que la tétracycline, l'érythromycine, souches microbiennes pour la surproduction de composés chimiques
la vancomycine et la streptomycine, proviennent du métabolisme naturels et non naturels utiles à l'humanité.[3](Figure 1). Bien que des
secondaire des actinomycètes. Au-delà des antibiotiques, d'autres justifications similaires puissent être appliquées aux actinomycètes,
produits naturels médicalement utiles qui ont été isolés de ce l'ingénierie des actinomycètes est plus difficile que l'ingénierie des
groupe de bactéries comprennent l'immunosuppresseur organismes modèles, tels que Escherichia colietSaccharomyces
rapamycine, les agents anticancéreux doxorubicine et bléomycine, cerevisiae,parce que les actinomycètes possèdent un contenu
l'avermectine anthelminthique et le composé antifongique génomique et une machinerie biochimique plus diversifiés[4](Figure 1).
nystatine. Nous passons en revue les outils et méthodes récemment développés
L'approche traditionnelle de la découverte de petites molécules à partir pour l'ingénierie métabolique efficace des actinomycètes, et discutons
de sources microbiennes telles que les actinomycètes a généralement de la manière dont ces outils permettent la génération d'usines
impliqué la culture des microbes sous différentes conditions de croissance. cellulaires microbiennes pour la production d'antibiotiques et d'autres
métabolites secondaires.

Auteur correspondant:Lee, SY (leesy@kaist.ac.kr).


Mots clés:actinomycètes; métabolites secondaires; génie métabolique; antibiotiques.
Extraction de génomes pour la détection et l'identification de groupes
de gènes biosynthétiques de métabolites secondaires
0167-7799/
- 2014 Elsevier Ltd. Tous droits réservés.http://dx.doi.org/10.1016/j.tibtech.2014.10.009 La machinerie protéique responsable de la biosynthèse des
métabolites secondaires chez les bactéries est codée par des

Tendances en biotechnologie, janvier 2015, vol. 33, n° 1 15


La revue Tendances en biotechnologieJanvier 2015, Vol. 33, n° 1

Glossaire identifier les groupes de gènes biosynthétiques de métabolites


secondaires (SMBGC ; voirGlossaire) et propose différents modules
Un domaine:les domaines d'adénylation des modules de synthétase de peptides non ribosomiques
(NRPS) sélectionnent, activent les acides aminés sous forme d'adénylates d'acides aminés et les d'analyse des parcours concernés.
transfèrent aux domaines de la protéine porteuse de peptidyle des modules NRPS. En plus des outils informatiques, l'exploration du génome
À:Les domaines d'acyltransférase codés dans la polykétide synthase modulaire sélectionnent
s'accompagne généralement d'analyses du protéome et/ou du
spécifiquement les éléments constitutifs de l'acyl-CoA et les transfèrent aux protéines
porteuses d'acyle (ACP). métabolome à l'aide de la SM pour une liaison précise d'un métabolite
ACP :les protéines porteuses d'acyle contiennent un groupe prosthétique phosphopantéthéine secondaire cible et de son groupe de gènes biosynthétiques [7,8]. La
attachant les intermédiaires de réaction pendant la biosynthèse des polycétides.
biosynthèse de plusieurs classes de métabolites secondaires suit une
BAC :les chromosomes artificiels bactériens sont des vecteurs d'ADN circulaires réplicables
développés à partir du plasmide F. Ils sont généralement utilisés pour cloner de longs logique biochimique conservée ; ceci est utilisé pour faire correspondre
fragments de 150 à 350 Ko. les données analytiques dérivées des métabolites secondaires avec les
CRISPR–Cas9 :la nucléase associée à des répétitions palindromiques courtes régulièrement
espacées (CRISPR) en grappes Cas9 est une endonucléase guidée par l'ARN utilisant
gènes du génome de l'organisme cible [9,10]. En plus de la logique
l'appariement de bases ARN-ADN pour cliver l'ADN cible, qui est délimité par des séquences biochimique, des données d'annotation du génome de haute qualité
de motifs adjacents au protospacer (PAM). Les séquences PAM sont de courts motifs pour l'organisme cible (par exemple, une couverture élevée et des
nucléotidiques qui sont spécifiquement reconnus et requis par Cas9 pour le clivage de l'ADN.
prédictions précises du cadre de lecture ouvert) et la disponibilité de
DH :le domaine déshydratase d'un module PKS est responsable de la déshydratation spectromètres de masse suffisamment sensibles déterminent le succès
dub-Groupe OH d'un intermédiaire polycétide.
de cette exploitation du génome basée sur la SP. Dans cette approche,
Urgences :le domaine énoylréductase d'un module PKS réduit une double liaison en une
simple liaison entre deux unités d'extension adjacentes. les données analytiques des métabolites secondaires générés par la
HDR :la réparation dirigée par homologie est une voie dépendante de la matrice pour la réparation de SEP (c'est-à-dire la SEPndata) fournissent des modèles de fragments
la rupture double brin (DSB).
spécifiques qui contiennent des « étiquettes » aminoacyle ou glycosyle.
KR :le domaine kétoreductase d'un module PKS est responsable de la réduction de la b-céto
du groupe intermédiaire polycétide en un groupe hydroxyle. SNRP :les synthétases Les étiquettes amino-acyles peuvent être recherchées par rapport aux
peptidiques non ribosomiques activent et condensent spécifiquement les acides aminés blocs de construction d'acides aminés prédits à partir du génome de
protéinogènes ou non protéinogènes selon une chaîne de montage. Ils interviennent dans la
l'organisme cible en utilisant la logique biochimique conservée pour les
biosynthèse de nombreux antibiotiques peptidiques comme par exemple la vancomycine.
peptides ribosomiques ou non ribosomiques[11–13].
PKS :les polykétides synthases condensent les unités acyl-CoA pour former un polykétide. Il
existe trois types de PKS : les PKS de type I sont homologues aux synthases d'acides gras de
Dans le même ordre d'idées, les étiquettes glycosyl de produits
type I que l'on trouve par exemple chez les mammifères. Ils agissent soit de manière
itérative, soit à la chaîne. Les PKS de type II sont homologues aux synthases d'acides gras de naturels glycosylés peuvent être liées à leurs gènes biosynthétiques
type II que l'on trouve dans de nombreuses bactéries. Leurs produits sont généralement des correspondants parmi tous les gènes de glycosylation qui sont
polycétides aromatiques. Les PKS de type III sont des homologues de chalcone/stilbène
synthases végétales. Rouge/ET :La recombinaison Red/ET est une méthode pour insérer de
initialement caractérisés par l'extraction du génome de l'organisme
l'ADN étranger dans des chromosomes ou des plasmides basés sur de courtes régions de cible. Ces méthodes peuvent être considérées comme
séquences homologues (<50 pb). Le système utilise les exonucléases/recombinases Redune/ peptidogénomique ou glycogénomique, selon l'utilisation d'amino-acyl
rougeb à partir dejephage ou RecE/RecT du prophage Rac.
SMBGC :les grappes de gènes biosynthétiques des métabolites secondaires contiennent tous les
(ou peptidyl) ou de «tags» glycosyl obtenus à partir des métabolites
gènes nécessaires à la biosynthèse, à la régulation, à l'exportation et très souvent à la résistance des secondaires cibles, respectivement, mais la justification générale de
produits naturels/métabolites secondaires, ainsi tous les gènes sont codés côte à côte. A de très rares
leurs approches reste la même. L'utilisation de la peptido- et de la
exceptions près, les voies de biosynthèse des métabolites secondaires bactériens sont toujours
organisées en SMBGC. Cependant, les SMBGC peuvent également être trouvés chez les producteurs glycogénomique a conduit à la découverte de nouveaux analogues de
de champignons. l'antibiotique stendomycine deStreptomyces hygroscopiquesATCC
TALEN :les nucléases effectrices de type activateur de transcription sont des fusions desFokI
53653[11], et l'arénimycine B de l'actinobactérie marineSalinispora
domaine de clivage et domaines de liaison à l'ADN dérivés des protéines TALE. Les TALE
contiennent plusieurs domaines répétés de 33 à 35 acides aminés, chacun reconnaissant une arenicolaCNB-527, un antibiotique efficace contre les multirésistants
seule paire de bases. Staphylococcus aureus[12], respectivement. Bien que ces méthodes
ET :le domaine thioestérase libère le polykétide ou l'intermédiaire peptidique de la chaîne
puissent devoir être adaptées aux métabolites secondaires avec des
d'assemblage PKS ou NRPS ; dans de nombreux cas, la libération est associée à une
macrolactonisation, donnant des molécules cycliques. structures hybrides ou hautement modifiées (par exemple, des
ZFN :les nucléases à doigts de zinc sont des fusions du domaine de clivage de l'ADN non hybrides non ribosomiques et polycétides), elles peuvent toujours être
spécifique duFokI endonucléase de restriction avec des protéines à doigt de zinc. Les
applicables à une variété de composés pour identifier rapidement leurs
dimères ZFN induisent des DSB d'ADN ciblés qui stimulent les voies de réponse aux
dommages à l'ADN. gènes biosynthétiques. Dans un autre exemple récent, des corrélations
significatives entre les niveaux d'expression des protéines et les
activités des métabolites secondaires cibles dans plusieurs conditions
clusters de gènes au sein de leurs génomes, ce qui fait de de croissance différentes ont été validées et utilisées pour lier les
l'identification de ces clusters par l'exploration du génome une métabolites secondaires cibles à leurs groupes de gènes spécifiques.
tâche importante[4]. Plusieurs développements majeurs ont fait
progresser ces efforts d'exploration du génome, en particulier le [14]. Une fois les liens positifs identifiés, les protéines respectives
développement de technologies de séquençage de nouvelle ont été cartographiées sur les grappes de gènes prédites de
génération, une connaissance accrue du métabolisme secondaire l'organisme cible grâce à des données d'expression protéomique
et de nouveaux outils de détection par spectrométrie de masse quantitatives.
(MS). Les informations biologiques résultantes ont été incorporées Une fois que le groupe de gènes d'un métabolite secondaire
dans plusieurs bases de données et outils logiciels pour la cible a été identifié, l'ingénierie métabolique peut être réalisée en
prédiction à l'échelle du génome des grappes de gènes, l'analyse utilisant une souche microbienne qui héberge nativement le
de leurs voies de biosynthèse des métabolites secondaires groupe de gènes spécifique à condition qu'il ait des
correspondants et la prédiction des spécificités du substrat. caractéristiques de croissance adéquates et qu'il se prête à la
[5]. Le logiciel actuellement le plus largement utilisé pour identifier manipulation génétique. Sinon, le groupe de gènes identifié peut
ces groupes de gènes est le shell d'analyse des antibiotiques et des être cloné et exprimé dans un hôte hétérologue. Le
métabolites secondaires (antiSMASH)[6]. antiSMASH comprend des développement récent de nouvelles techniques de clonage a
algorithmes basés sur des règles et des statistiques maintenant grandement accéléré ce processus.

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• Construction d'une voie de biosynthèse (si

Ingénierie métabolique avec


• Cultivabilité

micro-organismes de la plate-forme
• Élimination des sous-produits
hétérologue)
• Stabilité du génome • Op-misaon de
• Amélioration de l'auto-tolérance vis-à-vis d'un produit cible
• Disponibilité des informations condition de cul-va-on
• Suppression des réglementations néga-ves
génomiques • Mise à l'échelle d'un bioréacteur
• Op-misaon des cofacteurs et des précurseurs
• Disponibilité d'outils de • Stratégies de cul-va-on et
• Suppression des voies métaboliques concurrentes
manipulation génétique d'alimentation
• Op-miza-on des flux métaboliques via une voie de
• Disponibilité des médias • Séparaon et
biosynthèse cible (par exemple, promoteurs et utilisa-on
définis purification de produits
de codons)

Métabolite secondaire
Héberger Souche Bioprocédé
sélection amélioration op-miza-on

Production à l'échelle industrielle

• Réveil d'un groupe de gènes biosynthe-c (si silencieux)


considérations et outils

• Iden-fica-on de nouveaux
Ac-nomycète spécifique

• Isola-on et assemblage d'un cluster de gènes biosynthé-ques de grande taille


métabolites secondaires
• Construction de super-hôtes grâce à la minimisation du génome
• L'extraction du génome
(par exemple, élimination des grappes de gènes associées à d'autres métabolites secondaires)
en combinaison avec
outils analytiques pour lier
En cas de production d'analogues de métabolites secondaires :
un métabolite secondaire
• Utilisation de nouvelles molécules unitaires de départ et/ou d'extension
avec sa biosynthe-c
• Réorganisation des domaines et/ou des modules
grappe de gènes
• Ingénierie d'enzymes core et/ou sur mesure

TENDANCES en biotechnologie

Figure 1.Pipeline d'ingénierie métabolique représentatif avec des micro-organismes de plate-forme (par exemple,Escherichia colietSaccharomyces cerevisiae),indiqués dans les encadrés supérieurs, et des considérations
supplémentaires pour les actinomycètes, indiquées dans les encadrés inférieurs.

Réveiller le potentiel génétique silencieux Techniques avancées de synthèse d'ADN et d'assemblage de


L'extraction de génomes entiers d'espèces d'actinomycètes révèle en clusters
moyenne la présence de 30 à 40 SMBGC par souche, indiquant ainsi un Si un cluster d'intérêt ne peut pas être exprimé dans son hôte
grand potentiel génétique pour synthétiser des métabolites d'origine, il faut nécessairement exprimer le cluster de manière
secondaires, y compris des antibiotiques. Cependant, dans des hétérologue. Pour y parvenir, le cluster doit être cloné dans un
conditions de laboratoire standard, seule une fraction de ces clusters vecteur approprié. Plusieurs facteurs doivent être pris en
est exprimée. Plusieurs méthodes ont été développées qui déclenchent compte lors du choix d'une stratégie de clonage. Celles-ci
de manière non spécifique l'expression de tels « clusters de gènes incluent : si l'ADN génomique est facilement disponible pour
silencieux ». Il a été observé que l'induction de mutations dans les servir de modèle, si l'on souhaite se concentrer sur un petit
protéines ribosomales ou l'ARN polymérase, en complétant le bouillon nombre de clusters ou scanner plusieurs clusters dans un
de fermentation avec des produits chimiques tels que des éléments de génome, et s'il faut capturer le cluster dans sa forme native ou
terres rares, des antibiotiques,N-l'acétyl glucosamine, ou des composés le refactoriser.
synthétiques particuliers peuvent avoir des effets positifs sur Si l'ADN matrice est facilement disponible, par exemple à partir
l'expression des SMBGC et le rendement de leurs composés résultants de sources génomiques, environnementales ou métagénomiques,
[15]. Des effets similaires ont été observés pour les approches de co- la stratégie de clonage traditionnelle consiste à décomposer l'ADN
culture dans lesquelles des antibiotiques spécifiques sont produits lors en morceaux aléatoires et à cloner ces fragments plus petits enE.
de la co-culture du producteur d'antibiotiques avec d'autres micro- colipour les stocker sous forme de bibliothèque. Les vecteurs de
organismes.[16]. bibliothèque cosmide/fosmide sont capables de transporter des
Dans de nombreux cas, l'expression de SMBGC "silencieux" a été inserts jusqu'à 45 kb, et les vecteurs de chromosomes artificiels
activée avec succès par la coexpression de gènes activateurs bactériens (BAC) peuvent prendre des inserts jusqu'à 200 kb. La
spécifiques à la voie homologues (c'est-à-dire provenant du même bibliothèque est ensuite criblée à l'aide desur placehybridation de
SMBGC) ou hétérologues (c'est-à-dire provenant d'un SMBGC différent). colonies[19]ou PCR de colonie[20]pour identifier les colonies qui
Par exemple, la production de glycopeptide ristomycine A pourrait être contiennent des fragments du cluster cible. Dans certains cas, un
activée dansAmycolatopsis japonicumMG417-CF17 par coexpression de cluster ne sera pas entièrement cloné dans un seul vecteur en
l'activateur spécifique de la voie de la balhimycinebbr[17]. raison de sa taille. Les longueurs de cluster varient généralement
Alternativement, des promoteurs puissants peuvent être insérés de 10 à 100 ko, et certaines peuvent être encore plus grandes.
devant les régulateurs natifs pour déclencher l'activation des SMBGC Lorsque des colonies contenant des fragments du groupe cible ont
silencieux, comme indiqué pour le 6-épi-alteramides deS. albus J1074 été identifiées, les fragments peuvent être réassemblés en une
[18], ou des gènes répresseurs spécifiques à une voie peuvent être seule pièce contiguë par restriction-ligature,l-recombinaison
inactivés. Enfin, bien que la stratégie de régulation spécifique à la voie médiée ou recombinaison associée à la transformation (TAR) dans
d'ingénierie puisse être utilisée avec succès chez les hôtes natifs, elle la levure[21]. Une bibliothèque bien construite doit contenir tous
est également très pertinente pour l'expression hétérologue des les SMBGC d'une source donnée, permettant l'analyse de plusieurs
SMBGC dans les souches de plateforme. clusters.

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Plus récemment, TAR[22]et une technique connexe, la assemblage (SHA)[32], ne dépendent pas de sites de restriction ou de
recombinaison homologue linéaire plus linéaire (LLHR)[23], ont été recombinaison spécifiques et n'introduisent pas de cicatrices, ce qui les
utilisées comme méthodes de clonage direct pour capturer une rend particulièrement bien adaptés à la reconstruction de cluster. Des
séquence d'ADN cible à partir d'une matrice d'ADN génomique gènes, des voies et même des génomes bactériens entiers ont été
plus rapidement et plus efficacement que par la construction et le construits à partir de fragments plus petits à l'aide de ces techniques (
criblage de bibliothèques.S. cerevisiaeouE. colisont transformés Tableau 1)[33].
avec l'ADN génomique des producteurs, et le cluster cible est L'une des principales forces de ces approches est leur utilisation pour la
capturé dans un plasmide réplicable par recombinaison refonte des clusters. Chaque gène, promoteur ou autre élément peut être
homologue catalysée par la machinerie de recombinaison native considéré comme un module indépendant qui peut être remplacé, supprimé
dans la levure ou par un système de recombinaison Red/ET dérivé ou ajouté au cluster à volonté. Il est ainsi possible de remplacer les
d'un bactériophage dans desE. coli (Figure 2). La limite de taille promoteurs natifs par des synthétiques et de contourner la régulation
supérieure pour la capture de cluster n'est pas encore connue, native, de supprimer les répresseurs transcriptionnels codés sur le cluster,
mais le cluster de 67 kb de taromycine A a été capturé avec TAR[24] ou de créer des voies combinatoires pour produire de nouveaux
, et un cluster de 52 ko pourrait être directement capturé avec antibiotiques.[34]. Pourin vivoDans le cas de méthodes basées sur la
LLHR[23,25]. Une fois les clusters capturés, soit par des méthodes recombinaison homologue, telles que l'assembleur d'ADN et le TAR, des
de bibliothèque traditionnelles, soit par clonage direct, ils peuvent événements de recombinaison involontaires peuvent se produire entre des
être davantage manipulés à l'intérieur de leurS. cerevisiaeouE. coli régions qui ont des répétitions ou des séquences similaires, telles que celles
hôtes utilisant des techniques de recombinaison standard [23,25]. trouvées dans les groupes de gènes qui codent pour la polykétide synthase
Avec ces méthodes, il est possible, par exemple, d'introduire de (PKS) et la peptide synthétase non ribosomique (NRPS). Dans ces cas, il est
nouveaux promoteurs ou éléments régulateurs, de modifier des nécessaire de vérifier l'exactitude de la séquence construite par une
sites RBS, d'échanger des codons ou de reconstruire des modules cartographie de restriction[24]ou le séquençage direct de l'ADN. Pourin vitro
de gènes pour générer de nouveaux dérivés de produits.[26]. les méthodes dans lesquelles l'assemblage est basé sur des extrémités
Un cluster cible peut également être assemblé à partir de fragments homologues, par exemple l'assemblage Gibson et SLIC, les structures
plus petits grâce à l'utilisation de plusieurs techniques d'assemblage secondaires (épingles à cheveux et boucles de tige) dans les extrémités
d'ADN différentes. Certains d'entre eux, par exemple l'assemblage homologues peuvent réduire considérablement l'efficacité de l'assemblage.
Gibson[27], clonage indépendant de la ligature (SLIC)[28], LE GOUDRON
[22](ou assembleur d'ADN[29]), Fusion UTILISATEUR[30], réaction de Il convient de noter que la teneur en GC des SMBGC des
cyclage de la ligase (LCR)[31], et hybridation successive actinomycètes est généralement d'environ 65 à 75 %, ce qui rend le

(UNE) (B)

ADN génomique ou ADN environnemental

+ PCR
ADN génomique Vecteur de clonage linéaire sous-clonage
(digéré/non digéré)
ou synthèse

Cotransformaon
+
Vecteur de clonage linéaire Modules de gènes avec de nouveaux promoteurs
Levure ou
E. coliexprimant Red/ET Levure

In vitro
recombinaison ou ligature spécifique au site
Homologue
recombinaison Homologue
Transforma-on recombinaison

Levure ou Levure
E. coliexprimant Red/ET E. coli

Construction reproductible

TENDANCES en biotechnologie

Figure 2.Clonage direct et réassemblage de grappes de gènes biosynthétiques de métabolites secondaires. (UNE)Pour capturer un long cluster, un vecteur de clonage linéaire flanqué de bras
d'homologie est préparé puis co-transféré avec l'ADN génomique hébergeant le cluster dans la levure (TAR) ou modifiéEscherichia coli (LLHR). Catalysé par le mécanisme de recombinaison natif dans la
levure ou exprimé Red/ET dansE. coli,la recombinaison homologue entre les extrémités du cluster et les bras d'homologie du vecteur donne une construction réplicable circulaire. (B)Pour le
réassemblage d'un cluster, les gènes sont isolés individuellement par PCR, sous-clonage ou synthèse chimique, et sont modifiés par l'ajout d'extrémités d'homologie, d'extrémités avec des sites de
restriction ou de sites de recombinaison spécifiques. Des promoteurs forts ou inductibles peuvent être introduits devant les gènes. Ensuite, les fragments de gène sont assemblés dans un vecteur enin
vivorecombinaison homologue dans la levure, ou parin vitrorecombinaison ou ligation spécifique au site. Les produits assemblés peuvent être encore amplifiés dansE. coli.

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Tableau 1. Exemples d'isolement et de reconstruction de groupes de gènes biosynthétiques de métabolites secondaires entiers
Méthode Mécanismes Exemples
Bibliothèque génomique bibliothèque BAC Clonage du groupe de gènes biosynthétiques de la daptomycine
de 128 kb[62]
Recombinaison homologue Recombinaison rouge/ET Clonage direct de 10 clusters PKS-NRPS de 10 à 52 kb à
linéaire-linéaire (LLHR) dans Escherichia coli partir d'ADN génomique prédigéré[23,63]
Clonage "conventionnel" basé amplification PCR/sous-clonage ; clonage dans Assemblage de l'érythromycine polykétide synthase DEBS
sur la restriction/ligature des vecteurs d'expression appropriés [64]et la voie de biosynthèse complète de l'érythromycine A
[65]
Recombinaison associée à la Recombinaison homologue dans la levure Clonage direct du cluster taromycine A (NRPS) de 67 kb à
transformation (TAR) partir d'ADN génomique[24]
MASTER Ligature Endonucléase de type IIMspJI Assemblage du cluster d'actinorhodine (PKS) de 29 kb à partir
de quatre fragments[66]
Assembleur d'ADN Recombinaison homologue dans la levure Assemblage du cluster spectinabilin (PKS) de 42,6 kb à
partir de trois fragments[67]
Assemblage en tandem basé sur la In vitrorecombinaison site-spécifique par Assemblage du cluster d'épothilone de 56 kb (PKS-NRPS) à
recombinaison spécifique au site (SSRTA) StreptomycesphagetuBT1 intégrase partir de sept fragments[68]
PCR d'extension par chevauchement–méthode de Recombinaison homologue dans la levure Assemblage du cluster de gènes de biosynthèse de la
recombinaison homologue de levure (ExRec) xénoamicine (NRPS) de 45 kb à partir de six fragments[69]

la manipulation d'un tel ADN pour le séquençage, la synthèse d'ADN et l'hôte hétérologue est la stabilité du génome[36]car les génomes des
l'amplification par PCR est plus difficile que la manipulation d'ADN avec une actinomycètes peuvent être instables dans le temps, ce qui peut
teneur en GC plus proche de 50 %. Par conséquent, les procédures entraîner une réduction ou une perte complète de la production de
d'assemblage et de clonage nécessitent souvent des étapes d'optimisation métabolites secondaires[37].
ou de vérification supplémentaires pour s'assurer que chaque fragment Plusieurs groupes ont récemment développé des actinomycètes
cloné est correct. à génome minimisé qui s'avèrent prometteurs en tant que «super-
À l'avenir, il sera également possible d'obtenir des grappes hôtes» et souches de plate-forme pour l'expression hétérologue.
entières par synthèse chimique à mesure que le coût de la La caractéristique commune à ces souches est l'élimination des
synthèse d'ADN continue de baisser, contournant ainsi le besoin de SMBGC natifs inutiles. Cela permet au composé cible synthétisé par
clonage ou d'assemblage de grappes. Aux prix actuels, il est le groupe de gènes introduit d'être détecté plus facilement par des
courant d'acheter des fragments plus courts et de les assembler techniques analytiques de routine. Dans un cas, quatre SMBGC
selon les méthodes décrites ci-dessus. endogènes pour l'actinorhodine, l'undécylprodigiosine, la
coelimycine et l'antibiotique calcium-dépendant (CDA) ont été
Expression hétérologue et super-hôtes Les actinomycètes sont supprimés deStreptomyces coelicolor,et des mutations ponctuelles
souvent choisis comme hôtes pour l'expression hétérologue des ont été introduites dans rpoBetrpsLpour augmenter de manière
SMBGC en raison de facteurs tels que la teneur en GC pléiotropique le niveau de production de métabolites secondaires
correspondante, la disponibilité de précurseurs biosynthétiques du [38]. Dans un autre cas, différents ensembles de SMBGC ont été
métabolisme primaire qui soutiennent la biosynthèse des supprimés deS. coelicolor pour créer une série d'hôtes à génome
métabolites secondaires et le besoin d'enzymes de modification réduit, y compris une souche avec tous les clusters supprimés[39].
particulières lors de la biosynthèse des métabolites secondaires. L'expression vectorielle du cluster d'actinorhodine dans ces
L'expression hétérologue devient nécessaire lorsque l'hôte natif souches a cependant entraîné des rendements différents
est difficile à cultiver ou génétiquement intraitable d'actinorhodine parmi les souches. En plus deS. coelicolor,le
[35]. Pour la production industrielle de métabolites secondaires, tels producteur d'avermectineStreptomyces avermitilisa également fait
que les antibiotiques, un autre facteur important pour le choix d'un l'objet de

Tableau 2. Limitations de la production de composés et exemples d'amélioration du rendement de production après ingénierie des souchesune
Limites Stratégies d'amélioration de la production Composés cibles avec Réfs
rendement de production amélioré
Régulation Réglage de l'expression des gènes régulateurs Doxorubicine [70]
(la rétro-inhibition) Ristomycine [17]
Expression de gènes impliqués dans la synthèse de Actinorhodine et undécylprodigiosine [71]
molécules de signalisation (g-butyrolactones)
Approvisionnement en précurseurs Amélioration de la disponibilité des précurseurs Actinorhodine [43,72]
(titres de précurseurs améliorés) FK506 [73,74]
Érythromycine [75]
Balhimycine [44]
Expression et cinétique des Surexpression, inactivation et ingénierie des Érythromycine A [76]
enzymes structurales enzymes structurales
Auto-résistance Surexpression des gènes de résistance et Actinorhodine [77]
ingénierie des ribosomes Doxorubicine [78]
Système d'exportation (déterminant souvent Surexpression des gènes d'exportation Avermectine [79]
l'auto-résistance)

uneVoir également le tableau S1 dans le matériel supplémentaire en ligne.

19
La revue Tendances en biotechnologieJanvier 2015, Vol. 33, n° 1

réduction du génome et sondé en tant que super-hôte l'expression de chaque SMBGC est peu probable. Le transfert de gènes
potentiel pour l'expression hétérologue. Une région de plus de et la manipulation génétique compétents, les conditions de
1,4 Mb a été supprimée du chromosome linéaire de 9,02 Mb de fermentation (par exemple, un milieu et des conditions de culture
cet organisme[40,41]. La traçabilité de ceS. avermitilis appropriés) et un compromis optimal des flux entre les métabolismes
superhost a récemment été confirmé par l'expression primaire et secondaire jouent tous un rôle important dans la
hétérologue réussie de plus de 20 SMBGC exogènes dans cette biosynthèse des métabolites secondaires et peuvent varier d'un hôte à
souche[40]. l'autre. Des hôtes supplémentaires sont susceptibles d'être créés à
Malgré ces succès, le développement d'un seul super-host l'avenir en tant qu'outils d'édition du génome à haut débit, tels que
capable d'assurer des performances efficaces et de haut niveau TALEN, ZFN et CRISPR-Cas9[42], s'adapter pour

Encadré 1. Biosynthèse des antibiotiques par les chaînes d'assemblage moléculaires

Les polycétides synthases (PKS) et les peptides synthétases non ribosomiques (NRPS) Saccharopolyspora érythrée,le domaine acyltransférase (AT) du module de
sont des machineries enzymatiques multifonctionnelles intracellulaires qui catalysent la chargement sélectionne une unité propionyl-CoA et la charge sur un
biosynthèse des structures centrales complexes de nombreux polycétides ou peptides groupe phosphopantéthéine de sa protéine porteuse d'acyle apparentée
non synthétisés par les ribosomes. Ces chaînes d'assemblage enzymatiques ont une (ACP). Les AT des modules 1 à 6 restants sont spécifiques aux blocs de
organisation modulaire : chaque module de biosynthèse est chargé d'ajouter une construction méthylmalonyl-CoA, qui sont également chargés sur leurs
brique de construction (unité acyle dans le cas de la PKS et acide aminé dans le cas de ACP apparentés. Les domaines cétosynthase (KS) catalysent alors la
la NRPS) dans la molécule précurseur. Les modules de la chaîne de montage sont à leur condensation décarboxylative des différentes unités acyles. Si un module
tour constitués de domaines enzymatiques fonctionnels qui fournissent l'activité contient des domaines facultatifs (par exemple, KR, DH et ER),
requise pour la biosynthèse des polykétides ou des peptides. Les domaines de PKS et l'intermédiaire polykétide est encore modifié tout en restant attaché à
NRPS ont des fonctions diverses (voirTableau 2dans le texte principal et le tableau S1 l'ACP. Le dernier module a un domaine terminal de thioestérase (TE), qui
dans les documents supplémentaires en ligne)[9,10]. clive la molécule précurseur du dernier ACP et la cyclise en le précurseur 6-
Dans la chaîne de montage biosynthétique de l'érythromycine, un désoxyérythronolide B. Dans les dernières étapes de la biosynthèse de
antibiotique polycétide (Je figure), produit par l'actinomycète l'érythromycine,

eryAI(DEBS 1) toutAII(DEBS 2) eryAIII(DEBS 3)

Chargement
Module 1 Module 3 Module 5
module Module 2 Module 4 Module 6

KR KR DH Urgences KR KR KR
ACP
ACP ACP ACP ACP ACP ACP ET
À KS À KS À KS À KS À KS À KS À

S S S S S S S

O O O O O O O

OH OH O OH OH

OH OH O OH

OH OH O

OH OH O

OH OH

O OH
O

HO OH
OH N(CH3)2

HO OH
O
O O
O OH
O O H3CO
O OH
OH
O

Érythromycine A 6-désoxyérythronolide B

TENDANCES en biotechnologie

Figure I.Chaîne de montage pour l'érythromycine antibiotique polycétide.

20
La revue Tendances en biotechnologieJanvier 2015, Vol. 33, n° 1

utilisation chez les actinomycètes. L'utilisation de tels hôtes est et découverte de produits à partir d'actinomycètes. Plus récemment, des
sera cruciale pour exploiter le potentiel de biosynthèse des stratégies d'ingénierie métabolique ont été développées pour
nombreux SMBGC cryptiques. augmenter la production d'une molécule cible et créer de nouveaux
analogues. Dans les cas où une molécule a été identifiée et est
Ingénierie des voies de biosynthèse des métabolites approuvée pour une utilisation clinique, l'ingénierie métabolique
secondaires devient particulièrement importante car l'amélioration de la souche et
Alors que les techniques décrites ci-dessus n'ont émergé qu'au cours des la fermentation industrielle sont souvent les seules voies pour obtenir
dernières années, le génie génétique des SMBGC a une longue histoire dans de grandes quantités de la molécule. La synthèse chimique à grande
le domaine des antibiotiques et des substances naturelles. échelle est souvent inapplicable car la

(UNE) Ingénierie de domaine (B) Domaine inac-va-on

KR KR KR KR
ACP ACP ACP ACP
KS À KS À KS À KS À

O O O O
R OH R OH
R R
Exemples) Exemples)
- Échange de domaine AT - Suppression d'un domaine KR
- Ingénierie du site ac-ve du
domaine AT KR

KR KR KR
ACP ACP ACP ACP
KS À KS À KS À KS À

O O O O
OH O
R R
R R

(C) Mélange d'enzymes (RÉ) Ingénierie des étapes de confection

KR KR
ACP ACP ET
KR KR KS À KS À
ACP ACP
KS À KS À

O O R
OH R
R
R
R R
Exemples) Exemples)
- Remplacement de l'ensemble du KR - Ingénierie et altéra-on de
module et de la généra-on ACP l'enzyme de couture
d'enzymes PKS hybrides KS À (par exemple, glycosyltransférases)

KR KR KR KR
ACP ACP ACP ACP ET
KS À KS À KS À KS À

O O
OH R
R
R R

R R
TENDANCES en biotechnologie

Figure 3.Stratégies d'ingénierie des voies de biosynthèse des polycétides de type I. (UNE)Génération de nouveaux composés par ingénierie du domaine AT. (B)Interférer avecb-réduction
du carbone par inactivation de domaine. (C)Génération de nouveaux composés par le remplacement de modules entiers. (RÉ)Génération de nouveaux composés par ingénierie de
modifications sur mesure. Abréviations : ACP, protéine porteuse d'acyle ; AT, acyltransférase; ER, énoylréductase; KR, kétoréductase ; KS, cétosynthase ; TE, thioestérase.

21
La revue Tendances en biotechnologieJanvier 2015, Vol. 33, n° 1

les structures de ces métabolites secondaires sont trop complexes. surexprimant les gènes de biosynthèse, de résistance et d'exportation,
Dans de tels cas, il est avantageux d'identifier des facteurs, tels qu'une ont tous conduit à une augmentation des rendements en composés (
régulation globale ou spécifique à un cluster, un flux métabolique ou Tableau 2; Tableau S1 dans le matériel complémentaire en ligne). Par
une auto-résistance insuffisante, qui limitent la production de exemple, la surexpression du complexe de synthèse de malonyl-CoA
composés chez l'hôte natif ou hétérologue (Tableau 2; Tableau S1 dans (complexe acétyl-CoA carboxylase) a entraîné une multiplication par six
le matériel complémentaire en ligne). de la production d'actinorhodine dansS. coelicolor[43]. Chez le
Plusieurs approches ont été mises en œuvre pour surmonter ces producteur de balhimycineAmycolatopsis balhimycina,la surexpression
limitations et stimuler la production de composés. Plusieurs stratégies, de deux gènes de la voie du shikimate, la 3-désoxy-D-arabino-
telles que le réglage de l'expression des gènes régulateurs, heptulosonate 7-phosphate synthase (dahp)et la préphénate
l'augmentation de l'approvisionnement en précurseurs et déshydrogénase (pdh),augmenté

Tableau 3. Stratégies d'ingénierie pour les grappes de gènes biosynthétiques de métabolites secondairesune
Stratégies Exemples Réfs
Ingénierie des lignes d'assemblage PKS et NRPS
Combinaison de domaines acyltransférase (AT) et Érythromycine et rapamycine [47,80]
substitution AT Geldanamycine [81]
Manipulations de domaine : substitution Avermectine et rapamycine (ivermectine) [82]
déshydratase (DH) et kétoréductase (KR)
Remaniement des sous-unités de polykétide Méderrhodine et dihydrogranatihordine (antibiotiques hybrides [83,84]
synthase (PKS)/PKS hybride méderrhodines A et B)
Tylosine, spiramycine et chalcomycine [85]
Auréothine et lutéoréticuline [49]
Remplacement d'enzyme par un homologue d'acide gras Undécylprodiginine (remplacement de l'enzyme d'initiation de la 3-cétoacyl ACP [86]
synthase synthase III par une synthase d'acide gras)
Inactivation du gène PKS Pactamycine [87]
Désactivation du domaine KR Amphotéricine B [88]
Fusions de thioestérase Érythromycine et produits non actinomycètes [89]
Fusion de modules dans les PKS Tétracénomycine et R1128 [90]
Altération de la sous-unité de la synthétase de Daptomycine [91,92]
peptide non ribosomique (NRPS) et échange de
module combinés à la suppression de gène structurel
Fusions NRPS-module Daptomycine [93]
Suppression du gène NRPS Streptolydigine et christolane A, B et C (l'inactivation des gènes streptolydigine [94]
NRPS a conduit à la production de nouveaux composés)
Ingénierie du domaine A Altération de la spécificité du Antibiotique dépendant du calcium [48]
substrat par mutagenèse dirigée
Évolution dirigée du domaine A Dérivés andrimides [95]
Ingénierie des autres parties des voies
Modification des enzymes de couture Modification et altération des Érythromycine A [51,76]
glycosyltransférases, des halogénases, Doxorubicine [53,96]
des méthyltransférases, de la Daunorubicine et dérivés [53]
cétoréductase discrète
Staurosporine et rébeccamycine [97]
Clorobiocine et novobiocine [98]
Vancomycine, teicoplanine, [99 100]
tylosine, indolcarbazoles,
anthracyclines et
angucyclines
YC-17 [101]
Chlortétracycline et autres [102]
dérivés de la tétracycline
Mutagenèse des enzymes de couture Inactivation de l'époxydase P450 Pimaricine [103]
Inactivation de la kétoréductase Mithramycine et dérivés [104]
Inactivation de l'hydroxylase Tautomycine [105]
Inactivation de la monooxygénase Macbécin [106]
dépendante de la flavine, de la phosphatase
et de l'oxydoréductase
Altération des précurseurs Inactivation et ingénierie des gènes Rapamycines [107]
combinées à l'alimentation en précurseurs Balhimycine [108]
Novobiocine et chlorobiocine [109]
Geldanamycine [110]
Altération des précurseurs par des 36-méthyl-FK506 [111]
approches de biologie synthétique

uneVoir également le tableau S2 dans le matériel supplémentaire en ligne.

22
La revue Tendances en biotechnologieJanvier 2015, Vol. 33, n° 1

la production de glycopeptides par environ trois fois Remarques finales et perspectives d'avenir
[44]. Récemment, une approche combinée de mutagenèse aléatoire La période actuelle est susceptible de représenter le début d'une
classique et d'ingénierie métabolique a permis d'améliorer la nouvelle renaissance pour le domaine de la découverte d'antibiotiques
production de FK506 à partir deStreptomycessp. RM7011 et d'autres produits naturels. Les raisons d'être optimiste incluent : un
[45]. énorme pool de SMBGC provenant de microbes cultivables et non
Le génie génétique a également permis la construction d'analogues cultivables pour lesquels les molécules associées n'ont pas encore été
non naturels de molécules spécifiques. Ces études portent toutes sur la détectées ; la possibilité de capturer et d'assembler ces clusters
manipulation des grappes de gènes qui codent la machinerie beaucoup plus facilement que par le passé ; les progrès continus de
enzymatique pour la biosynthèse des métabolites secondaires. Deux l'ingénierie métabolique des souches hôtes pour faciliter l'expression
classes très importantes de métabolites secondaires à activité des clusters, l'optimisation des flux métaboliques et la détection des
antibiotique sont les polycétides et les peptides non synthétisés par les molécules ; et une meilleure compréhension des mécanismes
ribosomes. La plupart des polycétides complexes (par exemple, chimiques et biologiques de la biosynthèse des métabolites
l'érythromycine) et des peptides non synthétisés par les ribosomes (par secondaires. La disponibilité de toutes ces connaissances peut
exemple, la vancomycine) sont assemblés par de grandes protéines désormais être utilisée pour concevoir de manière rationnelle des
multifonctionnelles. Ces enzymes PKS et NRPS ressemblent aux lignes usines cellulaires pour la production d'antibiotiques et d'autres
d'assemblage moléculaires (Boîte 1) qui synthétisent une molécule composés naturels. Nous prévoyons que l'avenir apportera des
précurseur par incorporation successive d'unités d'extension de découvertes encore plus passionnantes qui faciliteront grandement
polykétide ou d'acides aminés, respectivement. Les deux classes l'ingénierie des souches d'actinomycètes et l'expression hétérologue,
d'enzymes ont une organisation hautement modularisée; chaque combinatoire et modulaire de gènes naturels et synthétiques. Par
module contient plusieurs domaines fonctionnels qui catalysent les exemple, la cartographie à l'échelle du génome de toutes les unités de
réactions nécessaires à la biosynthèse du squelette de la molécule transcription et des sites de début de transcription a maintenant été
centrale (Boîte 1). réalisée pour différents micro-organismes[54,55], et l'acquisition
La modularité et la logique de chaîne de montage des PKS et d'ensembles de données similaires pour des souches d'actinomycètes
des NRPS font de la manipulation de ces méga-enzymes une sélectionnées permettra une ingénierie plus précise du génome. En
stratégie attrayante pour créer des analogues. Des gènes entiers, outre, de nouvelles connaissances impressionnantes sur la biochimie et
des modules, des domaines ou seulement leurs spécificités l'architecture des enzymes clés de la biosynthèse des antibiotiques (par
peuvent être « mélangés et appariés » pour générer des dérivés ou exemple, les PKS complexes[56,57]et NRPS[58]), et la nouvelle
des composés complètement nouveaux. Il existe de nombreux bioinformatique[59]et les approches de biologie synthétique[60,61],
exemples réussis de telles stratégies « mix-and-match » ou « plug- permettra une ingénierie plus précise et dirigée des puissantes chaînes
and-play » (figure 3;Tableau 3; Tableau S2 dans le matériel de montage. Les prochaines années promettent d'être une période
complémentaire en ligne)[46]. Un exemple spécifique est passionnante pour l'ingénierie métabolique des actinomycètes et la
l'incorporation de nouveaux blocs de construction dans l'épine découverte de nouveaux composés antibiotiques.
dorsale en croissance. Les domaines d'acyltransférase (AT) et
d'adénylation (A) agissent comme des « gardiens » qui déterminent
quels précurseurs sont incorporés dans la molécule au cours de la
Remerciements
biosynthèse. Les tentatives d'ingénierie de ces domaines pour Le travail des auteurs est financé par une subvention de la Fondation Novo
modifier leurs spécificités de substrat ont abouti à l'isolement de Nordisk. HUK et SYL sont également soutenus par le programme de
nouveaux dérivés. Réussiin vivoDes substitutions de domaines AT développement technologique pour résoudre les changements climatiques sur
et A et la production de dérivés ont été décrites pour l'ingénierie métabolique des systèmes pour les bioraffineries du ministère des
Sciences, des TIC et de la planification future (MSIP) par l'intermédiaire de la
l'érythromycine[47]et CDA[48], respectivement. Un exemple très
National Research Foundation (NRF) de Corée (NRF-2012M1A2A2026556) .
récent et intéressant est la reprogrammation réussie d'une
auréothine PKS modulaire (type I) en une synthase produisant de
la lutéoréticuline, un composé initialement isolé d'une souche Annexe A. Données supplémentaires
Des données supplémentaires associées à cet article sont disponibles, dans la version en
différente.[49].
ligne, à l'adressehttp://dx.doi.org/10.1016/j.tibtech.2014.10.009.
Au-delà de la diversification des produits naturels par modification
des enzymes de l'assemblage central, la personnalisation des enzymes
peut également être manipulée pour construire de nouveaux dérivés Les références
1Bérdy, J. (2012) Réflexions et faits sur les antibiotiques : où en sommes-nous ?
de molécules spécifiques (figure 3;Tableau 3; Tableau S2 dans le
maintenant et où nous allons.J. Antibiot. (Tokyo)65, 385–395 2Bachmann, BO
matériel complémentaire en ligne). Les enzymes de personnalisation et coll. (2014) Extraction du génome microbien pour accélérer
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