18

ZAMORANO
Carrera de Ciencia y Produccin Agropecuaria

Mdulo de Biotecnologa Aplicada Area de Actividad: Cultivo de Tejidos Vegetales y Propagacin In Vitro

II. FACILIDADES Y EQUIPO

La limpieza es una de las mayores y ms importantes consideraciones en la ubicacin de un laboratorio de cultivo de tejidos, Las prdidas por contaminacin en un laboratorio de este tipo oscilan entre un 5 a un 50%. Cuando se considera el alto valor del producto, las prdidas por cotaminacin son verdaderamente inaceptables. La limpieza drstica realizada en forma rutinaria y el mantener las tcnicas de asepsia en el laboratorio, puede reducir las prdidas por contaminacin hasta a menos de un 1%. Un laboratorio de cultivo de tejidos, ya sea que se utilice con fines comerciales y/o de investigacin o enseanza, debe ser diseado con reas especficas destinadas a: a. Area para lavado de cristalera y almacenamiento; b. Area para preparacin de medios de cultivo y esterilizado; c. Cuarto/cmara de transferencias; d. Cuarto/cmara de crecimiento/incubacin. El trfico y el flujo de trabajo deben ser considerados con el objeto de maximizar limpieza. La reas que se deben conservar lo ms aspticas posibles son el cuarto de crecimiento o la cmara de incubacin, y el cuarto o cmara de transferencias. Estos cuartos deben ser diseados de manera que no tengan acceso directo hacia fuera sino hacia dentro mismo del laboratorio. Tanto el cuarto de transferencias como el cuarto de crecimiento deben tener comunicacin directa. El trfico por stos dos cuartos debe ser minimizado colocando ventanales grandes por donde se pueda observar el trabajo que se realiza en ellos. Antes de comenzar con las prcticas especficas de micropropagacin, es necesario que el estudiante se familiarice con el laboratorio, incluyendo las diferentes reas, su equipo, y las tcnicas bsicas de asepsia y esterilizacin. Independientemente de cun grande o pequeo es el laboratorio y de cuantas personas trabajan en el mismo siempre hay algunos principios bsicos que se deben seguir.

19

2.1

Area para Lavado de Cristalera y Almacenamiento

Esta rea preferiblemente debe ser localizada cerca del rea donde se prepara el medio de cultivo. Algunas observaciones en esta rea: a) Es importante que tan pronto como se usa la cristalera sta sea dejada en agua. - contenedores con medio de cultivo solidificado se limpian bien con una esptula y se enjuagan antes de poner en remojo. El agar no se debe botar en los desagues sino que en papel estraza o aluminio, o bolsas de plstico de descarte y luego en la basura; - contenedores con medio lquido con puente se descarta el lquido en los desagues y el papel filtro en la basura - cultivos que han sido descartados por contaminacin se ponen en el autoclave primero para matar todos los contaminantes, luego se descarta todo el medio y papel filtro si lo hay, en bolsas de plstico antes de colocar en la basura. b) Al poner la cristalera en las bandejas con agua, hacerlo teniendo el cuidado de poner el mismo tipo de cristalera en cada bandeja; c) Lavar la cristalera tan pronto como sea posible para evitar que el medio se pegue en las paredes del contenedor; d) Luego de lavar la cristalera con una brocha y jabn, se debe lavar con abundante agua de la llave (4 a 7 enjuagues); e) Seguidamente se hacen 1 a 3 enjuagues con agua destilada y se debe revisar que est completamente limpia; f) La cristalera se debe poner a secar inmediatamente despus de el o los enjuagues con agua destilada. El secado se puede hacer en un horno o al ambiente; g) Tan pronto como se ha secado, la cristalera debe almacenarse en un mueble en el que se puedan mantener las puertas cerradas. Es recomendable cubrir los contenedores con papel aluminio. Equipo: 1. Esta rea necesita estar equipada con un lavadero grande o dos preferiblemente. Es recomendable que en el fondo del lavadero se coloque una malla plstica para evitar que se quiebre la cristalera cuando se esta lavando; 2. Suficiente espacio a ambos lados de el o los lavaderos donde se va a mantener la cristalera en remojo hasta que sea lavada. 3. Un destilador de agua 4. Gradillas para secado 5. Un horno 6. Mueble para almacenar cristalera 7. Bandejas de plstico

20

2.2

Area para Preparacin de Medios de Cultivo y Esterilizado

Hay una amplia variedad de equipo para usar en los laboratorios de cultivo de tejidos. Los recursos disponibles determinarn el tipo y la cantidad de equipo, pero, en general, se necesita el siguiente equipo bsico en esta rea: 1. Refrigeradora y freezer. Para mantener soluciones madre y reactivos que se degradan a altas temperaturas. 2. Los reactivos que se van a utilizar para preparar medio y que no necesitan refrigeracin se deben mantener en un mueble cerca de la balanza por conveniencia. 3. Balanzas. Puede ser una macrobalanza y una de precisin. Cuando se esta preparando medio de cultivo se necesita una balanza analtica para pesar hormonas y vitaminas. Una balanza menos precisa se puede utilizar para pesar agar y sacarosa. 4. Plancha elctrica con agitador magntico para disolver los componentes del medio cuando se est preparando.

Figura 2-1. Plancha elctrica con agitador magntico mostrando una barra magntica agitadora en un erlenmeyer con medio de cultivo. Fuente: Kyte,L. Y J. Kleyn. Plants from Test Tubes: An Introduction to Micropropagation. 1996.

5. Medidor de pH. Algunos laboratorios utilizan papel indicador de pH, pero este mtodo es muy impreciso y puede afectar los resultados; 6. Licuadora. Para preparar algn componente del medio de cultivo, p. ej. banano; 7. Equipo para esterilizacin. Puede ser un autoclave o una olla de presin. El uso de una estufa elctrica o de gas y una olla de presin casera es el ejemplo ms barato de equipo para esterilizacin. Este equipo es de vital importancia ya que para poder esterilizar medios de cultivo, agua, platos Petri, herramientas y cristalera se necesita calor a alta presin. Adems de que algunas esporas de hongos y bacterias se matan solamente a temperaturas de 121oC y 15 psi (libras por pulgada cuadrada) de presin durante 20 minutos;

21

Figura 2-2. Olla de presin usada para esterilizar medios de cultivo, agua, herramientas, platos Petri, cultivos contaminados. Fuente: Kyte,L. Y J. Kleyn. Plants from Test Tubes: An Introduction to Micropropagation. 1996.

7. Un horno microondas es tambin recomendable para descongelar soluciones madre a utilizar o para disolver el agente gelatinizador en el medio de cultivo; 8. Estereoscopios; 9. Dipensadores de medio de cultivo de los que tambin se pueden encontrar en un amplio rango de precios dependiendo de las necesidades del laboratorio.

2.3

Cuarto / Cmara de Transferencias

Este cuarto necesita estar lo ms limpio posible ya que aqu es donde se llevan a cabo la inoculacin y transferencia de los explantes a los medios de cultivo. Antes de ingresar a este cuarto, y si no se estn utilizando botas desechables, se deben pasar los zapatos por una alfombra impregnada con cloro. Siempre se debe usar gabacha cuando se va a trabajar en esta rea. Se puede instalar luz ultravioleta en este cuarto para mantenerlo desinfectado. Algunas cmaras de flujo laminar vienen equipadas con lmparas germicidas que emiten luz ultravioleta. Este tipo de radiacin (254 nm) se utiliza para eliminar contaminantes en el aire y para desinfectar las superficies. El uso de radiacin ultravioleta se debe mantener al mnimo ya que no es un substituto de la limpieza y se debe usar solamente cuando no hay personas o material vegetal en el cuarto. Cuando se utilizan se deben encender 30 minutos antes de la siembra o transferencia, y no se deben dejar encendidas por muchas horas o durante toda la noche ya que la acumulacin de ozono txico en un espacio reducido puede representar un peligro; adems de que estas lmparas tienen una vida til muy corta. Recuerde que jams debe trabajar en la cmara con la luz ultravioleta encendida ya que sta puede causar daos irreversibles a la retina. Equipo:

22 1. Cmara de flujo laminar. Estas cmaras permiten trabajar en un ambiente estril al realizar las siembras y transferencias. Se pueden adquirir cmaras con capacidad para una o dos personas (una o dos estaciones de trabajo) segn los recursos disponibles. El aire pasa a travs de un filtro HEPA (high efficiency particulate air = aire particulado de alta eficiencia) que est localizado en la parte de atrs de la cmara (flujo horizontal) o en la parte de arriba (flujo vertical) y que retiene un 99.9% de polvo, esporas de hongos, bacterias, y todas aqullas particulas con un tamao mayor de 0.3 micrometros ( m). Luego de pasar por este filtro, el flujo de aire pasa a travs del rea de trabajo hacia el tcnico a razn de 30 m. por minuto, permitiendo as un ambiente estril de trabajo dentro de la cmara. Esta debe ser encendida 15 minutos a media hora antes de comenzar a trabajar en ella para asegurarse que el ambiente est estril cuando va a comenzar su trabajo. Es importante, cuando se va a trabajar en la cmara lavarse bien las manos ya que una de las principales causas de contaminacin cuando se trabaja en la cmara son las manos sucias. Adems se debe usar siempre gabacha y mascarilla. El uso de guantes tambin es recomendable pero se debe tener precaucin al utilizarlos cuando se est usando mechero para esterilizar las herramientas. En algunos laboratorios tambin se utilizan bolsas para el pelo. Se debe mantener una botella de alcohol al 70% fuera de la cmara y otra dentro de la cmara. Antes de entrar a trabajar en la cmara se deben rociar las manos, brazos y antebrazos con alcohol, y lo mismo cualquier material (contenedores con medio, frascos con agua, platos Petri, gradillas, etc.) que vaya a ingresar a la cmara. Antes de comenzar cualquier trabajo se debe rociar el rea con alcohol, y esto hay que estarlo haciendo constantemente durante el tiempo que se est trabajando en siembras o transferencias dentro de la cmara. El ethanol es un agente bacteriosttico que desinfecta las superficies tratadas, o sea que reduce los contaminantes a un nivel arbitrario aceptable.

Figura 2-3. Cmara de flujo laminar. Fuente: Kyte,L. Y J. Kleyn. Plants from Test Tubes: An Introduction to Micropropagation. 1996.

2. Equipo para esterilizar herramientas en la cmara de transferencias. Hay varias opciones: a) mecheros. Cuando se utilizan mechero las herramientas se colocan primero en alcohol etlico al 70% durante 2 a 3 minutos, antes de flamearlas por la llama del mechero. El tiempo

23 que se van a flamear depende del tipo de herramienta, pero por lo general, no es aconsejable flamearlos mucho tiempo ya que las herramientas van perdiendo su temple y se oxidan ms facilmente. Adems, con la combustin se propicia la acumulacin de materia orgnica en el metal que despus es difcil de remover. Despus del flameo y antes de manipular el material vegetal, la herramienta se debe colocar contra la corriente de aire para que se enfre, o se pasa por agua fra destilada estril. b) Caja esterilizadora con cpsulas de vidrio. Es el equipo preferido para esterilizar herrameintas en la cmara de flujo laminar. Consiste en una caja insulada que contiene unas cpsulas de vidrio. Esta caja tiene un componente que calienta las cpsulas. El inconveniente es que estos aparatos son caros, pero existen opciones del mismo aparato ms baratas en las que la caja esta llena de arena. c) Bacti-cinerador. un esterilizador que trabaja a base de rayos infrarojos. Este aparato esteriliza las herramientas en 5 segundos a 1600oC (870oF) cuando stas se insertan en el cilindro. De la misma manera se calienta la caja esterilizadora con cpsulas de vidrio.

Figura 2-4. Caja esterilizadora con cpsulas de vidrio.

Figura 2-5. Bacti-cinerador.

Fuente: Kyte,L. Y J. Kleyn. Plants from Test Tubes: An Introduction to Micropropagation. 1996.

24

3. Herramientas. Pinzas y bistures son las herramientas ms utilizadas en la preparacin de materiales y transferencias. Existen varias clases de pinzas y bistures segn su finalidad, as que se debe considerar el tamao y tipo adecuado de acuerdo al material vegetal con que se est trabajando.

2.4

Cuarto/Cmara de Crecimiento/Incubacin

Este es un cuarto con temperatura, iluminacin y humedad relativa controladas. Estantera con iluminacin es necesaria para mantener las gradillas con los tubos de ensayo o los frascos con los cultivos mientras estn creciendo. La temperatura que se mantiene en este cuarto es de 25 1oC y se maneja a travs de un sistema de aire condicionado. Con respecto a la luz en el cuarto de crecimiento se regulan los tres factores: a) calidad: las lmparas fluorescentes tienen ventajas sobre las lmparas incandescentes: mejor calidad de luz, forma ms conveniente, y despiden menos calor. La lmpara fluorescente del tipo cool white es la ms usada para estos propsitos. b) cantidad: dos candelas de luz fluorescente cool white de 8 pies (2.4 m.) de largo y espaciadas a 20 plg. (50 cm) proveen 100 a 300 pies candela (1000 a 3000 lux) que est en el rango de cantidad recomendable para crecer plantas en el laboratorio; c) duracin: fotoperodo de 16 horas luz / escotoperodo de 8 horas oscuridad. Aunque algunos cultivos pueden requerir luz constante en sus etapas avanzadas de crecimiento; otros necesitan oscuridad durante el perodo inicial. Es necesario tener un reloj automtico para mantener el fotoperodo correspondiente; La humedad relativa dentro de los contenedores es de aproximadamente el 100%. Si se mantienen suspensiones celulares en el cuarto de crecimiento es necesario tener algn tipo de plataforma agitadora o vibrador.

2.5

USO Y CUIDADO DEL EQUIPO

Recuerde que el equipo y los instrumentos del laboratorio son bastante caros y por lo tanto requieren de un manejo y cuidados muy especiales. Es importante seguir las instrucciones provistas por su instructor al manipular cualquier equipo. Si tiene preguntas sobre el manejo del mismo, hacerlas a su instructor ANTES de proceder a su uso. Una lista de los reactivos, cristalera y otros artculos de uso frecuente en el laboratorio se puede encontrar en el anexo referente a precios.