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Etudes Post-Universitaires en « Hématologie »

Les inhibiteurs physiologiques


de la coagulation

Pr Ag SASSI Mouna;
Pr Ag JOUINI Hamida;
Pr TOUMI Nour El Houda

EPU Hématologie: 2020-2021


Pré-requis
Physiologie de la coagulation

Objectifs pédagogiques
1. Expliquer les mécanismes d’action des inhibiteurs physiologiques
de la coagulation
2. Connaître les conditions pré-analytiques et interférences
analytiques lors du dosage des inhibiteurs physiologiques
3. Décrire les techniques de dosage des inhibiteurs physiologiques
4. Typer le déficit en inhibiteurs physiologiques

2
3
ACTIVATEURS ACTIVATEURS

T H

Hémostase Iaire
Coagulation
Fibrinolyse

INHIBITEURS INHIBITEURS

4
5
ACTIVATEURS

ACTIVATEURS Fibrinolyse

H
Hémostase Ire T
Coagulation

INHIBITEURS

INHIBITEURS

Déficit antithrombine
Déficit PC, PS
Résistance PCa...
6
7
I- Les inhibiteurs de sérine-protéases

-La superfamille des inhibiteurs de sérine-protéases ou


serpines:
 Antithrombine (anciennement appelée ATIII)
+++
 Autres serpines
• le second facteur de l’héparine (HCII)
• l’1-antitrypsine
• C1-inhibiteur
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Plan

I- Les inhibiteurs des sérines protéases

II- Le système de la Protéine C/Protéine S

III-La protéine Z

IV-Inhibiteur de la voie du facteur tissulaire

V- Autres marqueurs des thromboses

VI- Recommandations
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1-L’antithrombine

a. Gène/Protéine

Gène :
- chromosome 1, 7 exons et s’étendant sur 13 480 pb.
Protéine :
- GP plasmatique monocaténaire , synthétisée par le foie
- MM 58 kDa
- Demi-vie plasmatique moyenne de 65 h.

10
1-L’antithrombine
b. Structure

 un site réactif dans sa partie C terminale qui se lie aux sérines

protéases (Boucle P1-P1’: « Arg 393- Ser 394 »)

 un site de liaison aux glycosaminoglycanes (héparane sulfates

des cellules endothéliales + héparines) dans sa région N terminale

AT Site de fixation aux


Site réactif
GAG
(Boucle P1-P1’)

11
1-L’antithrombine

c. Mécanisme d’action

 inactive essentiellement le FIIa (thrombine) et le FXa,


mais également d’autres sérines protéases (FIXa, FXIa et
FXIIa).

inhibe aussi la kallicréine, l’urokinase et la trypsine.

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 Fixation héparane sulfate-AT changement de
conformation de l’inhibiteur exposition de la boucle
réactive de l’AT (P1-P1’).

 Complexe AT-sérine protéase: liaison irréversible entre


le site réactif de l’inhibiteur et le site actif de l’enzyme
complexe stable équimoléculaire.

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Endothélium

Sérine AT
protéase

 Changement de la conformation

Héparane sulfate

AT
L’inhibition des sérines protéases par l’AT est catalysée
par l’héparine et les protéoglycanes de l’endothélium
vasculaire. Cette interaction accélère l’inhibition de la
thrombine d’un facteur d’environ 2 000.

 Le changement de conformation de l’AT par l’héparine


est dû à la liaison d’un motif particulier : le
pentasaccharide

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Mécanisme d’action des HNF
Mécanisme d’action

16
Mécanisme d’action des HBPM

17
Clivage du site réactif par l’Enzyme cible: Insertion de la boucle
à l’intérieur de l’AT (inhibition irréversible de l’enzyme)

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1-L’antithrombine

d. Déficit constitutionnel en AT
 Décrit pour la 1ère fois en 1965 par Egeberg (famille
scandinave ayant une MTEV)
Transmis selon le mode autosomique dominant
 Prévalence estimée dans la population générale
comprise entre 1/2000 et 1/5000.
 > 250 mutations
Le déficit le plus rare et le plus thrombogène
19
1-L’antithrombine

e. Types de déficits constitutionnels

 Déficit de type I: défaut de sécrétion de la protéine, le


plus fréquent (anomalie quantitative).

Déficit de type II: la protéine est sécrétée normalement,


mais présente une anomalie fonctionnelle (anomalie
qualitative).

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QUANTITE QUALITE
= <=> =
ANTIGENICITE ACTIVITE

MOLECULE NORMALE : les 2 sont proportionnelles

Antigénicité = Activité
diminuée diminuée

DEFICIT QUANTITATIF: Synthèse diminuée d’une protéine normale

Quantité généralement
normale Activité
diminuée

DEFICIT QUALITATIF: Synthèse normale d’une protéine anormale


21
Déficits de type II

odéficits de type IIRS (Reactive Site), l’anomalie porte sur


le site réactif.

odéficits de type IIHBS (Heparin Binding Site), le site


actif est normal, mais le site de liaison à l’héparine est modifié.

odéficits de type IIPE (à Effet Pléiotropique), la


capacité de liaison de l’AT à l’héparine et sa capacité d’inhibition des
protéases sont toutes deux affectées, ainsi qu’à un degré moindre la
sécrétion de la protéine.
22
1-L’antithrombine
f. Déficits acquis en AT

oDéfaut de synthèse : cirrhose du foie, insuffisance hépatique

oExcès de pertes : syndrome néphrotique, entéropathies avec


pertes de protéines.

oConsommation ou inactivation : états septiques, CIVD,


brûlures, cancer …

oIatrogène : ttt par L-asparaginase, héparine, les


oestroprogestatifs. HNF diminuent la concentration plasmatique
d’AT de 10 à 20 %.
23
1-L’antithrombine

g-Diagnostic biologique du déficit en AT

Test de 1ère intention: Activité cofacteur de l’héparine =


activité de l’AT en présence de l’héparine
Diminuée  le type de déficit

Tests de 2ème intention:


1) Dosage par méthode immunologique: Antigène
2) Activité de l’AT en absence de l’héparine : Activité
progressive
Typer le déficit
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Principe de dosage de l’activité AT cofacteur de l’héparine
(méthode chromogénique / STACHROM ® ATIII)

-Incubation du plasma en présence d’héparine et d’une quantité

fixe et en excès de thrombine .

-Mesure de la thrombine résiduelle par son activité

amidolytique sur le substrat chromogène.

-la quantité de thrombine neutralisée est proportionnelle à la

quantité d’AT présente dans le milieu.


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Antithrombine Type I Type II

RS HBS PE

Activité cofacteur à < 80 < 80 <80 70-90


l’héparine (%)
Antithrombine < 80 <80 80-120 70-90
progressive (%)
Antigène (%) < 80 80-120 80-120 70-90

26
1-L’antithrombine

-Le taux d’AT est plus bas chez les NN et l’enfant et atteint
le taux adulte à 6 mois.
-AT non hormono-dépendante.
-Diminution de 15% chez la femme enceinte à terme (par
activation de la coagulation).

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2- Autres inhibiteurs de sérine protéases

* Second cofacteur de l’héparine (HCII)


 Inhiber de la thrombine.

 Action potentialisée par un autre glycosaminoglycane : le


dermatane sulfate, présent dans les matrices
extracellulaires.
*α1-antitrypsine
*C1-inhibiteur
*α2-macroglobuline

*Inhibiteur de la C1-estrase
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II- Le système de la Protéine C/Protéine S

-Protéine C (PC)

Inhibiteur dimérique

-Protéine S (PS)

29
1-La Protéine C

a. Gène/Protéine

Gène :
- chromosome 2, 9 exons et s’étendant sur 11 600 pb.
Protéine :
-GP plasmatique, vitamine K-dépendante comportant 23 % de
carbohydrates
- synthétisée par le foie sous forme d’un polypeptide monocaténaire
puis secrétée sous forme de protéine mature bicaténaire
- MM 62 kDa

30 -Demi-vie plasmatique de 4h-6h.


1-La Protéine C

b. Mécanisme d’action

 Une Enzyme (sérine protéase) : Protéine C (PC)


 Un Cofacteur: Protéine S (PS)
 2 récepteurs membranaires:
Thrombomoduline (TM)
Endothelial Protein C Receptor (EPCR)
 PCa-PS: inhibition par protéolyse des FVa et FVIIIa

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La liaison de la thrombine à la TM supprime ses activités
pro-coagulantes et la transforme en activateur de la PC.
L’EPCR accélère l’activation de la PC par le complexe
thrombine/TM
La PC activée (PCa) dégrade les FVa et FVIIIa, en présence
de la PS , sur la surface des plaquettes activées.
Les FVi et FVIIIi n’ont plus d’activité co-facteur.

Vi VIIIi

(2a) (2b)
IIa PCa
(1) PCa
Va PS
VIIIa
TM PS
PC PCa
EPCR
Endothelium
FW
32 FW
Endothélium Endothélium Endothélium
PS VIIIa
Va
Vai VIIIai
PC PCa
II a PCa
PC

II a II a
TM TM
Endothélium Endothélium Endothélium

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1-La Protéine C

c. Déficit constitutionnel en PC

 Décrit pour la 1ère fois en 1963 par Griffin et al.


Transmis selon le mode autosomique dominant
 Prévalence estimée dans la population générale
comprise entre 1/16 000 et 1/36 000.
 > 330 anomalies chromosomiques
Terminologie : PC correspondait au 3ème pic après une
séparation éléctrophorétique de protéines.
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1-La Protéine C

d. Types de déficits constitutionnels

 Déficit de type I: défaut de sécrétion de la protéine , le


plus fréquent (anomalie quantitative).

Déficit de type II: la protéine est sécrétée normalement,


mais présente une anomalie fonctionnelle (anomalie
qualitative).

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1-La Protéine C

Déficits de type II
On distingue :
Déficits de type IIAM : l’activité enzymatique
protéasique est diminuée, décelée par les méthodes
amidinolytiques. Atteinte de la poche catalytique.
 Déficits de type IIAC : l’activité anticoagulante de
la protéine est diminuée, décelée par les méthodes de
coagulation alors que l’activité enzymatique
protéasique est normale. Poche catalytique conservée.
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1-La Protéine C

e. Déficits acquis en PC

•Traitement par les AVK ou carence en vitamine K


•Traitement par la L-Asparginase
•Insuffisance hépatique
•Choc septique
•les syndromes de consommation.

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1-La Protéine C
f- Diagnostic biologique du déficit en PC

Test de 1ère intention: Mesure de l’activité anticoagulante de


la PC
Diminuée  le type de déficit

Tests de 2ème intention:


1) Dosage par méthode immunologique (Elisa): Antigène
2) Dosage par méthode amidolytique

38 Typer le déficit
Protéine C Type I Type II

AC AM

Antigène (%) <70 70-130 70-130

Activité <70 70-130 <70


amidolytique (%)
Activité <70 <70 <70
anticoagulante (%)

39
1-La Protéine C

-Le taux de PC est plus bas chez les NN et l’enfant.

40
1-La Protéine C

-Analyse du gène de la PC n’est totalement justifiée que dans

le contexte d’homozygotie ou d’hétérozygotie composite avec

complications thrombotiques sévères à la naissance, pour

permettre un diagnostic anténatal en cas de nouvelle

grossesse dans la famille.

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•Principe de dosage de l’activité anticoagulante de la PC
(méthode chronométrique/ STACLOT® PC)

-Dans ce test, la PC de l’échantillon à tester est activée par un


venin de serpent (Agkistrodon C. contortrix), le Protac.
-Puis, la technique chronométrique, consiste à mesurer un
allongement du TCA lié à la dégradation des facteurs Va et
VIIIa par la PCa, la PC ne provenant que du plasma à tester
alors que tous les autres facteurs sont apportés en excès par le
réactif.
42
2-La Protéine S

a. Gène/Protéine

Gène :
- chromosome 3, deux gènes présentant 98 % d’homologie : un gène actif
α (15 exons s’étendant sur plus de 80 kpb) et un pseudogène β non codant.
Protéine :
-GP monocaténaire , vitamine K-dépendante comprenant 7% de
carbohydrates
-Produite par le foie mais aussi la cellule endothéliale et le mégacaryocyte
- MM 69 kDa
43 -Demi-vie plasmatique moyenne de 42 h.
2-La Protéine S

b- Propriétés de la PS

 PS plasmatique: 40% sous forme libre (PS libre)+ 60%


sous forme complexée à la C4b binding protein (C4bBP)
 PS libre: cofacteur de la PCa
 PS augmente l’affinité de la PCa pour les PL anioniques
exposés à la surface des plaquettes activées ou des cellules
endothéliales stimulées rendant les FVa et FVIIIa plus
accessibles au clivage par la PCa. .
44
2-La Protéine S

c. Déficit constitutionnel en PS

Retrouvé chez 2 à 3 % des patients symptomatiques.


-Transmis selon le mode autosomique dominant.
- Risque thrombogène plus important en post-partum que
pendant la grossesse
->120 mutations.
- Terminologie : découverte à Seattle

45
2-La Protéine S

d. Types de déficits constitutionnels

quantitatifs (type I) avec un défaut de sécrétion


de la protéine
qualitatifs (type II) avec une anomalie
fonctionnelle de la PS.
 type III caractérisé par une PS libre basse
contrastant avec une PS totale normale

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2-La Protéine S

e. Déficits acquis en PS

o carence en vitamine K, AVK


o insuffisance hépatocellulaire,
o syndrome de consommation,
o anticorps anti-PS (au cours de la varicelle par exp)
o traitements œstroprogestatifs.
o SN
o Réaction inflammatoire aiguë

47 o VIH
2-La Protéine S

f- Diagnostic biologique du déficit en PS

Test de 1ère intention: Activité anticoagulante de la PS

Diminuée  le type de déficit

Tests de 2ème intention:


Dosage par méthode immunologique
(immunoenzymatique ou immunoturbudimétrique):
-PS libre
PS totale
Typer le déficit
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Protéine S Type I Type II Type III

Protéine S totale Diminuée Normal Normal


(%)
Protéine S libre Diminuée Normal Diminuée
(%)
Activité Diminuée Diminuée Diminuée
anticoagulante (%)

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2-La Protéine S

VN: 60-140%
-Le taux de la PS est plus bas chez les NN et l’enfant.
-PS: hormonodépendante: grossesse (50% à terme)
et postpartum (au moins deux mois)

-Les valeurs usuelles de l’adulte diffèrent en fonction:


 du sexe (homme, femme)
 de l’âge (femme jeune, femme ménopausée)
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Limites inferieures des valeurs usuelles de PS en
fonction de l’âge et du statut hormonal (D.Borgel et
al 2007).
Tests Valeurs seuils (%)
PS Totale
Homme 78
Femme
Préménopause avec CO 53
Préménopause sans CO 66
Post-ménopause 80
PS Libre
Homme 65
Femme
Préménopause avec CO 47
Préménopause sans CO 53
Post-ménopause 58
51
2-La Protéine S

- l’analyse du gène de la PS n’est totalement justifiée que dans

le contexte d’homozygotie associée à des manifestations

thrombotiques.

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•Principe de dosage de l’activité anticoagulante de
la PS (méthode chronométrique/ STACLOT® PS)

La mesure de l’activité anticoagulante de la PS se fait à


l’aide d’un test de coagulation global, qui étudie
l’allongement du temps de coagulation exercé par le plasma
du malade en présence de PCa sur un plasma déplété en
PS enrichi en FVa.
.

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Causes d’erreur dans les dosages :

-Mutation Leiden du FV (diminue artéfactuellement


l’activité de la PS). L’adjonction d’un excès de FVa dans
certaines trousses a permis de pallier au problème
d’interférence avec la résistance à la protéine C activée.

Attention:
-interférence du FVIII > 250% Mesures de PC
activité et PS
-interférence de l’héparine > 1UI/ml activité
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III- La Protéine Z et PZI

-La protéine Z (PZ) circule dans le sang sous la forme


d’un complexe avec un inhibiteur PZ dépendant (PZI).
Cet inhibiteur est une sérine protéase.

-La PZ sert de cofacteur au PZI pour la neutralisation


du FXa en présence de PL.

-Le PZI inhibe le FXIa en absence de la PZ.

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IV-Inhibiteur de la voie du Facteur
Tissulaire

Le TFPI: Tissue Factor Pathway Inhibitor


 Synthétisé par la cellule endothéliale

 Comporte 3 domaines de type Kunitz:

**Domaine 1 se lie au complexe FT-FVIIa,

**Domaine 2 se lie au FXa,

**Domaine 3 se lie aux lipoprotéines et aux


glycosaminoglycanes (GAGs).
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IV-Inhibiteur de la voie du Facteur
Tissulaire

 Le TFPI est présent à la fois dans le plasma et fixé sur les GAGs
de la paroi vasculaire
TFPI: déplacé de la paroi vasculaire par l’héparine
 Formation d’un complexe quaternaire: Xa-TFPI-VIIa-FT
 Le complexe FT-FVIIa est inhibé, bloquant la production
du FXa et FIXa.
 Pas de déficit héréditaire en TFPI associé aux thromboses.
 Le TFPI ne rentre pas dans le bilan de thrombose.

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IV-Inhibiteur de la voie du Facteur
Tissulaire

X Xa TFPI Xa

VIIa VIIa

TF1 TF1

TF2 TF2

58
V- Autres marqueurs de Thrombophilie

59
1- Résistance à la Protéine C Activée

Cette résistance plasmatique à la PCa (RPCA) est la


conséquence de la présence d’un FV anormal : facteur V Leiden
La substitution d’AA résulte d’une mutation ponctuelle (une
glutamine à la place d’une arginine en position 506).
Modification de l’un des sites de clivage du facteur Va par la
PCa.
 Augmentation du risque thromboembolique
 Cause la plus fréquente de thrombophilie :retrouvé chez 20 à
40% des patients ayant fait des ATEV et dans environ 5% de la

60
population caucasienne normale (prévalence en Tunisie de 5%).
2- Mutation G20210A du gène de la
Prothrombine

La fréquence de cette mutation chez les Européens est de


l’ordre de 2 %. Elle est retrouvée chez 6% des
thrombophiliques.

Prévalence de 2% en Tunisie

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3- L’hyperhomocystéinémie

-N’est pas réalisé en première intention

-Peut se faire chez les patients présentant des


thromboses récidivantes (avec absence d’étiologies
évidentes) ou des thromboses artérielles associées.

-Dosage Vit B12 et folates nécessaire.

-Implication de l’homocysteinémie: avis très


contreversés et actuellement remise en cause.

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4- Permanente du facteur VIII>150%

5- Dysfibrinogénémie

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VI- Recommandations générales

Prélèvements:
 Sur anticoagulant: Citrate de sodium

 Absence de microcaillots

 Respecter le rapport sang/anticoagulant (1V/9V).

 Acheminement rapide au labo

 Double centrifugation immédiate

 Si dosages différés:

Durée de conservation: 2 semaine à -20°C, 6 mois à -70°C.


64  Décongélation rapide et dosages.
VI- Recommandations générales

Contrôler toujours les déficits:

 2ème prélèvement ( même conditions de prélèvement,


d’acheminement et de conservation): en dehors de la phase
aigue
 Enquête familiale obligatoire: affirmer le caractère
constitutionnel.
 Interrogatoire: traitement en cours, contraception orale,
avortement récent, grossesse, post-partum.
 PS: dosage à contrôler en dehors d’un syndrome inflammatoire.
vérifier les limites des coffrets et les interférences
65

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