Cultivos celulares

El cultivo celular o cultivo de tejidos, como tambin se le llama, tiene su origen en el siglo XIX, el cultivo es el proceso complejo por el cual las clulas se cultivan condiciones controladas. En la prctica, el trmino "cultivo celular" ha venido a referirse al cultivo de clulas derivadas de multicelulares eucariotas, especialmente de los animales las clulas. Sin embargo, tambin hay cultivos de plantas , hongos y microbios ,

incluidos virus , bacterias y protistas . El desarrollo histrico y los mtodos de cultivo de clulas estn estrechamente relacionados entre s a las de cultivo de tejidos y cultivo de rganos .de cultivo de clulas animales se convirti en un comn de laboratorio tcnica a mediados de 1900, pero el concepto de

mantenimiento de lneas celulares viven separados de su fuente de tejido original fue descubierto en el siglo 19.

Mantenimiento de clulas en cultivo

Las clulas se cultivan y mantienen a una apropiada temperatura y mezcla de gases (habitualmente, 37C, 5% CO2 y 95% O2) en un incubado celular. Las condiciones de cultivo varan ampliamente para cada tipo celular, y la variacin de las condiciones para un tipo celular concreto, puede dar lugar a la expresin de diferentes fenotipos. Adems de la temperatura y la mezcla de gases, el factor ms comnmente variado en los sistemas de cultivo es el medio de crecimiento. Las recetas para los medios de crecimiento pueden variar

en pH, concentracin de glucosa, factores de crecimiento y la presencia de otros componentes nutritivos. Los factores de crecimiento usados para suplementar a los medios derivan a menudo de sangre animal, como el suero bovino. Estos ingredientes derivados de la sangre plantean una potencial contaminacin con virus o priones de los productos farmacuticos deriva dos. En la actualidad se tiende a minimizar o eliminar el uso de estos ingredientes cuando sea posible. Estrategias alternativas de abastecimiento involucran la sangre de los animales procedentes de pases con un riesgo mnimo de encefalopata espongiforme bovina , como Australia y Nueva Zelanda, y el

uso de nutrientes purificados concentrados derivados de suero en lugar de suero animal entero para el cultivo de clulas. 4 Las clulas pueden crecer en suspensin o de manera adherente. Algunas clulas viven de forma natural sin adherirse a una superficie, como las que existen en el torrente sanguneo. Otras necesitan una superficie, como la mayora de clulas derivadas de tejidos slidos. A las clulas que crecen sin unirse a una superficie se las llama cultivos en suspensin. Algunos cultivos celulares adherentes pueden crecer en plstico para el cultivo de tejidos, que puede estar recubierto con componentes de la matriz extracelular para aumentar sus propiedades de adhesin y proporcionar otras seales necesarias para el crecimiento y diferenciacin. Otro tipo de cultivo adherente es el cultivo organotpico que consiste en cultivar las clulas en un ambiente tridimensional a diferencia de las placas de cultivo bidimensionales. Este tipo de cultivo 3D es bioqumica y fisiolgicamente similar al tejido vivo. Sin embargo presenta dificultades tcnicas debido a varios factores (por ejemplo: difusin).

Manipulacin de las clulas en cultivo

Al estar generalmente las clulas en continua divisin durante el cultivo, es normal que crezcan hasta ocupar toda el rea o volumen disponible. Esto puede generar varios problemas:
  

Agotamiento de los nutrientes del medio Acumulacin de clulas apoteticas o necrticas Inhibicin de la divisin celular por contacto: los contactos entre clulas pueden desencadenar un arresto del ciclo celular

Diferenciacin celular promiscua provocada por los contactos intercelulares

Estos problemas pueden afrontarse mediante mtodos de cultivo celular en esterilidad. El objetivo de estos mtodos es evitar la contaminacin con bacterias o levaduras que competiran por los nutrientes y/o podran infectar y as eliminar las clulas. Toda manipulacin se lleva a cabo, tpicamente, en una campana de flujo laminar para evitar la entrada de

microorganismos contaminantes. medio de cultivo.

Tambin

pueden

aadirse antibiticos al

Entre las manipulaciones ms comunes llevadas a cabo en cultivos celulares, se encuentran los cambios de medio, el pase de las clulas y la transfeccin.

Aplicaciones del cultivo celular

El cultivo masivo de lneas celulares animales es fundamental para la manufactura de vacunas virales y diversos productos biotecnolgicos. Los productos biolgicos producidos mediante la tecnologa del ADN recombinante en cultivo celular incluyen enzima s, hormonas sintticas, inmunobiolgicos (anticuerpos monoclonales, interleucinas, linfoquinas yagentes

anticancergenos). A pesar de que muchas protenas pueden producirse mediante ADN recombinante en cultivos bacterianos, las protenas ms complejas que son glicosiladas (modificadas mediante el agregado de carbohidratos) deben producirse en clulas animales. Un ejemplo relevante de tales protenas complejas es la hormona eritropoyetina. Actualmente, se estn realizando investigaciones para producir tales protenas complejas en clulas de insectos o de plantas superiores, debido al alto costo que implica producir tales protenas complejas en clulas de mamferos.

Ventajas del cultivo celular

Las dos principales ventajas cuando se utilizan los cu ltivos celulares son: el control del medio fisicoqumico, a saber, pH, temperatura, presin osmtica, tensin de oxgeno (O2) y gas carbnico (CO2) de las clulas cultivadas y, las condiciones fisiolgicas que deben ser constantes. La mayora de las lneas celulares requieren para su buen desarrollo de suplementos en el medio en que se cultivan, ejemplo de esto es el suero, el cual provee infinidad de elementos como hormonas y otras sustancias reguladoras (Borg, et al., 1985). El control del medio fisicoqumico y de las condiciones fisiolgicas permite el cultivo de clulas especficas.

Los cultivos de clulas permiten someter a las mismas a una baja y definida concentracin de reactivos asegurando un acceso directo en ellas, lo que ahorra en un 90% lo requerido para la inyeccin del reactivo in vivo, su excrecin y su posterior distribucin a los tejidos en estudio. Aunque los estudios in vivo resulten ms econmicos que los in vitro son descartados porque el uso de la experimentacin en animales resu lta cuestionado en aspectos legales, morales y ticos (Freshney, 1995). Permiten el estudio del transporte y la utilizacin de metabolitos.

Desventajas del cultivo celular

Las tcnicas de cultivo celular necesitan unas estrictas condiciones de asepsia porque las clulas animales crecen menos rpido que la mayora de los contaminantes comunes como las bacterias, los mohos y las levaduras. Adems las clulas precedentes de animales no pueden desarrollarse en

medios de cultivo, por lo que es necesario agregar a los medios suplementos como suero, plasma y fluidos intersticiales, entre otros para de una manera u otra proveer a las clulas cultivadas un medio semejante al in vivo (Freshney, 1995).

Una mayor limitacin en el cultivo de clulas es el gasto de esfuerzo y materiales para la produccin de una pequea cantidad de clulas o de tejido. Los costos de producir clulas en cultivo son diez veces ms que el uso de tejido animal, ya que se invierte bastante en ensayos o procedimi entos preparativos que pueden ayudar en la estandarizacin del proceso reduciendo tiempo de manipulacin, volmenes de muestra, tiempos de centrifugacin, etc. (Brand, et al., 1997). En los cultivos celulares se dificulta relacionar las clulas cultivadas con las clulas funcionales ubicadas en el tejido del cual son derivadas, esto por que en la mayora de los casos presentan propiedades muy diferentes; para esto es necesario utilizar marcadores de clulas los cuales van a ser de gran ayuda

en el momento de caracterizarlas en cultivo porque van a garantizar que las clulas crecidas en cultivo son las mismas que se sembraron y no otras. Adems, suelen presentarse problemas de inestabilidad gentica cuando se realizan varios pases de cultivos de clulas no transformadas, lo que va a originar una gran heterogeneidad en el crecimiento de las clulas y en su diferenciacin (Driscoll, et al., 1993).

Estudios que emplean cultivos celulares

Los estudios que emplean cultivos

celulares

abarcan gran nmero de

disciplinas y aproximaciones al estudio del fenmeno celular. Son: Actividad celular. Estudia los mecanismos implicados en los diferentes procesos intracelulares, como por ej: transcripcin de DNA, sntesis de protenas, metabolismo energti co... Flujo intracelular. Estudia los movimientos intracelulares de sustancias y seales asociadas a los diferentes procesos fisiolgicos, como por ejemplo: ensamblaje y desensamblaje de los diferentes componentes intracelulares, movimientos del RNA: ncleo-citoplasma, movimiento de protenas. Ecologa celular. Estudio de las condiciones ambientales responsables del mantenimiento de la funcionalidad celular, de su diferenciacin..., como por ej. estudio de las necesidades nutricionales, infecciones, estudio poblacin celular,... Interacciones celulares. Estudia los procesos de induccin embrionaria, cooperacin metablica, inhibicin por contacto o por adhesin, interaccion es clula-clula. Como ejemplo de reas de investigacin fuertemente dependientes de las tcnicas de cultivo celular son: - Virologa: establecimiento de condiciones de cultivo de virus animales y de plantas, produccin de vacunas antivirales - Investigacin del cncer de la

transformacin celular (inducidad por virus o agentes qumicos), cintica de la

- Inmunologa - Ingeniera de protenas. Por la produccin de protenas en lneas celulares: interfern, insulina, hormona de crecimiento. - Estudios de interaccin y sealizacin celular, en la diferenciacin y en el desarrollo. - Aplicaciones diagnsticas. Por ejemplo en medicina y farmacologa destacan el anlisis cromosmico de clulas crecidas a partir de muestras de amniocentesis, deteccin de infecciones virales, ensayos de toxicidad,... - Aplicaciones mdicas: mantenimiento y produccin de tejido para trasplantes. - Aplicaciones industriales y agron micas: produccin pro reproduccin "in vitro" de clones de plantas de inters comercial.

Cultivo de tejidos e ingeniera

El cultivo celular es un componente fundamental del cultivo de tejidos y la ingeniera de tejidos, ya que establece los conocimientos bsicos del crecimiento y mantenimient o de clulas ex vivo

Vacunas

En

la

actualidad

las vacunas para

enfermedades

como

el polio, sarampin, paperas, rubola y varicela se producen en cultivos de clulas de mamferos. El peligro que representa una

posible pandemia de influenza por la cepa H5N1 se estn realizando activas investigaciones con el fin de producir dicho virus en cultivos celulares, financiadas por el gobierno de Estados Unidos. En 2009 se us esta tcnica para producir la primer partida de vacunas (destinadas al testeo) para la influenza H1N1.9 Entre las ideas novedosas se encuentra el uso de vacunas basadas en ADN recombinante con vectores derivados

de adenovirus humanos, causantes del resfro comn o el uso de adyuvantes

Mtodos de cultivo de clulas de plantas

Las

clulas

de

plantas

se

crecen

normalmente

en suspensiones

celulares en medio lquido o como cultivo de callos en medio slido. El cul tivo de clulas de plantas no diferenciadas y callos requiere del un adecuado balance de las hormonas de crecimiento vegetales auxina y citoquinina.

Tipos de cultivo celular CULTIVOS EN MONOCAPA

Las clulas exhiben una variedad de "comportamientos sociales", permitiendo la formacin de una monocapa que cubrir la correspondiente superficie de crecimiento (confluencia), lo que hace que su multiplicacin sea inhibida cuando establecen contacto entre s (quiescencia). Las clulas provenientes de cultivos primarios son las que mejor crecen en sta condicin, dada su estabilidad gentica y su naturaleza diploide normal. Los recipientes para el cultivo de clulas estacionarias son cajas de Petri, frascos para el cultivo de tejido (Roux), entre otros, que pueden ser de material de plstico o de vidrio previamente tratado y su desprendimiento para transferirlas a superficies mayores se realizan con agentes proteolticos como la tripsina.

CULTIVOS EN SUSPENSION

Las Lneas celulares que provienen de cultivos primarios con requerimiento de anclaje a superficies, tienen la propiedad de crecer de manera estacionaria o en suspensin despus de un perodo de adaptacin

Existe evidencia experimental que los sistemas en suspensin tambin requieren de matrices que son macromolculas, que sirven de pro tectores a la superficie celular; stas macromolculas se encuentran en el suero, el cual

contribuye igualmente con el medio de cultivo, proporcionando un sistema balanceado de nutrientes. Dentro de stas matrices est el Methocel, esencial para el crecimiento de cultivos en suspensin.

Aunque el cultivo estacionario es ideal cuando se busca la elaboracin de productos extracelulares, el cultivo en suspensin es deseable cuando los productos son intracelulares o cuando se presentan problemas con la capacidad de anclaje de un determinado tipo de clula.

El proceso de cultivo continuo ofrece factores econmicos decisivos (utilizacin de mejores equipos, reducida manipulacin) cuando se trata de producir cultivos a una mayor escala de operacin.

CULTIVOS PRIMARIOS

Los cultivos primarios tienen caractersticas especiales que los diferencian de las lneas celulares: conservan la morfologa de las clulas del rgano del que fueron aisladas, sus cromosomas tienen un nmero diploide (2n), su crecimiento in vitro es limitado y hay inhibicin por contacto.

El estar ms cercanas a las clulas que las originaron, se ve reflejado en una mejor actividad y funcionalidad similar a su ambiente natural, por lo que en aislamientos primarios de cepas virales stas tienen mayor sensibilidad que una Lnea Celular ya establecida. Igualmente para la produccin de vacunas los cultivos primarios son recomendables por tener una baja probabilidad de que se transformen en malignos.

Dentro de las desventajas est la de una mayor probabilidad de presentar virus adventicios o latentes, lo que implica el desarrollo de la adecuada tecnologa para el control de calidad.
LINEAS CELULARES

Las Lneas Celulares continuas estn formadas por clulas que se diferencian gentica y morfolgicamente de las clulas de las cuales se originaron. Pueden provenir de clulas que se derivan de tumores o de un

proceso de transformacin de un cultivo primario mediante transfeccin con oncogenes o con tratamiento con carcin ogenticos, lo que les confiere un nuevo fenotipo.

Este tipo de cultivo tiene la caracterstica de no tener inhibicin por contacto y de crecer de manera indefinida. El paso de un cultivo primario a lnea se denomina transformacin.

Una transformacin puede inducirse fisiolgicamente (interaccin celular, polaridad) a travs de hormonas como la hidrocortizona o utilizando inductores no fisiolgicos como el DMS.

CULTIVOS-TRIDIMENSIONALES

Son aquellos que buscan mantener la caracterstica o arquitectura del tejido in vivo. Los sistemas tridimensionales permiten estudiar la p roliferacin y morfologa epitelial y su interaccin con otras clulas como son las del tejido conectivo; igualmente con ellos se puede evaluar el efecto de sustancias que pueden influenciar en tales interacciones intercelulares. Actualmente se producen Kits drmicos comerciales con base en cultivos, que permiten evaluar la citotoxicidad de componentes qumicos presentes en lociones, preservativos, detergentes, perfumes, shampoos y solventes entre otros.

Los intentos de produccin de ste tipo de cultivo van desde el uso de telaraa (Harrison, 1914), pasando por el crecimiento de explantes en esponja de celulosa, (Leighton, 1951), as como la utilizacin de fibras de slica (Curtis y Varde, 1964) o de mallas de colgeno hidratado (Elsdale y Bard, 1972). El mtodo desarrollado por Bergenholtz (1977) es uno de los que mayor informacin han dado en cuanto a visualizacin de morfologa celular. Mediante ste sistema, se colocan trocitos de superficie epitelial sobre una membrana de Millipore, sistema que se deposita sobre una plataforma y sta en una caja de Petri con medio de cultivo.

El cultivo in vitro de tejidos vegetales ha sido visto como la opcin para producir metabolitos secundarios (Balandrn et al., 1985). Sin embargo, con excepcin de contados casos, la desdiferenciacin de los tejidos vegetales,

para producir callos o clulas en suspensin, se ve acompaada de una disminucin en su capacidad para producir estos compuestos (Barz et al., 1977, Aird et al., 1988). No obstante esta dificultad, los cultivos de clulas y rganos derivados de plantas productoras de metabolitos secundarios son cada vez ms utilizados como modelos para estudiar la biosntesis de compuestos con actividad farmacolgica, as como los mecanismos que regulan su sntesis (Kutchan et al., 1991).

El cultivo de rganos permite la ampliacin de un cultivo de clulas de tejido no disgregadas a un cultivo tridimensional que muestre en algo o en todo lascaractersticas histolgicas de los tejidos in vivo, para esto se utiliza un medio con interfase lquido gaseosa. El cultivo de cortes de tejido el cual utiliza fragmentos de tejidos colocados en vasos de vidrio o plstico con un medio con interfase lquida que va a promover la migracin de las clulas cultivadas hacia un plano slido provisto de un sustrato especfico para cada clula (Freshney, 1995).

El cultivo de clulas dispersas en suspensin se refiere al cultivo de clulas tomadas del tejido original, de cul tivos primarios de clulas o de una lnea o cadena celular por disgregacin enzimtica, mecnica o qumica, este cultivo necesita de una monocapa adherente o un sustrato slido que le provea a las clulas un medio adecuado para desarrollarse.

Se realiza tambin el cultivo primario en el cual las clulas han sido reasociadas para recrear la estructura tridimensional del tejido; esto realizado por perfusin y por el crecimiento de una monocapa, la reagregacin en suspensin, o la infiltracin de una matr iz tridimensional como el colgeno. Derivado del cultivo anterior encontramos el cultivo secundario en el cual se cultivan diferentes provenientes de una misma, es el caso de los cultivos de astrocitos donde se puede obtener, en un mismo cultivo, crecimie nto de los tipos I y II de stas clulas.

En la actualidad se estn realizando cultivos que permiten la recombinacin de clulas de diferentes linajes como los queratinocitos de la epidermis en combinacin con los fibroblastos de la dermis; a estos cu ltivos se les denomina cocultivos (Frashney, 1995). Dentro de estos cultivos encontramos los cultivos de neuronas y astrocitos en conjunto, en los cuales se ha

confirmado el ciclo de la glutamina -glutamato por medio de anlisis de los istopos del glutamato y la glutamina, donde la glutamina es producto de los astrocitos y el glutamato y el aspartato producto de las neuronas. Adems, se ha estudiado el acetato en estas clulas, el cual es metabolizado por ambas clulas, neuronas y astrocitos (Brand, 1997).

El cultivo de clulas transformadas generalmente se obtiene por la inyeccin de un carcingeno, despus de una serie de cultivos alternados y pasaje por animales (Benda, et al., 1968; McMorris, et al., 1973). Estas lneas

celulares son capaces de desempear sus funciones rgano especficas generalmente durante el perodo de un ao. La forma de estas clulas depende en gran parte, de las condiciones del cultivo utilizadas. Las clulas que crecen en cultivos en suspensin son casi siempre redondas con pocas

prolongaciones. Sin embargo, cuando las clulas de origen cerebral crecen sobre superficies planas muestran una diversidad morfolgica notable, con prolongaciones celulares y neuritas, que se forman con facilidad, mientras que los cuerpos celulares adoptan una forma alargada (ATCC, 1992; Benda, et al., 1968).

EN QUE CONSISTE UN LABORATORIO DE CULTIVOS CELULARES

Un laboratorio de cultivo celular debe contar con una infraestructura bsica en la cual se disponga de reas independientes para llevar a cabo la preparacin y esterilizacin de medios y reactivos, un espacio independiente para el proceso de lavado y preparacin de material y un rea propiamente destinada al trabajo con cultivos celulares. Dentro de la infraestructura fsica bsica se debe contar con sistemas de refrigeracin y congelacin, incubadoras, centrfugas, balanzas, microscopios y cabinas de flujo laminar.

Adicionalmente, se debe disponer de un buen suplemento de material plstico y de vidrio y con sistemas de esterilizacin apropiados para los diferentes tipos de reactivos y material utilizados. Desde el punto de vista de los sistemas de esterilizacin se pueden citar los siguientes:

Calor Hmedo: Mediante el empleo de autoclaves los cuales proporcionan una

temperatura de 121oC y una presin de 15 lb. Utilizados para la esterilizacin de soluciones cuyos componentes no se degradan por ste mtodo, material plstico y de vidrio y equipos de filtracin.
Calor Seco: Lo constituye el uso de hornos a temperatura de 200 C por

espacio de 3 horas. Es empleado para la esterilizacin de material de vidrio particularmente.

Filtracin: A travs del uso de equipos con membrana de nitrocelulosa o

acetato de celulosa con poro de 0.22 0.1 mm de dimetro, mediante la aplicacin de presin positiva o negativa. Por ste sistema se esterilizan la mayor parte de los medios de cultivo, suero, solucin de antibitico -antimictico y suplementos.