TRAVAUX DIRIGES

BIOLOGIE BIOTECH 1
2021/2022 - SEMESTRE 2
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TD Biologie Biotech 1

TD Biologie Biotech 1 – Semestre 2

TD n°1 – Acides nucléiques ............................................................................................ 5

TD n°2 – Réplication ................................................................................................... 11

TD n°3 – Réparation et Transcription ............................................................................ 17

TD n°4 – Expression des gènes .................................................................................... 21

TD n°5 – Technique de biologie moléculaire ................................................................... 27

TD n°6 – Cycle cellulaire.............................................................................................. 33

TD n°7 – Partiel Juin 2021 ........................................................................................... 41

ANNEXE – Code génétique........................................................................................... 47

Niveaux de difficulté des exercices :

* Facile (repose directement sur la connaissance du cours)

** Moyenne (demande un petit peu de réflexion)
*** Difficile (mais je peux y arriver !)
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TD n°1 – Acides nucléiques

EXERCICE 1 *

Les affirmations suivantes sont-elles exactes ? Justifiez.

1/ Une cellule humaine contient 46 molécules d’ADN dans son noyau.

2/ Les nucléosomes lient si étroitement l’ADN qu’ils ne peuvent pas se déplacer, une
fois positionné.

3/ Les cellules humaines ne contiennent aucun ADN circulaire.

4/ Environ la moitié de l’ADN d’une cellule humaine est codante, porteuse de gènes
ayant une fonction, le reste de l’ADN, considéré comme un ADN poubelle, n’a aucune
fonction.

5/ Tous les ADN eucaryotes sont associés à des histones.

6/ Si l’on compare l’ADN d’une souris et de l’Homme, certaines séquences sont

hautement conservées. On considère que ces régions sont donc fonctionnellement
importantes.

EXERCICE 2 : Structure des bases et des nucléotides *

1/ Quelle est la nature de la molécule présentée ci-dessous. De quoi est-elle constituée

et par quelle liaison ?

2/ Identifiez les molécules présentées ci-après, indiquez leur nature purique ou

pyrimidique et précisez dans quel acide nucléique ils peuvent être retrouvés.

Acides nucléiques 5/48

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3/ Quelles bases s’apparient entre elles dans l’ADN et l’ARN ? Par quel(s) type(s) et
combien de liaisons chimiques ?

4/ Par conséquent, si vous comptiez le nombre de bases de chaque type dans un

échantillon d’ADN double brin, quel serait le résultat ?

a. A + C = G + T c. G + C = A + T
b. G + C = A + C d. G + C = 2AT

5/ Représentez la réaction de polymérisation de deux molécules de desoxyGTP (dGTP).

Orientez cette molécule.

6/ Représentez la desoxycytidine-5’-triphosphate. Est-ce une base, un nucléoside ou

un nucléotide ? Dans quel type d’acide nucléique peut-on la retrouver ? Justifiez.
Identifiez et nommez les différentes liaisons retrouvées dans cette molécule.

EXERCICE 3 : L’ADN est un acide *

Une collaboration avec un laboratoire étranger vous amène à voyager avec des
échantillons d’ADN. Arrivé à l’aéroport, vous expliquez au douanier que vous transporter
des échantillons d’acide désoxyribonucléique.

Expliquez à ce douanier en quoi l’ADN est un acide mais qu’il n’a aucune raison d’être
sur ses gardes.

EXERCICE 4 : Structure de l’ADN *

1/ Légendez et donnez un titre à la figure ci-dessous.

2 3

1
5

3 2

nm

6/48 Acides nucléiques

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2/ Dans le monde du vivant, l’ADN est obligatoirement linéaire. Cette allégation est-
elle juste ? Justifiez.

3/ Que pouvez-vous dire de la structure de l’ADN et de celle des ARN ?

Soit la séquence suivante : 5’-UGGAACGCCUUUACGUUC-3’

4/ A quel type d’acide nucléique cette séquence correspond-elle ? Justifiez.

5/ Des appariements sont-ils possibles au sein de cette molécule ? Si, oui dessinez la
structure obtenue. Que pouvez-vous en conclure ? Combien de liaisons hydrogènes sont
contenues dans cette molécule ?

EXERCICE 5 : Etude d’un oligonucléotide **

1/ Qu’est-ce qu’un oligonucléotide ?

2/ La séquence simple brin d’ADN est écrite dans le sens 5’- 3’. Quels sont les
groupements chimiques correspondants à ces extrémités ?

Voici un brin d’ADN dont la séquence est la suivante :

5’- GTCCGACTTACGTGCGTAA -3’

3/ Ecrivez la séquence et l’orientation du second brin de ce fragment. Quelle est la

particularité de ce second brin ?

4/ Déterminez la température de fusion (Tm) de cette séquence selon la formule

simplifiée.

5/ Déterminez les Tm des oligonucléotides suivants et classez-les par ordre croissant :

A : AATGGTGTACCGTCC
B : AATTGTCTACCTAGTAATG
C : TTGTGCGCAAGCTGCCGC
D : ATGGCTGTCGGATATAACCGC

EXERCICE 6 : Teneur en GC et dénaturation **

Après avoir séquencé un brin d’ADN bicaténaire, un chercheur trouve qu’il est composé de
40 % de guanine et de cytosine.

1/ Sachant cela, calculez le rapport : AT/GC, précisez la proportion de chacune des

bases.

2/ Le même chercheur séquence un autre brin d’ADN bicaténaire et trouve que le

rapport AT/GC de ce brin vaut 2,25. Des deux brins d’ADN testé, lequel sera le plus
facilement dénaturable ? Justifiez votre réponse.

Acides nucléiques 7/48

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EXERCICE 7 : Organisation de l’ADN *

1/ Annotez et donnez un titre au schéma suivant :

7 2

9 11

10

EXERCICE 8 : Compaction de la chromatine ***

Les protéines HP1 font partie d’une famille multigénique. Ces protéines s’associent à
l’hétérochromatine et jouent un rôle dans sa compaction. Il existe trois protéines HP1
chez l’humain : HP1a, HP1b et HP1g dont le domaine de liaison à l’ADN est hautement
conservé.
Vous souhaitez déterminer si ces protéines HP1 sont capables de se lier à la queue N-
terminale de l’histone H3 lorsque celle-ci est non modifiée, méthylée sur sa lysine 9 ou
phosphorylée sur sa sérine 10.
Pour cela, vous avez fixé ces deux versions de l’histone H3 à des billes. Ces billes sont
ensuite incubées en présence de HP1a, HP1b ou HP1g. Un test est également réalisé
avec la protéine Pc1 qui est connue pour se lier à tous les histones.
La particularité de l’expérience réside dans le fait qu’après incubation, vous pouvez
récupéré deux fractions : les protéines non liées aux billes (N) et les protéines liées aux
billes (L).
Les résultats vous sont présentés dans la figure 1, ci-après.

8/48 Acides nucléiques

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Figure 1 : Test de pull-down de la protéine HP1.

Les protéines HP1a, HP1b, HP1g et Pc1 ont été détectées par des anticorps spécifiques : une
bande noire indique la présence de la protéine. La piste T correspond à la fraction de protéines
totales utilisée pour l’incubation, avant cette incubation. La piste N correspond aux protéines
non-liées après incubation, la piste L, aux protéines liées après incubation avec les billes. La
même expérience a été réalisée en incubant les protéines avec des billes couplées à l’histone H4
non-modifiée. K9-Me correspond à l’histone H3 méthylé et S10-P à la phosphorylation sur la
sérine.

1/ Pourquoi tester la protéine Pc1 et l’histone H4 alors que nous nous intéressons à
l’interaction potentielle des protéines HP1a, HP1b et HP1g avec l’histone H3 ?

2/ A partir de la figure 1, concluez sur l’interaction des protéines de la famille HP1 avec
H3.

3/ Quelle modification de l’histone H3 se retrouve dans l’hétérochromatine ? A quel

niveau d’expression cette marque est-elle alors associée ?

MOT CROISES
Horizontal

3. Arrangement standard de l'ensemble des chromosomes d'une cellule, à partir d'une prise
de vue microscopique
4. Constitué d'une base azotée et d'un sucre, je suis ...
5. Portion d'un chromosome dont la molécule d'ADN est associée à des protéines, apparaissant
lors des divisions cellulaires
6. ADN associé à des protéines basiques, dont le niveau de compaction sera variable et
influencera l'expression génique
8. Ensemble du matériel génétique codé par l'ADN d'une cellule
10. Copie de l'acide désoxyribonucléique, je permets la synthèse des protéines
12. Molécule azotée constituée de 5 atomes de carbone et de 4 atomes d'azote, je suis à l'origine
des adénines et des guanines
13. Molécule cyclique à 4 atomes de carbone et 2 atomes d'azote, je suis à l'origine des
cytosines, des thymines mais aussi des uraciles
14. Protéine basique participant à la formation de la chromatine
15. Unité de base de l'hérédité prédéterminant une caractéristique d'un individu
16. Structure secondaire adoptée par l'ADN
17. Zone de liaison reliant deux chromatides d'un chromosome

Acides nucléiques 9/48

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Vertical

1. Constitué d'une base azotée, d'un sucre et de groupements phosphates, je suis ...
2. Constituant d'un nucléotide, de nature purique ou pyrimidique
3. L'appariement des bases entre-elles repose sur le principe de la ...
7. Les deux brins d'ADN constituant l'hélice sont orientés de manière ...
9. Région hautement répétée constituant l'extrémité d'un chromosome
10. Macromolécule, je porte l'information génétique
11. Unité de base de la chromatine, constituée de 8 protéines

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TD n°2 – Réplication

EXERCICE 1 *

Des cellules sont mises en culture dans des boites de pétri contenant un milieu, dit
milieu lourd car il contient des nutriments enrichis en isotopes lourds d’azote et de
carbone (15N et 13C à la place des isotopes naturels 14N et 12C).
Dans un deuxième temps, les cellules sont transférées sur un milieu normal contenant
des nutriments légers 14N et 12C. L’ADN de ces cellules ayant poussées à différentes
générations est isolé et la densité de ces ADN sont déterminés par centrifugation sur
un gradient de densité. Les résultats sont présentés dans la figure suivante :

1 2 3 4

Figure 1 : Résultats de la centrifugation sur gradient de densité des ADN

1 : ADN issu des cellules ayant poussées sur milieu lourd
2 : ADN issu de la 1ère génération de cellules transférées sur milieu normal
3 : ADN issu de la 2ème génération de cellules transférées sur milieu normal
4 : ADN issu de la nème génération de cellules transférées sur milieu normal

1/ Quelle expérience est présentée dans l’énoncé ?

2/ Expliquez les résultats observés, en précisant la « nature » de chaque bande et la

proportion de chacune d’entre elles.

3/ Schématisez le concept révélé par l’expérience.

EXERCICE 2 : Polymérisation des nucléotides **

On ajoute à des extraits bactériens, contenant l’ensemble des constituants nécessaire

à la réplication, de la didesoxycytidine triphosphate (ddCTP) en excès par rapport à la
concentration de dCTP dans le tube.

1/ Que se passe-t-il lors de la réplication in vitro ?

La même expérience est réalisée mais cette fois-ci du dCMP (desoxycytidine

monophosphate) est ajouté en excès par rapport à la concentration en dCTP.

2/ Quel est l’impact de l’ajout de ce nucléotide sur la réplication ?

Réplication 11/48
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EXERCICE 3 : Initiation et progression de la réplication *

1/ Comment nomme-t-on le point de départ de la réplication ? Expliquez brièvement

le(s) événement(s) qui se produi(sen)t à ce point, ainsi que le(s) nom(s) de(s)
l’enzyme(s) responsable(s) ?

2/ Comment appelle-t-on la structure schématisée dans la figure ci-dessous ?

3/ Légendez ce schéma. Précisez le rôle des enzymes que vous aurez identifiés.
Orientez les brins.

4/ Faut-il amorcer la synthèse d’ADN sur le brin direct ?

5/ Pourquoi faut-il plusieurs amorces pour la synthèse du brin retardé ?

6/ Le brin direct est-il toujours le même sur toute la longueur du chromosome ?

Justifiez.

EXERCICE 4 : Altérations de la réplication **

Les mutations des gènes impliquées dans la réplication sont le plus souvent létales, du
fait de leur implication dans ce mécanisme clé de la cellule. Il est donc difficile d’étudier
des cellules mutées pour les enzymes de la réplication. Toutefois, un système permet
de créer des mutations dites conditionnelles. Dans certaines conditions, les cellules se
développent normalement, les mutations ne s’expriment pas. Le changement de
conditions environnementales (e.g. changement de température) « active » les
mutations, et l’on peut donc en voir les conséquences avant que les cellules ne meurent.
Concernant la réplication, deux phénotypes peuvent être observés : « quick-stop »,
arrêt immédiat de la synthèse d’ADN, ou « slow-stop », arrêt progressif de cette
synthèse.

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Dans ce cas, prédisez les phénotypes associés aux mutations des protéines que vous
avez identifiez en 1, 2, 3, 6 et 9 sur le schéma de l’exercice 3.

EXERCICE 5 : La télomérase **

Un problème rencontré lors de la réplication est la réplication des extrémités des

chromosomes linéaires. Avec le temps, les chromosomes raccourcissent. Chez
l’Homme, l’enzyme pouvant compenser cette perte, la télomérase, est inactive la
plupart du temps dans les cellules somatiques. Considérez un évènement de réplication
sur un chromosome d’une cellule somatique. Laquelle des assertions suivantes décrit-
elle correctement le statut des deux chromosomes fils par rapport au chromosome
parental ?

a. Un chromosome fils sera plus court à une extrémité ; l’autre chromosome fils sera
normal.

b. Un chromosome fils sera plus court aux deux extrémités ; l’autre chromosome fils
sera normal.

c. Un chromosome fils sera plus court à une extrémité ; l’autre chromosome fils sera
plus court à une extrémité.

d. Les deux chromosomes fils seront plus courts à une extrémité, la même dans les
deux chromosomes.

e. Les deux chromosomes fils seront plus courts à une extrémité, chacun à une
extrémité opposée.

f. Les deux chromosomes fils seront plus courts aux deux extrémités.

EXERCICE 6 : Processivité de l’ADN polymérase ***

On s’intéresse à la processivité d’une ADN polymérase in vitro. Pour cela, on utilise un

substrat composé de deux brins d’ADN complémentaires de longueurs différentes, 30
et 1000 nucléotides. Le brin de 1000 nucléotides sert de matrice, le brin de 30
nucléotides sert d’amorce qui sera allongée par l’ADN polymérase. Le brin court de 30
nucléotides est marqué en 5’ par un phosphate radioactif 32P.

Figure 1 : Structure de la matrice ADN radiomarquée.

On pré-incube ce substrat ADN synthétique avec l’ADN polymérase. Il se préforme un
complexe ADN/ADN polymérase. Pour démarrer la polymérisation, on ajoute ensuite les
quatre dNTP seuls (piste 2 figure 2) ou avec un très large excès du substrat ADN mais
non radioactif après ou pendant la préincubation (piste 3 et 4 figure 2). Les produits

Réplication 13/48
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résultant de l’expérience sont analysés par éléctrophorèse sur gel de polyacrylamide

puis révélés par autoradiographie.

Figure 2 : Autoradiographie de l’amplification in vitro d’un substrat ADN synthétique.

La taille des fragments observés est indiquée à gauche de l’autoradiographie.

1/ Que visualise-t-on sur l’autoradiographie ?

2/ Interprétez le résultat de cette expérience. A quoi correspondent les fragments de

100 à 200 nucléotides dans la troisième expérience ?

3/ Déterminer la processivité de l’ADN polymérase.

EXERCICE 7 : Fragments d’Okazaki ***

On effectue deux cultures cellulaires d’Escherichia coli. On ajoute, lorsque les bactéries
sont en croissance, de la thymidine tritiée (3H) et donc radioactive dans les deux
cultures à t0. A l’instant t5 secondes, on ajoute un large excès de thymidine non-
radioactive. On stoppe l’expérience à t10 secondes pour la première culture et t600
secondes pour la deuxième par ajout de soude (NaOH). On récupère l’ADN des lysats
cellulaires afin de réaliser une électrophorèse puis on révèle les résultats par
autoradiographie (Figure 1).

Figure 1 : Autoradiographie réalisée sur l’ADN des lysats des cultures cellulaires d’E.coli.
La taille des fragments observés est indiquée à gauche de l’autoradiographie.
Les fragments dans le haut du gel (>16 000 nucléotides) correspondent à des ADN très longs
qui n’ont quasiment pas migré dans le gel.

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1/ Quel mécanisme observe-t-on en ajoutant de la thymidine tritiée (3H) ?

2/ Expliquez pourquoi on parle de brins lents et de brins rapide lors de la réplication.

3/ Décrivez et Interprétez les résultats obtenus.

MOTS CROISES

Horizontal
2. Région en forme de Y d'une molécule d'ADN en réplication où les deux brins frères sont
formés
3. Protéine complexe qui encercle la double hélice d'ADN et qui se lie à l'ADN polymérase, le
gardant fermement lié à l'ADN pendant qu'elle se déplace
7. Enzyme qui se lie à l'ADN et casse de façon irréversible une liaison phospho-diester dans
l'un ou l'autre brin, permettant à l'ADN de pivoter à cet endroit
9. Enzyme qui ouvre l'hélice de l'ADN en séparant les simples brins

Vertical

1. Brin nouvellement formé de l'ADN trouvé à une fourche de réplication. Il est synthétisé de
façon continue dans le sens 5'-3'
4. Court fragment d'ARN synthétisé sur les brins tardifs au cours de la réplication de l'ADN et
ensuite éliminé
5. Enzyme qui unit deux brins d'ADN adjacents
6. Brin nouvellement formé de l'ADN trouvé à une fourche de réplication. Il est formé de
segments discontinus qui sont liés plus tard de façon covalente
8. Segments discontinus d'ADN d'un des deux brins d'ADN néosynthétisés. Ils finiront par être
reliés entre eux.

Réplication 15/48
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TD n°3 – Réparation et Transcription

EXERCICE 1 : Modification d’une cytosine en uracile *

1/ Représentez la modification d’une cytosine en uracile.

2/ De quel type de modification s’agit-il ?

3/ Quelle est la conséquence de cette modification si elle n’est pas réparée ? Faites un
schéma pour illustrer votre réponse.

EXERCICE :2 Système SOS **

Les expositions aux UV des bactéries peuvent provoquer des mutations de leur ADN
voire les tuer. Vous étudiez trois souches d’Escherichia coli, une souche sauvage Wt,
une mutante RecA (le gène RecA est muté, la protéine absente) et une mutante UvrA
(le gène UvrA est muté, la protéine absente). Vous mesurez la fréquence de mutations
des cellules survivantes après une exposition aux UV et vous obtenez les résultats
présentés dans le tableau suivant :

Tableau : Fréquence des mutations induites par les UV

Fréquence
Souche Survie (%)
(Mutations/100 survivants)
Wt 100 400
RecA 10 1
UvrA 10 40000

1/ Rappelez dans quelles voies de réparations de l’ADN, les protéines RecA et UvrA
sont-elles retrouvées ?

2/ En vous aidant des résultats obtenus, indiquez quelle voie est la plus sujette aux
erreurs ? Cela est-il cohérent avec ce que vous savez de ces deux voies de réparation ?

3/ Quelle voie prédomine dans les souches Wt ?

4/ Expliquez la voie de réparation dans laquelle est impliquée la protéine RecA, en

précisant l’opéron concerné. Ceci explique-t-il les résultats obtenus ?

5/ Est-ce que l’utilisation de cette voie est une bonne stratégie pour faire face aux
altérations causées par les UV ?

Réparation et transcription 17/48

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EXERCICE 3 ***

Les profils des mutations induites par les UV dans le gène LacI d’E.coli ont été analysés.
La figure vous présente la répartition le long du gène des mutations faux-sens au-
dessus de la ligne et des mutations frame-shift en dessous.
Les mutations faux-sens ont été identifiées en recensant les pertes de fonctions du gène
alors que les mutations frame-shift l’ont été grâce à des protéines fusion, sans pour
autant préciser si elles sont associées à une perte de fonction.

Figure : Profil des mutations induites par les UV dans le gène LacI d’E.coli

1/ Rappelez ce qu’est une mutation faux-sens et une mutation frame-shift.

2/ Pouvez-vous donner une explication aux points chauds de mutations faux-sens

observés aux extrémités du gène ? Cela signifie-t-il forcément qu’elles sont limitées à
ces extrémités ?

EXERCICE 4 : Conséquences des mutations sur l’expression génique *

1/ Complétez le schéma ci-dessus d’un gène eucaryote en précisant les rôles des
différentes structures représentées lors de la transcription.
(Ne tenez pas compte des numéros sur la figure)

2/ Vous dessinerez à la suite de ce schéma les différentes molécules obtenues suite à

l’expression de ce gène et nommerez les événements ayant conduit à ces molécules.

3/ Des mutations peuvent se produire à différentes positions sur un gène. Précisez les
conséquences de ces mutations en fonction de leurs positions numérotées de 1 à 9 sur
le schéma précédent.

18/48 Réparation et transcription

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EXERCICE : 5 Bulle de transcription *

1/ Expliquez les grandes étapes de la transcription.

2/ Quels sont les facteurs de transcription généraux associés à l’ARN polymérase

responsable de la transcription des gènes et pourquoi les nomme-t-on ainsi ?

3/ Soit la séquence suivante : 5’ATCGATG3’.

Schématisez une bulle de transcription en légendant les différentes structures et
protéines qui la composent.

4/ Lors de la transcription, quel(s) brin(s) est/sont considéré(s) comme codant et

matrice ?

EXERCICE 6 ***

Vous avez développé un système de transcription in vitro utilisant un petit segment de

chromosome contenant votre gène d’intérêt. Lorsque vous mettez ce segment en
présence des facteurs généraux de la transcription et de l’ARN polymérase II, vous
obtenez bien un transcrit mais en quantité moindre que ce que vous aviez trouvé dans
l’extrait nucléaire.

1/ Quelle hypothèse émettez-vous pour expliquer cette différence d’efficacité de

transcription ?

Afin de vérifier votre hypothèse, vous réalisez des matrices portant différentes délétions
de la séquence en amont du promoteur, présentées dans la figure ci-dessous. Vous
comparez ensuite les activités transcriptionnelles de ces différentes matrices dans des
extraits nucléaires.

Figure : Transcription in vitro de de différentes matrices.

Représentation schématique des constructions utilisées. A, la construction est complète. B à F
représentent les différentes délétions réalisées. La présence d’une activité transcriptionnelle
ainsi que son intensité est décrite à côté de chaque construction.

Réparation et transcription 19/48

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2/ D’après les résultats obtenus, pouvez-vous confirmer l’hypothèse que vous avez
émise ? Avez-vous obtenu des informations supplémentaires ?

Après quelques recherches, vous identifiez une protéine comme étant le responsable
putatif de cette transcription plus active in vivo.

3/ Quelle(s) expérience(s) réaliseriez-vous pour confirmer la responsabilité de cette

protéine dans la suractivation de l’expression de ce gène ?

20/48 Réparation et transcription

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TD n°4 – Expression des gènes

EXERCICE 1 *

Pour chacune des propositions suivantes, identifiez celles qui sont exactes. Justifiez vos
réponses.

1/ Un codon donné peut spécifier plusieurs acides aminés.

2/ Dans le code génétique, certains acides aminés sont spécifiés par plusieurs codons.

3/ Lors de la traduction, le COOH d’un acide aminé lie de manière covalente le 3’OH
d’un ARNt.

4/ Le mécanisme de la traduction eucaryote requiert la coiffe de l’ARNm.

5/ Il n’existe pas de système de réparation de la séquence primaire des protéines.

6/ L’épissage élimine les séquence promotrices du premier ARN transcrit.

7/ Un même ribosome assure la synthèse complète d’un peptide.

8/ Excepté le tryptophane, chaque acide aminé est spécifié par plusieurs codons.

9/ Toute synthèse protéique procède d’un allongement du peptide du NH2 COOH.

10/ D’une séquence peptidique unique, on peut remonter à plusieurs séquences

d’ADN.

11/ La fin de la traduction d’un peptide est spécifiée par un codon stop.

EXERCICE 2 : Traduction **

Le code génétique est fourni en annexe du livret.

Soit la séquence d’un brin d’un fragment d’ADN isolé à partir d’E. coli :

5’ - CTAGCCTACCCATAGG - 3’

1/ On suppose qu’un ARNm est transcrit à partir de cet ADN, en utilisant comme brin
matrice le brin complémentaire. Quelle sera la séquence de cet ARNm ?

2/ Quel peptide obtiendrait-on si la traduction commençait précisément à l’extrémité

5’ de cet ARNm ?
Nous admettrons ici qu’aucun codon de départ n’est nécessaire comme cela se présente
in vitro dans certaines conditions expérimentales.

3/ Quel ARNt se liera au ribosome après le départ de l’ARNtAla ?

Expression génique 21/48

 M W 2021-2022
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Vous devez définir des amorces PCR afin d’obtenir le cDNA correspondant à l’ARNm codant
4/ Quelles sont, s’il y en a, les liaisons rompues lorsque le groupement amine de
cette protéine d'intérêt.
l’alanine s’engage dans une liaison peptidique, et qu’arrive-t-il à l’ARNtAla ?
Q1 : A partir de la séquence peptidique obtenue, remontez à la séquence en acide nucléique du
5/ Combien
cDNA. de peptides différents cet ARNm code-t-il ?

Q2 : Donnez les paires d'amorces de 18 nucléotides les plus simples qui vous permettront d'identifier
le gène codant la protéine.
EXERCICE 3 : Régulation de l’expression génique ***

La transcription d’un gène

Exercice 8 : Régulation constituégénique
de l’expression de 4 exons peut générer 3 transcrits matures
distincts (T1, T2 et T3). Ces transcrits sont eux-mêmes traduits en 2 protéines de tailles
La transcription d’un gène constitué de 4 exons peut générer 3 transcrits matures distincts (T1, T2
différentes (protéine 1 pour T1 et T3, protéine 2 pour T2) mais ayant la même extrémité
et T3). Ces transcrits sont eux-mêmes traduits en 2 protéines de tailles différentes (protéine 1 pour T1 et
N-terminale. L’exon 3 a une taille de 300 nucléotides.
T3, protéine 2 pour T2) mais ayant la même extrémité N-terminale. L’exon 3 a une taille de 300
nucléotides.

Pour chacune des propositions suivantes, identifiez celles qui sont exactes. Justifiez vos
réponses.
8#
1/ Concernant
# la transcription de ce gène :
a/ les 3 transcrits sont produits à partir de 3 gènes différents.
b/ les 3 transcrits sont issus du même pré-ARNm.
c/ le gène possède 5 introns.
d/ les transcrits T1 et T3 partagent le même site d’initiation de la transcription.
e/ les transcrits T1 et T2 partagent le même signal de polyadénylation.

2/ Concernant la régulation de la transcription de ce gène :

a/ T1 et T2 diffèrent par un épissage alternatif de l’exon 3.
b/ dans les transcrits T1 et T3, le site donneur d’épissage de l’intron 3 n’a pas été
utilisé.
c/ les transcrits T1 et T3 ont le même site accepteur d’épissage fonctionnel en aval
de l’intron 2.

3/ Concernant la traduction des transcrits :

a/ les 3 transcrits partagent le même site d’initiation de la traduction.
b/ le codon AUG initiateur de la traduction se trouve dans l’exon 2.
c/ il y a un codon stop dans l’exon 4.

22/48 Expression génique

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EXERCICE 4 : Régulation de l’expression génique par des séquences cis-

régulatrices *

Le schéma ci-dessous montre cinq gènes, accompagnée de leurs amplificateurs,

provenant du génome d’une espèce quelconque. Imaginez que les protéines activatrices
en orangé, en bleu, en vert, en noir, en rouge et en violet présentes peuvent se lier aux
éléments de contrôle de la couleur appropriée dans les amplificateurs de ces gènes.

1/ Dessinez une croix au-dessus des éléments amplificateurs (de tous les gènes) qui
comporteraient des activateurs liés dans une cellule dans laquelle seul le gène 5 serait
transcrit.
De quelle couleur seraient les activateurs présents ?

2/ Ajoutez un point au-dessus de tous les éléments amplificateurs qui auraient des
activateurs liés dans une cellule dans laquelle les activateurs en vert, en bleu et en
orangé seraient présents.
Quel(s) gène(s) serai(en)t transcrit(s) ?

3/ Imaginez que les gènes 1, 2 et 4 codent des protéines spécifiques des cellules
nerveuses et que les gènes 3 et 5 sont spécifiques des cellules de la peau.
Quels activateurs doivent être présents dans chaque type de cellules pour assurer la
transcription des gènes appropriés ?

EXERCICE 5 : Nutrition chez la bactérie Escherichia coli et opéron arabinose **

Une culture d’Escherichia coli est réalisée sur un milieu contenant deux glucides : le D-
glucose et le L-arabinose.
La cinétique de croissance bactérienne est présentée figure 1 (trait plein). Pendant la
culture, les concentrations en D-glucose et L-arabinose sont mesurées (traits pointillés).

Expression génique 23/48

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gènes métaboliques
et de régulation
araCBAD

L-arabinose

concentration en sucre
nombre de cellules

glucose
carte génétique d’E. coli

araE araFG

temps gènes de transport

Figure 1 : croissance d’E. coli sur un mélange de Figure 2 : localisation des gènes
D-glucose et de L-arabinose (unités arbitraires) impliqués dans l’utilisation du L-arabinose

Les gènes impliqués dans l’utilisation du L-arabinose sont nommés ara. Ils sont disposés
en trois groupes sur le chromosome bactérien (figure 2). Les deux groupes E et FG
codent des protéines intervenant dans le transport du L-arabinose. Le troisième
comporte quatre gènes dont trois (A, B, D) codent des enzymes intervenant dans le
métabolisme du L-arabinose.

1/ Analyser et commenter les figures 1 et 2.

Afin d’élucider la fonction du gène araC en absence de D-glucose, l’expression du gène

araA est étudiée chez une souche sauvage araC+ et chez une souche mutante araC-, en
absence ou en présence de L-arabinose (figure 3). Par ailleurs, la protéine AraC a été
étudiée par diffraction aux rayons X : elle présente deux conformations différentes en
absence ou en présence de L-arabinose.

produit du gène araA

génotype sans arabinose avec arabinose
araC+ 1 1000
araC- 10 10

Figure 3 : quantité de protéine exprimée par le gène araA chez des bactéries sauvages araC +
et araC- en présence ou en absence de L-arabinose (unités arbitraires).

2/ Analyser et commenter le tableau de la figure 3.

Le produit de l’expression du gène araA est une enzyme : la L-arabinose isomérase. La

quantité de L-arabinose isomérase est suivie chez des populations bactériennes placées

24/48 Expression génique

 araE

c
temps gènes de tra
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Figure 1 : croissance d’E. coli sur un mélange de TD Biologie Biotech
Figure1 2
: localisa
D-glucose et de L-arabinose (unités arbitraires) impliqués dans l’utilisat
sur des milieux nutritifs comportant des concentrations croissantes en AMPc (figure 4)
et contenant à la fois le D-glucose et le L-arabinose en excès pendant toute la durée de
la culture.

L-arabinose isomérase

0 10-4 10-3 10-2 AMPc

Figure 4 : effets de l’AMPc sur la production de L-arabinose isomérase (unités arbitraires)

3/ Analyser et commenter la figure 4.

4/ En vous appuyant sur vos connaissances relatives à l’opéron lactose d’E. coli,
proposer un mode de fonctionnement de l’opéron arabinose.

Expression génique 25/48

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26/48 Expression génique

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TD n°5 – Technique de biologie moléculaire

EXERCICE 1 : Carte de restriction **

Après avoir isolé un plasmide provenant de E.coli, vous souhaitez le caractériser en

établissant une carte de restriction. Vous avez à disposition 3 enzymes de restriction :

① BamHI (G ↕ GATCC)
② EcoRI (G ↕ AATTC)
③ NotI (GC ↕ GGCCGC)

Vous réalisez 6 digestions différentes : des digestions simples, en utilisant chaque

enzyme séparément et des doubles digestions, en utilisant chaque combinaison de 2
enzymes. Les fragments résultants sont séparés par électrophorèse en gel d’agarose,
dont les résultats sont présentés ci-dessous :

1/ Qu’est-ce qu’une enzyme de restriction ?

2/ Pour chacune des enzymes utilisées, identifiez les sites de clivage sur une séquence
d’ADN double brin contenant le site de restriction. Quels types d’extrémités seront
obtenues ?

3/ Construisez la carte de restriction du plasmide.

Techniques de BM 27/48
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EXERCICE 2 : Séquençage de Sanger *

Dans la figure ci-contre, les quatre pistes montrent les

produits des réactions de séquençage contenant ddG
(piste 1), ddA (piste 2), ddT (piste 3) et ddC (piste 4).
Les chiffres à droite de l’autoradiogramme représentent
les positions de fragments d’ADN marqueurs de 50 et 116
nucléotides.

1/ Rappelez le principe de cette méthode.

2/ Déterminez la séquence d’ADN qui a été utilisée pour la

réaction de séquençage dont les résultats figurent ci-contre.

Cet ADN est issu de la partie centrale d’un clone d’ADNc d’une
protéine de mammifère.

3/ En considérant le brin orienté 5’-3’ dont vous avez déterminé

la séquence et en utilisant le code génétique fourni en annexe
à la fin du sujet, déterminez la séquence en acides aminés
de cette portion de protéine.

EXERCICE 3 : Séquençage et recherche de mutations *

Dans le cadre du dépistage d’une maladie génétique lors d’une enquête familiale, des
prélèvements sanguins sont réalisés chez plusieurs individus de la même famille.
L’analyse d’un gène, par séquençage de l’ADN génomique chez deux sœurs, a permis
de caractériser des mutations ponctuelles qui ne modifient pas la séquence protéique.
La sœur B est atteinte par la maladie, la sœur A ne l’est pas. Les résultats du
séquençage de l’ADN génomique sont présentés dans la figure ci-dessous :

1/ Expliquez et interprétez la figure.

28/48 Techniques de BM
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2/ Les mutations caractérisées précédemment ne modifiant pas la séquence protéique,

est-il possible d’affirmer qu’elles ne sont pas responsables de la maladie génétique
observée chez la sœur B ?

EXERCICE 4 : Banques d’ADN *

Expliquez la construction d’une banque d’ADNc. Quelle est la différence par rapport à
une banque d’ADN génomique ?

EXERCICE 5 : Amorces pour PCR ***

Vous disposez de la séquence génomique d’un gène suspecté d’être impliqué dans une
maladie génétique autosomique dominante :

La séquence en acides aminés correspondante au début de cet exon est : Leu-Leu-Leu-

Ile-Val-Ile. Les séquences exoniques sont indiquées en gras. Chez certains sujets
malades, une substitution peut être observée sur la position indiquée en gras et
soulignée, suivi ou non d’une délétion de 3 à 5 nucléotides.

Écrire les séquences en 5’-3’ d’amorces oligonucléotidiques de 20 nucléotides

nécessaires pour amplifier par PCR ce fragment d’ADN génomique correspondant
uniquement à l’exon dans sa totalité.

EXERCICE 6 : Northern blot **

Des chercheurs s’intéressent à l’expression d’un gène X impliqué dans une maladie
mitochondriale.
Ils ont à leur disposition des extraits d’ARN totaux de 4 souris atteintes par la maladie
à des degrés variables : la souris 1 est la plus atteinte par la maladie et la souris 4 a le
phénotype le plus léger.
Afin d’expliquer ces différences phénotypiques, les chercheurs décident de réaliser un
Northern blot, en utilisant comme sonde l’ADNc de l’exon 2 de ce gène. Les résultats
obtenus sont schématisés dans la figure ci-après.

Techniques de BM 29/48
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Figure 1 : Analyse de l’expression du gène X chez des souris atteintes par la maladie.
Le Northern blot a été réalisé à partir d’extrait ARN totaux de 5 souris, une sauvage (Wt) et 4
souris malades (1 à 4). L’expression du gène X et du gène de l’actine ont été testées ; des
quantités équivalentes d’ARN ont été déposées.

1/ Rappelez brièvement le principe du Northern blot.

2/ Pourquoi étudier l’expression du gène de l’actine ?

3/ Analysez la figure puis proposez une explication quant aux phénotypes observés
pour les différentes souris.

EXERCICE 7 : RFLP *

Un échantillon sanguin prélevé chez quatre paires de jumeaux a été analysé en utilisant
un mélange de sondes RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), disséminées
sur une vaste étendue du génome. Les résultats des analyses sont reportés dans la
figure ci-dessous :

1/ Quels enfants sont jumeaux ? Lesquels sont de vrais jumeaux ?

2/ Comment pourriez-vous relier une paire de jumeaux à leurs parents ?

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Pour s’entraîner

EXERCICE 8 : Amorces pcr bis

La molécule d’ADN ci-dessous fait partie d’un gène X. La séquence en gras correspond
à un intron.

3’-
AGTTTTATCCTATACAGGCCCGCTCACTAAATTCGAAATTCACGCACGGAATCTCCACACTTCCTATAGC
GGC-5’
5’-
TCAAAATAGGATATGTCCGGGCGAGTGATTTAAGCTTTAAGTGCGTGCCTTAGAGGTGTGAAGGATATC
GCCG-3’

1/ Donnez les séquences d’amorces oligonucléotidiques de 20 nucléotides nécessaires

pour amplifier la totalité de ce fragment d’ADN.
Vous écrirez les séquences de 5’ en 3’.

2/ Déterminez le Tm des amorces que vous avez obtenues.

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32/48 Techniques de BM
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TD n°6 – Cycle cellulaire

EXERCICE 1 : Cycle cellulaire **

1/Complétez le graphique ci-dessous. Associez les différentes observations

microscopiques de la figure 1 aux phases du cycle cellulaire qui leur correspond.

Figure 1 : Cellules de rein de rat observées au microscope à fluorescence.

L’ADN est marqué grâce à un agent intercalant à fluorescence rouge. Un anticorps anti-
tubuline couplé à du FITC (fluorescence verte) a été utilisé.

Cycle cellulaire 33/48

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Des fibroblastes sauvages de souris sont mis en culture dans une boite de pétri
contenant un milieu nutritif permettant leur croissance. Des prélèvements sont
effectués à intervalle régulier et le nombre de cellules compté.

2/D’après le tableau ci-après, déterminez la durée du cycle de ces cellules et précisez

la nature de leur croissance.

Temps (h) 0 44 88 132 154 176

Nombre
2,5.103 1.104 4.104 1,6.105 2.105 2.105
de cellules

La culture des cellules sauvages de souris est prolongée afin d’étudier l’évolution de
leur croissance. Les cellules sont comptées 154 h et 176 h après le début de
l’expérience.

3/D’après les résultats obtenus, déterminez la phase du cycle dans laquelle se trouvent
les cellules. Donnez une explication à cette observation.

De la thymidine tritiée est ajoutée au milieu de culture des cellules sauvages au temps
T44h. Après dix minutes en présence de thymidine tritiée, les cellules sont récupérées
par centrifugation, lavées, fixées. La figure 2 correspond à l’observation de ces cellules
après autoradiographie. Les cellules qui ont incorporé la thymidine tritiée
impressionnent le film photographique et sont couvertes de grains d'argent. 50% des
cellules en culture présentent un marquage.

Figure 2 : Autoradiographie de cellules marquées à la thymidine tritiée.

4/Expliquez où s’est intégrée la thymidine tritiée et à quelle phase du cycle. Quel est
l’objectif de cette expérience ?

EXERCICE 2 : Effet de la diosgénine sur le cycle cellulaire **

La diosgénine est une hormone stéroïde végétale. Ses effets sur le cycle de cellules en
culture sont étudiés : les cellules sont d’abord traitées pendant différents temps par 40
µM de diosgénine, puis mises en suspension et soumises à une technique permettant
d’étudier leur cycle cellulaire. Les résultats obtenus, pour des cellules traitées par la
diosgénine et des cellules contrôle non traitées, sont présentés ci-après. Le nombre de
cellules par rapport à la population totale sont indiqués en pourcentages.

34/48 Cycle cellulaire

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1/ Quelle technique utilisée ici a permis d’obtenir ces résultats ? Expliquez brièvement
son principe, en précisant notamment comment le contenu en ADN peut être évalué.
Vous pourrez vous aider d’un schéma.

2/ Expliquez comment interpréter ce type de données, en prenant l’exemple de la

population contrôle à 12h.

3/ D’après les résultats obtenus, les populations cellulaires étudiées vous semblent-
elles synchrones ou asynchrones ? Justifiez votre réponse.

4/ Comparez les résultats obtenus pour les cellules traitées et les cellules non traitées
à 12h, puis à 24h. Quel semble être l’effet de la diosgénine sur le cycle cellulaire ?

EXERCICE 3 : Synthèse des cyclines **

Le passage d’une phase du cycle cellulaire à une autre est contrôlé par l’activation des
différents complexes Cdk/cycline.
Afin d’étudier plus précisément la protéine Cdk2 et les Cyclines A et E, des cellules de
souris ont été mises en culture dans des boites de pétri.
Dans un premier temps, les cellules sont mises en culture dans un milieu dépourvu de
sérum pendant 2 jours, puis du sérum est ajouté au milieu de culture. A différents
temps de la culture, des cellules sont prélevées, leur extrait protéique est récupéré puis
utilisé pour réaliser des western blot. Des anticorps spécifiques de Cdk2, cycline A,
cycline E et de l’actine ont été testés.
Les résultats obtenus sont présentés dans la figure 1.

Figure 1 : Accumulation des protéines Cycline A, Cycline E et Cdk2 dans des cellules de souris.
Chaque piste correspond à un extrait total de protéines issu de cellules prélevées de 0 à 21
heures après l’ajout de sérum.

Cycle cellulaire 35/48

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1/Pourquoi avoir commencé la culture cellulaire sans sérum ?

2/Décrivez les résultats de la figure 1.

3/D’après vos connaissances, quelle transition du cycle cellulaire est étudiée ici ?

4/D’après les résultats du western blot, estimez la durée des phases étudiées dans ces
cellules de souris.

5/D’après vos connaissances, expliquez, à l’aide d’un schéma, les mécanismes mis en
jeu dans la synthèse et l’activation des cyclines permettant le passage des phases
étudiées ici.

EXERCICE 4 : Les complexes Cycline/Cdk **

Le complexe MPF (Maturation Promoting Factor) ou Cdk1/Cycline B participe à la

transition de la phase G2 à la mitose lors du cycle cellulaire.
MPF existe sous deux états dans la cellule : inactif lorsque Cdk1 est phosphorylé au
niveau de la tyrosine 15 ou actif lorsque Cdk1 est non-phosphorylé. La tyrosine kinase
Wee1 et la tyrosine phosphatase Cdc25 déterminent l’état de phosphorylation de Cdk1.

Figure 1 : Activité de MPF et de la concentration en cycline B au cours du cycle cellulaire.

Les activités de la kinase Wee1 et de la phosphatase Cdc25 sont elles-mêmes contrôlées

par phosphorylation. La régulation de ces différentes activités a été étudiée dans des
extraits d’ovocytes de grenouille. Dans ces extraits, la protéine Wee1 est active alors
que la protéine Cdc25 est inactive.

1/Quel est l’état d’activation du MPF dans les extraits d’ovocytes de grenouilles et
pourquoi ?

L’ajout d’acide okadaïque, un inhibiteur des sérine/thréonine phosphatases, est ajouté

au milieu de culture des ovocytes. Cet ajout a pour conséquence d’activer MPF. En
utilisant des anticorps spécifiques de chaque protéine, il est possible de visualiser leur
état de phosphorylation par Western blot (figure 2).

36/48 Cycle cellulaire

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Figure 2 : Effets de l’acide okadaïque sur les états de phosphorylations de Cdk1, Wee1 et Cdc25.

2/Sachant que les protéines phosphorylées migrent plus lentement que les non-
phosphorylées, déterminez et expliquez l’état de phosphorylation de Wee1 et Cdc25
en relation avec leur activité.

3/Comment l’addition d’acide okadaïque provoque-t-elle une augmentation de la

phosphorylation de Wee1 et de Cdc25 et une diminution de la phosphorylation de
Cdk1 ?

Le complexe MPF actif a pour cible les protéines Wee1 et Cdc25 dont il impacte l’état
de phosphorylation.

4/Expliquez comment l’apparition d’une faible quantité de MPF actif peut conduire à
son activation rapide et complète ? Schématisez la régulation de l’activation de MPF
(faire apparaître Wee1 et Cdc25 sur le schéma).

EXERCICE 5 ***
(adapté de Li et al., 2012, Cell)

La protéine p53 est considérée comme un suppresseur de tumeur. En effet, cette

protéine est impliquée dans le contrôle du cycle cellulaire, dans l’apoptose ou encore la
sénescence. Elle subit nombreuses modifications post-traductionnelles telles que
l’acétylation de certaines de ces lysines.

Afin de déterminer dans quelle mesure ces acétylations contrôle la prolifération

tumorale et donc l’activité de p53, des souris transgéniques mutées pour p53 ont été
générées (Figure 1) :
- p53K117R : lysine mutée en arginine position 117
- p533KR : 3 lysines mutées en arginine position 117, 161 et 162

Figure 1 : Structure de la protéine p53 et position des mutations étudiées

Cycle cellulaire 37/48

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1/Pourquoi réaliser une mutation des lysines en arginines

Les auteurs ont réalisé́ un western blot sur des extraits protéiques issus de cellules de
thymus de souris sauvage p53 (p53+/+), de souris mutées Ko pour p53 (p53−/−), et de
souris mutées p53K117R. Des anticorps dirigés cotre p53, Puma (impliquée dans la
mort cellulaire programmée) et p21 (impliquée dans la sénescence cellulaire) ont été
testés (Figure 2).

Figure 2 : Western blot sur des extraits de thymus de souris sauvages p53+/+, mutées
p53K117R/K117R et p53−/− (mutant KO) après expositions à des irradiations γ ou non.

2/Pourquoi utiliser un anticorps anti-actine lors d’un western-blot ?

3/Quel est l’impact des irradiations sur l’accumulation de p53 et pourquoi ? Quels sont
les effets des mutations de p53 sur l’accumulation des protéines testées ?

Par la suite, les auteurs se sont intéressés à l’impact de ces mutations sur les capacités
d’apoptose des cellules de différents tissus, à savoir le testicule, l’intestin et la rate.
Pour cela un marquage TUNEL des tissus a été réalisé permettant la visualisation les
cellules apoptotiques en noir (Figure 3).

Figure 3 : Marquage TUNEL de différents tissus de souris p53+/+ et p53K117R/K117R avant ou

après irradiations.

38/48 Cycle cellulaire

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4/Que pouvez-vous conclure à partir des observations microscopiques de la figure 3 ?

Figure 4 : Croissance de cellules sauvages p53+/+, KO p53-/- et mutées p533KR/3KR

5/Décrivez la figure 4.

6/Avec les informations obtenues grâce aux différentes figures, que pouvez-vous dire
du rôle de l’acétylation des lysines de p53 ?

Cycle cellulaire 39/48

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TD n°7 – Partiel Juin 2021

EXERCICE I

Soit la séquence d’ADN suivante nommée X codant pour un court polypeptide :

1/ Annotez la figure 1.

2/ Quel est le mécanisme présenté dans cette figure ?

3/ Précisez quels sont les brins sens et anti-sens, les brins transcrits et non transcrits
ainsi que les brins codants et non codants. Justifiez.

4/ Dessinez la molécule d’ARNm mature issue de la transcription de ce gène en

considérant qu’il n’existe pas d’épissage alternatif pour ce gène.

Afin d’étudier le mécanisme de l’épissage de l’ARN, une expérience en laboratoire a

consisté à mettre tous les éléments nécessaires à l’excision-épissage dans un tube à
essai ainsi que le transcrit primaire de ce gène X.
L’expérience est réalisée avec plusieurs transcrits primaires de ce gène X présentant
chacun une mutation différente. Pour chaque expérience des produits d’épissage sont
accumulés.

5/ Indiquez directement sur la figure les séquences nécessaires à l’excision-épissage.

6/ Expliquez brièvement les étapes de l’excision-épissage.

Le mécanisme détaillé n’est pas demandé.

Révisions 41/48
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7/ Pour chaque expérience présentée, dites quels sont les produits qui seront
accumulés. Justifiez votre réponse. Vous pouvez vous aider d’un schéma.

a/ Délétion du premier nucléotide au niveau du site 5’ d’épissage du 1er intron

b/ Délétion du nucléotide du site de branchement au niveau du 1er intron

c/ Délétion du dernier nucléotide au niveau du site 3’ d’épissage du 1er intron

8/ Complétez le tableau suivant présentant une partie de la molécule X. (Code

génétique en annexe)

9/ Combien de liaisons hydrogène contient la molécule d’ADN présentée dans le tableau

de la question 8 ? Justifiez.

EXERCICE II LA TRANSITION G2/M

La progression du cycle cellulaire est assurée par de nombreux contrôles moléculaires.

Les complexes Cdk/Cycline permettent le passage d’une phase à l’autre et des points
de surveillance existent afin de contrôler ces passages. L’un de ces points de
surveillance assure la transition G2/M.

1/ Rappelez les autres points de surveillance mis en place au cours du cycle cellulaire.

2/ Quel complexe Cdk/Cycline permet le passage de la phase G2 à la phase M ?

3/ Quelle est la fonction d’un complexe Cdk/Cycline ? De quoi est-il constitué ?

Lors du point de contrôle G2/M, le cycle cellulaire est mis en pause. L’ADN est alors
scruté par des enzymes de reconnaissance de potentielles altérations de l’ADN.

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4/ A l’aide d’un diagramme clair, expliquez le processus moléculaire qui conduit à l’arrêt
temporaire du cycle. Vous préciserez les fonctions/activités biologiques des protéines
impliquées.

5/ Certaines protéines impliquées dans le point de contrôle G2/M sont activées par de
fortes irradiations ou par des rayonnements UV. Expliquez pourquoi.

6/ Quelle(s) est/sont la ou les conséquence(s) des UV sur la cellule ?

7/ Quel mécanisme est mis en jeu pour contrer l’effet des UV chez les eucaryotes ?

8/ Décrivez ce mécanisme.

Une fois le point de contrôle G2/M passé, la cellule peut s’engager en phase M. Des
événements initiés en G2 se poursuivent, désormais sous contrôle du complexe
cdk/cycline que vous avez identifié à la question 2. L’un de ces événements implique
un complexe protéique nommé condensine.
Dans certaines leucémies, des défauts d’accumulation de cette condensine ont été
identifiés. Ils conduisent, entre autres, à des phénotypes particuliers observés dans des
cellules mutantes qui vous sont présentés ci-dessous.

Figure 1 : Association de la protéine TOP2α sur les chromosomes mitotiques dans des cellules
sauvages ou mutées.
La présence de la protéine TOP2α, une topoisomérase, est visualisée par fluorescence. L’ADN
est coloré au DAPI.
(D’après, Takahashi et al., 2016)

9/ D’après vos connaissances, quel est le rôle de la protéine TOP2α dans l’événement
qui conduit à l’obtention de chromosomes mitotiques ?

10/ Décrivez brièvement le phénotype observé. Est-ce cohérent avec un défaut de

production de la condensine ?

D’autres chercheurs menant des travaux sur des leucémies, où l’on retrouve ce type de
défauts chromosomiques, ont également identifié d’autres erreurs lors de la mitose
comme des chromosomes retardataires ou la formation de pont entre les chromosomes.
Un de leur résultat vous est présenté dans la figure 2.

Révisions 43/48
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Figure 2 : Observation microscopique et analyse statistique de la présence de ponts ou de

chromosomes retardataires durant la mitose. Les étoiles indiquent des résultats
significativement différents. chr = chromosome
(D’après, Molina et al., 2020)

11/ Quelle phase de la mitose est observée dans la figure 2 ? Justifiez.

12/ Décrivez brièvement la figure et expliquez la conséquence de ces deux défauts sur
la division cellulaire.

EXERCICE III LE CLONAGE

Vous avez découvert dans le génome d’une bactérie de l’espèce des staphylococcus,
dite « staphylocoque », un gène X (Figure 1) codant pour une protéine Y dont vous
ignorez la structure et la fonction. Etant donné le pouvoir pathogène de certains
staphylocoques, vous voulez en connaître davantage sur cette protéine. Vous planifiez
de cloner le gène puis de l’exprimer dans Escherichia Coli.
Chez ce staphylocoque, le gène X est borné par des sites de restrictions Sal I, tel que :

Figure 1 : Schéma du gène d’intérêt (743 bp), tel que positionné dans le chromosome de la
bactérie. Sal I fait référence à des sites de restriction.

1/ Rappelez la définition du clonage d’un fragment d’ADN.

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Vous disposez du vecteur de clonage pBR322, d’origine plasmidique, dont la carte vous
est présentée ci-dessous :

Figure 2 : Vecteur de clonage pBR322, avec ses sites de restriction.

Les flèches indiquent la position des gènes codant : une protéine conférant une résistance à
l’antibiotique ampicilline (amp) et la β-galactosidase (Lac Z). La β-galactosidase est une enzyme
d’hydrolysant un substrat incolore (X-Gal) en un produit coloré bleu. Ori correspond à l’origine
de réplication.

2/ Expliquez rapidement les étapes clés qui permettent de cloner le gène X dans le
vecteur pBR322.

Une fois la séquence du gène X cloné dans ce vecteur, vous transformez des bactéries
E. coli pour l’amplifier ; l’intérêt étant d’obtenir des colonies de bactéries contenant le
vecteur avec le gène X.

3/ Comment sélectionneriez-vous les bactéries transformées par le vecteur contenant

le gène X ?

Afin de valider le clonage, vous récupérez, à partir des bactéries sélectionnées à la

question précédente, vos plasmides. Vous les digérez ensuite par Sal I puis faites migrer
sur un gel d’agarose les produits de la digestion.

4/ Indiquez, sur la figure 3, le profil de migration obtenu par piste, en fonction des
conditions expérimentales et en précisant le poids moléculaire des fragments de
digestion. Justifiez ce profil.

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Figure 3 : Migration électrophorétique des produits de la digestion par Sal I.

Piste 1 : plasmide pBR322 sans insert. Piste 2 : pBR322 avec insert.

Votre clonage est correct. Vous voulez maintenant transférer ce gène X du vecteur
pBR322 vers un autre vecteur mais cette fois-ci d’expression. Ce nouveau vecteur
d’expression ne possède pas au sein de son polylinker de site Sal I. Votre directeur de
recherche vous demande alors de cloner le gène X en utilisant le site de clonage Taq I
présent dans ce vecteur d’expression qui reconnaît la séquence suivante :

Le problème est que le résultat de la digestion par Taq I produit des extrémités qui ne
sont pas complémentaires de celles que forme Sal I (utilisée pour cloner le gène X dans
pBR322). Vous devez donc traiter ces extrémités cohésives pour les transformer en
extrémités franches et pouvoir cloner le gène X avec des extrémités Sal I dans le
vecteur d’expression digéré par Taq I.

5/ Quelle est la différence principale entre un vecteur de clonage et un vecteur

d’expression ?

6/ Quelles sont les étapes qui vous permettront de finaliser le clonage du gène X depuis
pBR322 dans ce vecteur d’expression ? Expliquez brièvement.

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 2021-2022
TD Biologie Biotech 1

ANNEXE – Code génétique

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