LA UNIVERSIDAD DEL ZULIA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS DEPARTAMENTO DE PRODUCCIN E INDUSTRIA ANIMAL CTEDRA DE CIENCIAS Y TECNOLOGA DE LA LECHE

DETERMINACIN DE G LCIDOS Y P ROTENAS

GUA PRCTICA

M ARACAIBO, NOVIEMBRE 2003

OBJETIVOS ESPECFICOS

1. Aplicar las tcnicas de anlisis para la determinacin de glcidos y protenas en leche y derivados lcteos. 2. Establecer conclusiones acerca de los resultados del anlisis fsico qumico de la leche. 3. Reconocer diferentes causas en que una muestra de leche puede presentar valores alterados de glcidos y protenas.

PARTE I. D ETERMINACIN DE G LCIDOS

Los glcidos de la leche estn representados casi exclusivamente por lactosa, diholsido reductor 4-(beta-D-galacto-piranosil)-D-glucopiranosa, cuya concentracin es de 4,8 % en promedio. Estudios cromatogrficos han establecidos la presencia de trazas de otros glcidos como son la glucosa (7,5 mg/100 mL) y la galactosa (2 mg/100 mL) (JenNess-Patton,1959; Webb et al 1974). Algunos productos lcteos son adicionados de cantidades considerables de sacarosa (leche condensada) o de algunos ingredientes ricos en diversos glcidos (helados). Las normas COVENIN no establecen lmites legales para la concentracin de glcidos en leche, y la determinacin de este componente no es una prueba de rutina en los laboratorios de control de calidad de las industrias lcteas. Sin embargo, su anlisis cobra importancia en trabajos de investigacin sobre caracterizacin de la leche de determinada especie o raza, o en determinadas situaciones donde se sospecha de adulteraciones complejas de la leche, difciles de determinar con los anlisis rutinarios. Valores anormales de lactosa por lo general se asocia a problemas patolgicos del animal o adulteracin por adicin de agua. La determinacin de glcidos en la leche puede hacerse por numerosos mtodos, a continuacin se sealan los ms importantes.

Mtodos Polarimtricos: estn fundamentados en la propiedad que tienen los glcidos en solucin, de rotar el plano de vibracin de la luz polarizada, en virtud de ser sustancias pticamente activas, siendo la magnitud de esa rotacin proporcional a su concentracin bajo condiciones especiales. La lactosa en la leche puede determinarse por ese mtodo, previa precipitacin de las protenas y la materia grasa (AOAC, 1975; MIF, 1964).

Mtodos Qumicos: Se basan en las propiedades reductoras de los glcidos, debidas a la presencia de funciones aldehdicas o cetnicas libres. Aplicable en el mtodo de Munson-Walker que se estudiar en detalle durante la ejecucin de la actividad prctica.

Mtodos Colorimtricos: fundamentados en la transformacin del glcido contenido en la leche en un compuesto coloreado soluble por reaccin con ciertos reactivos especiales, y en la comparacin visual o fotomtrica del color que la muestra adquiere con el color de soluciones patrones del glcido, a concentracin conocida, tratada en idnticas condiciones. Dentro de este grupo se incluye el mtodo del cido pcrico que se puede aplicar tambin a la determinacin simultnea de lactosa y sacarosa (Perry Doan, 1950, MIF, 1964).

Mtodos Espectro-fotomtricos en el Infrarrojo: Se basan en la medicin de la absorbancia producida por los grupos-OH en la zona infrarroja del espectro. Encuentra aplicacin en el IRMA (Grubb Parsons, Inglaterra) y el analizador de la Technicon (USA.).

Mtodos Cromatogrficos: an cuando estos mtodos no son convenientes para exmenes de rutinas, constituyen valiosos medios para trabajos de investigacin en virtud de su gran sensibilidad y especificidad.

GLCIDOS REDUCTORES . M TODO DE M UNSON Y WALKER El mtodo de Munson y Walker (AOAC, 1975) est basado en la precipitacin de sulfato cprico (CuSO4 ) a partir de una solucin cupro-alcalina, por la accin reductora de los glcidos presentes en la muestra sobre la sal cprica, en presencia de calor, por tiempo determinado y bajo otras condiciones especiales.

La muestra a analizar (25g de leche, helados, etc.) se diluye con agua (hasta 500 mL) y se trata con solucin de CuSO4
y

NaOH para precipitar las protenas y las grasas.

Esta solucin se filtra y un volumen medido del filtrado (50 mL) se trata en caliente con reactivo de Fehling por un tiempo estipulado. El precipitado de Cu2 O formado se filtra al vaco a travs de un crisol con capa filtrante de asbesto, previamente tarado, se lava con agua caliente, alcohol y ter para eliminar las impurezas y finalmente se deseca a 100C, se enfra y se pesa. A partir del peso de Cu2 0 precipitado, calculado por diferencia, se puede determinar la cantidad equivalente de glcidos reductor presente en la muestra analizada (2,5 g) expresada en trminos de un glcido en particular (lactosa, glucosa, etc.). Las tablas de Munson y Walker (AOAC, 1975) facilitan esta conversin.

Materiales y Aparatos: Kitasato de 250 mL; Soporte de goma para crisoles; Estufa de desecacin; Balanza analtica; Crisoles de Gooch.

Reactivos: Solucin de CuSO4 ; Solucin alcalina de Tartrato; Solucin de NaOH 0,5 N; Etanol; ter.

Muestra: Leche cruda, leche pasterizada, helados

Procedimiento: 1. Pesar 25 g de la muestra preparada (homognea) y diluir con 400 mL de agua. Transferir a un baln volumtrico de 500 mL. 2. Adicionar 10 mL de la solucin de CuS04 y 8,8 mL de Na0H 0,5 N. Mezclar. La solucin debe presentarse an cida y contener un exceso de sal cprica en solucin. Diluir con agua hasta la marca. Filtrar a travs de papel filtro. 3. En un vaso de precipitado de 250 mL preparar 50 mL de reactivo de Fehling (modificacin de Soxhlet), mezclando 25 mL de solucin de CuS04 y 25 mL de solucin alcalina de tartrato.

4. Con pipeta volumtrica transferir 50 mL del filtrado obtenido en (2) al vaso precipitado conteniendo la solucin cupro alcalina. Cubrir el vaso con un vidrio de reloj. 5. Calentar la mezcla al mechero regulando la llama de tal manera que empiece a hervir a los 4 minutos y luego calentar por exactamente 2 minutos despus de haberse iniciado la ebullicin. 6. Filtrar al vaco la solucin, en caliente, a travs de un crisol de Gooch con capa filtrante de asbesto, adaptado con un soporte de goma a un kitasato. 7. Lavar el precipitado con agua caliente, luego con 10 mL de etanol y finalmente con 10 mL de ter. 8. Desecar el Cu2 O precipitado, en la estufa a 100C durante 30 minutos, enfriar en un desecador y pesar hasta peso constante. 9. El peso del Cu2 O equivalente a los glcidos reductores obtenidos en 2,5 g de la muestra original, puede convertirse en trminos de lactosa utilizando las tablas de la AOAC, 1975. 10. Expresar el resultado en gramos por cientos de lactosa, sin olvidar que en el caso de los helados existen cantidades considerables de otros glcidos reductores aportados por las frutas.

PARTE II. D ETERMINACIN D E PROTENAS

El contenido promedio de protenas totales en la leche es de 3,4%. En esta fraccin se incluyen las casenas, las cuales por si solas representan un 80% del contenido proteico total (2,7 %), el resto est integrado por las protenas sricas, que incluyen la lactoglobulina (0,3%), la -lactoalbmina (0,15%), una albmina similar a la seralbmina de la sangre, inmunoglobulinas y una fraccin de protenas menores, entre las cuales se incluyen la lactotransferrina, la lactolina y la protena de la membrana del glbulo graso. Algunas de estas fracciones proteicas son heterogneas, estando constituidas por varias protenas muy relacionadas entre s, pero que son separables mediante el uso de tcnicas fsicas como la ultracentrifugacin qumicas como el fraccionamiento con solventes y mas recientemente con tcnicas mas especficas como la electroforesis, mediante la cual ha sido posible identificar muchas fracciones dentro del grupo de las casenas, como lo son la s1 casena, la -casena y la -casena (Alas, 1984). Para la determinacin cuantitativa de protenas pueden emplearse diversos mtodos, los mismos pueden clasificarse en los siguientes grupos;

Mtodos Qumicos: fundamentados en las tcnicas qumicas convencionales, entre las cuales se incluyen la determinacin del nitrgeno total y los mtodos gravimtricos y volumtricos tradicionales.

Mtodos Fotomtricos: estn fundamentados en la medicin del color de soluciones, o de la absorbancia en determinadas regiones del espectro de absorcin, aqu se incluyen las tcnicas colorimtricas, la s de medicin en el ultravioleta o en el infrarrojo, las de fijacin de colorantes y algunas tcnicas turbidimtricas.

Mtodos Refractomtricos: estn basadas en el incremento en el ndice de refraccin de aproximadamente 0,001 por cada gramo de protena en 100 mL de leche, de este modo utilizando un refractmetro de inmersin o uno tipo Abbe, es posible determinar la concentracin proteica.

Electroforesis: las protenas pueden separarse por sus diferentes velocidades de migracin bajo la influencia de un campo elctrico, esto se debe al hecho de que

las protenas presentan cargas elctricas diferentes dependiendo de la composicin aminoacdica de las mismas.

A nivel de plantas receptoras de leche se utilizan comnmente las tcnicas para determinacin de protenas basados en los mtodos de fijacin de colorantes, como lo es el equipo Pro-Milk MK II, (Foss Electric), e incluso en laboratorios grandes puede encontrarse equipos como el Milko Scan, el cual est basado en la espectrofotometra con rayos infrarrojos, el cual es capaz de captar la absorbancia del enlace peptdico de las protenas, sin embargo, estos mtodos rpidos, requieren de una cuantiosa inversin inicial y adems deben ser sujetos a un proceso de calibracin que requiere de los mtodos qumicos convencionales, por lo cual son dependientes de estos. Tomando en cuenta que los mtodos qumicos son los mas precisos que se conocen y que los mismos son requeridos en cualquier laboratorio lcteo, independientemente del equipamiento que este posea, la determinacin de protenas en la leche se efectuar utilizando un mtodo qumico basado en la medicin del nitrgeno total, en este caso se aplicara la versin micro de la prueba de Kjeldahl, dado que la misma requiere menor cantidad de reactivos, de la misma forma se utilizar otro mtodo qumico basado en la titulacin de Sorensen para la estimacin directa de la concentracin de casenas en leche, la cual consigue especial utilidad para prever el rendimiento quesero a nivel de fincas o plantas procesadoras.

DETERMINACIN DE PROTENAS EN LECHE. M TODO DE KJELDAHL. En ambas versiones de este mtodo, la materia orgnica es digerida con cido sulfrico y el nitrgeno obtenido en forma de una sal estable (sulfato de amonio) es valorada, previa destilacin en medio alcalino para descomponer la sal y convertirla en amonaco, contra una solucin cida valorada (HCl). Determinacin de nitrgeno total: existen varios mtodos fundamentados en el hecho de que las protenas contienen, aproximadamente un 16% de nitrgeno, por lo tanto, si se determina el porcentaje total del mismo, puede establecerse segn un factor de conversin apropiado (100/16 = 6,25), el porcentaje de protenas totales presentes en la muestra, en el caso especfico de la leche, este factor de conversin es de 6,38, debido a que

las protenas de la leche presentan una menor relacin entre protenas y nitrgeno total (100/15,65). Es importante resaltar el hecho de que los resultados obtenidos por estos mtodos son ligeramente elevados, ya que, no todo el nitrgeno contenido en las muestras forman parte de mo lculas proteicas, existiendo entonces otras no proteicas cuyo nitrgeno afecta los resultados (rea, creatina, creatinina, adenina, guanina, cido rico, etc.), no obstante, la determinacin qumica de nitrgeno constituye el fundamento mas empleado, por su precisin, para la determinacin de protenas, entre ellos encontramos los mtodos de Kjeldahl (macro y micro), Nessler y el mtodo gasomtrico de Dumas.

M TODO M ICRO KJELDAHL La materia orgnica es digerida por la accin del H2 SO4 concentrado, convirtindose en CO2 y H2 O; adems reduce el nitrgeno a amonio, el cual pasa a ser fijado por el cido como sulfato de amonio, una sal de gran estabilidad. La reduccin del material nitrogenado hasta amonio, se debe a que parte del H SO4 es simultneamente 2 reducido a SO2 , que se comporta como un fuerte reductor. La digestin de la muestra es la parte mas difcil de la determinacin, esta se acelera mediante la adicin de catalizadores como el mercurio metlico, el xido rojo de mercurio (HgO), el sulfato cprico (CuSO4 ), el selenio, el permanganato de potasio (KmO 4 ) o una mezcla de estos. El sulfato de sodio o de potasio se adicionan a la mezcla con la finalidad de aumentar el punto de ebullicin y disminuir entonces el tiempo de digestin. Cuando la totalidad de la materia orgnica ha sido digerida, se libera el amonaco por descomposicin del sulfato de amonio con un lcali fuerte (NaOH) y luego se separa por destilacin y recoleccin en un volumen de cido brico, como borato de amonio. El amonio se determina por titulacin con solucin valorada de HCl 0,02 N en presencia de un indicador mixto compuesto por una mezcla de rojo de metilo y azul de metileno, el cual en medio cido se presenta de color morado y en medio alcalino de color verde.

Resumen de las reacciones qumicas en el mtodo Micro-Kjeldahl

Digestin

1) Materia Orgnica + H2 SO4

CO2 + H2 O + SO2 + (NH4 ) 2 SO4

2) (NH4 ) 2 SO4 + NaOH

Destilacin

Na2 SO4 + 2NH3 + 2 H2 O

3) NH3 + H3 BO3

Recoleccin

NH4 H2 BO3

4) NH4 H2 BO3 + HCl

Titulacin

NH4 Cl + H3 BO3

Se acostumbra a hacer determinaciones en blanco para corregir cualquier impureza en los reactivos. El contenido proteico de la muestra se calcula aplicando la siguiente frmula:

%N =

V N Pe 10 a

Luego de calculado el porcentaje de nitrgeno, es necesario calcular el porcentaje de protenas basndose en este valor y utilizando entonces la siguiente ecuacin;
%P = %N 6, 38

Donde: V = mL de HCl gastados en la titulacin. N = normalidad de la solucin de HCl (0,02 N). E = equivalente del nitrgeno (14). a = gramos de muestra. P = protena total.

Materiales y Aparatos Balones Micro Kjeldahl de 30 mL; Digestor elctrico micro; Microdestilador al vapor por calentamiento elctrico con restato; Microbureta automtica; Perlas de vidrio; Vaselina; Balanza analtica; Equipo individual.

Reactivos H2 SO4 libre de nitrgeno HgO libre de nitrgeno Na2 SO4 pulverizado Solucin de NaOH-Na2 S2 O3 (60 g NaOH + 5 g Na2 S2 O3 * 5H O /100ml) Solucin dev cido brico al 4%. Solucin indicadora (2 partes de rojo de metilo al 0,2% + 1 parte de azul de metileno al 0,2%, ambas en solucin alcohlica). HCl 0,02 N.

Procedimiento 1. Medir con pipeta 0,5 mL de la muestra bien homogeneizada, Transferir a un baln de Kjeldahl para microanlisis (30 mL). Agregar 1,9 g de K2 SO4 , 40 mg de HgO y 2,5 mL de H2 SO4. La tcnica de la A.O.A.C. recomienda no pesar mas de 100 mg de materia orgnica seca y el empleo de 2 mL de H2 SO4 para 15 mg de muestra, si la misma pesa mas de 15 mg, se debe agregar 0,1 mL de H2 SO4 por cada exceso de 10 mg de muestra. Adicionar adems, algunas perlas de vidrio. 2. Calentar la mezcla en el agitador hasta que el digerido adquiera un aspecto claro y limpio. Enfriar a temperatura ambiente. 3. Disolver el contenido del baln en una pequea cantidad de agua destilada. Colocar una fina pelcula de vaselina alrededor del borde del baln. 4. Para efectuar la destilacin, colocar un vaso de precipitado o erlenmeyer de 100 mL de capacidad, conteniendo 5 mL de solucin de cido brico al 4% y 2-4 gotas del indicador en el aparato, debajo del refrigerante de modo que la punta de este quede sumergida en el lquido. Seguidamente, transferir el digerido, ya

diluido, con agua destilada, a la cmara interna de destilacin, haciendo 5 o 6 lavados sucesivos con porciones de 1-2 mL de agua destilada. A continuacin adicionar 8-10 mL de la solucin de NaOH-Na2 S2 O3 , lavar ligeramente el embudo con agua destilada y cerrar las llaves de vidrio del aparato. Finalmente, encender el generador de vapor y destilar hasta recoger unos 15 mL. 5. Retirar el destilado y diluirlo con agua destilada hasta 50 mL. Titular directamente con HCl 0,02 N, colocado en una microbureta automtica. 6. Calcular el porcentaje de nitrgeno y de protenas totales en la muestra de leche aplicando la frmula correspondiente y empleando el factor 6,38.

DETERMINACIN DE CASENA EN LECHE. M TODO VOLUMTRICO DE TITULACIN CON FORMOL DE WALKER Este mtodo se fundamenta en la titulacin de Sorensen, en la cual los grupos amino de los aminocidos constituyentes de las protenas (-NH2 ), son bloqueados con formaldehdo neutralizado, para luego titular los grupos carboxilo (-COOH) con una solucin de lcalis valorada. Las reacciones involucradas son las siguientes:

H R C COO- + 2 H C = O

H R C COO- + H2 O HOH2 C N CH2 OH

NH3

Al aplicar este mtodo a la leche, 9 mL de la muestra se neutralizan con NaOH 0,1 N hasta el punto de viraje del indicador fenolftalena y luego de le adiciona formaldehdo neutralizado. La acidez que se desarrolla por el bloqueo de los grupos bsicos, hace virar de nuevo la fenolftalena a incolora. Seguidamente se re-titula nuevamente con NaOH hasta la reaparicin del color rosa permanente. El porcentaje de casena de la muestra est dado por el producto de multiplicar el nmero de mL de NaOH 0,1 N gastados en la segunda

titulacin (9 mL de muestra) por el factor 1,63, el cual es emprico y depende del cociente casena/protenas sricas y de la tcnica empleada. Este mtodo se utiliza para estandarizar la leche que va a procesarse para la obtencin de quesos, permitiendo estimar el rendimiento y por lo tanto la masa de queso a procesar.

Reactivos: NaOH 0,1N. Fenolftalena al 1% en etanol. Solucin de formaldehdo al 40% neutralizada con NaOH hasta el punto de viraje de la fenolftalena.

Procedimiento: 1. Transferir 9 mL de la muestra preparada a un vaso de precipitado. Adicionar 1 mL de solucin alcohlica de fenolftalena al 1%. 2. Colocar la solucin de NaOH 0,1 N en una bureta de 50 mL y adicionarla a la muestra hasta que aparezca el primer color rosado permanente. 3. Agregar 2 mL de solucin de formaldehdo. 4. Enrasar la bureta a 50 mL o leer la posicin del menisco antes de continuar con la titulacin. 5. Titular la muestra de leche hasta que aparezca el primer color rosado nuevamente, en ese momento medir exactamente el nmero de mL de la solucin de NaOH 0,1N empleados en esta segunda titulacin. 6. Calcular el porcentaje de casena en la muestra multiplicando el nmero de mL de NaOH 0,1 N gastados en la segunda titulacin por el factor 1,63.