Informacin Tecnolgica-Vol. 17 N3-2006, pg.

: 41-46 Pretratamiento Enzimtico de Expandido de Soja para la Extraccin de Aceite con Solvente Enzymatic Pretreatment of Soybean Collets for Solvent Extraction of Soybean Oil Florencia V. Grasso, Beatriz G. Maroto y Celso C. Camusso Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Nacional de Crdoba, Av. Valparaso s/n, CC 509, 5000 CrdobaArgentina (e-mail: fgrasso@agro.uncor.edu) Resumen El objetivo del presente trabajo es investigar la utilizacin de un pretratamiento enzimtico sobre expandido de soja para la extraccin de aceite con solvente. Se investigaron los efectos de un pretratamientomulti-enzimtico sobre el rendimiento de la extraccin. Se aplic la Metodologa de Superficies de Respuesta para evaluar el rendimiento en aceite como funcin del pH, temperatura y tiempo de hidrlisis enzimtica empleando tcnicas de regresin mltiple. Se prob la adecuacin de un modelo de segundo orden y se calcul las condiciones ptimas de hidrlisis enzimtica para obtener el mximo rendimiento terico en aceite. Las condiciones ptimas calculadas fueron: temperatura de 43.5 C, pH de 5.4 y tiempo de incubacin de 5.8 h. Bajo estas condiciones, el mximo rendimiento en aceite predicho por la funcin fue de 26.64 % sobre base seca. Palabras claves: enzimas, extraccin por solvente, aceite de soja, expandido de soja Abstract The objective of this research was to investigate the use of an enzymatic pretreatment of soybean collets for solvent extraction of the oil. The effect of multienzymatic pretreatment on extraction yield was investigated. Response Surface Methodology was applied to evaluate the oil yield as a function of pH, time, and temperature of the enzymatic hydrolysis by employing multiple regression techniques. The adequacy of a second-order model with interaction terms was tested and optimal enzymatic hydrolysis conditions for maximum oil yield were calculated. The optimal conditions calculated were: temperature 43.5 C, pH 5.4 and incubation period 5.8 h. Under these conditions, the maximum yield of oil as predicted by the function was 26.64% on a dry weight basis. Keywords: enzymes, solvent extraction, soybean oil, soybean collets INTRODUCCION Los aceites se encuentran en vacuolas intracelulares y tambin enlazados a protenas y a una amplia variedad de carbohidratos (celulosa, hemicelulosa, pectina, almidn, etc.). Para facilitar la extraccin de aceite con solvente a partir de semillas oleaginosas es necesario degradar las paredes celulares a fin de incrementar la permeabilidad del aceite (Olsen, 1988). Esto puede lograrse aplicando tratamientos mecnicos y trmicos. La soja necesita, al igual que otras semillas ciertas operaciones de pretratamiento para facilitar la extraccin de aceite. Los pretratamientos convencionales para soja incluyen descascarado, reduccin de tamao, laminado y tratamiento trmico/hidrotrmico, cocido o tratamiento con

vapor (Shankar et al., 1997). Estos pretratamientos tienen como objetivo mejorar la transferencia de masa. Tambin puede obtenerse una mejora en el rendimiento y la velocidad de extraccin destruyendo las paredes celulares de los granos de soja por accin enzimtica (Smith et al., 1993; Dominguez et al., 1995 y 1996).En experiencias previas se demostr, a partir de molido y laminado de soja (flakes), que la hidrlisis enzimtica es un pretratamiento viable, obteniendose una mejora significativa sobre el rendimiento en aceite respecto de la extraccin convencional con solvente (Grasso et al., 2002 y 2003). El objetivo de este trabajo es evaluar las variables: pH, temperatura y tiempo de incubacin enzimtica sobre el rendimiento en aceite, utilizando el Mtodo de Superficies de Respuesta (MSR) para el pretratamiento enzimticoextraccin por solvente a partir de expandido de soja (collets) obtenido en planta. PARTE EXPERIMENTAL Materiales Soluciones tampn: las soluciones utilizadas fueron de pH 4,5; 5,0; 5,8; 6,6 y 7,2 preparadas a partir de soluciones estndares de KH2PO4 1/15 mol/L y Na2HPO4 1/15 mol/L. Las drogas utilizadas fueron de grado analtico marca Sigma y Merck. Sistema de reaccin: todas las incubaciones enzimticas se realizaron en frascos erlenmeyer de vidrio de 150 mL y en bao termostatizado a la temperatura de trabajo con agitacin suave (100 rpm). Expandido de soja: las muestras de expandido de soja fueron obtenidas de la planta industrial Bunge Argentina S.A. de la localidad de Tancacha, Crdoba, Argentina. Enzimas: se utilizaron preparaciones de uso industrial con actividades individuales celulasa (Multifect GC), hemicelulasa (GC 440), pectinasa (Multifect XL), amilasa (Spezyme Fred), glucoamilasa (Optidex L-400) y proteasa (Multifect Neutral). Las mismas fueron provistas por Genencor Internacional S.A. A partir de estas enzimas comerciales se prepar la mezcla enzimtica empleada en todos los ensayos. Mtodos Analticos El contenido total de aceite fue determinado por el mtodo Soxhlet usando hexano como solvente extractor. Las cenizas y la humedad fueron determinadas segn las metodologas AOAC (Horwitz, 1998). La protena cruda fue calculada sobre el valor de nitrgeno Kjeldahl (N x 6,25). El contenido de Nitrgeno se determin espectrofotomtricamente segn el mtodo Apostolatos (Apostolatos, 1984). Los carbohidratos totales se calcularon por diferencia. Optimizacin de Variables Se utiliz un diseo de 20 determinaciones experimentales para evaluar el rendimiento en aceite extrado en funcin de las tres variables mencionadas. Cada experimento consisti en inactivacin de lipasas a 90 C durante 15 minutos, incubacin multi-enzimtica con hemicelulasa, celulasa, proteasa, amilasa, glucoamilasa y pectinasa cada una a 0,5 % p/p calculado sobre el sustrato. Para cada ensayo se utiliz una muestra de expandido de soja de 10 g y se ajust la relacin slido/lquido a 1:7 con solucin tampn al pH de trabajo. La temperatura se mantuvo constante durante el perodo de incubacin establecido. Posteriormente, se separaron las fracciones por centrifugacin. La fase slida se sec en estufa a 60 C hasta peso constante. El slido mantuvo su estructura

porosa luego del secado por lo que no fue requerida una etapa posterior de molienda. Sobre esta fraccin slida hidrolizada y secada se extrajo el aceite en un equipo Soxhlet durante 6 h con hexano grado analtico. El rendimiento en aceite fue calculado por pesada de la miscela evaporada al vaco. El esquema de un ensayo se presenta en la Fig. 1. El diseo experimental se bas en la Metodologa de Superficies de Respuesta.

tres tipos de experimentos: ensayos factoriales (ensayos llevados a cabo a niveles inferior y superior de las variables diseadas; 8 determinaciones); ensayos centrales (replicaciones del punto central del diseo; 6 determinaciones) y ensayos axiales (ensayos llevados a cabo a una distancia 1,68 uniforme del centro del diseo; 6 determinaciones) (Montgomery, 1991). En la Tabla 1 se muestran las condiciones experimentales para cada experimento. Las variables codificadas son: X1 = (T - 50) / 20; X2 = (pH - 5,8) / 0,8 y X3 = (t - 8) / 4. Tabla1: Rendimientos para los ensayos del diseo experimental. N Variables Rendimiento ensayo codificadas (% Aceite) X1 X2 X3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 0 0 0 0 0 0 -1 -1 +1 +1 +1 +1 -1 -1 0 -1,68 0 0 0 26.19 0 0 26.74 0 0 26.79 0 0 26.39 0 0 26.66 0 0 26.68 -1 -1 25.84 -1 +1 25.01 -1 -1 25.46 -1 +1 23.20 +1 -1 23.12 +1 +1 25.98 +1 -1 24.34 +1 +1 23.15 0 -1,68 24.93 0 0 24.27 0 24.38 1,68 0 + 0 26.01 1,68 +1,68 0 0 21.58 0 0 +1,68 25.31

Fig. 1: Diagrama de flujo de un ensayo de pre-tratamiento enzimtico-extraccin con hexano. Esta tcnica estadstica permite investigar procesos complejos. Los niveles de los factores fueron cuidadosamente seleccionados en funcin de la bibliografa disponible y experiencias previas (Grasso et al., 2002 y 2003). Los niveles y las variables ensayados fueron: temperatura, T, entre 30 y 70 C; pH entre 5 y 6,6 y tiempo de incubacin, t, entre 4 y 12 horas. Se desarroll esta tcnica para el rendimiento en aceite en base seca (% BS) como una funcin cuadrtica de estas variables, empleando tcnicas de regresin mltiple. Este procedimiento permite determinar el mximo rendimiento esperado terico en aceite. El diseo seleccionado consiste en

RESULTADOS Y DISCUSION La estructura del diseo experimental permite el desarrollo de una ecuacin emprica, donde la funcin objetivo, Y, puede calcularse como la suma de una constante (bo), tres efectos de primer orden (b1, b2, b3), tres efectos cuadrticos (b11, b22, b33), tres trminos de interaccin (b12, b23, b13) y el error experimental e: Y = bo + b1 X1 + b2 X2 + b3 X3 + b11 X12 + b22 X22 + b33 X32 + b12 X1X2 + b23 X2X3 + b13 X1X3 (1) +e donde Y = rendimiento en aceite (% base seca, BS). La adecuacin del modelo se compar sobre la base de los coeficientes, del error estndar y el anlisis de residuos. El modelo debe describir como afectan los parmetros de hidrlisis enzimtica sobre el rendimiento en aceite. Se encontr que el pretratamiento enzimtico ajusta a una funcin polinmica de la temperatura, para su efecto cuadrtico y del pH, tambin para su efecto cuadrtico. Para los efectos restantes, la variacin no es estadsticamente significativa (p>0,05). Tambin puede deducirse que no existen efectos significativos para la variable tiempo de

incubacin ni para los trminos de interaccin entre variables. Por lo tanto, la funcin objetivo, eliminados los trminos no significativos, se defini como: Y = 4,24.103- 3,1.10-3 T2 - 0,727 pH2+error (2) Los contornos de la superficie de respuesta predecida para el rendimiento de la extraccin de aceite de soja con hexano asistida con enzimas fueron generados por computadora como funcin de los dos parmetros significativos, manteniendo el tiempo en su valor central (Fig. 2). Como puede observarse, el rendimiento en aceite se incrementa con el aumento de cada parmetro indicando la existencia de un mximo terico. En el intervalo de variables estudiado, la funcin exhibe un punto de mximo rendimiento terico en aceite (26,64 %BS). Las condiciones experimentales de este ptimo se calculan por diferenciacin parcial e igualacin a cero con respecto a cada variable. Las condiciones ptimas encontradas para este mximo son: 43,5 C y pH 5,4 para la incubacin enzimtica durante 5,8 h. En la Tabla 2 se observa que el contenido total en aceite del expandido de soja es menor que el rendimiento terico esperado para la extraccin: pretratamiento enzimticoextraccin con solvente. Esto puede deberse a que se libera aceite extra enlazado a otras macromolculas, que no puede extraerse cuando se utiliza el mtodo convencional (Smith et al., 1993). Tabla 2: Composicin del expandido de soja. Componentes (g/100g) Humedad 22.71 Aceite total 20.69 Protenas 38.51 Cenizas 5.53 Carbohidratos 12.56 totales La Tabla 3 resume la significancia del modelo global. Como puede observarse, el valor p indica que el modelo es significativo con ms del 99 % de confianza. Por otro lado, se comprueba la adecuacin del modelo cuadrtico con ms del 99 % de confianza, un error total de 0,864 y una falta de ajuste no significativa con una confianza superior al 99 %. Tabla 3: Resultados de ANOVA para optimizacin del rendimiento en aceite.
SC 32.550 8.636 41.186 30.609 8.364 0.272 8.636 GL 9 10 19 6 5 5 10 MC 3.617 0.864 2.168 5.102 1.673 0.054 0.864 F-Fisher 4.188 valor-p 0.0178

Fig. 2: Contornos del rendimiento en aceite (% sobre base seca) en funcin del pH y temperatura de incubacin enzimtica CONCLUSIONES La hidrlisis enzimtica ha sido estudiada para mejorar la eficiencia de los procesos acuosos, sin embargo el rendimiento de la extraccin acuosa de soja es inferior al proceso de extraccin por solvente (Santos y Ferrari, 2005). Una opcin es aplicar la hidrlisis enzimtica a los procesos convencionales de extraccin actualmente empleados en las industrias aceiteras para obtener aceite de soja. Smith et al., (1993) obtuvo un incremento del 1,51 % en la liberacin de aceite debida a la hidrlisis enzimtica, cuando esta es combinada con prensado mecnico, mientras que Dominguez et al. (1995) obtuvo un incremento del 6 % para la hidrlisis enzimtica combinada con extraccin por solvente a partir de laminado de soja. Nuestros resultados indican mejores rendimientos para expandido de soja (cercanos al 27 %) que para molido de soja (cercanos al 23 %), aunque menores a los observados para laminado de soja (cercanos al 28%), obtenidos en experiencias previas (Grasso, et al., 2002 y 2003). Esto determinara que se podra incorporar la incubacin enzimtica a la salida de la operacin de laminado. Entre las ventajas esperadas a partir de la aplicacin de un pretratamiento enzimtico se pueden enfatizar: el incremento del rendimiento de la extraccin de aceite y la disminucin de la cantidad de solvente a utilizar y/o reduccin del tiempo de extraccin para la obtencin de la misma cantidad de aceite (Ziga et al., 2003). Los aspectos que necesitan ser revisados son los costos de las enzimas, el consumo energtico para el calentamiento durante el secado, el consumo energtico para el calentamiento durante la incubacin y las prdidas de aceite en la fase acuosa. Para minimizar el costo energtico por secado y por incubacin deberan desarrollarse enzimas con actividades mximas a temperaturas ms bajas y que puedan usarse en estado slido. Esta ltima opcin aportara adems una solucin a las prdidas de aceite en la fase acuosa, ya que podran disearse procesos de incubacin simultneos a la extraccin, a condiciones de humedad reducidas. AGRADECIMIENTOS Este trabajo fue financiado por la Secretara de Ciencia y Tecnologa de la Universidad Nacional de Crdoba y CONICET. Agradecemos a Genencor Internacional Inc y a Bunge Argentina S.A. por aportar las enzimas y las muestras de expandido de soja, respectivamente.

Modelo Error Ajuste total Cuadrtico Falta de ajuste Error puro Error total

5.907 30.729

0.0072 0.0009

REFERENCIAS Apostolatos, G., A rapid inexpensive procedure for determination of nitrogen in plant materials, Journal of Food Technology, 639-642 (1984). Dominguez, H; M. J. Nuez y J. M. Lema, Enzyme-assisted hexane extraction of soya-bean oil, Food Chemistry, 54, 223231(1995). Dominguez, H; J. Sineiro; M. J. Nez y J. M. Lema, Enzymatic treatment of sunflower kernels oil extraction, Food Chemistry,28, 537-545(1996). Grasso, F; B. Maroto y C. Camusso, Influencia de las variables de proceso en un pretratamiento enzimtico para extraccin de aceite de soja, XIX Congreso Argentino de Qumica, Santa F, Argentina, Agosto (2002). Grasso, F.; B. Maroto y C. Camusso, Pretratamiento enzimtico para mejorar la extraccin de aceite por solvente a partir de laminado de soja, XIX Jornadas IRAMUniversidades y IV Foro Unilab, San Luis, Argentina, Octubre (2003). Horwitz, W., Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemist's, 16th Ed, Wisconsin, USA(1998). Montgomery, D.C., Design and analysis of experiment, 467509, Wiley Inc, New York, USA(1991). Olsen, H. S., Aqueous enzymatic extraction of oil from seeds, Asean Food Conference '88, Thailand(1988). Shankar, D.; Y. C. Agrawal; B. C. Sarkar y B. P. N. Singh, Enzymatic hydrolysis in conjunction with conventional pretreatment to soybean for enhaced oil availability and recovery, Journal of the American Oil Chemist s Society, 74, 1543-1547(1997). Smith, D.D.; Y. C. Agrawal; B. C. Sarkar y B. P. N. Singh, Enzymatic hydrolysis pretreatment for mechanical explelling of soybeans, Journal of the American Oil Chemist s Society, 70, 885-890(1993). Santos, R. D. y R. A. Ferrari, Extraoaquosa enzimtica de leo de soja, Cincia y Tecnologia Alimentaria, 25, 132138(2005). Ziga, M. E.; C. Soto; A. Mora; R. Chamy y J. M. Lema, Enzymatic pre-treatment of Guevinaavellanamol oil extraction by pressing, Process Biochem, 39, 51-57(2003).