BASSAND Ophélie

CUIRASSIER Marine-Julie L3 – BBCP

TOURNERET Océane Groupe A3

Protéines fonctionnelles

COMPTE RENDU DU TP
« PRODUCTION, PURIFICATION DE PROTEINES
RECOMBINANTES ET GST PULL-DOWN »

Université de Bourgogne Franche-Comté

28/04/18

Production, purification de protéines recombinantes et

GST pull-down
 28 avril 2018

Ophélie BASSAND, Marine-Julie CUIRASSIER et Océane TOURNERET

Université de Bourgogne Franche-Comté, Besançon (25000), France

1. ABSTRACT
We produced recombinant (GST-GABARAPL1 and FLAG-
GABARAPL1-6HIS) proteins from native bacteria Escheri-
chia coli BL21 transformed by plasmids of expression of
the proteins. Proteins FLAG-GABARAPL1-6HIS were clea-
ned by the technology of chromatography of affinity and
proved by electrophorese SDS-PAGE of frost of polyacryla-
mide. The correlation in vitro of this proteins with GST-
GABARAPL1 was studied from GST pull-down and proved
by electrophorese SDS-PAGE on frost of polyacrylamide
and by Western Blot. This study allowed to show at first
that manipulations have gone well for the purification, but
Fi-
especially to be able to show the capacity of the protein
gure 2 : Structure cristallographique de la protéine
GABARAPL1 to form a dimer in vitro.
GABARAPL1. PDB code : 2R2Q
2. INTRODUCTION Elle augmente l'expression de la surface cellulaire du ré-
cepteur opioïde de type kappa en facilitant le trafic intra-
Le gène GEC1/GABARAPL1 (« glandular epithelial cell cellulaire antérograde du récepteur. Elle a un rôle dans la
1/GABAA receptor-associated protein like 1), appartenant à formation des vacuoles autophagosomales, et donc dans
la famille des gènes gabarap, a été identifié dans les labo- l'autophagie [3].
ratoires de biochimie à Besançon dans des cellules d'en-
domètre de cobaye. Ce gène, situé sur le chromosome 12 Lors de ces travaux pratiques, le but a été de produire des
chez l'humain, est constitué de 10 238 pb et contient 4 protéines recombinantes composées de GABARAPL1 :
exons et 3 introns (voir figure 1). Il possède une forte ho- FLAG-GABARAPL1-6HIS et GST-GABARAPL1 ; de les puri-
mologie de séquence (79%) avec le gène GABARAP (GABAA fier et enfin d'étudier l'interaction qu'elles ont entre elles
receptor-associated protein) [1] grâce à la technique de GST pull-down et son analyse par
Western Blot, afin de déterminer si la protéine GABA-
RAPL1 est capable de former un dimère in vitro.
La protéine GABARAPL1, composée de 117 acides aminés,
est considérée comme une Ubiquitin-Like protéin (UBL).
Elle est composée de deux hélices alpha en posi- 3. MATERIEL ET METHODES
tion N-terminale et un domaine central ressemblant à ce- Production de la protéine recombinante FLAG-
HABARAPL1-6HIS
Chaque solution ont été placées dans la glace à la fin de
chaque manipulation.
La protéine FLAG-GABARAPL1-6HIS a été produite. Pour
cela, des bactéries Escherichia coli de souche BL21 ont été
transformées par des plasmides d'expression de plusieurs
protéines : GST, GST-GABARAPL1 et FLAG-GABARAPL1-
6HIS. Ces bactéries ont ensuite été cultivées à 37°C dans
Figure 1 : Organisation du gène GEC1/GABARAPL1
du milieu LB contenant de l'ampicilline ou de la
chez l'humain. Les traits continus représentent les in-
kanamycine (100 µg/ml) puis l'expression des protéines
trons, et les rectangles les exons. La position du site d'ini- recombinantes a été induite en incubant les bactéries avec
tiation de la transcription (+1), du codon d'initiation de l'IPTG 0,5 mM pendant 2 h. Les cultures bactériennes
(ATG) et de terminaison (TGA) de la traduction ainsi que ont ensuite été centrifugées à 5 000 g pendant 10 min à
du site de polyadénylation (Poly A) sont indiquées [2]. 4 °C, puis le culot a été récupéré. Les bactéries ont été
lui de l'ubiquitine (voir figure 2). lysées dans 25 ml de tampon de lyse Tris-HCl 20 mM
pH 7,2, glycérol 20 %, EDTA 0,2 mM pH 8, KCl 500 mM,
imidazole 10 mM, β-mercaptoéthanol 10 mM et lysozyme
1 mg/ml puis soniquées 3 fois pendant 15 sec sur la glace.
2,5 ml de lysat ont été récupérés et aliquotés en deux
tubes Eppendorf, puis incubés pendant 30 min sur la glace.
Chaque lysat a été centrifugé à 10 000 g pendant 20 min à
4°C puis les surnageants ont été récupérés. Afin de
réaliser une analyse par électrophorèse SDS-PAGE de ce
lysat, un échantillon de 20 µl (F0) a été préparé.
Purification de la protéine FLAG-GABARAPL1-6HIS
par chromatographie d'affinité
Les protéines FLAG-GABARAPL1-6HIS ont été purifiées
par chromatographie d'affinité au nickel grâce à leur
queue histidine. Pour cela, 2 x 25 µl de cette résine ont été
centrifugés à 10 000 g pendant 1 min à 4 °C. Les
surnageants ont été ôtés, et la résine a été lavée avec
250 µl de tampon de lyse puis centrifugée une nouvelle
fois dans les mêmes conditions que précédemment avant
d'éliminer les surnageants. Ce lavage a été répété 3 fois au
total, dans les mêmes conditions, avant de fixer les
protéines.
La fixation des protéines a ensuite été réalisée en ajoutant
chaque surnageant FLAG-GABARAPL1-6HIS sur 25 µl de
résine pendant 2 h à 4 °C. Chaque tube a été centrifugé à 5
000 g pendant 5 min à 4 °C puis les surnageants éliminés.
À chaque tube de résine ont été ajoutés 250 µl de tampon
de lavage Tris-HCl 20 mM pH 7,2, glycérol 20 %, EDTA
0,2 mM pH 8, KCl 100 mM, imidazole 20 mM, β-
mercaptoéthanol 10 mM et PMSF 0,5 mM. Les deux tubes
ont ensuite été poolés et centrifugés à 10 000 g pendant
1 min à 4 °C et le surnageant a été retiré. Ce lavage a été
réalisé au total 3 fois dans les mêmes conditions.
Les protéines FLAG-GABARAPL1-6HIS, ont ensuite été
éluées avec des concentrations croissantes en imidazole.
Pour cela, 100 µl de tampon d’élution Tris-HCl 20 mM
pH 7,2, glycérol 20 %, EDTA 0,2 mM pH 8, KCl 100 mM, β-
mercaptoéthanol 10 mM, PMSF 0,5 mM et imidazole
50/125/250 mM ont été ajoutés à la résine, puis les tubes
ont été incubés 2 min sur la glace avant d’être centrifugés
à 10 000 g pendant 1 min à 4 °C. Le surnageant a ensuite
été récupéré. Cette élution a été renouvelée 2 fois mais
avec des concentrations d’imidazole croissantes (125 mM
puis 250 mM) dans les mêmes conditions que la
précédente tout en récupérant les surnageants obtenus.
Dosage des protéines par la méthode de Bradford
Les protéines ont ensuite été dosées par la méthode de
Bradford [4] à partir de 15 µl de chaque éluat non dilué et
de F0 (solution aliquot diluée au 1/5). Le réactif de Bradford
a été ajouté afin d'obtenir un volume final de 1 ml et
l'ensemble a été agité vigoureusement. Une gamme étalon
comprenant 0 à 25 µg de BSA (Bovine Serum Albumin) a
été réalisée simultanément dans les mêmes conditions et
l'absorbance a été mesurée immédiatement au
spectrophotomètre à 595 nm. La composition de chaque
tube a été reportée en annexe (tableau I et II).
Analyse par électrophorèse SDS-PAGE sur gel
d’acrylamide
Afin d'évaluer la purification de la protéine FLAG-
GABARAPL1-6HIS, un gel de polyacrylamide 15 % a été
préparé. La composition du gel de séparation 15 % et du
gel de concentration 4% a été reportée en annexes
(tableau III). 20 µg de chaque éluat et de F0 dans lesquels
ont été ajoutés 5 µl de tampon de charge SDS-LB 5X (SDS
10 %, Tris-HCl 312,5 mM pH 6,8, glycérol 50 %, bleu de
bromophénol 0,005 % et β-mercaptoéthanol 25 %) ont
été chauffés à 100 °C pendant 5 min. Ces derniers ont
ensuite été déposés dans les différents puits du gel de
polyacrylamide. Dans le premier puits a été placé 5 µl d'un
marqueur de taille prestained. Lors de la migration, le gel
a été placé dans du tampon d'électrophorèse SDS 0,1 %,
Tris-glycine 1X. Une première tension de 100 V a été
appliquée, puis a été augmentée à 200 V. Le gel a ensuite
été coloré dans une solution de coloration Coomassie-
R250 0,05 %, méthanol 40 %, acide acétique 10 %
pendant 20 min sous agitation douce puis à été décoloré
dans une solution de décoloration méthanol 30 % et acide
acétique 10 %. Le gel a ensuite été révélé au
transilluminateur et photographié.
Production des protéines recombinantes GST et
GST-GABARAPL1
Les protéines ont été lysées dans 8 ml (pour GST) ou 24
ml (pour GST-GABARAPL1) de tampon de lyse PBS+1 %,
Triton-X100, inhibiteurs de protéases dilués au 1/1000e
et PMSF 0,2 mM puis soniquées 3 fois pendant 15 s sur
glace. 800 μl de lysat GST et 3 x 800 μl de lysat GST-GEC1
ont été récupérés et incubés 30 min sur glace, puis
centrifugés à 10 000 g, pendant 20 min à 4°C. Les
surnageants ont ensuite été récupérés.
GST pull down
Une GST pull-down a été réalisée à partir de 4 x 50 µl de
résine de glutathion-agarose centrifugés à 10 000 g
pendant 1 min à 4 °C. Le surnageant a été retiré, et 4 x
500 µl de tampon de lyse ont été ajoutés. La même
centrifugation a été réalisée et le surnageant retiré. Ce
lavage a été réalisé 3 fois au total, dans les mêmes
conditions. Chaque surnageant ont ensuite été incubés
avec 50 µl de résine pendant 2 h à 4 °C sous agitation
rotative puis centrifugés à 10 000 g pendant 1 min à 4 °C.
Le surnageant a été retiré et 500 µl de PBS 500 mM NaCl
a été ajouté dans chaque tube puis centrifugés à 10 000 g
pendant 1 min à 4 °C. Le surnageant a été retiré. Ce lavage
a été réalisé 3 fois au total, dans les mêmes conditions.
Enfin, chaque échantillon a été incubé avec 10 µg de
protéine FLAG-GABARAPL1-6HIS dans un volume final de
PBS de 250 µl pendant une nuit à 4 °C sous agitation
rotative (voir schéma explicatif de la technique de GST
pull-down figure 3).
 Le tampon de charge SDS-LB (5X) a été ajouté dans les
échantillons obtenus après élution (voir GST pull-down),
avant d'être chauffés pendant 5 min à 100 °C puis chargés
sur les gels. 5 µl d'un marqueur de taille prestained a été
Chaque tube de résine glutathion-agarose a ensuite été placé dans le 1er puits. L’ensemble a migré à 100 V, puis
centrifugé à 10 000 g pendant 1 min à 4°C, les surnageants 200 V.
ont été éliminés puis 500 µl de tampon de lavage (PBS
100/300/500 mM NaCl pour une des GST pull-down Coomassie : Le gel a été coloré pendant 20 min au bleu de
réalisée avec GST-GABARAPL1, et PBS 300 mM pour celle Coomassie sous agitation, décoloré à l’aide d'une solution
réalisée avec GST) ont été ajoutés. L’ensemble a été de décoloration puis révélé au transilluminateur.
centrifugé à 10 000 g pendant 1 min à 4°C et le surnageant
Western Blot : Un Western Blot [5] a été réalisé, pour cela
a été éliminé. 3 lavages ont été réalisés au total, dans les
le transfert a été effectué sur une membrane PVDF
mêmes conditions.
préalablement trempée dans du méthanol 100 %, puis
A chaque résine a été ajouté 10 µl de glutathion réduit à placée dans du tampon de transfert (Tris-glycine 1X, SDS
10 mM, puis le tout a été incubé 10 min à température 0,01%, méthanol 10 %). Le sandwich comprenant
ambiante en agitant régulièrement les tubes, ensuite éponges, papiers Whatman, gel et membrane PVDF a donc
centrifugés à 10 000 g pendant 1 min à 4 °C. Le surnagent été réalisé et le transfert a été effectué à une intensité
a été récupéré et une nouvelle élution a été réalisée dans constante de 100 V pendant 1 h sous agitation.
les mêmes conditions. Les surnageants obtenus ont été
Après le transfert, la membrane a été placée pendant 1 h
poolés entre eux (20 µl final, soit 10 µl pour le Western
à température ambiante dans la solution de saturation
Blot et 10 µl pour le Coomassie).
(lait en poudre demi-écrémé 5 % ; TBS-0,2 % Tween20)
sous agitation douce à température ambiante puis
incubée avec l'anticorps primaire anti-GABARAP dilué au
Analyse par électrophorèse SDS-PAGE puis Western 1/2000e (Chemicon) dans la solution de saturation
Blot. pendant une nuit à 4 °C. Le lendemain, la membrane a été
récupérée et lavée 3 fois pendant 10 min avec du tampon
Afin d'évaluer l'interaction in vitro entre les protéines
de lavage (TBS-0,2 % Tween20) sous agitation douce à
GST-GABARAPL1 et FLAG-GABARAPL1-6HIS, 2 gels de
température ambiante, puis incubée pendant 1 h avec
polyacrylamide 12,5 % ont été préparés. La composition
l’anticorps secondaire anti-lapin couplé à la HRP (« Horse
des gels est reportée en annexes (voir tableau III).
Radish Peroxidase ») (1/10 000e) dilué dans 0,5 % de lait
en poudre écrémé dans du TBS-0,2 % Tween20 sous
agitation douce et à température ambiante. La membrane
est à nouveau rincée trois fois pendant 10 min dans le Nous ne pouv ons pas afficher l’image.

tampon de lavage, sous agitation douce, à température

ambiante.
La révélation a ensuite été réalisée au laboratoire de
Biochimie. Pour cela, la membrane a été incubée pendant
5 min avec 1 ml de Luminol puis les signaux ont été
visualisés sur le Chemidoc (Biorad).

4. RESULTATS
Dosage des protéines par la méthode de Bradford
Des bactéries E. coli ont été transformées par des plas-
mides d'expression des protéines GST, GST-GABARAPL1 et Figure 4 : Courbe étalon de l'absorbance en fonc-
FLAG-GABARAPL1-6HIS, mises en culture puis l'expres- tion de la quantité de protéines.
sion des protéines recombinantes a été induite grâce à Tableau VI : Quantités et concentrations de protéines
l'ajout d'IPTG. Les cultures bactériennes ont été centrifu- dans chaque tube. Les quantités sont exprimées en µg, et
gées, lysées et soniquées. Les protéines FLAG-GABA- les concentrations en µg/µl.
RAPL1-6HIS ont ensuite été purifiées par chromatogra- Tube Éluat 1 Éluat 2 Éluat 3 F0
phie d'affinité au nickel grâce à leur queue histidine se
fixant sur la résine.
Quantité de pro-
Afin de mesurer la concentration en protéines avant et 11,1 13,3 13,3 77,1
téines (µg)
après purification, un dosage de protéines à été réalisé se-
lon la méthode de Bradford [4] avec la BSA (Bovine Serum
Albumin) comme référence. Le dosage a été effectué sur
15 µl de chaque éluat non dilué, ainsi que sur 15 µl de l'ali- Concentration en 0,74 0,89 0,89 5,14
quot (F0) réalisé précédemment correspondant aux pro- protéines (µg/µl)
téines avant purification. Les résultats des absorbances de
la gamme étalon sont reportés dans le tableau IV (voir an-
nexes), et ceux des protéines FLAG-GABARAPL1 dans le C'est F0 qui a une concentration en protéines la plus éle-
tableau V. vée, car c'est la fraction qui n'a pas été éluée et qui con-
tient tous les types de protéines. En revanche, dans l'éluat
Tableau V : Résultats du dosage des protéines FLAG- 1, 2 et 3, la concentration en protéine, plus petite, corres-
GABARAPL1-6HIS. Le tube « éluat 1 » correspond à l'élu- pond majoritairement à la protéine FLAG-GABARAPL1-
tion de la protéine FLAG-GABARAPL1-6HIS par une concen- 6HIS. Ce dosage de protéines, et donc la détermination de
tration en imidazole de 50 mM, le tube « éluat 2 » par une la concentration, a permis de quantifier les échantillons à
concentration en imidazole de 125 mM et le tube « éluat 3 » déposer dans les puits du gel pour l'étape de l'électropho-
par une concentration en imidazole de 250 mM. F0 corres- rèse. De ce fait, la quantité de protéines déposées en µg est
pond à l'aliquot comprenant toutes les protéines avant la identique pour chaque puits.
purification.
Évaluation de la purification de la protéine FLAG-
Tube Éluat 1 Éluat 2 Éluat 3 F0 GABARAPL1-6HIS

DO
(595 nm 0,36 0,43 0,43 0,5
)

À partir de ces valeurs, une courbe étalon a pu être tracée.

Cette courbe est représentée figure 4.

L'équation de la courbe est : y = 0,0324x

D'après l'équation de cette courbe, il a été possible de dé-
terminer la quantité de protéines dans chaque tube, et
donc leur concentration (voir tableau VI). Les calculs sont
reportés en annexe (voir calculs 1).
Afin d'évaluer la purification des protéines FLAG-GABA-
RAPL1-6HIS, les échantillons ont été préparés dans du
tampon de charge, chauffés puis analysés sur gel de polya-
crylamide 15 % et coloré au bleu de Coomassie après une
électrophorèse SDS-PAGE. Le gel, après observation au
transilluminateur, a été photographié et reporté figure 5.
Nous ne pouv ons pas afficher l’image.
FLAG et 6HIS). L'hypothèse possible est que la deuxième
bande de 6,76 kDa correspondrait à une protéine qui se lie
avec moins d'affinité à la résine de nickel, ou de manière
non spécifique (les colonnes de chromatographies pour
les étiquettes 6 HIS retiennent plusieurs impuretés,
comme le SlyD [7]). Cela expliquerait la raison pour la-
quelle cette bande disparaît progressivement au cours des
purifications. Quant aux multiples bandes observées dans

les puits 1 correspondant à l'ensemble des protéines de

l'aliquot avant purification, elles disparaissent également
au fil des purifications car elles correspondent aux pro-
téines qui n'ont pas ou très peu d'affinité avec la résine de
nickel, et se décrochent au fil des élutions/lavages.

Évaluation de l'interaction in vitro entre les protéines

GST-GABARAPL1 et FLAG-GABARAPL1-6HIS
Afin d'évaluer la présence et l'interaction in vitro entre les pro-
téines GST-GABARAPL1 et FLAG-GABARAPL1-6HIS,
les échantillons ont été préparés dans du tampon de charge
SDS-LB, chauffés puis analysés sur gels de polyacrylamide
12,5 % après une électrophorèse SDS-PAGE ; l'un a été co-
loré au bleu de Coomassie, l'autre utilisé pour le Western Blot.
Figure 5 : Analyse en électrophorèse page SDS de la
purification de FLAG-GABARAPL1-6HIS : 20 µg de Le gel coloré au bleu de Coomassie, après observation au
l'aliquot (puits 1), 20 µg de fraction éluée par 50 mM transilluminateur, a été photographié et reporté figure 7.
d'imidazole (puits 2), 20 µg de fraction éluée par Le gel utilisé pour le Western Blot a été transféré sur une
125 mM d'imidazole (puits 3), 20 µg de fraction éluée membrane PVDF après avoir réalisé le sandwich compre-
par 250 mM d'imidazole (puits 4). 5 µl d'un marqueur de nant des éponges, papiers Whatman, gel de polyacryla-
taille prestained à été ajouté (Mq) et les tailles en kDa mide et membrane PVDF. La membrane a ensuite été in-
ont été reportées. Le gel de polyacrylamide à été coloré cubée avec les anticorps primaires anti-GABARAP puis
au bleu de Coomassie et révélé par transilluminateur. La avec des anticorps secondaires couplés à la HRP après
flèche représente la protéine FLAG-GABARAPL1-6HIS. avoir saturé tous les sites non spécifiques. Enfin, elle a été
incubée avec du Luminol, substrat de la HRP permettant
l'émission d'un signal lumineux, puis visualisée sur le Che-
Le gel, après observation au transilluminateur, permet de midoc et les résultats sont reportés figure 9.
révéler deux bandes distinctes plus ou moins exprimées
dans chaque puits (figure 5 puits 1, 2, 3, 4) ainsi que plu-
sieurs bandes beaucoup moins exprimées (puits 1 et 2).
Les poids moléculaires de ces deux types de protéines ont
été déterminés (voir calculs 2 et figure 6 en annexe). La
bande la plus lourde de 13,18 kDa est de plus en plus ex-
primée au fil des purifications (puits 1 au puits 4). La deu-
xième bande moins lourde de 6,76 kDa est au contraire de
moins en moins exprimée. La première bande à 13,18 kDa
représente la protéine recombinante FLAG-GABARAPL1-
6HIS, de plus en plus intense lorsque la concentration en
imidazole lors de la purification est de plus en plus élevée,
car elle est de plus en plus purifiée. En effet, les 6 HIS de
la protéine FLAG-GABARAPL1-6HIS ont une forte affinité
avec le nickel de la résine donc la concentration en imida-
zole (qui est lui-même un compétiteur ; en excès, il permet
de chélater les ions Ni2+ de la résine ce qui a pour effet de
décrocher les protéines) doit être plutôt élevée pour pou-
voir décrocher au mieux la protéine. De plus, le poids mo-
léculaire de cette protéine correspond parfaitement à ce-
lui trouvé dans les ouvrages [6] pour la protéine GABA-
RAPL1 qui est d'environ 12,9 kDa (en prenant en compte
Le gel coloré au bleu de Coomassie, après observation au protéines ont été déterminées (voir figure 10 en annexe).
transilluminateur, permet de révéler deux bandes forte- Ces deux bandes de deux tailles différentes permettent de

Figure 9 : Analyse en Western Blot de l'interaction

entre GST-GABARAPL1 et FLAG-GABARAPL1-6HIS :
15 µL GST-GABARAPL1 + FLAG-GABARAPL1–6HIS PBS-
100 mM NaCl (puits 1), 15 µL GST-GABARAPL1 + FLAG-
GABARAPL1–6HIS PBS-300 mM NaCl (puits 3), 15 µL
Figure 7 : Analyse en électrophorèse page SDS de la
GST-GABARAPL1 + FLAG-GABARAPL1–6HIS PBS-
GST PULL-DOWN : 15 µL GST-GABARAPL1 + FLAG-GA-
500 mM NaCl (puits 4), 15 µL GST + FLAG-GABARAPL1–
BARAPL1–6HIS PBS-100 mM NaCl (puits 1), 15 µL GST-
6HIS PBS-300 mM NaCl (puits 2), 5 µl d'un marqueur de
GABARAPL1 + FLAG-GABARAPL1–6HIS PBS-300 mM
taille prestained à été ajouté (Mq) et les tailles en kDa
NaCl (puits 2), 15 µL GST-GABARAPL1 + FLAG-GABA-
ont été reportées. La membrane a été incubée pendant
RAPL1–6HIS PBS-500 mM NaCl (puits 4), 15 µL GST +
1 h en présence d'anticorps primaires anti-GABARAP,
FLAG-GABARAPL1–6HIS PBS-300 mM NaCl (puits 3),
d'anticorps secondaires spécifiques couplés à la HRP
5 µl d'un marqueur de taille prestained à été ajouté (Mq)
puis avec 1 ml de Luminol avant d'être révélée sur le Che-
et les tailles en kDa ont été reportées. Le gel de polyacry-
midoc.
lamide à été coloré au bleu de Coomassie et révélé par
mettre en évidence les protéines GABARAPL1 : La bande
transilluminateur. La flèche représenterait la protéine
la moins lourde de 28,2 kDa représente les protéines GST-
FLAG-GABARAPL1-6HIS liée à GST-GABARAPL1.
GABARAPL1 non liées interagissant avec les
ment exprimées (figure 7 puits 1, 2 et 4). Les masses mo-
laires des protéines ont été déterminées (voir figure 8 en
annexe). La première bande de 50 kDa, la plus exprimée,
représenterait les protéines FLAG-GABARAPL1-6HIS et anticorps primaires anti-GABARAP révélés par des anti-
GST-GABARAPL1 interagissant entre elles. La deuxième corps secondaires couplés avec la HRP. Tous les appâts
bande de 34 kDa représenterait alors GST-GABARAPL1 « GST-GABARAPL1 » ne se sont pas liés aux FLAG-GABA-
non liée. Concernant le puits 3, une seule bande de 30 kDa RAPL1-6HIS. La bande la plus lourde de 47 kDa repré-
est visible ; elle représente la GST seule. Ce gel permet de sente la protéine GST-GABARAPL1 liée à FLAG-GABA-
montrer que si la protéine GABARAPL1 est présente dans RAPL1-6HIS et révélées par les même anticorps. La piste
le complexe, elle ne s'est pas liée à la GST. Dans le puits 1 pour laquelle aucune bande n'apparaît prouve encore une
est observé plusieurs autres bandes qui disparaissent au fois que la GST ne se lie pas à la protéine FLAG-GABA-
cours des lavages. Elles correspondent à des impuretés, RAPL1-6HIS, et donc que les interactions se font seule-
c'est à dire aux protéines qui se fixent de manière non spé- ment entre les deux protéines GABARAPL1. GST-GABA-
cifique à la résine. De plus, le poids moléculaire de GABA- RAPL1 et FLAG-GABARAPL1-6HIS peuvent alors interagir
RAPL1 étant d'environ 13 kDa et celui de la GST de 25 kDa entre elles lorsqu'elles sont mises en contact.
[8], l'interaction entre GST-GABARAPL1 et FLAG-GABA-
RAPL1-6HIS apparaîtrait alors sous la forme d'une bande 5. DISCUSSION
d'environ 51 kDa (13x2 + 25). Cette hypothèse est en adé- Durant ces trois jours de manipulation, le but était de pro-
quation avec le poids moléculaire de la bande observée duire des protéines recombinantes composées de GABA-
qui est de 51 kDa. Mais pour confirmer l'hypothèse, il estRAPL1 : FLAG-GABARAPL1-6HIS et GST-GABARAPL1 ; de
nécessaire d'étudier les résultats du Western Blot (figureles purifier et enfin d'étudier l'interaction qu'elles ont
9) : entre elles grâce à la technique de GST pull-down, afin de
La membrane, après visualisation sur le Chemidoc, per- déterminer si la protéine GABARAPL1 est capable de for-
met de révéler majoritairement deux bandes fortement mer un dimère in vitro. Pour cela, plusieurs analyses sur
exprimées (figure 9 Piste 1, 3 et 4). Au contraire, aucune gel et membrane ont été réalisées afin de vérifier la puri-
bande n'apparaît dans la piste 2. Les masses molaires des
fication de la protéine FLAG-GABARAPL1-6HIS par chro- 2. Chakrama, F. La protéine Gec1/Gabarapl1 : rôle au cours
matographie d'affinité, puis pour vérifier l'interaction in de l'autophagie et expression dans les cellules cancéreuses.
vitro entre cette protéine et GST-GABARAPL1 après GST Cancer. Université de Franche-Comté (2011).
pull-down. D'après les résultats obtenus, la protéine3. Chen, C. et al. GEC1 interacts with the kappa opioid recep-
FLAG-GABARAPL1-6HIS a bien été purifiée par chromato- tor and enhances expression of the receptor. J. Biol. Chem.
graphie d'affinité ; la purification la plus efficace a été ré- 281, 7983–7993 (2006).
alisée avec 250 mM d'imidazole. D'après l'intensité des
,4. Bradford, M. M. A Rapid and Sensitive Method for the
bandes et l'absorbance mesurée dans chaque éluat obtenu,
Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing
la quantité de protéines récupérées après chaque élution
était de plus en plus grande tout en restant largement in- the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Biochem. 72, 248-
férieure à la fraction non éluée F0 contenant tous les types 254 (1976).
de protéines, et donc la purification de plus en plus effi- 5. Towbin, H. Staehelin, T. Gordon, J. Electrophoretic trans-
cace. En revanche, la présence d'une protéine considérée fer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose
comme une impureté a persisté dans la solution même sheets: procedure and some applications. Proceedings of the
après différentes purifications. Pour éliminer cette pro- National Academy of Sciences USA. 76 (9): 4350–54 (1979).
téine, il aurait été possible de réaliser une chromatogra-
6. NCBI. gamma-aminobutyric acid receptor-associated pro-
phie d'affinité IMAC (« Immolized Metal-ion Afinity Chro-
tein-like 1 [Homo sapiens] [en ligne]. Disponible à
matography »). Ensuite, grâce à l'analyse de la GST pull-
down, la présence de GABARAPL1 et de la GST a bien été https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_113600.1
montrée sur gel de polyacrylamide après électrophorèse, [cité le 04 mai 2018].
et l'interaction de GABARAP avec elle-même a bien été 7. iWikipédia. 2018. Étiquette poly-histidine [en ligne]. Dis-
prouvée sur membrane après Western Blot. L'anticorps ponible à https://fr.wikipedia.org/wiki/ %C3%89ti-
utilisé est un anticorps GABARAP, car les séquences de GA- quette_poly-histidine [cité le 04 mai 2018].
BARAP et GABARAPL1 ont une forte homologie, mais au-
jourd'hui aucun anticorps n'est capable de les différencier.8.ooWikipédia. 2018. Glutathione S-transferase [en ligne]. Dis-
Cet anticorps a donc été utilisé pour révéler GABARAPL1 ponible à https://en.wikipedia.org/wiki/Glutathione_S-
transferase#Structure [cité le 04 mai 2018].
(FLAG-GABARAPL1-6HIS + GST-GABARAPL1). Néan-
moins, cette interaction a été prouvée « in vitro » seule-
ment, ce qui signifie qu'elle n'a pas obligatoirement lieu
dans les cellules, donc « in vivo ». D'autres techniques au-
raient pu être expérimentées afin de prouver la capacité
de GABARAPL1 à former un dimère « in vivo », , comme la
technique du double hybride ou la co-immunoprécipita-
tion. L'étude « in vivo » reste tout de même compliquée du
à la forte homologie entre les séquences de GABARAP et
GABARAPL1.

6. CONCLUSION
La protéine GEC1/GABARAPL1 est donc capable d'intera-
gir avec elle-même pour former un dimère. Dans les cel-
lules, il a été démontré qu'elle pouvait se lier à de nom-
breuses protéines jouant un rôle dans l'apoptose, comme
la protéine Nix. Mis à part dans l'apoptose, GEC1/GABA-
RAPL1 possède également un rôle de transporteur,
comme pour le transport des lipides, du glycogène ou en-
core du récepteur GABAA, toujours par interaction avec
d'autres protéines. L'étude de cette protéine et de ses in-
teractions pourrait amener à de grandes avancées dans les
recherches contre le cancer, notamment le cancer du sein.

6. REFERENCES
1. Wang, H. Bedford, F.K., Brandon, N.J., Moss, S.J., Olsen, R.W.
GABA(A)-receptor-associated protein links GABA(A) re-
ceptors and the cytoskeleton. Nature. 397, 69-72 (1999a).
7. ANNEXES

Tableau I : Composition des tubes permettant la réalisation de la gamme étalon

Tubes 1 2 3 4 5
Volume de BSA dans chaque tube (µl) 0 5 10 20 40
Volume d’eau dans chaque tube (µl) 700 700 700 700 700

Volume de réactif de Bradford ajouté (µl) 200 200 200 200 200

Tableau II : Composition des échantillons analysés par spectrophotométrie

Échantillons 1 2 3 F0
Volume d’échantillon
15 15 15 15
prélevé (µl)
Volume de réactif de
200 200 200 200
Bradford (µl)

Volume d’eau (µl) 785 785 785 785

Tableau III : Composition des gels constituant le gel de polyacrylamide 15 %.

Composition gel de séparation 15%
- Tampon Tris-HCl 1,5 M pH 8,8 : 1,25
ml
- Eau ultra-pure : 1,14 ml
- Acrylamide 30%: 2,5 ml
- SDS 10%: 50 µl
- Persulfate d’ammonium 10%: 50 µl
- TEMED: 7,5 µl
Composition Gel de concentration 4%
- Tampon Tris-HCl 0,5 M pH 6,8 : 625 µl
- Acrylamide 30% : 335 µl
- Eau ultra-pure : 1,5 ml
- SDS 10%: 25 µl
- Persulfate d’ammonium 10%: 25 µl
- TEMED: 3,75 µl
Tableau IV : Résultats du dosage de la gamme étalon. 0, 5, 10, 15, 20 ou 40 µg de BSA (1 mg/ml) ont
été versés dans chaque tube, complétés par de l'eau distillée qsp 100µl. L'absorbance a été mesurée par un
spectrophotomètre.
BSA (µg) 0 5 10 15 20 40

DO (595 nm) 0 0,241 0,437 0,614 0,753 1,158

Calcul 1 : Calcul de la quantité/concentration des protéines d'après le dosage de Bradford.

Par exemple, pour l'éluat 1 avec une absorbance de 0,36 :

Sachant que l'équation de la droite étalon est y = 0,0324x ; donc 0,36 = 0,0324x
x = 0,36/0,0324 = 11,1
Donc dans les 15 µl de solution, il y a 11,1 µg de protéines, ce qui représente une concentration de 11,1/15 =
0,74 µg/µl.

Calcul 2 : Calcul de la masse moléculaire des protéines d'après leur distance de migration sur
gel de polyacrylamide. La référence utilisée est un marqueur de taille prestained.

Tout d’abord, il convient de tracer un graphique du logarithme de la masse moléculaire de chaque bande du
marqueur en fonction de leur distance de migration.
Ensuite , la distance de migration de la bande correspondant à la protéine GABARAPL1 a été mesurée. Cette
distance est de 4,25 cm.
Il suffit ensuite de reporter cette distance sur la droite tracée au préalable pour trouver le logarithme de la masse
moléculaire correspondant à cette protéine. Par exemple la distance de migration de GABARAPL1 est de 1,12 cm.
Afin de trouver à quelle masse moléculaire cette valeur correspond, il suffit de faire 101,12 = 13,18.
La masse moléculaire de GABARAPL1 est alors de 13,18 kDa.