TEMA 57: TCNICAS DE MANIPULACIN IN VITRO DE CIDOS NUCLEICOS. TCNICAS DE PCR Y SUS DISTINTOS USOS. 1.

TCNICAS DE MANIPULACIN IN VITRO DE CIDOS NUCLEICOS. Los cidos nucleicos son molculas esenciales para la vida ya que son los encargados de conservar, codificar y transmitir la informacin gentica de todos los seres vivos. Los cidos nucleicos son polmeros de nucletidos. Los nucletidos estn formados por una pentosa, de tipo ribosa o de tipo desoxirribosa, a la que se une una base nitrogenada que pueden ser de tipo pirimidina (citosina (C), timina (T) y uracilo (U)) o de tipo purina (adenina (A) y guanina (G)). La unin de la ribosa y una base nitrogenada origina un nuclesido. Cuando a un nuclesido se le unen uno o ms grupo fosfato se forman los nucletidos. Estos nucletidos se enlazan a travs de los grupos fosfato formando cadenas denominadas cidos nucleicos. Los cidos nucleicos pueden ser de dos tipos: cuando la pentosa de los nucletidos es dexosirribosa el cido nucleico de denomina cido DexosirriboNuclico (ADN) mientras que si la pentosa es una ribosa y adems en la cadena hay nucletidos con uracilo, en lugar de timina, el cido nucleico se denomina cido RiboNuclico (ARN). Las molculas de ADN presentan una estructura caracterstica: estan formadas por dos cadenas que permanecen unidas por puentes de hidrgeno entre las bases nitrogenadas (la A con la T mediante dos puentes de H, y la G con la C mediante tres puentes de H) formando una doble hlice. Las dos cadenas de la hlice son antiparalelas y complementarias en su composicin en bases nitrogenadas. (Fig.1) Las molculas de ARN suele estar formadas por una nica cadena. Esta, puede plegarse sobre s misma, por apareamiento de bases de la misma cadena, formando estructuras secundarias. El ADN suele ser el portador de la informacin gentica en la mayor parte de los organismo. Esta informacin suele estar contenida en genes. Un gen es una regin de ADN que codifica una protena. La informacin contenida en los genes se transcribe del ADN a ARN mensajero (ARNm), que es una copia complementaria del gen de ADN. La secuencia de nucletidos del ARNm se transforma en secuencia de aminocidos, es decir, en protena, en el proceso de traduccin llevado a cabo por los ribosomas. En este proceso interviene tambin otros dos tipos de ARN: el ARN de transferencia (ARNt), encargado de transportar los aminocidos que van a integrar la protena y el ARN ribosmico (ARNr) que forma parte estructural de los ribosomas. Los ARNt y ARNr tambin son codificados por el ADN. En el proceso de traduccin cada uno de las 22 aminocidos esta codificado por un grupo de tres ncleotidos, denominado triplete. Esta codificacin se denomina cdigo gentico y gracias a l el ARNm puede ser traducido a protenas. Los organismos son capaces de copiar su ADN y transmitirlo a su descendencia. Esto se lleva a cabo gracias a enzimas que catalizan la sntesis de nuevas molculas de ADN. La replicacin comienza en un punto, en el que se abre la doble hlice permitiendo la copia de las dos cadenas. Este proceso es semiconservativo, esto significa que en las molculas de ADN obtenidas una cadena pertenecer al ADN usado como molde para la replica mientras que la otra ser el producto de la nueva sntesis. Dentro de las clulas los cido nucleicos se ven sometidos a gran variedad de procesos de replicacin, degradacin, fragmentacin, empalme, modificacin y recombinacin, llevados a cabo por mltiples enzimas. Las tcnicas de manipulacin in vitro de cidos nucleicos utilizan estas enzimas celulares como herramientas. Estas enzimas se utilizan aisladas del medio celular, en reacciones enzimticas llevadas a cabo in vitro, en las que las enzimas efectan las mismas funciones que en el medio fisiolgico, pero libres de toda regulacin, permitiendo controlar su actividad al antojo del experimentador. A continuacin detallamos la mayora de los procesos y mtodos para obtener, manejar y modificar cidos nucleicos in vitro. Mtodos de extraccin y purificacin de cidos nucleicos Para poder manipular el material gentico de un organismo se necesita previamente extraer y purificar los cidos nucleicos. El paso previo para la obtencin de cidos nucleicos es la

disrupcin de los tejidos y la lisis celular. La disrupcin deber ser ms o menos enrgica segn las caractersticas de la muestra. Se pueden emplear distintos mtodos para la extraccin de cidos nucleicos: Mtodos fsicos: Por abrasin o compresin utilizando morteros, disruptores por aspas, molinos de bolas, homogeneizadores, o la prensa de French, que combina una alta presin con el paso de las clulas por orificios de pequeo tamao. Tambin se pueden lisar las clulas por congelacin de la muestra, choque osmtico, sonicacin, etc. Mtodos enzimticos: Utilizan enzimas que digieran las paredes celulares, como celulasas en tejidos vegetales o lisozima para muestras bacterianas. Mtodos qumicos: Rompen o disuelven las membranas empleando detergentes. Permiten liberar el cido nucleico, y adems separarlo por su localizacin celular aprovechando las diferencias fisico-qumicas entre la membrana citoplsmica y nuclear. A menudo para conseguir una lisis celular completa debe emplearse una combinacin de varios de estos mtodos. El trabajo con cidos nucleicos requiere adoptar medidas que eviten su degradacin por accin de las nucleadas. Estas enzimas degradan los cidos nucleicos y son producidas por todos las clulas. El ARN es especialmente susceptible a la degradacin por nucleadas. Por esta razn, se suele aadir agentes inhibidores de las nucleasas (EDTA, agente quelante que excluye cationes necesarios para su actividad, isotiocianato de guanidina, que las desnaturaliza) y soluciones tamponantes, para evitar la degradacin de los cidos nucleicos durante el proceso de extraccin. Tambin debemos limitar la presencia de nucleadas ambientales (la piel y los organismos ambientales son fuente de ellas), usando guantes y utilizando materiales y disoluciones tratadas libres de nucleasas (por tratamientos con dietilpirocarbonato, DEPC, p.e). Una vez extrados, los cidos nucleicos deben ser purificados. Los cidos nucleicos poseen caractersticas fsicas y qumicas distintivas que permiten su separacin selectiva de otros componentes celulares. Su separacin se lleva a cabo por diferencias de densidad, solubilidad y secuencia de nucletidos. Existe varias tcnicas para purificar cidos nucleicos pero la eleccin la tcnica a utilizar depender de la naturaleza del cido nucleico a purificar y del grado de pureza e integridad que deseemos. Existen distintos mtodos de purificacin de cidos nucleicos: Sedimentacin en gradientes: Esta tcnica separa los componentes celulares segn su densidad. Consiste en preparar un gradiente de densidad utilizando cloruro de cesio o sacarosa, aplicar sobre l la muestra y someterla a centrifugacin. Los componentes de la muestra quedarn separados segn su densidad y cada fraccin de diferente densidad podr ser recogida por separado. De esta forma se pueden purificar ADN genmico y plasmdico, ARN. Es un procedimiento suave que mantiene la integridad de los cidos nucleicos. (Fig.2) Extraccin fenlica: Se basa en la diferente solubilidad de los cidos nucleicos. Esta tcnica consiste en, mezclar el lisado celular con una solucin de disolventes orgnicos y alcohol (fenol-cloroformo-alcohol isoamlico). Despus se someten a centrifugacin obtenindose dos fases, una acuosa y una orgnica. Cada fase contendr diferentes componentes celulares: los cidos nucleicos, de naturaleza hidrfila, se solubilizan en la fase acuosa, mientras que el resto de componentes, ms hidrfobos, lo hacen en la fase orgnica. La grado de pureza aumenta si se realizan varias extracciones fenlicas consecutivas. La extraccin a diferentes pH permite purificar especficamente ARN: a pH 4 nicamente el ARN es soluble en fase acuosa mientras que a pH7 o superior tanto ARN como ADN son solubles en agua. Precipitacin en alcoholes: Se basa tambin en la diferente solubilidad de los cidos nucleicos. Consiste en hacer que precipiten aadiendo a la muestra una proporcin elevada de sales y alcohol (etanol o isopropanol). La utilizacin de bajas temperaturas durante el proceso incrementa la precipitacin. El ADN genmico precipita formando un ovillo que puede ser literalmente pescado con una punta de pipeta o una varilla de cristal, pero si la cantidad de ADN de la muestra es baja se puede recoger el ADN precipitado por centrifugacin. Purificacin en fase slida: Tambin se basa en la solubilidad. Los cidos nucleicos son solubles en presencia de agentes caotrpicos (el isocianato de guanidinio o el cloruro de

guanidinio), pero en estas condiciones tiene tendencia a unirse a silicatos (por ejemplo, a las tierras de diatomeas). Esta tcnica se emplea en muchos kits comerciales, que incluyen membranas o matrices con esta fase slida. Una vez el cido nucleico se ha unido a la matriz sta se lava con mezclas de agua-alcohol para eliminar protenas y otros componentes celulares y el ADN se eluye con agua o un buffer con baja fuerza inica. Purificacin de ADN plasmdico: Se basa en las caractersticas, de los plsmidos, y de los microorganismos de los que se extraen. Se puede conseguir una purificacin diferencial del ADN plsmidico: mediante una lisis suave, en la que el ADN genmico queda asociado a las membranas mientras que el plasmdico permanece soluble, o bien mediante la lisis las bacterias con detergentes (SDS) en medio alcalino. En esas condiciones los cidos nucleicos y las protenas se encuentran desnaturalizadas. La posterior neutralizacin del medio provoca que el ADN genmico forme agregados insolubles con las protenas, mientras que el ADN plasmdico, de menor tamao y estructura ms simple, vuelve a formar la doble hlice y a ser soluble. La centrifugacin de la muestra permite por tanto recuperar el ADN plasmdico que, habitualmente se termina de purificar en fase slida o por precipitacin en alcoholes. Purificacin por hibridacin: Permite la purificacin especfica de un tipo de cido nucleico por su secuencia. La muestra se somete a cromatografa en una matriz a la que se han acoplado la secuencia del cido nucleico que se quiere purificar. Esta tcnica se utiliza para purificar especficamente el ARNm aprovechando que este posee una secuencia de adeninas (poliA) en su extremo 3. Con frecuencia se utilizan varias tcnicas de purificacin consecutivamente, para mejorar la pureza y aumentar la concentracin de los cidos nucleicos. Tambin es habitual el tratamiento de la muestra con enzimas que degradan determinados componentes celulares, mejorando el proceso de purificacin (utilizar proteasas para eliminar protenas) o incluso permitiendo una purificacin diferencial de los cidos nucleicos (un tratamiento con ARNasas, permite purificar nicamente ADN, y un tratamiento con ADNasas, permite purificar nicamente ARN). Estas tcnicas no slo se emplean para la obtencin del cidos nucleicos tras la lisis celular sino tambin para la purificacin de cidos nucleicos tras muchas tcnicas de biologa molecular. Una vez purificados suele ser til determinar la concentracin de los cidos nucleicos y su pureza. Para ello se utilizar tcnicas de cuantificacin de cidos nucleicos: Espectrofotometra de UV: Esta tcnica aprovecha la capacidad de los cidos nucleicos de absorben luz ultravioleta para cuantificarlos y determinar su pureza. La concentracin de cidos nucleicos se puede calcular midiendo la absorbancia de la muestra a 260 nm, ya que existe una relacin lineal entre concentracin de cidos nucleicos y absorbancia. Tambin permite una estimacin dese puede estimar la pureza, midiendo la absorbancia a 280nm. A esta longitud de onda la absorbancia est tambin influenciada por la presencia de sales y protenas en la muestra. De esta forma, el clculo del cociente A260/A280 nos dar una idea de la pureza de los cidos nucleicos (una preparacin pura da valores de A260/A280 entre 1,82,0, mientras que valores menores indican contaminacin con protenas). Fluorometra: Esta tcnica se basa en marcar los cidos nucleicos con un fluorocromo capaz de unirse a ellos especficamente. La fluorescencia de la muestra depender directamente de la cantidad de cidos nucleicos. La cantidad cidos nucleicos se puede calcular comparado la fluorescencia de la muestra con una muestra de concentracin conocida. Los cidos nucleicos pueden ser sometidos a mltiples manipulaciones in vitro. Se puede llevar a cabo la fragmentacin de los cidos nucleicos para su posterior utilizacin en diversas tcnicas de biologa molecular. Existen varios mtodos de degradacin de cidos nucleicos: Mtodos qumicos: Se basan en degradar los cidos nucleicos por cambios de pH: un pH muy cido los hidroliza totalmente (dando azcares, fosfatos y bases), un pH = 4 hidroliza slo los enlaces glucosdicos (ms en ADN que en ARN) y a un pH alcalino el slo se hidroliza el ARN. Esto se puede utilizar para eliminar el ARN de una muestra de cidos nucleicos.

Mtodos enzimticos: Se basan en la utilizacin de las enzimas denominadas nucleadas, capaces de degradar el ADN por rotura del enlace fosfodister entre dos nucletidos contiguos. Existen varios tipos: Las exonucleasas, que liberan nucletidos de uno en uno desde un extremo de la molcula y las endonucleasas, que rompen enlaces internos en la molcula. Las ADNasas que degradan especficamente ADN, y las ARNasas, que degradan especficamente ARN. Las enzimas que producen cortes al azar y las que reconocen secuencias especficas, como las enzimas de restriccin. Por ltimo, enzimas que degradan especficamente cidos nucleicos de cadena sencilla (ADNcs o ARNcs) o de doble cadena (ADNdc o ARNdc). La combinacin de todas estas capacidades enzimticas, da lugar a una gran variedad de nucleadas, cada una con actividades muy especificas. Las enzimas de restriccin son las enzimas ms importantes en ingeniera gentica, ya que permiten cortar las molculas de ADN de una forma precisa, predecible y reproducible. Son endonucleasas capaces de reconocer y digerir secuencias especficas de ADN (dianas). Estas enzimas forman parte de un mecanismo de defensa de los microorganismos frente al DNA exgeno, que permite la degradacin de ADN intruso, sin afectar al propio, en el que las dianas de restriccin estn protegidas por metilacin. Existen varios sistemas de restriccin (Tipo I, II, III y IV) que se diferencian en el nmero de enzimas implicados y en los mecanismos de restriccin y metilacin. Las enzimas de restriccin de tipo II y III cortan el ADN a una distancia definida de sus dianas. Sin embargo, las enzimas de tipo II, las ms utilizadas, cortan el ADN directamente en las dianas que reconocen. Estas enzimas reconocen secuencias de 4, 6 u 8 pares de bases que son secuencias palindrmicas, es decir, se leen igual de izquierda a derecha en una de las cadenas que de derecha a izquierda en la otra. El corte puede generar: extremos romos, cuando las dos cadenas de ADN son cortadas al mismo nivel, o extremos cohesivos cuando son cortadas a distinto nivel, generando extremos con bases desapareadas que son complementarios. Existen cientos de enzimas de restriccin diferentes que han sido purificadas y se encuentran disponibles comercialmente. Los nombres de las enzimas derivan del microorganismos del cual han sido purificadas. Cada enzima tiene su propia secuencias de reconocimiento, sin embargo, hay enzimas de especies distintas que reconocen la misma, o parte de una misma diana, en cuyo caso se denominan isoesquizmeros. La frecuencia con la que aparece la secuencia diana de una enzima de resticcin en el ADN puede variar enormemente y depende de la longitud (L) de la secuencia de reconocimiento de la enzima (se puede calcular como 4L). Las aplicaciones de las enzimas de restriccin son muy amplias, y prcticamente cualquier procedimiento que requiera manipular el ADN va a requerir de su uso. Los cidos nucleicos tambin pueden ser sintetizados in vitro. Existen varios mtodos de sntesis de cidos nucleicos: Mtodos qumicos: Permiten sintetizar fragmentos cortos de cidos nucleicos denominados oligonucletidos. La sntesis se lleva a cabo por etapas, fijando el primer nucletido de la cadena a un soporte slido por su extremo 3 y despus aadiendo consecutivamente ncleotidos que se irn incorporando al extremo 5 de la cadena. Una vez terminada la sntesis, el oligonucletido se separa del soporte slido. Mtodos enzimticos: Se basan en el empleo de las enzimas que utilizan las clulas para transcribir y replicar los cidos nucleicos, denominadas polimerasas. Estas enzimas sintetizar cidos nucleicos a partir de un cido nucleico molde, el cual son capaces de copiar o transcribir. Existen distintos tipos de polimerasas: ADN polimerasas: Sintetizar la cadena complementaria a una cadena de ADN. Necesitan un oligonucletido, complementario a la cadena molde, que utilizan como cebador, sobre el que aaden desoxirribonucletidos en el extremo 3'. De esta forma, la sntesis avanza en direccin 5 3. La mayor parte de la polimerasas poseen adems actividad exonucleasa que puede darse tanto en direccin 35 (actividad correctora de errores, elimina nucletidos mal incorporados), como en direccin 53. Existe una gran variedad

de ADN polimerasas, con distintas eficiencias en cada una de las tres actividades, algunas carecen de actividad exonucleasa. Otras son termorresistentes y su actividad cataltica optima se da a temperaturas entre 70-80C. Transcriptasas inversas: Capaces de sintetizar una cadena de ADN complementaria a una cadena de ARN molde. Catalizan tres reacciones diferentes: la sntesis de ADN dirigida por un molde de ARN (actividad de transcripcin inversa), la degradacin de ARN en una molcula hbrido de ARN-ADN (actividad ARNasa) y la sntesis de ADN a partir de ADN (actividad ADN polimerasa). Necesitan un cebador para sintetizar ADN y la sntesis se lleva a cabo en direccin 53. Existen transcriptasas inversas, con distintas eficiencias en cada una de las tres actividades, algunas carecen de actividad ADN polimerasa. ARN polimerasas: Sintetizan una cadena de ARN complementaria a una cadena molde de ADN. La sntesis de ARN se lleva a cabo en direccin 53 y slo utilizan como molde la cadena 35 de una molcula de ADN de cadena doble. No necesitan un cebador pero requieren la presencia de unas secuencias especficas en la cadena molde de ADN denominadas promotores. Estas regiones son necesarias para la unin de la enzima. Cada ARN polimerasa necesita un promotor especfico. Transferasa terminal: La polinucletido fosforilasa es la nica polimerasa capaz de sintetizar cidos nucleicos sin utilizar un molde. Esta enzima es capaz de sintetizar cadenas de ARN, y de aadir nucletidos al extremo 3 de una molcula de ADN. Tambin tiene actividad exonucleasa, degradando ARN. Los cidos nucleicos tambin se pueden someter in vitro a otro tipo de modificaciones que nos pueden se tiles para su manipulacin. Estas modificaciones se llevan a cabo utilizando estas enzimas: ADN ligasas: Permiten unir covalentemente fragmentos de ADN de doble cadena. Catalizan la formacin de nuevos enlace fosfodiester entre nucletidos. Necesitan una fuente de energia (ATP o NADH). ARN ligasas: Permiten unir dos molculas de ARN o dos molculas de ADN de cadena simple. Catalizan la unin del extremo 5 de una molcula con el extremo 3 otra molcula. Necesitan ATP. Fosfatasas: Nos permiten eliminar los fosfatos del extremo 5' de una molcula de cido nucleico, dejando extremos 5'-OH. Quinasas: Permiten aadir fosfatos, procedentes del ATP, a los extremos 5'-OH de ADN y ARN. La disponibilidad de todas estas herramientas ha permitido el desarrollo de la tecnologa del ADN recombinante que se basa en el clonaje del ADN. El clonaje de ADN consiste en generar un gran nmero de copias idnticas de una molcula de ADN. Para conseguir esto, un fragmento de ADN se une a una molcula transportadora, denominada vector de clonaje. Los vectores de clonaje son molculas de ADN que pueden manipularse e introducirse fcilmente en un organismo, donde pueden replicarse un gran nmero de veces. La inclusin de un fragmento de ADN en un vector permitir su introduccin y multiplicacin en un organismo, obtenindose un gran nmero de copias idnticas del fragmento de ADN. La forma ms habitual de introducir un fragmento de ADN (o varios) dentro de un vector es digiriendo ambos con enzimas de restriccin y unindolos mediante el empleo de ADN ligasas. Esta reaccin se lleva a cabo in vitro, generando una nica molcula denominada ADN recombinante que posteriormente se introduce en un organismo adecuado, en el que va a poder multiplicarse. Existe una gran variedad de vectores de clonaje pero todos ellos cumplen unas caractersticas: Son capaces de replicarse en un clula hospedadora de modo independiente al genoma de la clula. Suelen ser pequeos, para acoger la mayor cantidad de ADN posible y manejarlos con facilidad. Son fciles de purificar.

Poseen algn sistema que permite la seleccin o la identificacin de las clulas que lo han incorporado. Afectan lo mnimo a la clula hospedadora y se mantienen en ella sin ser modificados. Es fcil integrar en ellos ADN forneo y seleccionar las molculas de vector que lo han incorporado. Existen distintos tipos de vectores, que pueden clasificarse en funcin de su capacidad de multiplicarse en clulas procariotas o eucariotas, de su mayor o menor capacidad de clonaje y de sus posibles utilidades. Los ms importantes son los siguientes: Plsmidos: Los mas utilizados. Son molculas de ADN circular de origen bacteriano, capaces de replicarse independientemente y de heredarse con cierta estabilidad. Normalmente se utilizan como vectores en procariotas pero plsmidos modificados se utilizan tambin en clulas eucariotas. Su tamao es muy variable (de 1 a 250 kilobases) y su capacidad de clonaje, suele estar alrededor de la 10kb. El nmero de copias de un plsmido presentes en una clula es caracterstico de cada plsmido, y puede ir desde 1 hasta cientos. Algunos son capaces de integrarse en el cromosoma y mantenerse as estables durante numerosas divisiones celulares (plasmidos integrativos). Existe una gran variedad de plsmidos distintos, algunos han sido modificados in vitro, obteniendose plsmidos con nuevas caractersticas que facilitan y mejoran el clonaje o con propiedades particulares que permiten su uso con distintos fines. Virus: Se utilizan como vectores de clonaje tanto en procariotas como en eucariotas. El ADN exgeno se introduce en el genoma del virus, insertndolo o bien reemplazando partes de su genoma, sin afectar a su viabilidad. Clulas hospedadoras son infectadas con el virus recombinante permitiendo su multiplicacin. La capacidad de clonaje de los vectores virales es mayor que la de los plsmidos y permiten obtener un gran nmero de copias, pero su manipulacin es ms compleja. Algunos virus son capaces de integrarse en el cromosoma y mantenerse as estables durante numerosas divisiones celulares. En procariotas se utilizan bacterifagos. En eucariotas superiores, la mayor parte de los vectores son vricos y el tipo de virus utilizado depender del organismo hospedador (SV40 para clulas humanas, retrovirus, adenovirus, herpes, para clulas de mamfero o baculovirus para clulas de insecto). Existe una gran variedad de vectores virales, algunos ha sido modificados in vitro para conferirles nuevas caractersticas que faciliten y mejoren el clonaje o que les aporten propiedades particulares que permitan su uso con distintos fines. Csmidos: Son vectores artificiales hbridos construidos por un plsmido al que se le han unido las secuencias COS del fago , necesarias para el empaquetamiento del ADN en la capside del fago. Este vector posee las caractersticas de un plsmido, se replica y se segrega como un plsmido, pero adems es capaz de ser empaquetado in vitro por el fago . Esto nos permite utilizar la alta eficiencia del fago para introducir el vector en las clulas hospedadoras. Se utiliza como vector en procariotas y su capacidad de clonaje es alta, de casi 50 kb, pero debido al gran tamao de los insertos el nmero de copias por bacteria es bajo. Cromosomas Artificiales: Son vectores para clulas eucariotas (levaduras y mamiferos). Estn diseados para replicarse y heredarse como cromosomas normales, y poseen sitios para insertar ADN exgeno. Son vectores de clonaje de gran capacidad (pueden soportar hasta megabases). Dentro de los vectores cabe destacar por su utilidad los denominados vectores de expresin. En estos vectores se han introducido elementos genticos, que permiten controlar e inducir altos niveles de transcripcin y traduccin de los genes clonados. De esta forma se pueden obtener grandes cantidades de protenas codificadas por el ADN recombinante dentro de la clula huesped. Estos vectores de expresin se han diseado para producir protenas a escala industrial o con fines teraputicos (terapia gnica). El ADN recombinante debe ser introducido en la clula husped. El mtodo utilizado para ello depender del vector utilizado y del organismo husped. La introduccin de ADN exgeno en procariotas se denomina transformacin y su eficacia depende de la permeabilidad de la pared celular. Existen distintas tcnicas que permiten permeabilizar las membranas, permitindonos obtener clulas competentes, es decir, que tienen incrementada su capacidad de incorporar ADN extracelular. Una tcnica consiste en someter a las clulas a cationes divalentes (Cl 2Ca) y a

un posterior choque trmico, consiguiendo alterar las envueltas y aumentando su permeabilidad. Otra tcnica ms eficaz es la electroporacin, que se basa en someter a las clulas a una corriente elctrica de elevado voltaje durante un periodo de tiempo muy corto. Durante ese tiempo las membranas de las clulas se despolarizan y se forman pequeos orificios por los que pueden penetrar el ADN que se encuentran alrededor. Tras la transformacin, las clulas que ha recibido el ADN se suele denominar transformantes. Otra forma de introducir el ADN recombinante en la clula huesped consiste en utilizar virus. Estas tcnicas se denominan de infeccin o transduccin. Los vectores de clonaje viricos tienen la gran ventaja de utilizar la capacidad que tiene el propio virus para introducir, de forma muy eficaz, el ADN recombinante en la clula huesped adecuada. Los csmidos pueden ser empaquetados in vitro para ser introducidos en la clula hospedadora por transduccin. La introduccin de ADN exgeno en clulas eucariotas se denomina transfeccin. Para ello se pueden utilizan mtodos qumicos, que consiguen que el ADN recombinante forme complejos que las clulas son capaces de incorporar, mediante la ruta endoctica / fagoctica (metodo del fosfato clcico), a travs de la membrana permeabilizada (mtodo del DEAE dextrano y del Polibreno-DMSO) o por afinidad con las membranas (mtodo de lipofeccin). Tambin se pueden utilizar mtodos fsicos, basados en la introduccin de las molculas de ADN en el interior de la clula sin que estos formen complejos. La introduccin puede ser mecnica (microinyeccin directa, bombardeo gentico con microproyectiles revestidos con ADN, infiltracin a vacio) o por permeabilizacin de las membranas (por electroporacin o rayos laser). Tras la transfeccin, las clulas que ha recibido el ADN se denominar transfectantes y los organismos que derivan de ellas, transgnicos. Tras los procesos de transformacin, transduccin o transfeccin se deben seleccionar o identificar las clulas que ha incorporado el ADN recombinante. Para ello se emplea el sistema de seleccin o identificacin presente en el vector que se esta utilizando. Esta tecnologa del ADN recombinante nos permite modificar el ADN a nuestro antojo abriendo un abanico enorme de posibilidades. La secuenciacin de genomas completos, la obtencin de organismo modificados genticamente, el diseo y la generacin de nuevos frmacos, el desarrollo del diagnostico gentico y la terapia gnica son slo algunos ejemplos de las mltiples aplicaciones de esta tcnica. Los cidos nucleicos tambin pueden ser sometidos a tcnicas que nos permitan una mejor caracterizacin de los mismos, permitindonos conocer el tamao de las molculas, conocer su secuencia, detectar cambios en la secuencia o detectar la presencia de determinadas secuencias. Existen distintos mtodos que nos van a permitir la caracterizacin de los cidos nucleicos: Electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida: Esta tcnica nos permite, separar, caracterizar y purificar fragmentos de ADN y ARN. Consiste en introducir las molculas de ADN o ARN en un gel y someterlas a la fuerza de un campo elctrico. Debido a la carga negativa de los cidos nucleicos, estos migran hacia el polo positivo, pero los fragmentos de mayor tamao, encuentran mayor resistencia a travs del gel, y migran ms despacio. De esta forma se consiguen separar los fragmentos en funcin de su tamao. El tamao de poro del gel va a determinar su capacidad resolutiva, as, geles de acrilamida, con un tamao de poro muy pequeo, consiguen separar fragmentos que difieren en un solo nucletido. Una vez separadas, las molculas pueden ser visualizadas utilizando molculas fluorescentes intercalantes, como bromuro de etidio o SYBR-Green. Esta tcnica nos permite tambin estimar el tamao de los fragmentos comparando su migracin con la de fragmentos de tamao conocido. Las molculas as separadas y caracterizadas pueden recuperarse del gel y utilizarse posteriormente. Modificaciones de esta tcnica que permiten separar molculas de gran tamao. Todas ellas se basan en cambios en la orientacin y/o la polaridad del campo elctrico a lo largo del recorrido. En cada cambio las molculas debern reorientarse y el tiempo de reorientacin depender de su tamao (mayor tamao, mayor tiempo de reorientacin), consiguiendo su separacin. Ejemplos de estas tcnicas son: Pulsed Field Gel Electroforesis (PFGE), Orthogonal Field Alternative Gel Electroforesis (OFAGE), Field Inversin Gel Electroforesis (FIGE) y Contour clamped Homogeneus Electric Field (CHEF). Existen tcnicas que utilizan la electroforesis en gel para detectar cambios en la secuencia de

los cidos nucleicos: Polimorfismo de tamao de los fragmentos de restriccin (RFLP): Permite detectar mutaciones en secuencias de ADN. La presencia o ausencia de mutaciones en una secuencia puede generar o hace desaparecer sitios de restriccin. En esta tcnica el ADN es digerido con enzimas de restriccin y los fragmentos obtenidos se separan por electroforesis en un gel. Un cambio en el tamao de los fragmentos obtenidos pone de manifiesto la presencia de mutaciones en la secuencia. Heteroduplex y Polimorfismo Conformacional de Cadena Sencilla (SSCP): Ambas tcnicas nos permiten detectar mutaciones en secuencias de ADN. Cambios en la secuencia de ADN pueden provocar un desapareamiento de las bases, en molculas de cadena doble, o la formacin de estructuras secundarias, en molculas de cadena simple. La presencia de bases desapareadas o de estructuras secundarias provoca que las molculas migren de forma distinta al someterlas a electroforesis. Ambas tcnicas se basan en esto para detectar mutaciones. La tcnica de heteroduplex analiza molculas de ADN de doble cadena y la SSCP analiza molculas de cadena simple. Marcaje o etiquetado de cidos nucleicos: Algunas tcnicas de caracterizacin de cidos nucleicos necesitan que estos puedan ser detectados eficazmente. Por ello se utilizan tcnicas que nos permiten marcarlos o etiquetarlos. Los cidos nucleicos se pueden marcar en un extremo utilizando quinasas que, empleando ATP marcado, incorporan un grupo fosfato en el extremo 5, transfiriendo de esta forma el marcaje al cido nuclico. Tambin podemos marcar los cidos nucleicos sintetizndolos in vitro mediante polimerasas y utilizando nucletidos marcados. De esta forma el marcaje se incorporar a lo largo de toda la molcula. Otra opcin consiste en sintetizar los cidos nuclicos in vitro utilizando cebadores marcados para generar las molculas. Los marcadores que se utilizan son: istopos radiactivos (P32, S35, H3 y I125) capaces de excitar una pelcula fotogrfica, enzimas que llevan a cabo reacciones detectables (peroxidasa o fosfatasa), marcadores de afinidad que se detectan posteriormente mediante anticuerpos conjugados o estreptavidina (biotina o digoxigenina) o molculas quimioluminiscentes que producen luz y puede excitar una pelcula fotogrfica. Tcnicas de Hibridacin: Nos permiten detectar la presencia de una secuencia concreta en una muestra de cidos nucleicos. La base de estas tcnicas es la capacidad que poseen las cadenas de cidos nucleicos de unirse mediante puentes de H cuando sus secuencias son complementarias. Este proceso de unin es reversible, las cadenas pueden separarse (desnaturalizacin) y volverse a unir (renaturalizacin) si se alteran las condiciones ambientales. Si en una solucin, tenemos cidos nucleicos de procedencias distintas, pero con regiones complementarias, las cadenas van a poder asociarse, dando lugar a molculas hbridas. A este proceso se le denomina hibridacin y es le fundamento de estas tcnicas. La presencia de una secuencia concreta en una muestra de cidos nucleicos se detecta utilizando sondas de hibridacin. Las sondas son molculas de ADN o ARN homlogas a la secuencia que se quiere detectar, con la que hibridan de forma estable y especifica. Estas sondas pueden obtenerse por sntesis qumica, clonacin o PCR (se explica ms adelante), y se deben marcar, utilizando las tcnicas de marcaje anteriormente descritas. De esta forma, cuando la sonda se una a la secuencia diana, podr ser detectada. Las tcnicas de hibridacin se pueden llevar a cabo en varios formatos:

Hibridacin en soporte slido: Los cidos nucleicos de la muestra se inmovilizar en una membrana (de nitrocelulosa o nylon), se desnaturalizan y se hibridan con la sonda. A este formato pertenecen las siguientes tcnicas:

o Dot Blot o Slot Blot: Para detectar secuencias de ADN o de ARN. Se

inmoviliza en la membrana una gota (Dot blot) o una muesca (Slot Blot) de la muestra a analizar. o Southern Blot: Para detectar secuencias de ADN. La muestra se digiere con enzimas de restriccin, los fragmentos se separan por electroforesis en gel y finalmente se transfieren a la membrana (por capilaridad, vaco o

electroforesis), donde se lleva a cabo la hibridacin. (Fig. 3)

o Northern Blot: Para detectar secuencias de ARN. La muestra a analizar se

somete a electroforesis en gel y finalmente se trasfiere a la membrana (por capilaridad, vaco o electroforesis), donde se lleva a cabo la hibridacin. (Fig.3) Hibridacin in situ. Este modelo permite detectar la secuencia problema (de ADN o ARN) directamente sobre muestras histolgicas. Requiere un paso previo de permeabilizacin de las membranas celulares que permita la entrada de la sonda. Hibridacin en fase lquida. En este modelo la hibridacin se da en una solucin lquida. Se emplea en la tcnica de PCR en tiempo real (ver ms adelante).

Una vez se ha llevado a cabo la hibridacin, se analiza la presencia de molculas hbridas, procediendo a la deteccin de la sonda. El procedimiento de deteccin depender del tipo de etiquetado que se utiliz para marcar la sonda. Otra tcnica basada tambin en la hibridacin de cidos nucleicos son los microarrays o chips de ADN. (Fig.4) Esta tcnica permite la deteccin rpida y simultnea de miles de secuencias. Bsicamente consiste en: sintetizar sondas de ADN de cadena simple, para detectar todas las secuencias que se quieran analizar, e inmovilizarlas en un soporte slido de forma ordenada, obteniendo as una herramienta denomina microarray o chip. La muestra que se quiere analizar, que puede ser de ADN o ARN, se somete a un proceso de marcaje y posteriormente se hibrida con el chip. Tras la hibridacin se lleva a cabo el revelado que pone de manifiesto la presencia de hbridos. Dado que conocemos la secuencia y el orden en el que estn colocadas las sondas en el chip podremos detectar qu secuencias estaban presentes en la muestra. Esta tcnica es sumamente verstil ya que los chips se pueden disear de forma personalizada segn la aplicacin que se le quiera dar y la cantidad de informacin que se obtiene simultneamente es enorme. Tcnicas de secuenciacin: Permiten conocer la secuencia de los cidos nucleicos. La tcnica ms utilizada es el mtodo de Sanger (Fig.5). Consiste en sintetizar ADN in vitro en presencia de una mezcla de nucletidos normales y nucletidos artificiales (didesoxinucleotidos) que adems estn marcados (radiactivamente o con un fluorocromo). Los dideoxinucleotidos impiden que contine la extensin de la cadena de ADN cuando se incorporan, generando de esta forma fragmentos de distintos tamaos que son separados por electroforesis. Siguiendo los fragmentos, de menor a mayor tamao, y detectando del marcaje, que nos permite conocer cul a sido el ltimo nucletido introducido en cada fragmentos, podemos obtener la secuencia de la molcula. Esta tcnica de secuenciacin suele requerir un paso previo de clonaje del ADN a secuenciar. Actualmente existen tcnicas ms sofisticadas que permiten secuenciar sin necesidad de clonar (pirosecuenciacin). 2. TCNICAS DE PCR Y SUS DISTINTOS USOS. La tcnica de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa o PCR (Fig.6) ha sido una tcnica clave para el avance de la biologa molecular en los ltimos 25 aos. Esta tcnica permite generar in vitro un gran nmero de copias idnticas de un fragmento de ADN a partir de una cantidad mnima del mismo. Esta tcnica se basa en reproducir in vitro la forma en la que el ADN se replica de modo natural en las clulas. Para ello se emplean ADN polimerasas. Como ya se ha comentado anteriormente estas enzimas son capaces de sintetizar una hebra de ADN complementaria utilizando una hebra de ADN molde. Para ello, necesitan un oligonucletido, complementario a la cadena molde, que acte como cebador, sobre el que ir aadiendo desoxirribonucletidos en el extremo 3'. De esta forma la cadena se va sintetizando en direccin 5 3. En la PCR se emplean dos oligonucletidos sintticos, que delimitan el fragmento que se va a amplificar, ya que sus secuencias son complementarias a las de sus extremos. Esto implica un conocimiento previo de la secuencia de ADN, que nos permita disear estos oligonucletidos.

El mecanismo de esta tcnica consiste en la repeticin consecutiva de un ciclo que consta de 3 fases: 1. Desnaturalizacin de ADN molde: Para que comience la reaccin es necesario que el ADN molde se encuentre en forma de cadena sencilla. Esto se consigue aplicando altas temperaturas (90 a 95C) que rompen los puentes de hidrgeno intercatenarios y provocan la separacin de ambas cadenas. Para conseguir la completa separacin de todas las hebras de la muestra esta temperatura debe mantenerse unos 45 segundos. 2. Hibridacin de los cebadores: En este paso se produce la unin de los cebadores, con sus correspondientes secuencias complementarias, presentes en el ADN molde. Esto se consigue disminuyendo la temperatura. La temperatura ptima de hibridacin (que debe estar entre los 40-70C) es de 2-5C ms baja que la temperatura de fusin (Tm) de los cebadores. La Tm de cada cebador es especifica y depende de su longitud y de su secuencia. Se puede calcular mediante la siguiente formula: Tm = 4(G+C) + 2(A+T). 3. Elongacin o extensin: Una vez que lo cebadores han hibridado, la enzima ADN polimerasa sintetiza, a partir de los extremos 3 de los cebadores, la cadena complementaria a la cadena molde. Esto se lleva a cabo a una temperatura ptima para el funcionamiento de la polimerasa (72C) y durante un periodo de tiempo que permita a la enzima completar el fragmento que va amplificar (suele ser de 1 minuto por Kb). La repeticin consecutiva de ciclos va a permitir una amplificacin exponencial del nmero de copias del ADN molde. El nmero de copias que se obtienen (N) se puede calcular como N = 2 n , donde n es el nmero de ciclos realizados. As, en una PCR convencional (de unos 30 ciclos) alcanzaramos un aumento del material de partida de 9 rdenes de magnitud. Antes de comenzar los ciclos, suele haber una etapa de desnaturalizacin adicional, que favorece la completa separacin de todas las hebras de la muestra y cuando ya se han completado todos los ciclos, suele haber una etapa adicional de elongacin, de varios minutos, para asegurar que no quedan cadenas sencillas libres. Antiguamente se usaban ADN polimerasas que se inactivaban por calor, por lo que haba que aadir enzima en cada ciclo de amplificacin. Actualmente se utilizan ADN polimerasas termoresistentes capaces de funcionar a altas temperaturas y de soportar los cambios. La utilizacin de estas enzimas permiti la automatizacin del proceso que actualmente se lleva a cabo en un aparato denominado termociclador. Este aparato controla automticamente la duracin y la temperatura de cada fase, as como el nmero de ciclos de amplificacin al que se somete la muestra. Los componentes que deben estar presentes en la reaccin son:

DNA molde: Es el objeto de la amplificacin (ADN genmico, ADN plasmdico, ADNc).

Su pureza e integridad deben ser altas. Su cantidad debe ser suficientemente como para permitir la amplificacin y pero no muy alta, ya que puede inhibir la reaccin. Dos cebadores: Complementario a cada extremo del fragmento de ADN que se quiere amplificar. Deben aadirse en cantidad suficiente, no limitante. La especificidad de los cebadores es crucial, por lo que al disearlos hay que tener en cuenta varias consideraciones: no deben hibridar entre ellos y no deben formar estructuras secundarias, su secuencia debe ser especifica, con un alto contenido en CG y sin bases repetidas, y su longitud debe ser suficiente para conferirles especificidad (en torno a 18 nucletidos). DNA polimerasa: Deben ser termoresistentes. Existen gran variedad de polimerasas que difieren en su capacidad de amplificacin y en su actividad exonucleasa. La eleccin de la ADN polimerasa adecuada depender del objetivo de la tcnica. Nucletidos (dNTPs): Se deben suministrar los 4 tipos de nucletidos (dATP, dTTP, dGTP y dCTP) en una proporcin equilibrada y en cantidad suficiente, no limitante. Cationes divalentes (habitualmente Mg o Mn): Actan como coenzimas de la ADN polimerasa por lo que son necesarios para su actividad. Sin embargo, tambin son capaces de alterar la hibridacin de los cebadores con el ADN diana, afectando a su especificidad. Por lo tanto, la concentracin de cationes divalentes debe ser suficiente para un buen rendimiento de la reaccin sin afectar a la especificidad.

 Buffer o solucin tamponante. Para controlar el pH del medio.

La tcnica de PCR es una tcnica de amplificacin que nos permite detectar cantidades muy pequeas de ADN molde, lo que hace que sea una tcnica extremadamente sensible. Esto en ocasiones puede suponer un problema, ya que cualquier mnima contaminacin con ADN extrao puede dar lugar a amplificaciones inespecficas. Tambin hay que tener en cuenta que existen limitaciones en cuanto al tamao del ADN amplificado. En secuencias mayores de 3 kilobases la amplificacin empieza a dar problemas de eficiencia que pueden ser solventados ajustando la etapa de elongacin y utilizando enzimas con una mayor capacidad de amplificacin. Sin embargo, sigue existiendo un lmite de tamao en la amplificacin. Tras las reaccin de PCR, el ADN amplificado se somete a electroforesis en gel de agarosa y a marcaje con un compuesto fluorescente para visualizarlo. Esto nos va a permitir separar el fragmento de ADN amplificado, determinar su tamao (comparandolo con patrones de peso molecular conocido) y purificarlo para su utilizacin en otras tcnicas de biologa molecular. El ADN amplificado tambin se puede detectar utilizando las tcnicas de hibridacin, anteriormente descritas. Existe una gran variedad de tcnicas que se basan en la PCR. Estas son las ms importantes: PCR mltiple (multiplex PCR): Permite amplificar en la misma reaccin, varios fragmentos de ADN a partir de la misma muestra. Esto se consigue incluyendo en la misma reaccin varios pares de cebadores que amplifiquen fragmentos diferentes de ADN. Esta tcnica se puede utilizar para identificar la presencia de diferentes organismos en una misma muestra o para detectar la presencia de varios genes a la vez. PCR anidada (nested PCR) (Fig.7): Permite aumentar la sensibilidad y la especificidad de una PCR convencional. Consiste en utilizar el producto de una primera PCR como molde para una segunda reaccin de PCR, en la que se utilizan cebadores que hibridan en una secuencia interna del producto de la primera PCR. Esto permite utilizar unas condiciones menos especficas en la primera reaccin y ms especficas en la segunda, mejorando la sensibilidad y la especificidad. PCR in situ: Esta tcnica permite amplificar fragmentos de ADN en muestras de tejido. Consiste en realizar una PCR sobre secciones histolgicas. Para ello deben permeabilizarse las membranas celulares antes de realizar la PCR y los cebadores deben marcarse con biotina para permitir la deteccin del producto de la PCR. PCR con retrotranscripcin (Reverse Transcription-PCR, RT-PCR): Permite obtener a partir de ARN molde molculas de ADN y amplificarlas. Consiste en copiar el ARN molde a ADNc mediante una transcriptasa inversa y posteriormente amplificar ese ADNc por PCR. Esta tcnica se utiliza para, detectar molculas de ARN, analizar la expresin del ARNm, y construir bibliotecas de ADNc. PCR a tiempo real (Real Time PCR) o PCR cuantitativa: Permite cuantificar el nmero de molculas iguales, de ADN o ARN, que hay en una muestra. Consiste en llevar a cabo una reaccin de PCR en la que se aaden molculas fluorescentes (como sondas, agentes intercalantes, etc..) que nos permiten detectar las molculas de ADN que se van generando durante la PCR. La reaccin se lleva a cabo en un termociclador especial que llevan incorporado un sistema de deteccin de fluorescencia, permitiendonos monitorizar, en tiempo real, lo que esta ocurriendo dentro de cada reaccin. La deteccin de la fluorescencia permite cuantificar las copias que se van generando en cada ciclo, pudiendo extrapolar el nmero de molculas molde del material de partida. Entre sus mltiples aplicaciones estn el anlisis de la expresin gnica, la discriminacin allica, la determinacin de la carga viral, etc RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends): Esta tcnica es una modificacin de la RT-PCR. Permite amplificar fragmentos de ADNc. Consiste en retrotranscribir el ARN a ADNc mediante una RT-PCR y posteriormente realizar una PCR utilizando como molde ese ADNc, para amplificar una secuencia especifica. Esta tcnica se utiliza entre otras cosas, para determinar el sitio de inicio de la transcripcin de los genes. PCR con cebadores degenerados: Permite amplificar regiones de ADN en las que slo se

conoce la secuencia de uno de los extremos. Se emplea una mezcla de oligonucletidos generados al azar, consiguiendo que alguno actue de cebador en el extremo desconocido. Hot Start PCR: Permite aumentar la especificidad de la reaccin. Consiste en aadir la ADN polimerasa a la reaccin despus del primer paso de desnaturalizacin, evitando la generacin de fragmentos no deseados durante el primer paso de desnaturalizacin. Actualmente muchas polimerasas comerciales estn bloqueadas y slo se activan tras el paso de desnaturalizacin inicial. La tcnica de PCR y todas sus variantes tienen mltiples aplicaciones: Son tcnicas que combinan una alta sensibilidad y una alta especificidad, lo que las convierte en herramientas muy tiles para: el diagnostico gentico, la identificacin de alelos, la deteccin de mutaciones, el diagnostico de infecciones, la deteccin de organismos contaminantes en alimentos, la identificacin de organismos, etc.

La capacidad de estas tcnicas de generar grandes cantidades de ADN a partir de una

muestra original de pequea cantidad, nos permite mejorar el clonaje de ADN e incluso las convierte en una alternativa al clonaje. Esto hace que sean una herramienta muy til para: la generacin de material para la obtencin de organismos modificados genticamente, la generacin de sondas para tcnicas de hibridacin, la secuenciacin masiva de genomas, etc. La posibilidad de esta tcnica de generar secuencias de ADN con modificaciones la convierte en una herramienta muy til para: la modificacin del material gentico, la obtencin de organismos modificados genticamente, el clonaje dirigido de secuencias, etc.