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FABIO ET GENC

Travaux pratique
Chromatographie

Problématique :
La réalisation de ce travail pratique a pour but d’extraire les pigments de la
photosynthèse d’une feuille et de séparer les différents pigments.

Technique :
Nous avons utilisé en premier temps la filtration afin d'extraire les organites et les séparer du
sable et les feuilles d'épinards.
Nous avons aussi utilisé la décantation pour purifier l'extrait de carbonate de calcium et de
l'acétone a l'aide d'une ampoule a décanter.
La distillation a été utilisé pour séparer l'éther de pétrole de la chlorophylle.
La chromatographie a été utilisé pour séparer analytiquement la chlorophylle afin de faire
migrer ses constituants.

Principe :
L'extraction de la chlorophylle à l'aide d'un mortier et de l'acétone qui permet d'obtenir une
solution chlorophyllienne. Pour séparer la chlorophylle avec le reste des ingrédients nous
avons utilisé un système Büchner. La décantation est utilisé après avoir ajouté de l'éther de
pétrole dans le filtrat pour séparer l'acétone et le carbonate de calcium de l'éther de pétrole et
de la chlorophylle. Pour séparer l'éther de pétrole de la chlorophylle nous avons utilisé la
distillation. Pour séparer les constituants nous avons utilisé la chromatographie.

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FABIO ET GENC

Matériel :
Produits :
- Epinard (sans tiges ni. nervures)
- Sable
- Carbonate de calcium (CaCO3)
- Acétone (C3H6O)
- Ether de pétrole (CH3-(CH2)n-CH3)
- Eau distillée
- Isopropanol (C₃H₈O)
- Chlorure de sodium semi-saturé (NaCl)
- Sulfate de sodium ( Na2SO4)

Matériels :
- cylindre gradué 20ml
- cylindre gradué 50ml 2x
- pompe a vide
- ampoule a décanter + bouchon
- cuve de chromatographie
- spatule
- mortier en pilon
- entonnoir Büchner
- joint
- matériels de montage : socle, tige, anneau
- papier filtre
- fiole à filtre
- Bêcher de 100ml
- Entonnoir
- 2 pipette pasteur et Nuggi (petite poire pour pipette pasteur).
- évaporateur rotatif
- Eppendorf

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FABIO ET GENC

Marche à suivre :
1. Enlever les grosse tiges et les nervures de l'épinard.
2. Mettre dans un mortier.
3. Rajouter une pincé de sable + une pointe de spatule de carbonate de calcium.
4. Mesure 20ml d'acétone puis les verser dans le mortier une partie de l'acétone.
5. Commencer le broyage et rajouté petit à petit le reste de l'acétone.
6. Finir de broyer jusqu'à que le liquide devienne vert foncé.
7. Monter le système de Büchner.
8. Mouiller le filtre avec de l'acétone (quelques goûtes).
9. Ajouter la solution du mortier dans l'entonnoir Büchner.
10. Allumer la pompe a vide.
11. Filtrer et récupérer le filtrat.
12. Verser le filtrat et le mettre dans l'ampoule à décanter.
13. Ajouter 30ml d'Ether de pétrole dans le filtrat.
14. Agiter l'ensemble et dégazer de temps en temp.
15. Ajouter 30ml de chlorure de sodium semi-saturé.
16. Agiter encore une fois de la même manière.
17. Attendre que tout soit bien séparer.
18. Enlever le bouchon et ouvrir doucement l'ampoule.
19. Verser la phase aqueuse dans un bêcher.
20. Le faire 3 fois (étapes 15-18).
21. Changer le bêcher puis faire sortir toute la phase organique dans le bêcher.
22. Ajouter une plaine de spatule de sulfate de sodium.
23. Monter un évaporateur rotatif.
24. Verser la phase organique sans prendre la partie solide dans le ballon et le fixer sur
l'évaporateur rotatif.
25. Brancher les deux tuyaux.
26. Ajouter de l'eau dans le bain marie.
27. Allumer l'évaporateur rotatif à 60°.
28. Attendre que l'évaporation soit finie.
29. Récupérer la phase organique présente dans le ballon et la mettre dans des Eppendorf.

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FABIO ET GENC

30. Emballer les Eppendorf dans de l'aluminium.


31. Congeler un des deux et mettre l'autre au frigo (nous les avons laisser ≈ 2 semaines).
32. Préparer l'éluant -> 10ml d'éther pétrole, 1ml d'isopropanol et 1 goute d'eau déminéralise
(H2O).
33. Faire le mélange dans un bêcher.
34. Découper du papier de silice (papier de chromatographie).
35. Faire une ligne horizontale à 11.5 cm du bas de la feuilles au crayon papier.
36. Ajouter deux points sur la ligne.
37. Prendre une pipette pasteur et mettre une goute sur un des deux points, attendre que sa
sèche et refaire la même chose avec l'autre Eppendorf (ne pas utiliser de ... pour la pipette
pasteur peux aider.
38. Mettre la feuille de silice dans la cuve.
39. Attendre que le liquide soit bien monter et laisser cuver.
40. Noter les résultats.

Résultat :

La migration de gauche est celle qui à L'Eppendorf de gauche est celle qui
été congelé à été congeler

La migration de droite est celle qui à L'Eppendorf de droite est celle qui à
été laisser au réfrigérateur été laissé au réfrigérateur.

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Bêta-carotènes

Phéophytine
Chlorophylle a

Chlorophylle b

Lutéine

Violaxantine

Néoxantine

Discussion :
D'après ce que nous avons obtenu, nous pouvons apercevoir que l'éprouvette qui à été
congeler est moins concentré et s'étend plus loin que celle qui à été mis au réfrigérateur.
L'eppendorf de gauche (sur l'image de droite) est celle qui à été congeler, on peut voir que la
quantité est resté très semblable à celle de base avant la période de 2 semaines, en sachant que
les deux eppendorf on été rempli au maximum. Pour celle de droite on peut voir qu'une
grande partie à été évaporée, ce qui pourrait expliquer la concentration de chlorophylle plus
élever sur la migration de droite (image de gauche).

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FABIO ET GENC

Conclusion :
Nous pouvons conclure sur le fait que notre expérience est réussite puisque nous pouvons
distinguer toutes le différentes pigmentation de la photosynthèse. Nous pouvons aussi
constatez que d’après les résultats les différents pigments n’ont pas le même pouvoir
d’absorption et que la chlorophylle A empêche les autres couleurs de s’imposer sur la couleur
des plantes. Nous avons aussi remarqué que l’acétone permet la séparation des pigments avec
les feuilles d’épinards.

Avis personnel :
Nous avons trouver le TP assez long mais très intéressant et complet, il y avait toujours
quelque chose a faire, c'était assez stimulant. Nous avons aussi trouver intéressant de voir
l'éther de pétrole et la chlorophylle se séparer et monter petit a petit dans l'ampoule à
décanter.

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