Réactif de dosage de la bilirubine directe

Méthode à l’acide diazoté

RÉSUMÉ DU PRODUIT Symboles sur l’étiquetage du produit
Représentant agréé Limite de température
Stabilité  : Jusqu’à la péremption entre 2 °C et 25 °C Pour usage diagnostique in vitro
Plage linéaire  : Jusqu’à 340 µmol/l (20 mg/dl) Date de péremption
Type d’échantillon  : Sérum Code/numéro du lot MISE EN GARDE. Consulter le
Méthode  : Point final Référence catalogue mode d’emploi.
Préparation du réactif  : Fourni prêt à l’emploi.
Consulter le mode d’emploi Fabricant

Corrosion Point d’exclamation

UTILISATION PRÉVUE
Ce réactif est destiné à la détermination quantitative in vitro de la bilirubine directe
dans le sérum humain.
IMPORTANCE CLINIQUE
Les érythrocytes sont dégradés dans le système réticulo-endothélial à la fin de
leur vie circulante, essentiellement dans la rate. Le noyau hème résultant, une fois
le fer retiré, est ensuite converti en bilirubine. Ce processus représente environ
80 % des 500 µmol (300 mg) de bilirubine formés chaque jour. Les autres sources
de bilirubine comprennent la dégradation de la myoglobine et des cytochromes et
le catabolisme des érythrocytes immatures dans la moelle osseuse.
Une fois formée, la bilirubine liée à l’albumine, insoluble dans l’eau, est transportée
dans le foie. Cette fraction de bilirubine est désignée par le terme de bilirubine
indirecte ou libre. Dans le foie, la bilirubine est conjuguée à l’acide glucoronique
(mono- et diglucuronides) par l’enzyme uridyl-diphosphate-glucuronyl-transférase
pour former de la bilirubine conjuguée. La bilirubine conjuguée ou directe est
excrétée par le système biliaire dans l’intestin où elle est métabolisée par des
bactéries en un groupe de produits désignés collectivement stercobilinogène.
L’élimination est quasiment complète et les concentrations plasmatiques sont
normalement négligeables.
La bilirubine totale est la somme des fractions conjuguée et libre. La bilirubine
totale est élevée dans les affections provoquant l’obstruction des voies biliaires,
l’hépatite, la cirrhose, les troubles hémolytiques et plusieurs carences enzymatiques
héréditaires.
La bilirubine indirecte est élevée en raison de causes pré-hépatiques, comme des
troubles hémolytiques ou des maladies hépatiques résultant en l’altération de
l’entrée, du transport ou de la conjugaison dans le foie.
La surveillance de la bilirubine chez le nouveau-né, en particulier s’il est prématuré,
est particulièrement importante. Comme la prise en charge hépatique de la bilirubine
est souvent immature dans ces cas, un ictère dû à une élévation de la bilirubine libre
est fréquent. La bilirubine libre, si elle n’est pas liée à l’albumine, peut traverser la
barrière sang-cerveau plus facilement et augmenter le risque de lésion cérébrale.1
MÉTHODOLOGIE
La plupart des méthodes utilisées actuellement pour doser la bilirubine sont basées
sur la réaction entre la bilirubine et les solutions d’acide sulfanilique diazoté. Dans
une solution aqueuse, seule la bilirubine directe (conjuguée) réagit de cette manière.
Ce réactif de dosage de la bilirubine directe utilise une méthode à l’acide diazoté.
La bilirubine conjuguée réagit avec l’acide sulfanilique diazoté pour produire une
azobilirubine acide, dont l’absorbance est proportionnelle à la concentration de
bilirubine directe dans l’échantillon et peut être mesurée à 550 nm. Pour les analyseurs
bichromatiques, la longueur d’onde de référence doit être réglée à 660 nm.
COMPOSITION DU RÉACTIF
Principes actifs Concentration
Réactif de dosage de la bilirubine directe :
Acide chlorhydrique 100 mmol/l
Acide sulfanilique 10 mmol/l
Réactif Nitrite de sodium :
Nitrite de sodium 144 mmol/l
Symbole de risque : Point d’exclamation et corrosion
Mention : danger
Phrases de risque
H314 Provoque des brûlures de la peau et des lésions oculaires graves
H317 Peut provoquer une allergie cutanée
H318 Provoque des lésions oculaires graves
Conseils de prudence – Prévention
Ne pas respirer les poussières/fumées/gaz/brouillards/vapeurs/aérosols
Se laver abondamment le visage, les mains et les zones cutanées exposées après
manipulation
Porter des gants de protection/des vêtements de protection/un équipement de
protection des yeux/du visage
Les vêtements de travail contaminés ne doivent pas sortir du lieu de travail
Conseils de prudence – Intervention
Appeler immédiatement un CENTRE ANTIPOISON ou un médecin.
Traitement spécifique (voir les instructions supplémentaires de premiers secours
sur cette étiquette)
Réactif de dosage de la Réactif Nitrite de sodium
bilirubine directe
Yeux
EN CAS DE CONTACT AVEC LES YEUX : rincer avec précaution à l’eau pendant plusieurs
minutes. Enlever les lentilles de contact si la victime en porte et si elles peuvent être
facilement enlevées. Continuer à rincer
Appeler immédiatement un CENTRE ANTIPOISON ou un médecin.
Peau
EN CAS DE CONTACT AVEC LA PEAU (ou les cheveux) : enlever immédiatement tous
les vêtements contaminés. Rincer la peau à l’eau/se doucher
Laver les vêtements contaminés avant réutilisation
En cas d’irritation ou d’éruption cutanée : consulter un médecin
Inhalation
EN CAS D’INHALATION : transporter la victime à l’extérieur et la maintenir au repos dans
une position où elle peut confortablement respirer
Appeler immédiatement un CENTRE ANTIPOISON ou un médecin.
Ingestion
EN CAS D’INGESTION : rincer la bouche. NE PAS faire vomir
Conseils de prudence – Stockage
Garder sous clef
Conseils de prudence – Élimination
Éliminer le contenu/récipient dans une usine approuvée de traitement des déchets
Dangers non classés par ailleurs
Non applicable
Toxicité inconnue
0 % de la préparation contient un ou plusieurs ingrédients dont la toxicité n’est pas connue
Autres informations
Le contact répété ou prolongé avec la peau peut produire des réactions allergiques
chez des personnes sensibles
Interactions avec d’autres produits chimiques
Aucune information disponible.
Pour un complément d’information, se reporter à la Fiche de données de sécurité du produit.
PRÉPARATION DU RÉACTIF
Réactif de test :
Ajouter le réactif Nitrite de sodium au réactif de dosage de la bilirubine directe dans un
rapport de 1:100. Par exemple, ajouter 0,1 ml de nitrite de sodium (ceci correspond à
environ 3 gouttes mais il est recommandé à l’opérateur de vérifier ce point) à 10 ml de
réactif de dosage de la bilirubine directe.
Blanc réactif :
Utiliser le réactif de dosage de la bilirubine directe tel qu’il est fourni.
STABILITÉ ET CONSERVATION
Le réactif conservé entre 2 °C et 25 °C est stable jusqu’à la date de péremption indiquée
sur le flacon et sur l’étiquette de la boîte du coffret.
Réactif fonctionnel :
Le réactif fonctionnel conservé entre 2 °C et 8 °C est stable pendant au moins 21 jours.
Indications de détérioration du réactif :
• Turbidité
• Absorbance du réactif > 0,1 UA à 550 nm et/ou
• Impossibilité d’obtenir des valeurs de contrôle dans la plage attribuée.
PRÉLÈVEMENT ET PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS
Sérum : utiliser du sérum non hémolysé.
Conservation : les échantillons doivent être protégés de la lumière vive car la bilirubine
est photolabile. Les échantillons peuvent être conservés réfrigérés pendant 3 jours.2
ÉQUIPEMENT SUPPLÉMENTAIRE REQUIS MAIS NON FOURNI
• Au besoin, pipettes pour distribuer avec exactitude les volumes mesurés.
• Analyseur de chimie clinique capable de maintenir une température constante
(30 °C/37 °C) et de mesurer l’absorbance à 550 nm.
• Consommables spécifiques de l’analyseur, p. ex. godets à réaction.
• Matériel de contrôle normal et anormal.
• Étalon ou standard adapté de dosage de la bilirubine directe en solution aqueuse.
PROCÉDURE DE DOSAGE
Il est recommandé de réaliser un blanc échantillon pour chaque échantillon. Le blanc
échantillon peut être obtenu simplement en utilisant le réactif de dosage de la bilirubine
directe fourni sans ajouter de nitrite de sodium.
Les paramètres d’analyseur suivants sont recommandés. Des applications d’instruments
individuels sont disponibles sur demande auprès du groupe de support technique.
 Paramètres de l’analyseur • Si les résultats sont toujours hors limites, ré-étalonner avec un étalon frais, puis
répéter le test.
Température 30 °C/37 °C • Si les résultats sont toujours hors limites, réaliser un étalonnage avec du réactif
Longueur d’onde primaire 550 nm frais, puis répéter le test.
Longueur d’onde secondaire 660 nm • Si les résultats sont toujours hors limites, contacter les services techniques ou le
Type de dosage Point final distributeur local.
Sens Augmentation
Rapport échantillon : LIMITES
Rapport échantillon : réactif 1:20 1. Des études visant à déterminer le niveau d’interférence de l’hémoglobine et de
p. ex. Vol. échantillon 10 µl l’hyperlipidémie ont été menées. Les résultats suivants ont été obtenus.
Vol. réactif 200 µl Hémoglobine : éviter d’utiliser des échantillons hémolysés.
Durée d’incubation 300 secondes Hyperlipidémie : aucune interférence de l’hyperlipidémie, mesurée sous forme de
Limites du blanc réactif Basse 0,0 UA triglycérides, observée jusqu’à 8,8 mmol/l (780 mg/dl).
(550 nm, trajectoire lumineuse 1 cm) Haute 0,1 UA 2. Young DS3 a publié une liste exhaustive de médicaments et de substances
Linéarité 340 µmol/l (20 mg/dl) susceptibles d’interférer avec ce dosage.
Sensibilité 2,5 DmAbs par µmol/l
(550 nm, trajectoire lumineuse 1 cm) (43 DmAbs par mg/dl) VALEURS ATTENDUES2
Adultes et enfants (âgés de > 1 mois) : 0 à 3 µmol/l (> 0,2 mg/dl)
CALCULS
Les résultats sont calculés, en général automatiquement par l’instrument, de la Les valeurs indiquées sont représentatives de la plage attendue avec cette méthode et
manière suivante : sont uniquement destinées à servir de guide. Il est recommandé que chaque laboratoire
vérifie cette plage ou détermine une plage de référence pour la population dont il a la
charge.4
Bilirubine Absorbance de l’inconnu
= ————————————— x Valeur de l’étalon
directe
Absorbance de l’étalon DONNÉES DE PERFORMANCE
Les données suivantes ont été obtenues en utilisant le réactif de dosage de la bilirubine
Exemple : directe sur un analyseur de chimie clinique automatique bien entretenu. Les utilisateurs
Absorbance de l’étalon (test) = 0,038 doivent établir les performances du produit sur leur analyseur spécifique utilisé.
Absorbance de l’étalon (blanc) = 0,003
IMPRÉCISION
Absorbance de l’inconnu (test) = 0,029 L’imprécision a été évaluée en utilisant deux niveaux de contrôle disponibles dans le
Absorbance de l’inconnu (blanc) = 0,01 commerce et en suivant la procédure NCCLS EP5-T.5
Valeur de l’étalon = 15 µmol/l (0,88 mg/dl)
Intra-série : NIVEAU I NIVEAU II
Absorbance de l’étalon = 0,038 - 0,003 = 0,035 Nombre de points de données 80 80
Absorbance de l’inconnu = 0,029 - 0,01 = 0,019 Moyenne (µmol/l / mg/dl) 20,5 / 1,2 35,9 / 2,1
ET (µmol/l / mg/dl) 1,9 / 0,11 1,9 / 0,11
CV (%) < 1 2,9
Bilirubine 0,019
= ———— x 15 = 8,1 µmol/l Total : NIVEAU I NIVEAU II
directe
0,035 Nombre de points de données 80 80
Moyenne (µmol/l / mg/dl) 20,5 / 1,2 35,9 / 2,1
Bilirubine 0,019
= ———— x 0,88 = 0,48 mg/dl ET (µmol/l / mg/dl) 1,9 / 0,11 1,9 / 0,11
directe
0,035 CV (%) 8,7 5,2

REMARQUES
1. Les échantillons avec des valeurs supérieures à 340 µmol/l (20 mg/dl) doivent
être dilués et dosés de nouveau. Multiplier les résultats obtenus par le facteur
de dilution.
2. Conversion d’unité :µmol/l x 0,0585 = mg/dl.
EXACTITUDE
Des études de comparaison ont été menées en utilisant comme référence un réactif de
dosage de la bilirubine directe similaire disponible dans le commerce. Des échantillons
de sérum ont été dosés en parallèle et les résultats ont été comparés par régression des
moindres carrés. Les statistiques suivantes ont été obtenues :

ÉTALONNAGE Nombre de paires d’échantillons 51

Un étalonnage est requis. Il est recommandé d’utiliser un standard adapté en solution
aqueuse ou un étalon à base de sérum.
Pour la fréquence de l’étalonnage sur les instruments automatiques, se reporter aux
spécifications des fabricants de l’instrument. Toutefois, la stabilité des étalonnages
est tributaire des performances optimales de l’instrument et de l’utilisation de
réactifs qui ont été conservés comme recommandé dans la section Stabilité et
conservation de cette notice. Un ré-étalonnage est recommandé à chaque fois que
l’un des événements suivants survient :
• Le numéro de lot de réactif change.
• Une intervention de maintenance préventive est réalisée ou un composant
critique est remplacé.
• Les valeurs du contrôle se sont décalées ou sont hors limites et un nouveau
flacon de contrôle ne corrige pas le problème.
CONTRÔLE QUALITÉ
Pour assurer un contrôle qualité adéquat, des contrôles normaux et anormaux
disposant de valeurs dosées doivent être exécutés comme des échantillons inconnus :
• Au moins toutes les huit heures.
• Quand un nouveau flacon de réactif est utilisé.
• Après une intervention de maintenance préventive ou le remplacement d’un
composant critique.
Des résultats de contrôle hors des limites supérieure ou inférieure des plages établies
indiquent que le dosage est peut-être hors limites.
Dans de telles situations, les actions correctrices suivantes sont recommandées :
• Répéter les mêmes contrôles.
• Si les résultats du contrôle répété sont hors limites, préparer du sérum de
contrôle frais et répéter le test.
Plage des résultats des échantillons 5 à 488 µmol/l (0,3 à 28,6 mg/dl)
Moyenne des résultats de la
méthode de référence 107 µmol/l (6,3 mg/dl)
Moyenne des résultats Bilirubine directe 111 µmol/l (6,5 mg/dl)
Pente 0,96
Ordonnée à l’origine 8,5 µmol/l (0,5 mg/dl)
Coefficient de corrélation 0,99
LINÉARITÉ
Lorsqu’il est exécuté comme recommandé, le dosage est linéaire jusqu’à 340  µmol/l
(20 mg/dl).
SENSIBILITÉ
Lorsque ce dosage est exécuté comme recommandé, sa sensibilité est de 2,5 DmAbs
par µmol/l ou 43 DmAbs par mg/dl (trajectoire lumineuse 1 cm, 550 nm).
RÉFÉRENCES
1. Zilva JF, Pannall PR. “Liver Disease and Gall Stones” in Clinical Chemistry in
Diagnosis and Treatment”. Lloyd-Luke 1979; Chap XIII; 286-8.
2. Tietz Textbook of Clinical Chemistry, deuxième édition. Burtis CS and Ashwood ER
(Eds), WB Saunders Company, 1994.
3. Young DS. Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests, Troisième édition. AACC
Press, 1990.
4. Watchel M et al, Creation and Verification of Reference Intervals. Laboratory Medicine,
1995; 26: 593-7.
5. National Committee for Clinical Chemistry Standards. User evaluation of Precision
Performance of Clinical Laboratory Devices NCCLS; 1984, NCCLS Publication EP5-T.

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