Chapitre VII 

: Génie génétique et application

De nombreux systèmes de clonage cellulaire ont pour but d’amplifier l’ADN introduit pour en
obtenir les quantités satisfaisantes aux différents types d’analyses structurales et
fonctionnelles. D’autres systèmes de clonage plasmidique permettent la synthèse de grandes
quantités de brins spécifiques du transcrit ARN, à partir de l’ADN, introduit par synthèse
d’ARN in vitro.

Dans certains cas, le système de clonage est conçu pour permettre l’expression du polypeptide
à partir du gène introduit (clonage d’expression). Il est ainsi possible de produire des grandes
quantités de protéines spécifiques, qui peuvent avoir un rôle thérapeutique (ex : Insuline,
Interféron, antigènes viraux pour production de vaccins, ou pour produire des anticorps
spécifiques). Ce type de système permet ainsi l’étude complète de la structure et de la
fonction des protéines, ce qui est particulièrement utile dans le cas de protéines peu exprimées
ou difficiles à isoler.

Il existe une grande variété de vecteurs d’expression qui peuvent être utilisés dans différentes
cellules hôtes (procaryote et eucaryote) et des vecteurs spécifiques ont été conçu pour être
utilisés dans des types de cellules hôtes spécifiques.

Systèmes d’expression bactériens

Les gènes eucaryotes ne peuvent normalement être exprimés directement dans les cellules
bactériennes. Ceci n’est possible que si l’on obtient d’abord un clone de l’ADNc
correspondant contenant la séquence codante entière, clonée dans un vecteur permettant
l’expression bactérienne.

L’ADNc n’apporte que l’information nécessaire à spécifier le polypeptide. Le contrôle de

l’expression est apporté extérieurement.

Les systèmes d’expression contiennent souvent des promoteurs inductibles. Les cellules
contenant l’ADN recombinant peuvent être sélectionnées et amplifiées en grande quantité
sans que le gène étranger soit exprimé. L’expression du gène inséré peut être déclenchée par
l’exposition à un agent inducteur.

RMQ :

Dans certains cas, un problème essentiel concerne l’importance des mécanismes post-
transcriptionnels de production de nombreuses protéines. Les protéines produites par
expression de clones d’ADNc dans les bactéries peuvent être instables ou leur activité
biologique peut être diminuée.

Systèmes d’expression eucaryotes

Permettent l’expression de gènes eucaryotes spécifiques ou de segments d’ADN dans des
cellules eucaryotes hétérologues.
L’environnement similaire, même s’il n’est pas identique à la cellule hôte d’origine, permet la
détection spécifique, et dans certains cas la purification, des protéines exprimées.

Les systèmes de clonage eucaryotes sont de plus en plus utilisés pour préparer en masse des
protéines eucaryotes spécifiques. De nombreuses protéines eucaryotes requièrent des
modifications post-traductionnelles spécifiques (ex : glycosylation spécifique), essentielles
pour leur stabilité ou leur activité fonctionnelle. Les organismes hôtes eucaryotes
hétérologues ayant souvent des systèmes de maturation post-traductionnelle identiques ou
similaires (ex : Baculovirus) sont souvent préférés pour produire de grandes quantités de
protéines.

Exemple de synthèse de protéines

Le génie génétique a permis de fabriquer de nombreuses protéines d’importance médicale. La

fabrication de l’insuline est un exemple bien connu.

Cette hormone abaisse le taux de glucose dans le sang et la plupart des diabétiques dans le
monde entier en ont besoin chaque jour. Les porcs possèdent une insuline qui ne diffère que
d’un seul acide aminé par rapport à l’insuline humaine. C’est pourquoi, à l’origine, l’insuline
pour le traitement des diabétiques était l’insuline porcine. Environ 50 pancréas de porc sont
nécessaires aux besoins annuels d’un diabétique. Cependant, l’efficacité de l’insuline animale
est souvent faible et beaucoup de patients sensibles développent une allergie.

L’insuline humaine fut le premier médicament conçu par génie génétique qui est arrivé sur le
marché, en 1982. L’insuline humaine est composée de deux chaînes polypeptidiques. La
chaîne A est longue de 21 acides aminés et la chaîne B de 30 acides aminés. L’hormone ne
devient active qu’après la formation de deux ponts disulfures entre les deux chaînes A et B.
Comme la structure primaire de l’insuline était déjà connue, on a pu synthétiser chimiquement
les séquences d’ADN correspondant aux deux chaînes polypeptidiques. Un plasmide a été
utilisé comme vecteur, dans lequel a été inséré le gène de la galactosidase et le gène de
résistance à un antibiotique. Les deux ADN de la chaîne A et B ont été insérés dans des
plasmides différents à chaque fois derrière le gène de la galactosidase. Ils ont été insérés
immédiatement derrière un triplet codant pour l’acide aminé méthionine. De cette manière, les
gènes étaient sous le contrôle du promoteur du gène de la galactosidase. Les deux plasmides
recombinés ont été ensuite transférés séparément dans des bactéries E. coli et les bactéries
transgéniques ont été amplifiées.

Le promoteur du gène de la galactosidase est activable par le lactose, C’est pourquoi, lorsque
l’on ajoute du lactose dans la culture de bactérie, le promoteur est activé et le gène est
exprimé. Chaque bactérie synthétise jusqu’à 100'000 molécules d’une protéine de fusion
formée par la combinaison de la galactosidase et d’une chaîne d’insuline. Après la lyse des
bactéries et la purification, ces protéines sont spécifiquement clivées par un traitement au
bromure de cyanogène. Ce composé coupe les liaisons peptidiques après la méthionine et
sépare ainsi les chaînes d’insuline de la galactosidase. Les chaînes A et B sont une nouvelle
fois purifiées et la réaction entre les cystéines permet de former des ponts disulfures entre les
chaînes A et B, rendant ainsi l’insuline humaine active.
 La transgénèse
La transgenèse consiste à intégrer un gène (ou une construction avec un promoteur) exogène
dans un échantillon (cellule, tissu, organe, embryon…). Le type de gènes à intégrer peut être
très variable : on peut intégrer une copie supplémentaire pour étudier l’effet d’une probable
« surexpresssion » ; on peut intégrer un fragment d’acide nucléique qui va bloquer
spécifiquement un gène d’intérêt dans le génome pour étudier l’effet de l’extinction complète
(knock-out) ou partielle (knock-down) de ce gène ; on peut intégrer des gènes dits
« marqueurs » qui permettent de suivre in vivo le fonctionnement d’un gène (par fluorescence
par exemple).

Il est possible de définir deux grandes catégories de transgenèse : la transgenèse dite

« stable » et la transgenèse dite « transitoire ». La transgenèse stable implique que le gène
étranger (ou transgène) s’incorpore par recombinaison au génome de la cellule hôte et fait
partie intégrante du génome de l’échantillon, si les cellules germinales sont touchées, ce
transgène sera transmis à la descendance qui pourrait en découler. La transgenèse transitoire
indique que le transgène ne s’intègre pas dans le génome ; il reste « libre » dans la cellule et
peut-être transcrit et traduit pendant une durée limitée avant d’être éliminé soit par des
systèmes de protection cellulaire, soit par dilution au cours des divisions cellulaires
successives.

Principe :

Les grandes étapes de la transgenèse impliquent un système d’intégration de l’ADN étranger

dans l’échantillon visé, soit en utilisant des vecteurs de transformation du style virus,
plasmides…, soit en l’intégrant physiquement (par exemple par micro-injection) dans les
cellules d’intérêt. Ensuite, il faut sélectionner (essentiellement dans le cas de la transgenèse
stable) les cellules qui ont incorporé le transgène. Souvent, le transgène n’est pas incorporé
seul mais en compagnie d’autres transgènes qui ont pour but de suivre ou sélectionner les
cellules transformées : par exemple un gène de résistance à un antibiotique cointégré avec le
transgène d’intérêt permettra de sélectionner les cellules transformées, car ce sont les seules
qui se développeront sur un milieu contenant l’antibiotique. Les marqueurs peuvent
également être colorimétriques ou fluorescents. Puis, à partir des cellules transformées et
sélectionnées, il est utile de procéder à leur multiplication, voire à leur différenciation en un
individu entier. Cela implique qu’il faut bien connaître la biologie de l’espèce étudiée et être
capable par différentes techniques de bio- technologie de régénérer un individu entier à partir
d’une cellule. On peut utiliser soit la capacité de différenciation et redifférenciation des
cellules (c’est souvent le cas pour les plantes), soit la capacité de transformer des cellules
souches embryonnaires.

Notez bien : Les organismes génétiquement transformés (ou modifiés, OGM) doivent se
manipuler en laboratoire dans des conditions évitant toute dissémination à l’extérieur.
Cela nécessite des infrastructures adaptées.

Transgénèse végétale

Chez les plantes, la transgénèse est possible grâce au plasmide Ti (tumeur inducing) dérivé de
la bactérie Agrobactérium tumefaciens responsable de la maladie du collet. Ce plasmide une
fois modifiés par élimination des régions responsables de la tumorigénèse sont d’excellents
vecteurs permettant l’intégration d’ADN exogène dans le génome

En pratique, une séquence de l’ADNt contenant les gènes qui induisent la tumeur est
remplacée par notre gène d’intérêt. Les cellules végétales sont blessées en réalisant des
coupures au niveau des feuilles. Elles sont ensuite incubées en présence des bactéries
porteuses du plasmide Ti modifié. Sous l’effet de la blessure, les plantes synthétisent une
substance qui active les gènes Vir du plasmide permettant le transfert de la région T par un
mécanisme de conjugaison et son intégration dans le génome de la cellule végétale. Cette
technique permet d’intégrer des résistances aux virus, aux insectes ou à des herbicides et elle
permet également la production de protéines pharmaceutiques.

Exemple : L’interféron produit dans les plantes de riz

Les animaux transgéniques 

Il s’agit d’introduire des gènes étrangers dans des embryons d’organismes complexes.

Les transgènes sont en général injectés avant la première division cellulaire, ce qui permet de
les retrouver dans toutes les cellules et par conséquent dans les cellules sexuels d’où la
transmission par la suite.

Les principales étapes sont les suivantes :

1- On doit disposer d’ovocytes de souris qui viennent d’être fécondés. Ils sont récoltés
avant la fusion des deux pronucléi. On injecte alors avec une micropipette étirée
(micro-injection) 10-12 litre d’ADN dans le pronucéus mal.
2- Mise en culture de l’œuf jusqu’au stade morula.
3- Implantation de l’œuf dans l’utérus d’une souris pseudogestante.

Le rendement de ces expériences est faible. Ainsi, on ne retrouve que 10 à 20% des œufs
manipulés qui survivent et se développent jusqu’à terme.

Il est a noté que l’ADN est souvent intégré de manière aléatoire.

 Mutagenèse
Les approches de mutagenèse sont de deux ordres et sont historiquement basées sur la
génétique dite classique ou mendélienne. On peut réaliser des approches de génétique directe
ou de génétique inverse.

La génétique directe consiste à identifier dans une population un phénotype différent de celui
d’un individu sauvage en relation avec notre question de recherche (par exemple des mouches
avec des yeux mutants si l’on s’intéresse aux mécanismes de développement de l’œil). Une
fois le ou les individus identifiés, il faut rechercher le ou les gènes responsables de cette
déviance. Comme le taux de mutation naturelle est très faible, il est nécessaire de stimuler ce
taux de mutation en traitant les individus sauvages par des agents mutagènes de l’ADN.
Comme la fréquence des mutations recherchées reste très faible, il faut bien définir le mode
de criblage des individus traités avec l’agent mutagène pour permettre d’analyser des milliers
d’individus rapidement (la couleur des yeux est un crible assez aisé). Une fois le ou les
individus présentant le phénotype d’intérêt identifiés, il s’agit par des approches de
croisements génétiques et d’analyses de génome de tenter d’identifier le gène muté
responsable du phénotype.

La génétique inverse vise à chercher un mutant pour un gène d’intérêt que l’on connaît et dont
on veut avoir des individus mutés pour en étudier le phénotype. La transgenèse est l’une des
méthodes qui permet de générer un mutant du gène d’intérêt. Récemment, l’approche
d’édition du génome CRISPR-Cas9 s’est largement développée par sa relative facilité
d’utilisation ; elle permet de muter spécifiquement un gène d’intérêt.

Mutagenèse dirigée

Un moyen puissant d’étudier la fonction d’un gène au sein d’un organisme est de créer des
mutations dans des sites spécifiques grâce à un procédé appelé mutagenèse dirigée. Trois
approches peuvent être utilisées :

- Coupure dans la région cible grâce à une enzyme de restriction et remplacement -

par un oligonucléotide contenant la mutation d’intérêt.
- Mutagenèse par extension enzymatique d’une amorce synthétique portant la
mutation.
- Mutagenèse par PCR.
Coupure dans la région cible grâce à une enzyme de
restriction et remplacement par un oligonucléotide
contenant la mutation d’intérêt.
 Mutagenèse par extension enzymatique
d’une amorce synthétique portant la
mutation.

Mutagénèse pas PCR :

Le principe de toute mutation introduite par PCR repose sur l'observation qu'une stricte
complémentarité de l'amorce nucléotidique avec la séquence de l'ADN cible n'est pas absolument
nécessaire sur toute la longueur considérée. Elle est obligatoire du côté 3' pour l'amorçage de la
réaction, mais pas du côté 5'.

A partir de ce constat, il est possible d'imaginer deux types de mutation :

1) Le premier consiste à modifier une des extrémités ou les deux extrémités du segment d'ADN à
amplifier à l'aide d'une ou de deux amorces mutées.
2) Le second permet d'effectuer des modifications (insertions, délétions, substitutions, fusions de
gènes) à l’intérieur de la séquence d’ADN à amplifier. Elle est un peu plus complexe que la
précédente car elle exige 2 paires d'amorces. Elle est aussi beaucoup moins limitante que la
précédente puisqu'elle permet de (presque) tout imaginer 

La PCR peut aussi être considérée comme une méthode de modification de l'ADN.
La possibilité d'obtenir simplement, rapidement et en grande quantité des ADN mutés fait de la PCR
l'une des stratégies de mutagénèse les plus puissantes.

D'une manière générale, l'intervention à l'intérieur d'un segment d'ADN par PCR nécessite deux
paires d'amorces oligonucléotidiques : une paire qui apporte la mutation et une paire qui permet
d'étendre l'ADN ainsi modifié de part et d'autre de la modification.

Les amorces 1 et 2 sont des amorces mutées (la région 5' qui porte la mutation est symbolisée par un
rectangle rouge). Elles ont, en plus, la particularité d'être complémentaires (le recouvrement des
régions 5' mutées est particulièrement important pour la suite). Les amorces 3 et 4 bornent le
segment d'ADN à modifier. Elles déterminent sa longueur du produit final.
(Il est assez classique d'effectuer la mutation sur un segment d'ADN intégré dans un plasmide. Dans
ce cas, les amorces 3 et 4 peuvent être construites en fonction du plasmide choisi).

Deux réactions de PCR sont d'abord réalisées en parallèle :

Une PCR avec les amorces 2 et 3 donne un produit d'amplification correctement muté dans la région
désirée mais de taille insuffisante. Une PCR avec les amorces 1 et 4 donne un produit, lui aussi
correctement muté, mais toujours de taille insuffisante.

Les deux produits de PCR ainsi obtenus sont alors purifiés (il s'agit surtout d'éliminer les amorces 1 et
2), et réunis dans un même tube. Remarquons qu'ils possèdent en commun la région mutée (région
d'ADN possédant un rectangle rouge). L'hybridation des deux fragments par cette partie commune
est importante pour la dernière étape.

Une dernière PCR utilisant les amorces 3 et 4 est alors réalisée sur ce mélange et donne, en effet, un
fragment de taille souhaitée.  

De nombreuses autres "combinaisons" sont imaginables (substitutions, insertions, délétions,

fusions de gènes) et pourront être développées ultérieurement ...
 La thérapie génique

Définition

Elle consiste à introduire des gènes sains dans des cellules malades. Les vecteurs viraux sont
les plus fréquemment employés à ces fins. Le gène sain n’est pas introduit à la place du gène
déficient mais il est introduit en plus à la cellule. De plus, la réussite de cette manipulation
nécessite une expression adéquate et non toxique du gène.

Règlementation

Il existe un ensemble de règlementations, les principales sont les suivantes :

1- Le protocole doit être appliqué sur l’animal.

2- Le passage à l’homme exige un ensemble d’autorisation.
3- Le protocole doit être appliqué uniquement sur des cellules somatiques.

La première autorisation fut accordée aux USA en 1989.

Stratégies de thérapie génique

Deux stratégies sont à retenir pour délivrer des gènes dans des cellules:

1- Stratégie ex-vivo
 Elle consiste à récupérer les cellules du patient, transférer le gène correcteur dans leur
génome, puis transplanter les cellules modifiées dans l’organisme du patient.
2- Stratégie in-vivo
C’est un transfert direct du gène dans les cellules d’un tissu. Cette stratégie nécessite
l’utilisation de vecteurs viraux qui ciblent le transfert vers les cellules appropriées.
L’inconvénient majeur de l’insertion réside dans l’effet mutagène du virus ou l’effet
d’inactivation pendant l’insertion.

Exemple : Traitement de tumeurs du cerveau en décembre 1992 par introduction d’un virus
portant le gène thymidine kinase (TK), les cellules infectées par ce virus et traitées au
genciclovir vont dégénérés ce qui induira la diminution du volume de la tumeur.