INSTITUT PASTEUR

D’ALGERIE
LABORATOIRE CENTRAL DE LA
TUBERCULOSE

DIAGNOSTIC
BACTERIOLOGIQUE DE LA
TUBERCULOSE
ET DES MYCOBACTERIOSES

D. YALA
 M. TAZIR.

PREFACE
Ce guide du diagnostic bactériologique de la tuberculose se veut un
manuel à l’intention des étudiants en médecine et aux autres professionnels de
santé : Agents de laboratoire de bactériologie ( microscopiste ), Paramédicaux
....

C’est un outil de référence pour le diagnostic bactériologique de la

tuberculose .

Rédigé par d’éminents bactériologistes, il comporte 3 parties distinctes :

- Le premier chapitre est relatif à un rappel sur les caractères
fondamentaux des mycobactéries .
- Le deuxième chapitre se rapporte au diagnostic bactériologique de la
tuberculose depuis le recueil des divers prélèvements, en passant par la
conservation, le transport jusqu’à l’interprétation des résultats.

En plus des méthodes “ classiques ” de diagnostic de la tuberculose

(microscopie, culture), les auteurs expliquent et décrivent les nouvelles
techniques de diagnostic comme la Polymerase Chain Reaction (P.C.R.).

La fin du manuel comporte des annexes qui permettront de mieux

comprendre certains points plus difficiles.

Ce document pédagogique reste une référence et un outil de travail

indispensable pour les personnels de santé chargésde la lutte antituberculeuse
(médecins - infirmiers - laborantins).

Le Président du Comité Pédagogique

du module de Pneumo-phtisiologie
Pr. Salim NAFTI

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 SOMMAIRE

I - Place des Mycobactéries dans le monde bactérien

II - Classification médicale des Mycobactéries

III- Caractères fondamentaux des Mycobactéries

IV- Les Mycobactéries de la tuberculose

V - Les Mycobactéries atypiques ( généralités)

VI- Diagnostic bactériologique de la tuberculose

VII- Les nouvelles techniques de diagnostic de la tuberculose

- Annexes

3
GENERALITES :
=============

I. Place des mycobactéries dans le monde bactérien.

Le genre Mycobacterium appartient à la famille des Mycobactériaceae dans

l’ordre des actinomycetales. Les mycobactéries sont caractérisées par leur
aptitude à conserver la coloration par la fushine et de ne pas être décolorées par
les acides dilués et l’alcool. Elles sont dites Acido-Alcoolo-Résistantes (AAR).

II. Classification médicale des mycobactéries.

Les mycobactéries peuvent être classer en trois groupes différents :

1° Groupe : Les mycobactéries responsables de tuberculose (Maladie

transmissible). Ces bactéries appartiennent au complexe tuberculosis.

- Mycobacterium tuberculosis appelé aussi bacille

tuberculeux ou bacille de Koch (B.K). Il est responsable de la majorité des
tuberculoses humaines .
- Mycobacterium bovis responsable des tuberculoses
bovines, mais l’homme peut être contaminé .
- Mycobacterium africanum responsable de
tuberculose en Afrique centrale et occidentale ; il n’a jamais été isolé en
Algérie.

2° Groupe : Les mycobactéries responsables de mycobactérioses (Maladie

non transmissible) appelées mycobactéries de l’environnement ;
mycobactéries opportunistes ou mycobactéries atypiques. Dans ce groupe,
on retrouve une centaine d’espèces .
Exemple :
- Mycobacterium avium souvent responsable de
mycobactériose chez l’immuno-déprimé (SIDA).
- Mycobacterium fortuitum
- Mycobacterium gordonae etc......

3° Groupe : Mycobactéries responsables de la lèpre :

- Mycobactérium lepreae ou bacille de Hansen qui est
un bacille non cultivable “ In-vitro ”, responsable de la lèpre chez l’homme
- Mycobacterium lepreae murium responsable de la lèpre chez
la souris.

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III. Caractères fondamentaux des mycobactéries :

a/ L’Acido-Alcoolo-Résistance (A.A.R.) des mycobactéries est un

caractère tinctorial utilisé en microscopie après coloration de Ziehl Neelsen
pour poser le diagnostic positif de la tuberculose.

b/ Les mycobactéries présentent une résistance relative aux détergents

et aux désinfectants chimiques (acide sulfurique, soude) par rapport aux
germes banals , ce caractère est utilisé pour décontaminer les prélèvements
avant leur mise en culture.

IV. LES MYCOBACTERIES DE LA TUBERCULOSE :

Ce chapitre concerne essentiellement M.tuberculosis responsable de la
majorité des tuberculoses humaines .

1- Caractères bactériologiques de bacille de la tuberculose: (M..tuberculosis)

A/ Caractères morphologiques :

M. tuberculosis est un bacille immobile, à extrémités arrondies, de 2 à 5 de

long sur 0,2 à 0,3 µ de large. Il est acapsulé. Il se colore mal par les colorants
usuels tel que la coloration de Gram et par le bleu de méthylène. Coloré par la
fushine phéniquée à chaud, le bacille tuberculeux se colore en rouge et n’est
pas décoloré par l’acide sulfurique à 25% et par l’alcool à 95° comme le
seraient toutes les bactéries autres que les mycobactéries. Après coloration, ces
bactéries apparaissent au microscope optique comme des bâtonnets rouges,
légèrement incurvés, isolées ou en petits amas.

B/ Caractères culturaux :

Comme toutes les mycobactéries; M.tuberculosis est un bacille aérobie strict .

La température optimale de croissance est comprise entre 35 et 37°C.
Le pH physiologique est de 6,9. C’est un germe très exigeant , qui ne pousse
pas sur milieux gélosés usuels . Il se cultive sur milieux à base d’œufs. Il est
caractérisé par sa lenteur de croissance . Il se divise une fois
toutes les 20 heures, ce qui explique pourquoi , les colonies sont visibles en 3 à
4 semaines et non pas en 18 à 24 heures comme celles d’Escherichia Coli par
exemple, dont le temps de division est de 20 minutes.

5
Après 21 à 28 jours d’incubation, on voit apparaître de petites colonies opaques,
arrondies de couleur crème. En se développant, elles prennent un aspect
rugueux, verruqueux torsadé, en “chou -fleur ”, de teinte crème-beige à
chamois.

C/ Caractères biochimiques :

Les caractères biochimiques gardent toute leur importance dans l’identification

des espèces des mycobactéries. A titre d’exemple : M.tuberculosis est
producteur d’acide nicotinique, tandis que la plupart des autres mycobactéries
n’ont produisent pas.

2 - Viabilité de M. tuberculosis :

M.tuberculosis est très sensible

- à la chaleur ;
- à la lumière solaire ;
- aux rayons X ;
- aux Ultra-Violet;
- à l’eau de javel
- et à l’alcool (5 mn par l’alcool à 70°),
par contre il résiste
- au froid à +4°C ;
- plusieurs années à moins (-) 70°C.
- à la dessiccation

V. LES MYCOBACTERIES ATYPIQUES : (généralités)

Il faut toujours garder à l’esprit que ces mycobactéries atypiques peuvent

être responsables de mycobactérioses chez l’immuno-déprimé , mais aussi chez
les sujets présentant une tare localisée ou généralisée , qu’elle soit connue ou
non. Leur mise en évidence en biologie n’est pas toujours synonyme de
mycobactériose. Pour les incriminer, il faut isoler plusieurs fois le même germe
à partir d’un prélèvement contaminé (prélèvements contaminés par la flore
cutanée ou muqueuse), ou l’isoler une seule fois à partir d’un prélèvement non
contaminé dans un contexte clinique et épidémiologique évocateur.

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VI. DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE DE LA TUBERCULOSE :

La mise en évidence du bacille tuberculeux en microscopie et/ou en

culture reste le critère essentiel du diagnostic de certitude de la tuberculose
quelle soit pulmonaire ou extra-pulmonaire.

L’identification du bacille de la tuberculose est si critique qu’il est donné une

attention particulière aux prélèvements ; à leurs conservation et à leurs
transports. Comme la tuberculose peut toucher presque n’importe quel organe
du corps , une variété d’échantillon clinique peuvent être envoyée au laboratoire
pour la recherche de bacilles responsables de tuberculose.
Pour des raisons pratiques, Nous considérons deux types de prélèvements :
 Les prélèvements d’origine pulmonaire
 Les prélèvements d’origine extra-pulmonaire.

A/ Les prélèvements d’origine pulmonaire :

Ils comprennent :
- Les expectorations “ crachats ”
- Tubages gastriques
- Aspirations ou lavages bronchiques
- Ecouvillonnages laryngés.

1/ Les crachats :
Sont les prélèvements les plus fréquemment reçus au laboratoire. Chez un
malade suspect de tuberculose pulmonaire il convient , chaque fois que
possible, de faire trois ( 3 ) prélèvements selon les modalités suivantes :
Après la consultation, le premier échantillon ( appelé “ échantillon sur place ”)
est recueilli sous la supervision de l’infirmier ; celui-ci doit lui expliquer
que l’expectoration doit se faire après un effort de toux profond et vigoureux
afin de ramener des mucosités bronchiques.
L’infirmier doit confier un deuxième pot “ crachoir ”, et demander au malade de
recueillir un deuxième prélèvement le lendemain matin très tôt (appelé
échantillon matinal). L’échantillon est ramené le plus rapidement possible au
laboratoire.
Quand le malade revient avec l’échantillon matinal, un troisième prélèvement
est fait sur place.

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2/ Tubage gastrique :
Un certain nombre de malades ne peut pas ou ne sait pas cracher (femmes et
enfants). Cette technique est pratiquée en milieu hospitalier. Elle permet de
recueillir les mucosités bronchiques dégluties pendant le sommeil, donc il doit
être fait le matin au réveil avant que les contractions de l’estomac n’en aient
chassé le contenu.

3/ Aspiration ou lavage bronchique :

Consiste à aspirer au cours d’une bronchoscopie les sécrétions bronchiques.
Cette technique ne peut être pratiquée que sur des malades hospitalisés et en
milieu spécialisé

4/ Ecouvillonnage laryngé :
Le but de l’écouvillonnage laryngé est de recueillir les mucosités d’origine
pulmonaire présentes dans le larynx. Cette technique peut être appliquée chez
les malades qui ne savent pas ou ne peuvent pas cracher, où l’aspiration
bronchique ou le tubage gastrique ne peut être fait (faute de moyens). Il est à
noter que l’écouvillon laryngé ne ramène qu’une faible quantité de matériel, et
de ce fait il ne peut être utilisé que pour la recherche du BK en culture et non à
l’examen microscopique direct.

B/ Les prélèvements d’origine extra-pulmonaire (E.P.) :

Il faut distinguer deux types de prélèvements :
- Les prélèvements d’origine E.P. contaminés
- Les prélèvements d’origine E.P. non contaminés

1/ Les prélèvements d’origine E.P. contaminés :

Proviennent des collections purulentes s’écoulants à l’extérieur et dont la
souillure est inévitable malgré les précautions aseptiques prises lors du
prélèvement.

Les prélèvements sont :

- Les urines : on prélève les premières urines du matin
- les pus d’abcès ou de ganglions fistulisés
- tous les autres produits pathologiques prélevés sans précaution
d’aseptie.

2/ Les prélèvements d’origine E.P. non contaminés :

Sont les liquides séreux ou séro-purulents se trouvant dans les cavités fermées.
Ils sont recueillis par ponction dans un tube stérile après désinfection de la
peau.

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Les prélèvements sont :
- le Liquide Céphalo-rachidien (L.C.R.)
- le liquide pleural
- le liquide péritonéal
- le liquide péricardique
- l’épanchement articulaire
- la biopsie chirurgicale
- le liquide (suc) ganglionnaire ( ganglion non fistulisé )

C/ Fiche de renseignements +++

Tout prélèvement doit être accompagné d’une fiche de renseignement

indiquant l’identité du malade, son âge et son adresse, la nature de l’affection, la
nature et la durée du traitement antituberculeux reçu éventuellement avant le
prélèvement. Elle doit contenir le nom du médecin traitant et celui du service de
prise en charge.
Tous les prélèvements sont enregistrés sur le registre du laboratoire réservé au
dépistage de la tuberculose. Les cas positifs seront reportés sur un registre
spécial de déclaration des cas de tuberculose (voir annexe 1 ).

D/ Conservation des prélèvements

Les prélèvements d’origine pulmonaire sont contaminés, quel que soit les
précautions prises pour les recueillir aseptiquement, par les germes qui
pullulent normalement dans le rhino-pharynx et la bouche. S’il n’est pas
possible d’examiner sur place les prélèvements le jour même et pour éviter la
multiplication de ces germes qui risquent de nuire à la vitalité des BK. Les
prélèvements peuvent être conservés :

a/ Conservation au froid à +4°C (au maximum 10 jours) en attendant leur

transport.
b/ Conservation chimique au bromure de cetylpiridium à 10%.

E/ Transport des prélèvements :

Le transport doit être fait dans une boite réservée à cet effet (une glacière
contenant des “ Ice Box ” et des portoirs dans lesquels s’adapteraient les
crachoirs). Les crachoirs opaques hermétiquement fermés et soigneusement
étiquetés. L’étiquette doit porter le nom et prénom du malade, le numéro du
dossier et le nom du service demandeur. Elle doit être collée sur le corps et

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jamais sur le couvercle du crachoir. Les pots de prélèvements sont placés
dans la boite qui sert de transport.
Les fiches de renseignements de chaque prélèvement sont mises dans une
enveloppe à part.

VII- 1- Diagnostic bactériologique classique :

A/ Les techniques bactériologiques classiques:

1/ Techniques Microscopiques:

1-1 / Confection du frottis à partir d’un crachat :

Sur une lame neuve préablement dégraissée (24 heures dans un mélange
acide-alcool - voir annexe -) et séchée. Le numéro attribué au malade sur le
registre du laboratoire doit être inscrit sur l’extrémité de la lame.
A partir du prélèvement; on choisit une parcelle muco-purulente voire
hémorragique à l’aide d’une anse de platine qu’on étale sur la lame
L’étalement se fait par mouvements circulaires sur environ 2 cm de
long et 1 cm de large. Le frottis doit être séché à l’air, à l’abri des mouches.

1-2 / Fixation du frottis :

Peut se faire de deux façons :

- à la chaleur : par 3 à 4 passages rapides la lame au
dessus d’une flamme d’un bec bunsen
- à l’alcool : recouvrir la lame, rejeter le surplus et
flamber.

1-3 / La coloration :

Il existe plusieurs techniques de coloration. Les plus utilisées sont la

coloration de Ziehl Neelsen et la coloration à l’auramine .

Coloration de Ziehl Neelsen

a/ Temps de coloration :

Placer la lame sur un support en verre ou en métal et la recouvrir de

fuchsine phéniquée de Ziehl filtrée sur papier. A l’aide d’un coton monté sur
une tige ; trempé dans l’alcool et flambé, passer la flamme sous la lame

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recouverte de fuchsine, arrêter immédiatement de chauffer dès émission de
vapeur.
Laisser agir trois minutes.
Chauffer une deuxième fois, puis une troisième fois en laissant agir à
chaque fois trois minutes.
Éviter l’ébullition et le dessèchement du colorant. Ajouter si besoin de
la fuchsine au fur et à mesure.
A la fin du temps de coloration, rejeter la fuchsine et laver la lame à l’eau
du robinet en faisant attention à ne pas détacher le frottis (jet du robinet trop
fort par exemple).

Porte lame

Lame

Frottis

Tige métallique

Flamme

Étape de coloration par la fuchsine phéniquée

-b/ Temps de décoloration :

Recouvrir la lame d’acide sulfurique dilué au quart (à 25%). Laisser agir

pendant trois minutes.
Laver la lame de la même manière que précédemment.
Recouvrir la lame avec de l’alcool à 95° pendant 5 minutes.
Rincer à l’eau (le frottis est alors légèrement rose ou incolore).

-c/ Temps de contre coloration :

Recouvrir la lame de bleu de méthylène.

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 Laisser agir pendant 30 secondes à 1 mn.
Laver et sécher.

N.B. - En cas de nécessité le temps de décoloration à l’alcool peut être supprimé et

remplacé par une deuxième décoloration à l’acide ( 1 mn ).

- Lecture au microscope :

Elle se fait au microscope ordinaire à lumière blanche, à l’aide d’un

objectif X 100 à l’immersion.
Les B.A.A.R. vont apparaitre en rose - rouge sur un fond légerement
bleuté

- Technique de lecture des lames :

Mise au point :

Dans le cas de la coloration de Ziehl-Neelsen, la lecture se fait en

immersion objectif X 100, oculaire X6 à X8. En plaçant la goutte d’huile à
immersion sur la préparation, éviter de toucher la lame pour ne pas transporter
des bacilles sur des préparations suivantes .
La mise au point est faite, lorsqu’on voit une image nette.
Toute la surface observée représente un (1) champ microscopique.

Le frottis doit être lu d’un bout à l’autre ; ce qui correspond à 100

champs microscopiques ou une longueur de frottis. On note le nombre de
bacilles (rouges) vus. Si aucun bacille n’est découvert sur 100 champs ou si leur
nombre est inférieur à 9 ; on décale d’un cran vers l’avant ou l’arrière le chariot
du microscope pour lire en sens inverse la ligne suivante (lecture en créneau)
et ainsi de suite jusqu’à faire 300 champs .

Lecture en créneau

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Expression des résultats :
Cinq éventualités peuvent se présenter
Lame négative :
0 bacille sur 300 champs
Inscrire : 0 BAAR / 300 champs (0)

Lame douteuse :
1 à 9 bacilles sur 300 champs;
Exemple : 4 BAAR/300 champs (+/-) Refaire l’examen

Lame faiblement positive :

10 à 99 bacilles sur 100 champs;
Exemple : 35 BAAR/100 champs (1+), ou (+)

Lame moyennement positive :

1 à 10 bacilles par champ, (moyenne sur 10 champs)
Exemple : 6 BAAR/1 champ (2+), ou (++)

Lame fortement positive :

>10 bacilles par champ, moyenne sur 10 champs)
Exemple : 25 BAAR / 1 champ (3+), ou (+++)

Coloration à l’auramine

Cette méthode de coloration et de lecture n’est rentable que pour les

structures chargées du diagnostic qui traitent plus de 50 lames par
jours.

Elle consiste à colorer le B.K. par un fluorochrome (auramine) et à

utiliser une lumière excitatrice (ici lumière bleue) qui va le rendre fluorescent.
Les bacilles vont apparaitre comme de petits bâtonnets brillants de couleur
jaune sur fond sombre.

Technique :

a/ Coloration :
Recouvrir la lame d’auramine phéniquée et laisser agir pendant 10
minutes. Laver à l’eau de robinet.

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 b/ Décoloration :
Recouvrir la lame de mélange acide-alcool et laisser agir 4 minutes :
Laver.

c/ Contre coloration :
Recouvrir la lame avec une solution de permanganate de potassium à 1%.
Laisser agir une (1) minute. Laver puis sécher.

- Lecture:

La lecture se fait au microscope à fluorescence. La lumière est ici

fournie par une lampe riche en rayonnement bleu ou UV capable d’exciter la
fluorescence de l’auramine.
L’examen se fera à l’aide d’un objectif de faible grossissement
(X 25 ou X 40).
Ceci a l’avantage de donner de grands champs microscopiques
(environ 16 fois le champs habituel obtenu avec l’objectif X 100). La lecture
est de ce fait plus rapide qu’avec la méthode de Ziehl Neelsen.
Les résultats sont appréciés également en nombre de bacilles par
champ, par 100 champs ou par 300 champs microscopiques.

Examens microscopiques des prélèvements autres que les crachats :

- Tubage gastrique et aspiration bronchique :

Le liquide aspiré doit être centrifugé à 3000 tours/mn pendant 20 mn.

Une petite partie du culot est étalée sur la lame, colorée et examinée comme les
crachats.

- L.C.R.; liquide de ponction; urine et autres prélèvements

extra-pulmonaires.

Du fait de la pauvreté en bacilles de ces prélèvements, le diagnostic

microscopique de la tuberculose est aléatoire. Il est préférable dans ce cas, de
procéder directement à la mise en culture et ensemencer plusieurs tubes de
Löwenstein-Jensen (L.J.)

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INTERPRETATIONS:

Un crachat est positif lorsque au moins deux frottis d’expectorations se

révèlent positifs avec présence de bacilles acido-alcoolo-résistants .

2/ Culture:

Mise en culture des différents prélèvements :

Les prélèvements non contaminés sont ensemencés directement sur

milieu de L.J. à raison de 2 à 4 gouttes par tube de L.J. . Tandis que les
prélèvements contaminés nécessitent une décontamination préalable avant leur
mise en culture.
Plusieurs techniques de décontamination existent ; toutes basées sur
l’utilisation d’une décontamination chimique suivie d’une neutralisation ( voir
annexe ).

Une fois les tubes de Löwenstein-Jensen ensemencés, ils sont incubés

à 37°C. Au bout de 24 à 48 heures, on examine les tubes pour contrôler la
qualité de la décontamination à la recherche de colonies de germes banals et/ou
le changement de couleur du milieu de culture. Ainsi les tubes contaminés
sont éliminés, les autres sont remis à l’étuve.
Au bout d’une semaine, une lecture doit être faite à la recherche de
mycobactéries à croissance rapide. Si des colonies apparaissent, nous
procédons à une identification biochimique. Si non , les tubes sont remis à
l’étuve jusqu’au 28eme jour date de la première lecture. En cas d’apparition de
colonies, un résultat quantitatif est donné, par comptage de leur nombre par
tube de L.J.. Si la culture est négative la réponse sera :
“ culture négative au 28eme jour, attendre 42eme jour ” et les tubes
sont remis à l’étuve.
Au 42eme jour une deuxième lecture est faite selon les mêmes
modalités qu’au 28eme jour . Si au 42eme jour la culture est toujours négative,
une troisième et dernière lecture se fera au 72eme jour , car certaines
mycobactéries mettent beaucoup plus de temps à pousser telles que
Mycobacterium bovis et quelques mycobactéries atypiques à croissance
lentes.

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-Intérêt de la culture:

La culture est plus sensible que l’examen microscopique direct (une

microscopie n’est positive que s’il y a environ 5000 ou plus de bacilles/ml de
produit pathologique).

Elle permet :
le diagnostic des tuberculoses extra-pulmonaires (pauvre en bacilles),
l’identification biochimique des différentes mycobactéries,
la pratique de tests de sensibilité aux antibiotiques.

VIII - Les nouvelles techniques de diagnostic de la tuberculose:

L’examen microscopique après coloration est une méthode de diagnostic rapide

de choix puisqu’il permet de détecter en moins de 30 mn les formes les plus
contagieuses de tuberculose.

Pour les formes les moins riches en bacilles l’examen microscopique est
négatif, la culture s’impose. Le résultat de la culture est obtenu au bout de 4 à
6 semaines.

Pour pallier cette lenteur, de nouvelles techniques de diagnostic ont été

proposées. Parmi celles-ci, la Polymérase Chain Réaction (PCR) est la
technique qui semble la plus prometteuse.

A/ Rappels :

Le génome bactérien :
Le génome bactérien est une molécule d’ADN bicaténaire (deux brins) de
structure hélicoïdale. Chaque brin est constituée d’un axe sucre-desoxyribose
auquel sont fixées quatre bases puriques (Adenine (A), et Guanine (G) ) et
pyrimidiques ( Cytosine (C) , et Thymine (T)). L’adenine se trouve en
interaction avec la thymine de l’autre brin, et la guanine avec la cytosine par
l’intermédiaire de liaisons hydrogènes. Les deux chaines ont une polarité
opposée dans le sens 3’-5’ et 5 - 3’.

16
Sonde :
Une sonde est un fragment d’acide nucléique monocaténaire, marquée, soit par
une enzyme (sonde froide), soit par un élèment radio-actif. Elle peut s’apparier
à des portions d’ADN complémentaires, préalablement dénaturées (donc
simple brin). Cette sonde d’ADN peut également se lier à un ARN.

Les deux brins doivent pouvoir entrer en contact l’un avec l’autre et avoir
suffisamment de bases complémentaires contiguës, donc posséder suffisamment
d’homologie pour qu’une molécule bicaténaire stable soit formée.

Cette liaison entre molécules complémentaires s’appelle “ Réaction

d’hybridation ”.

B/ Polymerase Chain Reaction ( P.C.R.):

P.C.R. ou Amplification Enzymatique “ in vitro ” est une technique de

biologie moléculaire récente qui offre le moyen de multiplier une séquence
choisie d’ADN en un million de fois ou plus, en un temps très court. Dans cette
méthode, la réplication de l’ADN est amenée à se faire “ in vitro ” de la même
façon qu’elle se produit au niveau de la cellule bactérienne (voir schéma 1) .

1/ Principe :

La séquence d’ADN choisie (connue partiellement ou entièrement) va

représenter le “ modèle ” à amplifier. Elle est appelée matrice. A partir de
celle-ci la PCR va pouvoir se développer selon les étapes suivantes :

a/ La dénaturation :

C’est la séparation des deux brins d’ADN par chauffage (de 90 à 100°C)

b/ L’hybridation :

En abaissant la température, on va provoquer l’hybridation sur les brins de

deux amorces qui sont des oligonucléotides simples brins. Elles sont choisies
de façon à être complémentaires d’une séquence de la matrice et apportées en
excés afin de favoriser leur liaison aux brins d’ADN dénaturés. C’est l’étape
d’hybridation des amorces. Les séquences de ces amorces vont délimiter la
longueur du segment d’ADN à amplifier.

17
c/ La synthèse du néo-brin complémentaire :

Après hybridation, en présence d’ADN polymérase (Taq polymérase) et de

désoxynucléosides tri-phosphates (dATP, dCTP, dGTP et dTTP) , la synthèse
du brin complémentaire à la matrice va s’effectuer. Cette extension se fait à
partir de l’extrémité 3’OH libre de chaque amorce.

Les trois étapes précédentes constituent un cycle .

d/ Multiplication des cycles :

Un protocole de PCR comprend N cycles successifs (chaque cycle dure en

moyenne de 2 à 5 mn) . Après N cycles on devrait obtenir 2 puissances N
copies de la matrice dont les extrémités correspondent à celles des amorces en
5’.

e/ Révélation des produits amplifiés :

Il existe plusieurs techniques de révélation des produits amplifiés .On citera

pour exemple la révélation par méthode “ Southern blot ”: les produits amplifiés
sont soumis à une migration éléctrophorétique sur gel d’agarose ou
polyacrilamide puis colorés. La spécificité de la bande observée sur gel est
confirmée par hybridation avec une sonde d’ADN complémentaire marquée
après transfert sur feuille de nitrocellulose.

C/ Application au diagnostic de la tuberculose:

Des oliginucléotides ont été synthétisées (amorces) qui délimitent une matrice
spécifique au “ complexe tuberculosis ” , appelé IS 6110 (anciennement appelée
IS 987) utilisés en PCR , le diagnostic des tuberculoses pauvres en bacilles est
obtenu au bout de 8 heures au lieu de 4 à 6 semaines. Avec cette technique, on
arrive théoriquement à détecter jusqu’à 3 bacilles par 10 µl de produit
pathologique.

18
INSTITUT PASTEUR D’ALGERIE
Laboratoire Central de la Tuberculose
Oued Kniss.

FICHE DE RENSEIGNEMENTS

STRUCTURE
Hopital ou CCTMR...................................................N° de dossier.....................
Service................................................................Médecin....................................
______________________________________________________________
MALADE

Nom......................................................................................Age.......................
Prénom.................................................................................Sexe.......................
Adresse.............................................................................................................
Adresse Professionnelle .....................................................................................
______________________________________________________________
MALADIE
- Début de la maladie remonte:..............................................................................
- Malade a été déjà traite par les antituberculeux avant l’épisode actuel
(ancien malade) :
Oui /__/ Non /__/

- Si oui quand à t-il reçu son premier traitement ? .............................................

- Antibiotiques reçus:...........................................................................................
- Durée des antibiotiques reçus:...........................................................................
- Localisation de la tuberculose
a/ Pulmonaire /__/
b/ Extra-Pulmonaire /__/
Si oui : quel est la localisation ..........................................................................
______________________________________________________________
PRELEVEMENT:
Nature :...................................................Date de Réception:................................
______________________________________________________________
RESULTATS BACTERIOLOGIQUES:
Microscopie :......................................................
Culture N°:........................Nombre de col................par .............tube (s) de L. J.
_______________________________________________________________

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 A N N E X E ( 2)

TECHNIQUES DE DECONTAMINATION:

A/ Décontamination à la Soude avec centrifugation :

Les crachats, placés dans un flacon stérile, fermant
hermétiquement sont mélangés à 2 ou 4 fois leur volume de solution stérile de
soude à 4%. Après agitation vigoureuse ; on porte les flacons à l’étuve
à 37° C minutes pendant 20 mn . On centrifuge à 3000 tr/mn pendant 20 mn.
On jette le liquide surnageant et, soit neutralise le culot par quelques gouttes
d’acide sulfurique à 15% en présence d’un indicateur de pH (bleu de
bromothymol), soit on rajoute de l’eau distillée stérile, on agite quelques
secondes et on centrifuge une deuxième fois pour chasser la soude en excès. Le
produit final est ensemencé à raison de 4 gouttes par tube. On ensemence 2 à 3
tubes de Lowenstein Jensen (L.J) par prélèvement.

B/ Décontamination sans centrifugation :

La partie la plus purulente des crachats est placée dans un crachoir. On ajoute
une quantité égale de soude (NaOH) à 6% stérile et 2 à 3 gouttes d’indicateur de
pH. Le mélange est agité pendant 15 mn puis mis à l’étuve à 37°C pendant 50
mn. Ensuite le mélange est immédiatement neutralisé par quelques gouttes
d’acide sulfurique (H 2 S04) à 15% stérile.
Le produit final est ensemencé à raison de 4 gouttes par tube de
milieu de culture (L.J).

C/ Décontamination par la méthode de Petroff à la soude sans

neutralisation .
- Placer 2 ml de crachat dans un tube à centrifuger
- Ajouter 4 ml de NaOH à 4%.
- Agiter sur un agitateur de Khan pendant 15 mn .
- Centrifuger à 3000 tours/ mn pendant 15 mn.
- Jeter le surnageant.
- Laver à l’eau distillée stérile ( 10 à 15 ml ).
- Re-centrifuger 3000 tr/mn pendant 15 mn.
- Jeter le surnageant.
- Ensemencer le culot sur 2 tubes de L.J.

20
PRINCIPE DE LA POLYMERASE CHAIN REACTION
(P.C.R.)

5’
3’
ADN Cible
3’
5’

5’
3’

Dénaturation

Hybridation
3’
5’ ( amorces)

5’
3’

Synthèse

des
3’
5’ Neobrins

5’
3’

Dénaturation

21
Hybridation

3’
5’

amorce 1
Synthèse des
amorce 2
néobrins

SCHEMA N° 1

22