NDICE 1. INTRODUO ....................................................................................................2 2. MANIPULAO CROMOSSMICA EM PEIXES...............................................2 2.1 Triplides Puros e Hbridos ...........................................................................3 2.2 Haplides e Tetraplides ...............................................................................

8 2.3 Ginogenticos................................................................................................9 2.4 Androgenticos............................................................................................12 3. REVERSAO SEXUAL EM PEIXES...................................................................13 3.1 Linhagens Revertidas Monossexuais ..........................................................13 3.2 Produo de Supermachos .........................................................................16 3.3 Produo de Superfmeas ..........................................................................17 4. MARCADORES MOLECULARES EM PROJETOS DE ICTIOGENTICA, ......18 5. ENGENHARIA GENTICA EM PEIXES ...........................................................20 5.1 Produo de Transgnicos..........................................................................20 5.2 Contribuio dos Transgnicos em Projetos de Piscicultura .......................22 6. RISCOS BIOLOGICOS POTENCIAIS DE LINHAGENS DE PEIXES GENETICAMENTE MANIPULADOS ....................................................................23 6.1 Riscos Potenciais de Linhagens Cromossomicamente Manipuladas..........23 6.2 Riscos Potenciais de Linhagens Sexualmente Revertidas ..........................25 6.3 Riscos Potenciais dos Transgnicos ...........................................................26 7. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS..................................................................27

1. INTRODUO No decorrer da ltima dcada, a contribuio da gentica para a piscicultura moderna tem abrangido o emprego das tcnicas mais recentes usadas em biotecnologia e engenharia gentica. Algumas dessas biotecnologias genticas, como as que possibilitam a manipulao cromossmica, podem ser usadas tambm em plantas, porm no ainda em aves e mamferos. Outras, como as que permitem a transferncia de genes, vm sendo aplicadas tanto em peixes e outros organismos, como em plantas. No presente trabalho so apresentadas e comentadas as principais biotecnologias genticas atualmente aplicadas piscicultura. Inicialmente discutida a produo de peixes triplides, tetraplides, haplides, ginogenticos e androgenticos. A seguir, so resenhados vrios procedimentos para a obteno de linhagens de neomachos, neofmeas, supermachos e superfmeas. Os principais objetivos tericos dos tpicos 2 e 3 deste trabalho so a produo de linhagens de peixes estreis, monossexuais e com altos nveis de consanginidade. Sob o aspecto prtico, as linhagens manipuladas cromossmica e hormonalmente podem ser usadas para evitar maturao precoce, para possibilitar a produo de peixes maiores, para a obteno de exemplares que apresentem somente o sexo de maior valor comercial e para permitir o uso de peixes exticos artificialmente estreis no cultivo ou para introduo na natureza. As biotecnologias de manipulao cromossmica e reverso sexual precisam ser bem conhecidas e compreendidas por todos os que trabalham atualmente em piscicultura porque vm sendo gradativamente incorporadas s rotinas dos programas desenvolvidos em nvel mundial e, h alguns anos, comearam a ser experimentadas tambm em nosso pas, A seguir, no item 4, so apresentados os principais tipos de marcadores moleculares, em nvel de DNA, que vm sendo usados em projetos de ictiogentica aplicada piscicultura. 0 tpico 5 diz respeito aplicao da engenharia gentica piscicultura e trata da transferncia de genes entre diferentes organismos e peixes. Como a engenharia gentica apresenta alto grau de sofisticao tcnica, dificilmente dever ser usada rotineiramente a curto prazo na rea ictiolgica, devendo, por mais uma dcada, se restringir apenas a algumas instituies de pesquisa e a grandes empresas agrcolas. 0 ltimo item do trabalho analisa os riscos bioecolgicos potenciais de linhagens de peixes geneticamente manipuladas sobre populaes selvagens e cultivadas. 0 presente trabalho baseado em grande parte na experincia adquirida com os projetos que vm sendo, ou que foram, desenvolvidos em conjunto pelo Laboratrio de Gentica de Peixes do IB/USP (So Paulo), Laboratrio de Biologia e Gentica de Peixes do IB/UNESP (Botucatu) e pelo Centro de Pesquisas e Treinamento em Aqicultura, CEPTA/IBAMA (Pirassununga), Centrais Eltricas de Minas Gerais, CEMIG (Volta Grande), Companhia Energtica de So Paulo, CESP (Paraibuna), Instituto de Pesca de So Paulo (Campos do Jordo) e Projeto Pacu (Terenos), e pretende ser de utilidade no planejamento de projetos de biotecnologia gentica aplicados piscicultura, que venham a ser desenvolvidos em nosso pas. A maioria dos resultados obtidos, at o momento, j foi resenhada e publicada. 1,2,3,5,9,10,12,24,25,26,27,28,29,30 2. MANIPULAO CROMOSSMICA EM PEIXES As tcnicas de manipulao ou engenharia cromossmica podem ser aplicadas com relativa facilidade aos peixes, porque esse grupo de animais geralmente apresenta fecundao externa, o que favorece em muito o manuseio de seus gametas. Numerosas tcnicas tm sido descritas na literatura para a produo de peixes haplides, triplides, tetraplides, ou mesmo os que tenham s cromossomos maternos (ginogenticos) ou s paternos (androgenticos) (Tabela 1)7,20,22,23

As tecnologias usadas para alterar o nmero cromossmico dos peixes pertencem a duas categorias principais: choques de temperatura ou trmicos e choques de presso ou hiperbricos. Os choques de temperatura geralmente so aplicados aos ovos logo aps a fertilizao (cerca de 5 - 10 minutos) e, por isso, so chamados de precoces. Os choques de presso so aplicados aos ovos decorridos tempos maiores aps a fertilizao (cerca de 60 - 90 minutos) e, por isso, so chamados de tardios. A finalidade do choque precoce a de atuar na meiose, bloqueando a eliminao do segundo corpsculo polar do ovcito e o choque tardio, de interferir no incio da mitose, impedindo a primeira clivagem do zigoto quando este vai se tornar um embrio com duas clulas. Na maioria das estaes de piscicultura do mundo utilizase o choque trmico em vez do hiperbrico, porque a aparelhagem para manuteno de temperaturas constantes oferece maior segurana para os operadores e possibilita trabalhar com maiores volumes de ovos. Para os choques de presso usam-se cilindros hidrulicos de ao inoxidvel que so bastante caros, comportam volumes reduzidos de ovos, operam por vrios minutos com altas presses entre 7 e 10 mil psi (psi = libra por polegada quadrada), correndo, muitas vezes, riscos de rompimento, principalmente quando o ar dos cilindros no devidamente removido, ou seja, quando no feito um "sangramento" adequado. Embora se possa utilizar tanto choques trmicos quentes quanto frios, parece que os quentes produzem melhores resultados em espcies de peixes de guas frias e, ao contrrio, os choques frios em espcies de guas quentes. Em geral, a temperatura que produz os melhores resultados espcie-especfica e se situa na proximidade de seu limiar letal. bastante importante que no decorrer do tratamento trmico os ovos sejam mantidos numa temperatura uniforme sem flutuaes; isso pode ser conseguido dispondo-se os ovos em poucas camadas em um recipiente de vidro que, por sua vez, mergulhado num banho trmico com volume suficiente de gua, de modo que a temperatura desejada seja mantida constante. Portanto, o tipo, a intensidade e a durao do tratamento trmico so peculiares para cada espcie. H vrias tcnicas que podem ser usadas para verificar o sucesso das manipulaes cromossmicas, sendo que um dos mtodos mais laboriosos contar o nmero de cromossomos. Um segundo mtodo medir o tamanho dos ncleos dos eritrcitos; isto feito corando-se esfregaos de sangue com Giemsa e medindo-se ao microscpio o eixo maior do ncleo dos eritrcitos. Um terceiro, a medida do volume nuclear do eritrcito, rotineiramente realizado nas pisciculturas norteamericanas produtoras de carpas capim triplides, com o auxlio do aparelho Coulter Counter Channelyzer, que caro, porm bastante eficiente e rpido. Um quarto mtodo consiste na determinao do contedo de DNA do ncleo dos eritrcitos por citofotometria de fluxo. Um quinto mtodo utiliza a colorao pelo nitrato de prata de um esfregao de sangue e contagem do nmero mximo de nuclolos existentes nos ncleos dos eritrcitos.' Uma sexta tcnica usar a eletroforese. 2.1 Triplides Puros e Hbridos A produo de triplides o tipo de manipulao cromossmica mais familiar na rea de piscicultura. 0 interesse que os triplides despertam se deve a duas caractersticas que potencialmente eles podem apresentar: maior crescimento que os diplides e esterilidade (Tabela 1). Os dois tipos de triplides mais usados em piscicultura so os puros e os hbridos. Os triplides puros, tambm chamados de autotriplides e triplides intraespecficos, so formados por trs conjuntos haplides de cromossomos provenientes de uma mesma espcie. Os triplides hbridos, tambm designados como autotriplides ou triplides interespecficos, so formados por dois lotes haplides de cromossomos de uma determinada espcie e por um outro lote de outra espcie.

Tabela 1 - Tipos de biotecnologias genticas aplicadas piscicultura 7.20,22,23

Tipo de Biotecnologia 1. TRIPLOIDIA PURA 2. TRIPLOIDIA HBRIDA 3. TETRAPLOIDIA 4. HAPLOIDIA 5. GINOGNESE Produtos Obtidos Linhagens estreis Linhagens hbridas estreis Gametas diplides Linhagens haplides Linhagens ginogenticas Aplicaes em Piscicultura Controle da reproduo Linhagens com maior sobrevivncia e crescimento Controle da reproduo Linhagens com maior sobrevivncia e crescimento e resistncia a doenas. Obteno de linhagens triplides interplides Produo de ginogenticas e/ou androgenticas haplides Produo de linhagens monossexuais de fmeas para casos de determinao do sexo tipo XX/XY Produo de linhagens altamente endocruzadas Identificao de sistemas de determinao do sexo Produo de supermachos Produo de linhagens altamente endocruzadas Criopreservao do germoplasma Produo de linhagens revertidas Produo de supermachos e superfmeas; Identificao de sistemas de determinao do sexo Linhagens com caractersticas vantajosas codificadas pelo DNA transplantado

6. ANDROGNESE

Linhagens androgenticas Linhagens de neomachos e neofmeas Linhagens transgnicas

7.REVERSO

8.DNA RECOMBINANTE

1) Produo de triplides - Os triplides so obtidos da seguinte maneira: logo aps a fertilizao comum, os ovos so submetidos a choque trmico ou hiperbrico (Tabela 2). Lembremos que, por ocasio da desova, os peixes do sexo feminino eliminam o que comumente se costuma chamar de "ovas" ou "vulos", mas que na realidade so ovcitos de segunda ordem. Doravante, por motivo de simplificao, designaremos de "vulos" aos ovcitos de segunda ordem, Estes "vulos" eliminam o segundo corpsculo polar somente aps terem sido fertilizados. Porm, se um "vulo" recm-fertilizado for submetido a um choque trmico ou hiperbrico, o segundo corpsculo polar no ser eliminado. Como conseqncia, o ovo resultante ir conter trs ncleos haplides: um que o ncleo feminino do "vulo", outro que o ncleo masculino proveniente do espermatozide, e um outro que o ncleo do segundo corpsculo polar. Os trs ncleos haplides se fundem para formar um zigoto triplide que, por sua vez, produzir um peixe triplide. 2) Como otimizara produo de triplides- A maioria dos pesquisadores e piscicultores usa choques de temperatura ou de presso. Os choques qumicos so pouco usados, porque produzem um grande nmero de "mosaicos" (peixes que contm clulas com vrios graus de ploidia). Os choques trmicos so os mais usados em pisciculturas comerciais porque so os operacional mente mais fceis de aplicao, mais baratos em termos de aparelhagem e produtos qumicos usados e mais seguros. A temperatura exata e a durao do choque trmico que so necessrios para a produo de triplides devem ser estabelecidas inicialmente por tentativa e erro. As temperaturas quentes ou frias timas so aquelas situadas alguns graus acima ou abaixo das

temperaturas letais inferiores ou superiores para uma determinada espcie. Logo, a primeira etapa para se otimizar a produo de triplides seria a determinao dos limiares letais para as temperaturas quentes e frias. 0 tempo exato em que o choque deve comear e terminar depende do tempo aps a fertilizao, no decorrer do qual o segundo corpsculo polar eliminado. 0 choque deve comear antes do evento da eliminao e continuar por tempo suficiente ate que seja improvvel a extruso do segundo corpsculo polar. Por exemplo, em ensaios realizados no Brasil para a produo de triplides puros de carpa comum, cerca de 10 minutos aps a fertilizao, os ovos foram tratados a OC 0,2 durante 30 minutos, resultando na produo de 94,7% de triplides 12 . Estes valores usados para a produo de triplides j foram otimizados para algumas espcies usadas na piscicultura brasileira (Tabela 2)3,12,23. Tabela 2 -Valores otimizados para induo de triploidia por choques trmicos em algumas espcies usadas na piscicultura brasileira
Espcie Bagre africano Bagre do canal Carpa capim Carpa comum Tambaqui Tilpia do Nilo Truta arco-iris Incio do choque (minutos) 4 5 4 10 2 7 25 Temperatura do choque (C) 5 5 42 0-0,2 39 9 26 Durao do choque (minutos) 40 60 1 30 3 30 20 Freqncia de triplides (%) 8-100 100 67 95 12 100 100 Taxa de ecloso (%) 9-40 79 72 52 82 86 87

Certos especialistas acreditam que as espcies de peixes que historicamente vivem em guas frias (por exemplo, truta arco-ris e outros salmondeos) respondem melhor a choques trmicos quentes moderados (entre 26C e 29C), e, ao contrrio, em espcies provenientes de guas quentes (tais como as carpas comum e chinesas, bagres do canal e africano e a maioria das espcies neotropicais), os choques frios fortes (abaixo de 4C) ou moderados (entre 5C e 15C) parecem ser mais efetivos na induo de triploidia. Este tipo de generalizao no aceito por outros especialistas, tendo em vista os excelentes desempenhos obtidos com choques quentes fortes (pouco acima de 40C) em espcies de guas quentes (tais como tilpias e carpas) e tambm o sucesso de choques frios bastante fortes (pouco abaixo de OC) na induo de triploidia em salmondeos. 3) Reconhecimento dos triplides - Em relao morfologia externa, os triplides puros e os diplides geralmente no apresentam diferenas significativas. Em nvel celular que se encontram as diferenas mais marcantes, pois o tamanho dos ncleos e das clulas dos triplides cerca de um tero maior do que os dos diplides. A maneira mais fcil para identificar triplides de peixes atravs das medidas dos eixos maiores dos eritrcitos em esfregaos de sangue corados por Giemsa. Outro procedimento a contagem do nmero mximo de nuclolos nos eritrcitos, evidenciados aps colorao com nitrato de prata. 0 mtodo mais direto para identificar os triplides puros o exame do nmero cromossmico. Por exemplo, em trabalho realizado no Brasil12 foi possvel distinguir claramente carpas comuns triplides (eixo maior dos eritrcitos = 8,23 0,50 m; nmero mximo de nuclolos = 3; nmero de cromossomos 3n = 150) das diplides (4,76 0,25 m; nmero mximo de nuclolos = 2; nmero de cromossomos 2n = 100). Existem mtodos mais sofisticados para a identificao de triplides, tais como estimativas do contedo de DNA nuclear por citofotometria e volume celular dos eritrcitos por sistemas automatizados como o "Coulter Counter Channelyzer", que bastante eficiente porm de custo elevado, como j mencionado.

4) Esterilidade, crescimento e sobrevivncia - 0 interesse que os triplides tm despertado na piscicultura devese a dois tipos de expectativa: a de que apresentem maior crescimento em peso e comprimento e a de que sejam estreis. Sob o aspecto terico, espera-se que os triplides sejam maiores do que os diplides porque suas clulas contm 33% mais informao gentica para o crescimento; alm disso, por serem estreis, os triplides no gastariam energia para a produo de gnadas e gametas, para a corte, reproduo e cuidados prole. Quanto ao crescimento, tem-se verificado, de u ma maneira geral, que diplides e triplides crescem igualmente at o incio da idade da primeira maturao. Durante o perodo de maturao sexual os diplides de ambos os sexos sofrem uma parada no crescimento, concentrando suas energias no desenvolvimento das gnadas; entretanto, as fmeas triplides, no formando gnadas normais, continuam crescendo em peso e comprimento e acabam por superar as fmeas diplides em 5% a 20% ao final do perodo de maturao. De fato, as fmeas triplides apresentam somente gnadas residuais e nveis de hormnios sexuais semelhantes aos das diplides jovens. Os machos triplides, entretanto, apresentam um considervel desenvolvimento gonadal, nveis de hormnios sexuais semelhantes ao dos diplides adultos, mostram caractersticas sexuais secundrias e apresentam comportamentos de corte. Chegam tambm a produzir quantidade limitada de smen bastante fluido, com poucos espermatozides mveis que, quando usados experimentalmente em fecundaes artificiais, produzem abortos precoces, mostrando ser pouco provvel que machos triplides venham a produzir descendncia normal e frtil. Logo, as fmeas triplides no so maiores que as diplides devido a seu grau de ploidia, mas porque apresentam esterilidade gondica. Conseqentemente, a produo de linhagens monossexuais de fmeas triplides parece ser a mais interessante em programas de piscicultura que tenham por objetivo a obteno de peixes maiores, cujos tamanhos comerciais ultrapassem a fase de maturao sexual. Os triplides puros usualmente apresentam uma taxa de sobrevivncia menor (entre 40% e 95%) do que a dos diplides nas etapas iniciais do desenvolvimento7 . As informaes at o momento disponveis no permitem afirmar qual seria a principal causa do aumento da mortalidade dos triplides. Admite-se que poderiam ser trs as possveis causas: a) efeito deletrio dos choques trmicos sobre as protenas fibrilares constituintes do fuso meitico e eventualmente tambm sobre o citoesqueleto celular; b) a consanginidade parcial, devida ao fato de os triplides apresentarem em geral dois genomas femininos; c) o efeito da prpria triploidia, em especial sobre o tamanho das clulas. Duas maneiras tm sido usadas com sucesso para atenuar o problema da mortalidade precoce dos triplides puros. Um caminho, desenvolvido apenas experimentalmente, mas ainda no inserido na rotina das pisciculturas, consiste em se obter linhagens tetraplides e cruz-las com diplides para se obter triplides, que so chamados de triplides interplides22 ; estes interplides apresentam taxas de sobrevivncia e crescimento semelhantes s dos diplides 7. Outra maneira que vem sendo usada em piscicultura e a produo de triplides hbridos, cujas taxas de sobrevivncia e resistncia a doenas geralmente superam as dos diplides hbridos. 5) Uso de triplides em programas de piscicultura - A produo de triplides constitui um excelente caminho para se utilizar peixes exticos em programas de piscicultura, minimizando assim possveis problemas adversos de impacto ambiental. A carpa capim uma espcie extica na qual as possibilidades dos triplides vm sendo testadas h alguns anos. Esse peixe herbvoro, originrio da China, foi introduzido nos EUA em 1963 e, desde ento, vem sendo usado no controle biolgico da vegetao aqutica. Em muitos estados norte-americanos, foi banida a entrada da carpa capim, porque havia o receio de esta espcie escapar dos tanques de cultivo, reproduzir-se na natureza e prejudicar de algum modo as espcies nativas. A primeira possibilidade para

se evitar a reproduo da carpa capim surgiu quando, em 1978, se verificou que a prognie hbrida F1 entre fmeas de carpa capim e machos de carpa cabea grande era formada por triplides. Ensaios realizados em 1995 no CEPTA/IBAMA, Pirassununga-SP, com estoques brasileiros dessas duas espcies de carpa, possibilitaram tambm a obteno de cerca de 100% de triplides hbridos. Como os hbridos recebem dois lotes cromossmicos do genoma materno, essas linhagens apresentam a maioria das caractersticas de carpa capim e so mais vigorosas do que os diplides hbridos. Em 1983 conseguiu-se a produo de triplides puros de carpa capim, com eficincia de 98%. A vantagem apresentada por essas novas linhagens de triplides puros a de que consomem biomassa de vegetao aqutica igual dos diplides normais e de 3 a 4 vezes maior do que os triplides hbridos. Os triplides puros, devido sua maior capacidade de se alimentar de vegetao aqutica e pelo fato de apresentarem tipo de esterilidade equivalente dos triplides hbridos, tm sido os preferidos ultimamente em projetos de piscicultura voltados para a rea de controle da vegetao aqutica em lagos e reservatrios. Tabela 3 -Esquemas gerais dos protocolos para a produo de linhagens de peixe poliplides, ginogenticos e androgenticos
1. Produo de Linhagens Poliplides CTP TRIPLIDES OVOS CHT TETRAPLIDES

ESPERMATOZIDES + VULOS

2. Produo de Linhagens Ginogenticas e Androgenticas CTP GINOGENTICOS MEITICOS OVOS CHT GINOGENTICOS MITTICOS OVOS CHT

- Espermatozides + vulos inativados por UV - ESPERMATOZIDES +

VULOS inativados por Co

ANDROGENTICOS

CTP = choque trmico precoce; CHT = choque hiperbrico tardio; UV = fonte de ultravioleta; Co = fonte de cobalto

Os triplides de carpa capim tratados hormonalmente para a induo das fases finais da gametognese mostraram que praticamente todo o esperma produzido anormal; a probabilidade de que um macho triplide possa produzir descendncia frtil to remota que os triplides de carpa capim podem ser considerados estreis para propsitos operacionais de manejo em piscicultura. A maioria dos estados norte-americanos somente permite a entrada de linhagens 100% triplides em seus territrios. Devido a essa exigncia, necessrio verificar o nvel de ploidia de cada lote de carpa capim a ser usado. Portanto, o controle de qualidade absolutamente necessrio neste tipo de agroindstria, o que aumenta os custos de produo, mas diminui sensivelmente os riscos ecolgicos. Por exemplo, para se ter certeza de que todos os exemplares de carpa capim so triplides, o nvel de ploidia de cada exemplar deve ser determinado antes de os mesmos serem legalmente estocados

na natureza. Isso aumenta o custo da carpa capim triplide em cerca de 400% em relao s linhagens diplides. Muitos pesquisadores gostariam de produzir triplides de algumas espcies importantes para o cultivo, tal como as tilpias, para eliminar a reproduo precoce que ocorre ainda durante a fase de crescimento destas espcies de peixes. Um pr-requisito importante para que esse tipo de biotecnologia seja efetivo e prtico numa escala comercial que a desova possa ser facilmente induzida e que uma grande quantidade de "vulos" possa ser facilmente obtida. Algumas espcies, tais como as tilpias, so pouco fecundas e se reproduzem de maneira continuada porm assincrnica. A combinao destes fatores resulta em que dezenas de milhares de animais reprodutores teriam que ser manuseados anualmente para a produo de "vulos" suficientes para um sistema de larga escala. Portanto, seria impraticvel basear a piscicultura comercial da tilpia, ou de espcies de peixes com caractersticas reprodutivas semelhantes, na produo continuada de triplides. A possibilidade de se utilizar triplides no controle populacional de espcies de peixes "no desejveis" em determinados ecossistemas abre perspectivas que precisam ser cuidadosamente pr-testadas em condies experimentais. Por exemplo, em princpio, existiria a possibilidade de serem usados machos triplides do tucunar no Pantanal Mato-grossense para se tentar o controle populacional desta espcie que proveniente da Bacia Amaznica, caso ficasse documentado que esses machos triplides se cruzam com fmeas.diplides normais e produzem descendncia invivel. Esta proposta aqui apresentada, e por ns anteriormente J mencionada e discutida em dois encontros tcnico-cientficos realizados em Pirassununga-SP e em Campo Grande-MS em 1995, deveria ser obrigatoriamente pr-testada em sistemas fechados de estaes de piscicultura apropriadas. Em primeiro lugar, seria necessrio produzir os triplides de tucunar, e a seguir testar o comportamento reprodutivo dos triplides adultos. Deste modo seria possvel responder a uma srie de perguntas, tais como: os machos triplides de tucunar desenvolvem ou no gnadas maduras? Ser que esses machos triplides iro apresentar comportamento de corte e espermiar" naturalmente? Caso os machos triplides fertilizem os "vulos" das fmeas diplides normais, sero ou no formados embries? Estes embries morrem ou no logo nos primeiros estdios de desenvolvimento? 0 tamanho populacional dos estoques de tucunars diplides normais diminui ou no nos tanques-teste, quando neles so introduzidos machos de tucunars triplides? 2.2 Haplides e Tetraplides 1) Haplides - So organismos que apresentam somente um lote de cromossomos. Como possuem um nico conjunto cromossmico, qualquer gene com efeito detrimental ir se manifestar e, como tal, pouco provvel que a maioria dos haplides sobreviva durante muito tempo. De fato, dados da literatura tm mostrado que haplides, produzidos em cerca de sete espcies de peixes para propsitos experimentais, tm mostrado baixa sobrevivncia 7. H dois caminhos para se produzirem haplides e ambos envolvem a destruio do material gentico de um dos parentais. Um dos modos consiste em fertilizar os "vulos" com espermatozides que tenham tido seu material gentico destrudo por raios X, raios gama, produtos qumicos ou radiao UV. A radiao UV provavelmente o melhor mtodo para destruir o DNA dos espermatozides, porque outras tcnicas podem deixar fragmentos cromossmicos viveis, que podem contribuir para a produo de indivduos diplides parciais ou que apresentem reduo na taxa de sobrevivncia. Alm disso, a radiao UV mais barata e mais segura que os demais tipos. Os espermatozides tratados com UV ainda permanecem mveis e aptos para fertilizarem e

ativarem os "vulos". Uma vez ativados, os "vulos" iniciam o desenvolvimento embrionrio, mesmo que o espermatozide fecundante no mais transporte genes funcionais. Como o espermatozide inativado com UV no contribui com material gentico, os alelos contidos no ncleo haplide do "vulo" sero os nicos a fazerem parte do ncleo do "zigoto". Os embries assim produzidos so ginogenticos haplides, porque todo o material gentico de provenincia materna. Um segundo modo de produzir haplides destruir o material gentico dos "vulos" com raios X ou raios gama e fertilizar esses "vulos" com espermatozides normais. Como o ncleo haplide do espermatozide ser a nica contribuio para o genoma do "zigoto", o embrio ser haplide. Nesse caso, o embrio ser androgentico haplide, porque o material gentico ser proveniente exclusivamente do parental paterno. As linhagens de peixes haplides so interessantes porque possibilitam aos pesquisadores estudar certos processos genticos durante a embriognese. Sob o ponto de vista prtico, bastante importante conhecer como produzir haplides, porque constituem o primeiro passo para a produo de peixes ginogenticos e androgenticos diplides. 2) Tetraplides - Os tetraplides apresentam quatro conjuntos haplides de cromossomos em lugar dos dois lotes normais. Os tetraplides podem ser produzidos geralmente por um choque hiperbrico tardio, que bloqueia a primeira diviso mittica de um zigoto diplide (Tabela 2). Desse modo, foram produzidos em 1984 salmondeos tetraplides de primeira gerao, que mostraram taxas de ecloso variando entre 5% e 80%, e taxas de sobrevivncia e crescimento bastante baixas7,23. 0 interesse potencial dos tetraplides em projetos de piscicultura e que podem ser usados para a produo de triplides interplides estreis; desse modo ficaria eliminada a necessidade de produzir triplides pelos mtodos convencionais de choques trmicos precoces. Assim, cruzando-se linhagens tetraplides com diplides, produz-se descendncia chamada de triplide interplide. 0 tipo de cruzamento mais conveniente seria usar como parentais fmeas tetraplides e no machos tetraplides, porque as micrpilas dos "vulos" de fmeas diplides no apresentam dimetro suficiente para receber os espermatozides produzidos pelos machos tetraplides, uma vez que esses espermatozides sero diplides. Uma vez produzidas, as linhagens tetraplides podem ser autoperpetuadas via intercruzamentos, evitando-se assim terem de ser continuamente produzidas. Em 1986, uma primeira gerao de tetraplides foi intercruzada e obteve-se a segunda gerao de tetraplides, que apresentou taxas de sobrevivncia e crescimento apenas satisfatrias7,23. Os machos tetraplides tambm tm mostrado capacidade de fertilizao reduzida, em relao aos machos diplides, aparentemente porque seus espermatozides maiores apresentam dificuldade de penetrao nas micrpilas dos "vulos" normais. Atualmente, a tecnologia de tetraploidia se encontra restrita apenas ao nvel experimental, no tendo sido ainda includa na rotina de projetos de piscicultura. Somente trabalhos futuros diro sobre as reais possibilidades dos tetraplides na rea aplicada. 2.3 Ginogenticos As linhagens ginogenticas apresentam os dois lotes haplides de cromossomos provenientes do parental materno. Em espcies de peixes nas quais a determinao do sexo do tipo XX/XY e as fmeas so homogamticas (XX), todos os ginogenticos sero fmeas. Os ginogenticos tm duas grandes aplicaes potenciais em piscicultura: a primeira o controle da proporo sexual pela produo de linhagens monossexuais de fmeas e a segunda, a rpida produo de linhagens altamente consangneas7,16,23

1) Produo de ginogenticos - H trs maneiras principais de produzir linhagens ginogenticas. A primeira ativando os "vulos" com espermatozides que tenham tido seu material gentico destrudo por raios X, raios gama (em geral usando fonte de 60CO) ou radiao UV. A radiao gama tem a vantagem de possuir excelente poder de penetrao, o que facilita o tratamento de grandes'quantidades de esperma. No entanto, fragmentos cromossmicos residuais so freqentemente encontrados na descendncia de ginogenticos aps a fertilizao com espermatozides irradiados com radiao gama; como tais fragmentos podem reduzir a sobrevivncia dos ginogenticos, d-se preferncia inativao dos espermatozides por UV. 0 procedimento para o tratamento dos espermatozides por UV relativamente simples: inicialmente, o esperma diludo de modo a que possa ser espalhado numa camada bem fina em uma placa de vidro e exposto a uma fonte de UV de uma lmpada germicida. Grande nmero de "vulos" pode ser fertilizado quando colocados diretamente na placa de vidro na qual foi feita a inativao dos espermatozides. Normalmente, com exposies apropriadas radiao UV, nenhum fragmento cromossmico paterno permanece nos espermatozides. possvel que alguns dos peixes produzidos durante o processo acima descrito sejam diplides normais, visto que tambm espermatozides no-inativados podem fertilizar os "vulos". Para evitar esse tipo de ocorrncia, alguns pesquisadores usam espermatozides de outras espcies que sabe-se, produzem embries hbridos no-viveis. Um segundo modo para se confirmar a no-transmisso do genoma do parental paterno usar esperma de doadores que sejam homozigotos para genes marcadores dominantes. Por exemplo, espermatozides de truta arco-ris pigmentada homozigota podem ser usados para ativar "vulos" de fmeas albinas; nesse caso, toda a descendncia Albina ser ginogentica, enquanto a descendncia normalmente pigmentada ser diplide normal. Logo aps a ativao, os "vulos" so submetidos a choques precoces para impedir a eliminao do segundo corpsculo polar (Tabela 3). Os ovos assim produzidos contero dois ncleos haplides: o ncleo do "vulo" e o ncleo do segundo corpsculo polar; os dois ncleos se fundem para formar um ncleo diplide contendo os dois conjuntos de cromossomos originrios do parental materno. Uma segunda tcnica para produzir ginogenticos comea do mesmo modo que a anterior: numa primeira etapa, os "vulos" so ativados por espermatozides que tiveram seu material gentico destrudo por radiao. Assim, sero produzidos ginogenticos haplides. Quando o zigoto haplide inicia a primeira clivagem, dado um choque tardio que bloqueia a primeira diviso mittica. Desse modo, os dois ncleos haplides se fundem e formam um zigoto diplide, com dois lotes cromossmicos provenientes do parental materno. Os ginogenticos produzidos pela supresso da primeira clivagem (chamados de ginogenticos mitticos) so homozigotos para todos os seus locos e apresentam 100% de consanginidade. A maioria desses tipos de ginogenticos apresenta baixas taxas de sobrevivncia (ao redor de 1,5%), devido expresso dos genes detrimentais recessivos que podem existir em maior ou menor quantidade nessas linhagens. Os ginogenticos produzidos pelo bloqueio da eliminao do segundo corpsculo polar (chamados de ginogenticos meiticos) so, por definio, altamente consangneos, porm apresentam certo nvel de heterozigose devido ocorrncia de permuta durante a meiose. Na literatura no h uma concordncia geral a respeito dos nveis exatos de consanginidade apresentados pelos ginogenticos meiticos; segundo certos autores os nveis de consanginidade seriam ao redor de 45% e 65%, e segundo outros entre 33% e 100%. Uma terceira biotecnologia que pode ser usada para produzir ginogenticos consiste em fertilizar "vulos" de fmeas tetraplides com espermatozides cujo DNA tenha sido inativado por radiao. Como as fmeas tetraplides produzem "vulos"

diplides, no h necessidade de os "vulos" serem submetidos a choques precoces para a produo de complemento cromossmico diplide. Em 1988, linhagens ginogenticas de truta arco-ris foram produzidas por meio dessa tcnica. Embora esses tipos de ginogenticos sejam consangneos por definio, devem apresentar nveis consideravelmente maiores de heterozigose do que os ginogenticos produzidos a partir de parentais maternos diplides. De fato, tem-se verificado na literatura que esse tipo de ginogentico apresenta pouca reduo nos nveis de heterozigose. 2) Controle da proporo sexual- Um dos interesses da ginognese em piscicultura a possibilidade de produo de linhagens monossexuais de fmeas. A produo de linhagens ginogenticas poderia constituir potencialmente um caminho para o controle da reproduo. Entretanto, a ginognese apresenta vrias desvantagens quando proposta em projetos de piscicultura visando ao controle da reproduo. Um dos problemas que os ginogenticos so altamente consangneos. Se, por um lado, uma grande vantagem dispor de diferentes linhagens consangneas para serem intercruzadas, seguindo-se o mesmo padro de procedimento gentico usado para a obteno do milho hbrido, por outro lado desvantajoso no caso em que os peixes ginogenticos tenham que ser soltos na natureza, pois apresentam taxas de sobrevivncia substancialmente menores do que as dos peixes normais. Um segundo problema relativo ao uso da ginognese para finalidades de controle populacional que, embora a descendncia dos ginogenticos possa ser unissexual, ainda permanece frtil. Portanto, a introduo acidental ou produo ocasional de machos em um projeto de ginognese para controle populacional pode levar ao estabelecimento de uma populao no desejvel. Logo, em projetos para o controle da reproduo, parece ser prefervel a utilizao da esterilidade por triploidia induzida ou por tratamentos hormonais do que a monossexagem por ginognese. No entanto, a ginognese pode ser bastante til na produo indireta de linhagens monossexuais de fmeas. Nesses tipos de programas, uma linhagem ginogentica constituda somente por fmeas pode ser tratada hormonalmente e revertida sexualmente em machos funcionais. Como os peixes resultantes sero geneticamente fmeas e funcionalmente machos, quando cruzados com fmeas normais iro produzir descendncia constituda somente por fmeas. Este tpico ser retomado em detalhe no item 3- Reverso Sexual em Peixes do presente trabalho. 3) Linhagens consangneas - Na rea de pesquisa ictiogentica, verifica-se que a aplicao da ginognese para a produo de linhagens consangneas torna-se cada vez mais importante; porm, as possibilidades de aplicao prtica da ginognese no manejo gentico em projetos de piscicultura so ainda muito incertas, embora bastante promissoras. Em certas espcies de peixes, tais como a truta arco-ris, os estoques cultivados apresentam uma grande similaridade gentica, como sugerem os estudos efetuados com auxlio dos marcadores gentico-bioqumicos. Nessas condies pouco provvel que cruzamentos entre estoques muito pouco diferentes sob o aspecto gentico dem lugar a fenmenos de heterose ou vigor hbrido, em que o desempenho das prognies seja superior ao melhor estoque parental. Para casos como estes, uma das idias dos geneticistas tem sido criar linhagens biologicamente bastante distintas. Um dos caminhos clssicos o da consanginidade, que possibilitaria, teoricamente, obterem-se as chamadas linhagens "puras", nas quais os indivduos seriam, em princpio, geneticamente muito semelhantes entre si. Sob esse aspecto, o ponto mais interessante a se considerar o de que duas linhagens consangneas seriam, em mdia, bastante mais diversificadas geneticamente do que duas outras no-consangneas. Portanto, cruzando-se duas linhagens consangneas diferentes, poder-se-ia esperar o aparecimento do fenmeno da heterose. Por este mtodo, obteve-se o milho hbrido, que mais do que triplicou a produo deste cereal nos EUA aps 1960.

Para se obterem linhagens altamente consangneas nos animais, o procedimento clssico consiste em cruzamentos entre irms e irmos inteiros, que so repetidos ao longo de geraes sucessivas. Esta forma de consanginidade programada tem se mostrado muito eficiente na produo de linhagens "puras" de camundongos usados em laboratrio. Ocorre, porm, que o intervalo entre duas geraes sucessivas, sendo bastante maior nos peixes cultivados do que nos camundongos, demandaria um mnimo de vinte anos de trabalho. A sada para tornar este mtodo mais promissor tem sido a obteno mais rpida de peixes altamente consangneos via ginognese. Na prtica, h vrios obstculos para se usar rotineiramente a ginognese em programas de piscicultura. Um dos principais problemas que as tecnologias de ginognese so mais complicadas que os esquemas clssicos de cruzamentos entre irmos; outro problema srio que a ginognese mittica maximiza tanto os nveis de consanginidade em 100% em uma nica gerao, como tambm maximiza as taxas de mortalidade e de anomalias. Um caminho alternativo que vem sendo adotado um aumento gradual da consanginidade das linhagens: para isso usa-se a ginognese por reteno do segundo corpsculo polar, que resulta em aproximadamente 45% a 65% de consanginidade por gerao, alternada com cruzamentos entre irmos, que produz 25% de consanginidade por gerao7,6,20. Usando-se este esquema alternativo, a produo de linhagens ginogenticas j comea a fazer parte da rotina de algumas pisciculturas europias, sendo o caso mais conhecido dos brasileiros o das chamadas carpas hngaras 17 . 4) Identificao de sistemas de determinao do sexo -A produo de linhagens ginogenticas auxilia na caracterizao e distino de sistemas de determinao do sexo em espcies de peixes em que a fmea seja homogamtica ou heterogamtica. Quando a fmea for homogamtica, a ginognese ir produzir somente fmeas; quando a fmea for heterogamtica a ginognese ir produzir nmeros iguais de machos e fmeas. Estes tipos de resultados no provam em definitivo qual seria o sistema de determinao do sexo na espcie testada; mas, devido ao fato de os sistemas XX/XY (igual ao de mamferos) e ZZ/ZW (igual ao de aves) serem os mais comuns dentre os nove mecanismos de determinao do sexo existentes em peixes, a ocorrncia de ginogenticos constitudos somente por fmeas sugere que a espcie em questo apresente o sistema XX/XY, enquanto que a ocorrncia de 50% de machos e 50% de fmeas sugere que a espcie em teste apresente o sistema ZZ/ZW. 2.4 Androgenticos Os androgenticos so linhagens de peixes que apresentam unicamente o genoma paterno. 1) Produo de androgenticos - As linhagens androgenticas podem ser produzidas por dois mtodos; o mais comumente usado consiste em fecundar um "vulo", cujo material gentico tenha sido destrudo por raios X ou raios gama, com um espermatozide normal. Deste processo resulta um androgentico haplide. Quando o zigoto androgentico haplide vai sofrer a primeira clivagem mittica, dado um choque hiperbrico tardio para impedir a diviso celular, e os dois ncleos haplides se fundem para formar um ncleo diplide (Tabela 3). Todos os cromossomos do peixe androgentico provm do parental paterno, e os animais assim produzidos so altamente consangneos. Como o complemento cromossmico diplide provm de um nico lote que se autoduplicou, os nveis de homozigose e de consanginidade so ambos da ordem de 100%. Essas linhagens androgenticas apresentam taxas de sobrevivncia ao redor de 5%, devido expresso dos alelos recessivos detrimentais7. Uma segunda tcnica, que pode ser usada para a produo de androgenticos, consta em fertilizar os "vulos", cujo material gentico tenha sido destrudo por radiao, com espermatozides de machos tetraplides. Como se sabe, os machos tetraplides

produzem espermatozides diplides e, assim,os zigotos resultantes seriam diplides. Desse modo, em 1990 foram produzidas nos EUA trutas arco-ris androgenticas23. 2) Androgenticos e supermachos - Nos casos em que os androgenticos sobrevivem at o perodo de primeira maturao sexual, possvel us-los para a produo de supermachos (YY), nas espcies cujos sistemas de determinao do sexo sejam do tipo XX/XY. Nestes casos os machos so heterogamticos, de modo que metade dos androgenticos produzidos ser de supermachos. 3) Andrognese e conservao gentica - Os androgenticos apresentam uma aplicao potencial bastante interessante na rea de manuteno do germoplasma e conservao de espcies de peixes em perigo de extino. Atravs da andrognese, pode-se recuperar o material gentico de espcies cujas amostras de esperma tenham sido criopreservadas em bancos de germoplasma. Como atualmente a tecnologia para preservao de "vulos" de peixes ainda no satisfatria, a nica via prtica para a estocagem e recuperao gentica na rea ictiolgica fertilizar "vulos" recm-obtidos com esperma criopreservado. Usando-se a andrognese, o genoma de espermatozides criopreservados pode ser recuperado, mesmo que a espcie venha a se extinguir. Este tipo de abordagem no geneticamente completo, porque o DNA mitocondrial, que herdado por via materna, no poder ser recuperado por andrognese 3,6. 3. REVERSAO SEXUAL EM PEIXES A manipulao de gametas, ovos e embries podem ser realizados com maior facilidade em peixes do que em outros animais, porque esse grupo geralmente apresenta fecundao e desenvolvimento externos. Valendo-se do desenvolvimento externo dos peixes, os geneticistas e piscicultores conseguem controlar o sexo fisiolgico desse grupo de animais atravs da adio de hormnios esterides anabolizantes no seu alimento ou na gua em que vivem. A razo pela qual possvel controlar o sexo fisiolgico dos peixes que, enquanto o sexo gentico determinado por ocasio da fecundao, o sexo fisiolgico no . Durante o incio da embriognese, um embrio de peixe no nem macho nem fmea, porque no possui ovrios, testculos ou outras caractersticas associadas aos sistemas reprodutores. Ao contrrio, um embrio de peixe possui precursores embriolgicos de ovrios e testculos (clulas germinativas primordiais) e, nesse estdio, um embrio "totipotente" porque pode se desenvolver em um macho ou em uma fmea. Em um determinado momento especfico durante o desenvolvimento embriolgico (momento que diferente para cada espcie), um sinal qumico originado de um gene ou de um conjunto de genes informa" ao tecido totipotente em que direo se desenvolver. Uma vez que isso ocorra e o tecido pr-gonadal complete seu desenvolvimento, o peixe se torna fisiologicamente macho ou fmea. Aps essa etapa, no mais possvel alterar o sexo fisiolgico, exceto por tcnicas radicais, tais como a cirurgia gonadal, que tm mostrado pouco sucesso. H um pequeno espao de tempo, que varia de espcie para espcie, durante o qual o sexo fisiolgico pode ser alterado. Se um peixe ingere ou absorve esterides anabolizantes durante esse perodo, o esteride pode interferir diretamente no desenvolvimento das clulas totipotentes. Esta tecnologia tem sido bastante pesquisada nos ltimos vinte anos e vem sendo rotineiramente aplicada em programas de piscicultura envolvendo, por exemplo, tilpias, salmondeos e ciprindeos. 3.1 Linhagens Revertidas Monossexuais 1) Produo de linhagens monossexuais em uma etapa - Para se alterar em uma nica etapa o sexo fisiolgico de peixes, as larvas e alevinos devem ser, ou alimentados com rao contendo andrgenos (hormnios masculinos) ou estrgenos (hormnios

femininos), ou mantidos por certo tempo em gua contendo concentraes diludas desses mesmos hormnios. As dosagens exatas de hormnios e os tempos durante os quais 'devem ser administrados so fatores importantes no sucesso dos programas de reverso sexual em peixes 20,31. 0 procedimento de reverso sexual em uma nica etapa tem sido bastante usado na piscicultura das tilpias (Tabela 4). Uma das principais metas no cultivo de tilpias tem sido produzir linhagens monossexuais de machos com a finalidade de impedir a reproduo precoce e descartar as fmeas que crescem mais devagar que do os machos. Para essa finalidade, as larvas de tilpia do Nilo por exemplo, so alimentadas com rao contendo 40 mg de 117-alfa-metiltestosterona/ kg de dieta durante um perodo de 60 dias. Essa dosagem usualmente reverte 100% das fmeas em machos. Tabela 4 -Esquema geral do protocolo para a produo direta de linhagens revertidas de machos ou fmeas em peixes com determinao do sexo tipo XX/XY
ETAPA NICA: Produo direta de linhagens revertidas FASE DE VIDA TIPO DE ESTERIDE SEXO FISIOLGICO SEXO GENTICO Larvas Indiferenciadas ANDRGENOS ESTRGENOS MACHOS FMEAS MACHOS REVERTIDOS FMEAS REVERTIDAS ou NEOMACHOS (XX) ou NEOFMEAS (XY) MACHOS NORMAIS (XY) FMEAS NORMAIS (XX)

Nas pisciculturas de truta arco-ris, onde uma das finalidades seria produzir populaes monossexuais de fmeas, as larvas indiferenciadas so alimentadas com rao contendo 20 mg de 17-beta-estradiol/kg de dieta durante um perodo de 40 dias, obtendo-se normalmente 100% de fmeas revertidas. 0 consumo de peixes revertidos sexualmente por administrao de esterides anablicos pode levantar uma srie de questes na rea de sade pblica, conforme dever ser discutido mais detalhadamente no item 6 - Riscos Potenciais de Linhagens de Peixes Geneticamente Manipulados, do presente trabalho. Este tipo de problema pode ser contornado, em parte, pela incorporao do processo de reverso sexual em programas de piscicultura que possibilitem a produo de linhagens monossexuais de fmeas para espcies com sistema de determinao do sexo tipo XX/XY e de linhagens monossexuais de machos, para espcies com sistema de determinao do sexo tipo ZZ/ZW. 2) Produo de linhagens monossexuais de fmeas em duas etapas - relativamente fcil obter matrizes que sejam capazes de produzir linhagens constitudas somente de fmeas em espcies de peixes que possuem o sistema de determinao do sexo tipo XX/XY. Nesse caso, so usados andrgenos para produzir neornachos XX (Tabela 5). Numa primeira etapa, as larvas sexualmente indiferenciadas so alimentadas com rao contendo andrgenos ou mantidas em banho de gua, tambm contendo hormnios. Os peixes so criados at que possam ser sexados e, ento, so separados em duas categorias: fmeas, que so descartadas e machos, que so guardados.

Tabela 5 - Esquema geral do protocolo para a produo de linhagens monossexuais de fmeas em espcies de peixes com sistema de determinao do sexo tipo XX/XY
1. Etapa: Produo de linhagens de machos revertidos (XX) - Larvas indiferenciadas Andrgenos Machos revertidos (XX) e Machos normais (XY) 2. Etapa de Prognie para identificao dos machos revertidos (XX) - Fmeas normais (XX) x Machos revertidos (XX) 100% de Fmeas normais (XX) - Fmeas normais (XX) x Machos normais (XY) 50% de Machos normais (XY) + + 50% de Fmeas normais (XX) Guardar Linhagens de Machos Revertidos (XX)

impossvel separar os neomachos ou machos revertidos tipo XX dos machos normais XY pelo simples exame de caractersticas sexuais externas. Assim, numa 29 etapa necessrio realizar um teste de prognie para identificar os machos revertidos, dos normais. Para esta finalidade, so feitos cruzamentos entre casais de fmeas normais e machos tratados hormonalmente e cada famlia criada separadamente at que a descendncia possa ser sexada. Caso a descendncia se mostre constituda por 50% de fmeas e 50% de machos, o macho parental do tipo XY e deve ser descartado. Se, por outro lado, a descendncia for constituda somente de fmeas, ento o macho parental testado um neomacho tipo XX e deve ser mantido, porque so estes tipos de matrizes que serviro para a produo de linhagens monossexuais de fmeas. Vrios programas em piscicultura tm sido desenvolvidos para a produo de linhagens monossexuais de fmeas como, por exemplo, em carpa capim, truta arco-ris e salmo do Atlntico. No caso da carpa comum, foram produzidos ginogenticos revertidos (ginogenticos em carpa comum so todos fmeas XX) e criada uma linhagem que produzia somente filhas. Tanto na truta arco-ris como no salmo do Atlntico, no necessrio realizar o teste de prognie, porque os machos revertidos ou neomachos XX apresentam dutos espermticos incompletos, o que significa que o esperma no pode ser normalmente liberado desses machos, mesmo por compresso abdominal. Devido a isso, o esperma de machos revertidos XX de trutas arco-ris somente pode ser obtido atravs do sacrifcio dos animais. Portanto, os machos de truta arco-ris e de salmo do Atlntico podem ser caracterizados como neomachos (XX) ou como machos normais (XY) pelo exame dos dutos espermticos. 3) Produo de linhagens monossexuais de machos em duas etapas - Para se obterem matrizes que sejam capazes de produzir linhagens monossexuais de machos em espcies com sistema de determinao do sexo tipo ZZ/ZW, as larvas devem ser revertidas sexualmente com estrgenos. Assim so produzidas linhagens de neofmeas ZZ. 0 nico modo de diferenciar as neofmeas ZZ de fmeas normais ZW atravs do teste de prognie das fmeas. As fmeas normais ZW produzem descendncia constituda de 50% de machos e 50% de fmeas, e devem ser descartadas. Por outro lado, neofmeas ZZ iro produzir 100% de descendentes machos e sero estas as matrizes que devero ser guardadas porque so capazes de produzir linhagens monossexuais de machos. Em certos casos, como verificado em tilpias da espcie urea, algumas fmeas produzem famlias somente de machos e outras famlias constitudas por machos e hermafroditas. As razoes para o insucesso parcial de programas com esta espcie de tilpia no so completamente conhecidas, mas podem

ser devidas contaminao com cromossomos sexuais de outras espcies, em decorrncia de hibridao ou introgresso,ou devidas a genes modificadores do sexo. 3.2 Produo de Supermachos A maioria das espcies utilizadas em piscicultura apresenta sistema de determinao do sexo tipo XX/XY Nesses casos, a obteno de linhagens monossexuais de machos pode ser feita atravs da produo de matrizes de supermachos (machos que so YY em vez de XY). A Tabela 6 apresenta um esquema do roteiro em trs etapas, necessrio para a produo de supermachos. A primeira etapa deste programa consta de se alimentarem larvas sexualmente indiferenciadas com rao contendo estrgenos, com a finalidade de produzir neofmeas ou fmeas revertidas (fmeas que geneticamente so machos XY, mas que fenotipicamente e fisiologicamente so fmeas). Quando so sexados, verifica-se que os peixes tratados por hormnios se enquadram em trs categorias: machos normais XX, neofmeas revertidas XY e fmeas normais XX. Os machos normais XY devem ser descartados porque no sero usados neste tipo de programa. As fmeas normais XX tambm no so usadas neste tipo de programa de piscicultura, mas e impossvel separ-las das neofmeas XY examinando-se apenas as caractersticas sexuais externas. Portanto, a segunda etapa do programa consta da realizao do teste de prognie para identificar as fmeas revertidas XY e se poder descartar as fmeas normais XX. Isto feito pelo cruzamento de cada fmea com um macho normal e, ento, pelo cultivo de cada famlia em tanques individuais, at que a descendncia possa ser sexada. As fmeas que produzirem descendncia constituda por 50% de fmeas e 50% de machos, so geneticamente XX e devem ser descartadas. Por outro lado, as fmeas que produzirem 75% de descendentes machos, so neofmeas XY e devem ser mantidas. No entretanto, neste ponto, as neofmeas XY so menos importantes do que os 25% de seus descendentes que so supermachos YY, como indicado na Tabela 5 22,31. Tabela 6 - Esquema geral do protocolo para a produo de supermachos em espcies de peixes com sistema de determinao do sexo tipo XX/XY
1. Etapa: Produo de linhagens de fmeas revertidas Larvas indiferenciadas Estrgenos Fmeas Normais XX + Fmeas revertidas XY 2. Etapa: Teste de prognie para identificar fmeas revertidas Fmeas revertidas XY x Machos normais XY 25% Fmeas normais XX + +50% Machos normais XY 3. Etapa: Teste de Prognie para identificar os supermachos - Fmeas normais XX x Supermachos YY 100% Machos - Fmeas normais XX x Machos normais XY 50% Machos normais XY - + 50% Fmeas normais XX Guardar as Linhagens de Supermachos YY

Os supermachos so o objeto principal deste tipo de programa de reverso sexual, porque so as matrizes capazes de produzir descendncia constituda somente de machos. Infelizmente impossvel separar machos normais XY e supermachos YY pelo exame das caractersticas sexuais externas, de modo que necessrio, numa

terceira etapa, realizar um teste de prognie para identificar os supermachos, guardar essas linhagens, e descartar as linhagens de Machos normais. As linhagens de machos que produzirem descendncia constituda por 50% de fmeas e 50% de machos devem ser descartadas e aquelas que produzirem 100% de machos devem ser guardadas, porque so constitudas por supermachos, ou seja, so matrizes capazes de produzir descendncia formada por 100% de machos, quando cruzadas com fmeas normais, sem o uso de hormnios anabolizantes. Programas para a produo de supermachos tm sido levados a efeito, por exemplo, com truta arco-ris, bagre do canal e tilpia do Nilo. As matrizes de supermachos podem ser produzidas tambm pela combinao das biotecnologias de reverso sexual e ginognese, conforme esquematizado na Tabela 7 para espcies com sistema de determinao do sexo do tipo XX/XY. Esse procedimento se mostrou bastante satisfatrio na produo de linhagens monossexuais de machos de tilpia do Nilo20,22,31. Tabela 7 - Esquema geral do protocolo para a produo de supermachos combinando reverso sexual e ginognese em peixes com o sistema de determinao do sexo tipo XX/XY
1. Etapa: produo de linhagens de fmeas revertidas XY Larvas indiferenciadas Estrgenos Fmeas normais XX + Fmeas revertidas XY 2. Etapa: produo de supermachos ginogenticos Fmeas revertidas XY x Machos normais XY com espermatozides inativados por UV Ovos Choque Trmico Precoce para restaurar a diploidia 50% Fmeas ginogenticas XX + 50% Supermachos ginogenticos YY Fmeas normais XX x Machos normais XY com espermatozides inativados por UV ovos Choque Trmico Precoce para restaurar a diploidia 100% Fmeas ginogenticas Guardar as Linhagens de Supermachos Ginogenticos YY

Um pr-requisito, absolutamente necessrio para o sucesso dos programas produo de supermachos com tilpias, comear sempre com espcies "puras", porque linhagens resultantes de hibridao ou introgresso, por exemplo, entre tilpia do Nilo (com sistema de determinao do sexo do tipo XX/XY) e tilpia da espcie homorum (com sistema de determinao do sexo do tipo ZZ/ZW), iro apresentar uma mistura de sistemas de determinao do sexo, o que tornar bastante difcil, seno impossvel na prtica, levar avante qualquer programa bem sucedido de produo de supermachos com tilpias. 3.3 Produo de Superfmeas As matrizes de superfmeas (WW) possibilitam a produo de linhagens monossexuais de fmeas em espcies de peixes que apresentam o sistema de determinao do sexo tipo ZZ/ZW. A primeira etapa'para a produo de superfmeas consiste na alimentao de larvas sexualmente indiferenciadas com dietas contendo andrgenos, com a finalidade de produzir machos revertidos ZW. Quando os peixes puderem ser sexados, so separados em duas categorias: fmeas normais ZW, que so descartadas e machos, que so mantidos. H dois tipos de machos, os neornachos ZW e os machos normais ZZ, os quais so impossveis de serem separados pelo exame das caractersticas sexuais externas.

Para identificar os machos revertidos ZW, necessrio, numa segunda etapa, realizar o teste de prognie. Os machos que produzem descendncia constituda por 50% de fmeas e 50% de machos so geneticamente ZZ e devem ser descartados e, os que produzem 75% de fmeas so machos revertidos ZW e devem ser mantidos. Cerca de 25% das fmeas produzidas por machos revertidos ZW, sero constitudas por superfmeas WW, que devem ser mantidas, e por cerca de 50% de fmeas normais ZW, que podem ser descartadas. As matrizes de superfmeas WW produzem descendncia constituda por 100% de fmeas normais ZW, quando cruzadas com machos normais ZZ. 0 nico meio para se diferenciar as superfmeas das fmeas normais realizar numa terceira etapa, um outro teste de prognie. Caso a proporo sexual da descendncia desse teste for constituda por 50% de fmeas e 50% de machos, sabe-se que a parental fmea geneticamente normal ZW e deve ser descartada; por outro lado, se toda a descendncia do teste for constituda somente por fmeas, ento a parental materna ser a matriz superfmea WW que est sendo procurada e deve ser mantida porque, quando cruzada com machos normais ZZ, produzir somente uma descendncia de fmeas ZW 23,31. Poucas espcies importantes para a piscicultura apresentam sistema de determinao do sexo tipo ZZ/ZW, como por exemplo, o bagre africano, a tilpia homorum e a enguia japonesa, porm pouco provvel o interesse na produo comercial de linhagens monossexuais de fmeas, por exemplo, no caso das tilpias, uma vez que, neste grupo so os machos que apresentam maior interesse econmico, pois crescem mais que as fmeas. Os programas de reverso sexual em piscicultura desenvolveram-se tanto que, sob o ponto de vista comercial, so atualmente os grandes responsveis pela *produo de peixes em larga escala em vrios pases. Por exemplo, cerca de 50% da truta arco-ris produzida no Reino Unido e 40% do salmo "chinook produzido no Canad, so provenientes de linhagens monossexuais de fmeas produzidas por matrizes sexualmente revertidas, conforme procedimento sumarizado na Tabela 5. 4. MARCADORES MOLECULARES EM PROJETOS DE ICTIOGENTICA, Nos ltimos anos, tem havido um crescente aumento no uso de marcadores moleculares ao nvel do DNA, em projetos de ictiogentica aplicados piscicultura 4. Na Tabela 8, encontram-se resumidas informaes gerais sobre os principais marcadores moleculares mais usados na rea de ictiogentica e sobre o grau de contribuio de cada tipo de marcador para estudos gentico-evolutivos. 1) mtDNA - o DNA mitocondrial (mtDNA) de natureza haplide, apresenta molcula circular, no recombinante, transmitido via materna e contm cerca de 16 a 20 mil pares de bases. Quando o mt DNA digerido por enzimas de restrio (enzimas que clivam a molcula de DNA em locais especficos) e submetido a eletroforese, originam-se at cerca de 10 fragmentos por indivduo, que so chamados RFLP (restriction fragment length polymorphism"). Esses fragmentos podem variar ou por substituies de bases que causam ganho ou perda de stios ou pela insero/deleo de mutaes que mudam o comprimento dos fragmentos. Diferentes enzimas de restrio reconhecem e clivam seqncias de 4, 5 ou 6 bases; por exemplo, a Xba 1, derivada da bactria Xanthomonas badrii, atua sobre seqncias T^ CTAGA (^ = ponto de clivagem). 0 mt DNA tem sido o marcador molecular mais usado em vrios projetos na rea ictiogenticas,10,14,15. 2) scn DNA - um tipo de DNA nuclear de cpia nica ("single-copy"), presente somente uma vez no genoma haplide, sendo por isso tambm designado no-repetitivo. Engloba cerca de 70% do genoma dos mamferos e geralmente visualizado pela anlise dos RFLP.

3) DNA repetitivo interdisperso - uma categoria de DNA nuclear constituda por elementos repetitivos longos (LINE) e curtos (SINE), que ocorrem mltiplas vezes, cerca de centenas de milhares, no genoma. Normalmente visualizado tambm pela anlise dos RFLP. 4) DNA satlite - um tipo de DNA nuclear, repetitivo, que contm seqncias curtas que se repetem em tandem. Um dos tipos mais conhecidos de DNA satlite o minissatlite multilocos, que d origem ao chamado "DNA fingerprinting". 0 minissatlite multilocus constitudo por duas a vrias centenas de cpias de seqncias curtas de DNA com 9 a 100 bases, muitas vezes concentradas nas regies telomricas. Quando esse tipo de DNA cortado por enzimas de restrio, produz padres bastante complexos que se parecem com um padro de cdigo de barras, que caracterstico para cada indivduo, sendo por isso chamado de "DNA fingerprint". At o momento existem na literatura boas e ms notcias a respeito do "DNA fingerprint. Primeiro as boas. o desempenho e a aplicao desta tcnica nos ltimos anos tem sido cada vez mais promissores. Agora as ms. ainda uma tcnica cara, com custos de U$ 50 a 100 por animal. Um outro tipo de DNA satlite o chamado minissatlite loco-nico tambm designado por VNTR (variable number of tandem repeats"), cujo polimorfismo se deve a variao no comprimento dos alelos. H alguns anos foi possvel confirmar a presena e o potencial do VNTR no salmo do Atlntico 4. Tabela 8 - Principais tipos de marcadores moleculares ao nvel de diferentes classes de DNA e o grau de desempenho em estudos gentico-evolutivos
Tipos de Marcadores mt DNA scn DNA Repeties e contribuio interdispersas NA B NA Anlise de Genealogias B B NA Gentica de Populaes B/E S B Deteco de Zonas Hbridas E B E Filogenias VNTR E B NA NA Microssatlites S E NA NA RAPD B S NA NA

E - excelente; B - boa; S - satisfatria; NA - no adequada Outro tipo ainda de DNA satlite o microssatlite formado por seqncias simples de 1 a 6 bases repetidas de 5 a 100 vezes em cada loco e, usualmente, espalhadas ao longo do genoma. Por exemplo, a unidade CA pode ser encontrada repetida 50 vezes em tandem. 0 nmero de repeties pode ser altamente varivel, dando origem a um amplo Polimorfismo, que pode ser detectado via eletroforese. Os microssatlites exibem atributos que os tornam favorveis como marcadores genticos em vrios projetos de piscicultura. So abundantes, apresentam altos nveis de variao allica, e so bastantes teis em vrias situaes: por exemplo, em espcies que apresentam baixo nvel de variao com marcadores gentico-bioqumicos (isozimas) ou moleculares (mt DNA) como por exemplo o salmo do Atlntico, espcie na qual vrios microssatlites exibem mais do que 25 alelos e nveis de heterozigose que excedem 90%. Se, por um lado, o uso de microssatlites bastante favorvel porque seus alelos se comportam como marcadores mendelianos codominantes, por outro lado apresentam menores informaes sob o aspecto filogentico4.

5) RAPD("random amplfied polymorphic DNA")- consiste de regies arbitrrias do DNA, mas de seqncias conhecidas, constitudas por 10 a 20 bases do genoma, que so amplificadas pela tcnica chamada PCR ("polymerase chain reaction") e cujos produtos podem ser detectados por eletroforese. 0 RAPD foi usado com sucesso, por exemplo, na distino de tilpias, evidenciando sua utilidade em investigaes aos nveis taxonmicos de subespcies e espcies4. 5. ENGENHARIA GENTICA EM PEIXES A engenharia gentica um tipo de biotecnologia molecular pela qual um ou mais genes so transferidos ou transplantados de organismos de uma espcie chamada doadora, para organismos de outra espcie chamada receptora, que ser constituda pelos indivduos transgnicos. Os programas com peixes transgnicos, a nvel mundial, esto ainda em fase experimental e acredita-se que comecem a ser incorporados na rotina da piscicultura at o final da dcada de noventa 6,11,18,19. 0 tipo de tecnologia usada pela engenharia gentica de tal ordem sofisticado, que praticamente nenhum pesquisador ou piscicultor independente ter condies de desenvolver sozinho tal tipo de programa. Alm disso, em muitos pases j h uma srie de leis federais, estaduais e at municipais regulando e disciplinando sobre pesquisas na rea de engenharia gentica. H tambm o receio de que o escape de animais transgnicos para a natureza possa apresentar riscos de impactos ambientais ainda no totalmente conhecidos. Esses fatos, somados ao tipo de legislao, problemas ticos, morais e filosficos sobre a produo de transgnicos, acrescidos ainda aos problemas de financiamento de projetos nessa rea, leva a crer que a engenharia gentica de peixes permanecer durante vrios anos ainda no mbito de certas instituies de pesquisa e de algumas grandes empresas agroindustriais6,19. 5.1 Produo de Transgnicos As etapas bsicas para a produo de peixes transgnicos so: a) clonagem gnica, ou seja, a escolha e a obteno de um determinado gene que, por exemplo, codifique a produo de hormnio do crescimento; b) microinjeo do gene escolhido nos ovos da espcie receptora; c) incorporao ou insero do gene transferido no cromossomo da espcie receptora; d) expresso do gene inserido; e) transmisso do gene transplantado. 1) Clonagem gnica - Para a obteno de um determinado gene de um doador, existem trs caminhos principais. 0 primeiro recorrer s chamadas "bibliotecas gnicas", ou seja, h estoques de genes anteriormente j clonados e guardados em muitos laboratrios em vrias partes do mundo. 0 segundo, clonar os genes de maneira direta, ou seja, removendo o gene dos cromossomos da espcie doadora por digesto do DNA nuclear com auxlio de enzimas de restrio. Aps a obteno dos fragmentos e a identificao dos seus contedos gnicos, o gene a ser transplantado inserido em plasmdios bacterianos (pequenos anis de DNA localizados no citoplasma das bactrias), cortando-se esses plasmdios com enzimas de restrio, ligando-se o gene escolhido ao plasmdio, e ento fechando-se os plasmdios com ligases (enzimas de reparo do DNA). 0 complexo gene-plasmdio , ento, transferido para uma bactria, com auxlio de um choque trmico e, ento, as bactrias so cultivadas e multiplicadas. As bactrias replicam os seus plasmdios ao se dividirem e, deste modo, so produzidas milhes de cpias do plasmdio e do gene a ele ligado. As bactrias so cultivadas at que haja material suficiente e depois so mortas e rompidas para a liberao dos

complexos plasmdios-genes a serem transplantados. Os plasmdios so ento isolados e purificados e o gene que interessa isolado e removido. Um terceiro caminho o mtodo de clonagem indireta que comea com a extrao do RNA do tecido, sua purificao e seu uso como modelo para sintetizar o DNA complementar (c DNA). A vantagem em se usar o material nuclear que este material engloba as diferentes partes do gene, tais como o promotor e o espaador que, normalmente, no so obtidos durante a transcrio. No entretanto, o c DNA contm apenas aquelas seqncias do nucleotdio que codificam para o trecho especfico do RNA ativo na transcrio da molcula de protena; por essa razo necessrio usar outros promotores para possibilitar a ativao do gene c DNA. Esses promotores no so especficos e podem ser usados para uma variedade de genes codificadores. Por exemplo, o plasmdio usado no caso do famoso gene para o hormnio do crescimento de rato que foi transplantado para camundongo em 1982, tambm inclua um promotor. Este mesmo plasmdio tambm foi usado em truta arco-ris. A maioria dos trabalhos com peixes tem usado DNA clonados para outros organismos, porm vrios programas vm sendo desenvolvidos visando a clonagem gnica em peixes; nesse sentido, j foram clonados os genes para o hormnio do crescimento do salmo "chum" em 1985, da truta arco-ris em 1988 e do salmo do Atlntico em 198919. 2) Microinjeo de DNA nos ovos -Cerca de um milho de cpias do DNA purificado devem ser injetadas em cada ovo. Os ovos de peixes so bastante favorveis para esse tipo de procedimento, porque so grandes (geralmente tm mais de 1 mm de dimetro), a fertilizao externa e pode ser controlada, as injees no exigem micromanipuladores especiais e os ovos so fceis de incubar. Existem"duas dificuldades principais relativas manipulao dos ovos de peixes. Uma delas se deve presena do crion, que uma membrana externa envoltria do ovo. Em algumas espcies, como no caso do peixe dourado japons, h necessidade de usar produtos qumicos ou enzimas proteolticas para remover o crion. Os ovos dos salmondeos resistem retirada do crion, que deve ser puncionado previamente com uma agulha slida, antes da introduo da agulha para microinjeo do DNA. Sabe-se que a microinjeo do DNA no ncleo dos zigotos parece produzir melhores resultados do que injees no citoplasma. Uma outra desvantagem dos ovos de peixes que os ncleos so pequenos e no so visveis, como ocorre com os ncleos dos zigotos de mamferos; isto faz com que as injees do DNA a ser transferido atinjam geralmente o citoplasma mais ou menos prximo do ncleo do zigoto. Centenas de milhares de cpias precisam ser injetadas em cada ovo, porque um grande nmero ser destrudo pelas enzimas celulares. 3) Incorporao do gene transferido - As primeiras indicaes do sucesso do transgenismo, ou seja, de que o DNA transferido foi incorporado ao genoma hospedeiro, iro surgir durante o perodo de intensa replicao do DNA, que acompanha os rpidos estdios de diviso celular do embrio jovem. A replicao conjunta do DNA introduzido e do DNA receptor pode ser detectada aps a extrao e deteco por sondas que hibridam especificamente com o DNA introduzido. Mesmo que o DNA transferido seja incorporado ao genoma do hospedeiro, os genes podem estar "danificados", de modo que pode ocorrer que somente uma parte do genoma venha a ser incorporada, os genes podem vir a ser incorretamente incorporados, ou incorporados no lugar errado. Mesmo que ocorra incorporao correta, a mensagem codificada pode no ser apropriadamente transcrita em RNA mensageiro, bloqueando assim a produo do produto gnico. 4) Expresso do gene inserido - Tendo sido produzidos peixes transgnicos, a questo que se segue saber se o novo gene transplantado est ou no transcrevendo em RNA e se o RNA est sendo traduzido em protena. A expresso do gene inserido pode ser monitorada testando-se o RNA mensageiro dos tecidos transgnicos por testes imunolgicos apropriados. A transferncia bem-sucedida de um determinado gene no garantia de sucesso. Os genes contm reguladores e promotores que os ligam ou

desligam em situaes determinadas e, tambm, estes tipos de genes precisam ser transplantados junto com os genes estruturais. Logo, os complexos formados pelos genes estruturais e reguladores devem ser tambm injetados, pois suas presenas so essenciais para o funcionamento gnico. Por exemplo, as trutas arco-ris transgnicas produzidas em 1988 no apresentaram expresso gnica quanto ao hormnio do crescimento, porque foi usado na poca um promotor de camundongo. 8,19,20 5) Transmisso dos genes transplantados - A transmisso do DNA transplantado um dos aspectos cruciais dos programas de engenharia gentica, porque a finalidade desses programas produzir linhagens de peixes com caractersticas vantajosas que possam ser transmitidas para a descendncia. Em um peixe transgnico, espera-se que no s todas as clulas somticas, como as germinativas, contenham o gene transplantado. Caso o peixe seja um heterozigoto transgnico, com a integrao do gene transplantado em apenas um loco, ento 50% de todos os espermatozides ou "vulos" produzidos transportaro a nova seqncia e, em cruzamentos com peixes no-transgnicos, 50% de toda a descendncia ser transgnica heterozigota. Caso os peixes transgnicos apresentem mais de uma cpia integrada em seu genoma, como, por exemplo, em diferentes locais dos cromossomos e em vrios cromossomos, a descendncia ser constituda por mais de 50% de transgnicos. Caso, a partir de ovos de fmeas transgnicas heterozigotas, sejam produzidos ginogenticos mitticos, cerca de 50% da prognie ser formada por fmeas transgnicas homozigotas. Evidncias de transmisso de caractersticas transgnicas tm sido mostradas em programas de engenharia gentica desenvolvidos na Frana com trutas arco-ris, nos Estados Unidos com a carpa comum, com o peixinho zebra danio e na China com o peixinho dourado 113,19,20,23 5.2 Contribuio dos Transgnicos em Projetos de Piscicultura Atualmente comeam a ser testadas em condies de piscicultura nos EUA, carpas comuns transgnicas para o gene do hormnio do crescimento. Pesquisas equivalentes, conduzidas na China em condies de laboratrio, mostraram que o peixe dourado transgnico tambm para o gene do hormnio do crescimento, apresenta desempenho quatro vezes superior aos dos normais19. Nos EUA e Canad j foi clonado o gene que codifica protenas anticongelamento existentes no sangue de alguns linguados do rtico, que permitem a sobrevivncia destes animais em temperaturas inferiores a OC. Os salmes do Atlntico no possuem as protenas anticongelamento e morrem nos tanques-rede na regio da Escandinvia quando as temperaturas caem a -0,7C. A transferncia dos genes para protenas anticongelamento certamente seria muito til se fosse feita tanto para salmes do Atlntico como para espcies de regies tropicais, candidatas ao cultivo em regies temperadas19. Outra possibilidade de aplicao da engenharia gentica em piscicultura seria a utilizao dos genes para a metalotionena, que uma protena que se liga a metais pesados nas clulas, particularmente o cdmio, cobre, zinco e mercrio18,19. Os genes para a metalotionena esto presentes em muitas espcies de vertebrados, inclusive nos peixes, e tm uma dupla funo: uma, que parece ser a principal, de suplementar com zinco as enzimas zinco-dependentes. Outra seria uma funo de desintoxicao, um processo que envolve sua ligao com metais pesados e sua excreo pelos rins. Em teoria pelo menos, os genes da metalotionena poderiam ser introduzidos em espcies que habitassem reas poludas por metais pesados. Infelizmente, a metalotionena no se liga ao alumnio e no oferece proteo para peixes que vivem em guas acidificadas. Logo, prev-se que a aplicao da tecnologia de engenharia gentica em piscicultura demore ainda pelo menos mais uma dcada. Durante este perodo, a

pesquisa em engenharia gentica deve ficar mais restrita a instituies de pesquisa e a companhias agroindustriais. Alm disso, os dados atualmente disponveis no fornecem garantia total de que os peixes transgnicos sejam capazes de transferir para a descendncia os genes transplantados e, mesmo que isto seja possvel, no h garantia plena de que a insero do gene para o hormnio do crescimento ou outras caractersticas desejveis apresentem resultados positivos. 0 manejo sanitrio de peixes assim como a produo de vacinas contra doenas bacterianas e virais na rea ictiolgica so reas que provavelmente sero bastante beneficiadas nos prximos dez anos pela engenharia gentica aplicada piscicultura19. 6. RISCOS BIOLOGICOS POTENCIAIS GENETICAMENTE MANIPULADOS DE LINHAGENS DE PEIXES

Na rea de biotecnologia aplicada piscicultura tambm importante avaliar os riscos biolgicos potenciais das linhagens geneticamente manipuladas, tanto para o desenvolvimento satisfatrio de projetos neste setor, como para propsitos de conservao gentica de estoques selvagens e cultivados de peixes6. As linhagens de peixes geneticamente modificadas podem ser intencional ou acidentalmente introduzidas em ambientes naturais onde possam sobreviver, dispersar-se ou reproduzir-se. Diferentes tipos de modificaes genticas podem ocasionar impactos ecolgicos. Por exemplo, a reproduo de peixes transgnicos pode levar introgresso de transgenes em populaes selvagens de peixes, enquanto a introduo de linhagens de triplides transgnicos pode envolver certa percentagem de no-triplides frteis. A possibilidade de impacto ecolgico destes eventos ainda no pode ser adequadamente avaliada face aos dados atualmente disponveis. Na verdade, os riscos potenciais de peixes transgnicos em ecossistemas naturais se baseiam, at o momento, apenas em evidncias de natureza terica. 6.1 Riscos Potenciais de Linhagens Cromossomicamente Manipuladas As linhagens de peixes cromossomicamente manipuladas apresentam riscos de impactos bioecolgicos que podem ser considerados previsveis. Estes riscos potenciais dizem respeito a dois aspectos principais: efeitos dos graus de ploidia sobre o sucesso reprodutivo de populaes naturais coespecficas e das conseqncias dos novos nveis de variabilidade gentica ps-manipulao cromossmica sobre a coadaptao populacional6. 1) Problemas com os triplides - Sabemos que grande parte da utilidade das linhagens triplides de peixes se deve a sua esterilidade. No entanto, o uso de triplides em piscicultura pode apresentar trs tipos bsicos de problemas potenciais. Um deles a obrigatoriedade de verificao dos nveis de ploidia dos indivduos pertencentes s linhagens a serem introduzidas na natureza. A necessidade deste procedimento se deve ao fato de a percentagem de triplides induzidos artificialmente variar de maneira considervel, de acordo com os diferentes protocolos seguidos e as vrias espcies de peixes usadas. Caso no se adote este tipo de encaminhamento, corre-se o risco de planejar projetos para o emprego de triplides e, na realidade, acabar realizando, na prtica, trabalhos com grande nmero de diplides. Outro problema o de que os triplides apresentam desenvolvimento sexual anormal e so estreis. A despeito de apresentarem desenvolvimento sexual anormal, os triplides machos de truta arco-ris, por exemplo exibem diferenciao sexual, nveis de testosterona, comportamento de corte e "espermiao" comparveis aos normais. Alm disso, podem se cruzar com fmeas normais diplides, porm sem sucesso reprodutivo, porque a prognie no sobrevive possivelmente pelo fato de os embries serem aneuplides. Portanto, nos casos em que

ocorrem cruzamentos entre fmeas diplides e machos triplides, haver uma perda total da descendncia, o que poderia reduzir o potencial reprodutivo da populao. Em populaes selvagens, os fatos acima mencionados podem aumentar dois tipos de riscos genticos: com a perda da variabilidade gentica e o declnio demogrfico, pode at haver risco de extino populacional. Em certos lagos dos EUA, onde foram introduzidos estoques de peixes triplides hbridos entre a truta " Yellowstone cutthroat" e a truta arco-ris para se obterem exemplares mais vigorosos destinados pesca esportiva, est ocorrendo uma sensvel diminuio do tamanho populacional das trutas nativas diplides. Este tipo de impacto gentico de uma linhagem cromossomicamente manipulada sobre outra cromossomicamente normal poderia ter sido atenuado, caso tivessem sido utilizadas somente linhagens de fmeas triplides que, como sabemos, no apresentam maturidade sexual, comportamento de corte, etc. Por outro lado, caso se desejasse propor um programa visando ao controle populacional de uma espcie extica, poderia ser experimentado o uso de linhagens de machos triplides; evidente que tentativas iniciais deveriam ser realizadas, por exemplo, em tanques experimentais e no diretamente na natureza. Admitamos, por exemplo, que se pretendesse tentar reduzir o tamanho populacional do tucunar que, h alguns anos foi introduzido na bacia superior do rio Paraguai, usando linhagens triplides de machos do prprio tucunar, como j mencionado no item 2 - Manipulao Cromossmica em Peixes, deste trabalho. Neste caso, seria necessrio comear com a produo e identificao de linhagens triplides de tucunar e, a seguir, com ensaios em tanques experimentais para a anlise do comportamento reprodutivo dos machos triplides estocados junto com machos e fmeas diplides normais. Desse modo, seria possvel determinar se os machos triplides de tucunar teriam ou no acesso sexual s fmeas diplides, se interfeririam ou no no comportamento de desova dessas fmeas, e se poderiam interferir na biologia populacional dos diplides frteis. Um outro problema biolgico dos triplides o fato de poderem apresentar maior sobrevivncia que os diplides. H indicaes de que salmes estreis maiores e mais velhos consomem 40% mais alimento do que os exemplares frteis maduros. Os estreis tambm competem com os frteis quanto aos itens alimentares, durante todo o seu cicio de vida, o que pode limitar a taxa de crescimento populacional. 2) Problemas com os tetraplides- 0 maior interesse prtico dos tetraplides o de servir de matrizes para a produo de linhagens triplides quando so cruzados com estoques de diplides. 0 escape de tetraplides para a natureza pode apresentar riscos potenciais. Um dos problemas que podem surgir o cruzamento entre fmeas tetraplides e machos diplides, levando produo de grande quantidade de triplides estreis, ocasionando uma diminuio dos diplides normais. Bem mais problemtico parece ser o cruzamento reciproco entre fmeas diplides e machos tetraplides, porque o esperma diplide apresenta baixa capacidade de fertilizao, possivelmente devido a dificuldades de penetrao atravs da micrpila de um "vulo" normal haplide, como j.mencionado. 0 escape continuado de tetraplides confinados em direo a ecossistemas naturais poderia, em princpio, levar a uma reduo do sucesso reprodutivo das populaes naturais6. 3) Problemas com os ginogenticos e androgenticos -A ginognese e a andrognese so biotecnologias genticas que levam produo de linhagens com diferentes graus de consanginidade. Em condies de cultivo, as linhagens consangneas podem constituir matrizes vantajosas para o desenvolvimento de programas envolvendo hibridaes entre diferentes estoques de peixes. 0 risco potencial que essas linhagens consangneas apresentam o de serem. introduzidas na natureza e virem a se cruzar com estoques selvagens, resultando em descendncia com variabilidade gentica reduzida. Como se sabe, a uniformidade gentica geralmente

perturba a coadaptao biolgica historicamente estabelecida nas populaes selvagens e leva ao decrscimo do tamanho populacional. Portanto, seria bastante importante que as linhagens ginogenticas e androgenticas fossem cultivadas em locais bastante seguros e, sempre que possvel, que tambm fossem biologicamente estreis. 6.2 Riscos Potenciais de Linhagens Sexualmente Revertidas 0 uso de anabolizantes para a produo de peixes revertidos sexualmente um assunto ainda acompanhado mundialmente, de muita polmica6. Os anabolizantes tm a capacidade de aumentar, por exemplo, em cerca de 20% a produtividade da truta arco-ris21. Um dos principais pontos de discusso se os anabolizantes fazem ou no mal para a sade do ser humano, No Brasil, o uso de anabolizantes na rea de pecuria de corte, por exemplo, est suspenso h vrios anos e muito se tem discutido a favor ou contra sua liberao. Em peixes, h vrios trabalhos na literatura mostrando que, desde que corretamente usados para a reverso sexual, os hormnios no ofereceriam riscos para a sade dos consumidores humanos6. Um dos principais argumentos favorveis ao uso de hormnios em peixes que a quantidade de anabolizantes ingerida por animal, para a produo de linhagens monossexuais ou revertidas de fmeas ou machos, muito pequena, sendo inferior a 5 mg por animal. Outro argumento favorvel ao uso, o de que a maior parte do hormnio ingerido rapidamente eliminado. Por exemplo, no decorrer do perodo de 24 horas a truta arco-ris excreta cerca de 67% da 17-alfa-metiltestosterona ingerida; e, em juvenis de tilpia da espcie urea, permanece apenas 0,9% da 17-alfametiltestosterona, aps esta ter sido suspensa h 21 dias da dieta. Outro argumento a favor que, desde que sejam utilizados ,segundo os protocolos indicados na literatura, os anabolizantes so detectados somente ao nvel de partes por bilho nos peixes revertidos com tamanho comercial, o que, em princpio, no ofereceria problemas para a sade dos seres humanos. Os argumentos contrrios ao consumo de peixes revertidos para a alimentao humana, em especial, dizem respeito aos riscos potenciais decorrentes do uso incorreto de anabolizantes sem controle de qualidade ou aplicados em dosagens aleatrias e elevadas, resultando na produo de resduos acima dos limites biologicamente aceitveis6,13. Em vrios pases europeus, para se evitarem riscos potenciais, no so usados para consumo alimentar peixes revertidos diretamente em uma etapa13 como indicado na Tabela 4. Pelo contrrio, as linhagens revertidas so usadas como matrizes para a produo indireta, em duas etapas, de linhagens monossexuais de fmeas ou de machos (Tabela 5), ou de linhagens de superfmeas ou supermachos (Tabelas 6 e 7). Sugerimos que os projetos brasileiros de piscicultura destinados produo de peixes revertidos adotem preferencialmente os protocolos de produo indireta, em duas etapas, de linhagens monossexuais como resenhado nas Tabelas 5 e 6. No entanto, caso venham a ser usados os protocolos para produo direta de linhagens revertidas como indicado na Tabela 4, h necessidade e obrigao por parte dos produtores, de prestarem os esclarecimentos necessrios e cabveis contidos nos cdigos nacionais e federais e/ou estaduais de proteo aos consumidores, e de se orientarem previamente junto aos servios veterinrios oficiais responsveis pelos controles sanitrio e alimentar existentes a nvel estadual e/ou federal, sobre o uso de anabolizantes em piscicultura. Os programas de piscicultura para a produo de linhagens monossexuais de peixes pelo uso de esterides anabolizantes sofrem, a nvel mundial, uma presso continuada de grupos de consumidores para que seja proibido o uso desses hormnios que, na opinio de vrias entidades poderiam aumentar a incidncia, por exemplo, de cncer da mama. De fato, recentemente, alguns pesquisadores tm proposto hipteses sugerindo que os xenoestrgenos (substncias provenientes do ambiente, que mimetizam

ou alteram a ao dos estrgenos produzidos pelo ser humano) poderiam ser responsveis por cerca de trs quartos dos casos mundiais de cncer das glndulas mamrias8. Os principais xenoestrgenos tm sido englobados em quatro categorias, a saber: compostos organoclorados usados como inseticidas, tais como o DDT, "endosulfan" e "metoxiclor", ou como exterminadores de cupins e formigas como o "clordane" e "kepone"; compostos plsticos que contm "bisfenol A" e "nonilfenol"; produtos farmacuticos, tais como os estrgenos sintticos, dentre os quais o dietilestilbestrol cujo uso foi banido em 1971. Os prprios anabolizantes usados na produo de peixes revertidos poderiam se espalhar pelo ambiente atravs das guas dos tanques e aqurios onde so administrados aos animais por via alimentar, e virem tambm a atuar secundariamente como xenoesterides. 6.3 Riscos Potenciais dos Transgnicos Nos ltimos anos tem havido um amplo debate, a nvel mundial, sobre os riscos potenciais de organismos transgnicos caso venham a ser introduzidos em ecossistemas naturais ou estejam disponveis para o consumo alimentar humano. Existem dois tipos de riscos potenciais de natureza gentico-ecolgica; so os que decorrem das possibilidades de proliferao descontrolada de transgnicos na natureza e da capacidade de esses organismos transferirem caractersticas genticas no desejveis para espcies domsticas ou selvagens. Outro problema potencial, na rea de sade pblica, diz respeito futura comercializao de peixes transgnicos e seu consumo humano ou em raes para animais6. Parece ser consenso na rea gentico-ictiolgica, que peixes transgnicos devem ser criados em confinamento total, acompanhados de todas as medidas cabveis para que sejam evitados escapes acidentais ou intencionais. Neste sentido, em 1991, foi iniciada, pela primeira vez, na Auburn University, Alabama, EUA, a criao fora do laboratrio de carpas transgnicas para o gene do hormnio do crescimento, adotando-se uma srie de medidas de segurana aconselhadas pelo Departamento de Agricultura dos EUA 18,19. Atualmente existem cerca de vinte laboratrios em vrias partes do mundo, tais como EUA, Canad, e alguns pases da Europa e sia tentando desenvolver peixes transgnicos. Alm das medidas de confinamento dos transgnicos, os pesquisadores tm proposto outros cuidados adicionais com os transgnicos; um deles seria usar marcadores gentico-bioqumicos diagnsticos de linhagens transgnicas; outro, seria esterilizar biologicamente os transgnicos via triploidia induzida; outro cuidado ainda, seria trabalhar com espcies incapazes de hibridao ou introgresso com estoques selvagens ou, ainda, que no fossem capazes de colonizao de ambientes naturais. Alguns pesquisadores tm produzido, a nvel mundial, peixes transgnicos com genes para o hormnio de crescimento humano, bovino e de outros peixes. Estima-se que dentro de 10 anos, quando essas linhagens transgnicas comearem a ser comercializadas, haver forte presso por parte dos consumidores no sentido de que seja proibido o consumo dessas linhagens geneticamente modificadas. Por enquanto, sob o ponto de vista da legislao brasileira na rea de transgnicos, existe a lei 8.974 de 05/01/95 que disciplina e regulamenta as atividades de ensino, pesquisa e desenvolvimento tecnolgico e tambm a produo de organismos geneticamente modificados (OGM). A referida lei criou tambm uma Comisso Tcnica Nacional de Biossegurana (CTNBio), regulamentada pelo decreto 1.752 de 20/12/95. A CTNBio, alm de outras atribuies, emitir Certificados de Qualidade em Biossegurana. Em concluso, de tudo o que foi resenhado na presente publicao, pode-se ter uma idia da contribuio da biotecnologia gentica piscicultura moderna desenvolvida a nvel mundial, e que tambm comea a ser realizada em nosso pas. Os fatos de a poliploidia e a monossexagem terem sido rapidamente repassadas para a prtica do

cultivo, mostram a relativa simplicidade e eficcia dessas biotecnologias nas mos dos piscicultores; um animal ou no estril, um plantel pode conter somente um ou ambos os sexos. 0 grande interesse que a aplicao da gentica em piscicultura despertou a nvel mundial foi a fundao, h alguns anos da Associao Internacional de Gentica em Aqicultura (IAGA), que j realizou at o presente, quatro congressos sendo o primeiro em 1982 na Irlanda (Galway)31, o segundo em 1985 nos EUA(Davis)13 , o terceiro em 1988 na Noruega (Trondheim)15, e o quarto em 1991 na China (Wuhan)14 . A nvel nacional, o IX Encontro Brasileiro de Ictiologia realizado em 1992 em Maring, patrocinou pela primeira vez no Brasil uma mesa-redonda sobre Conservao Gentica de Peixes27 , e o 102 Congresso Latino-Americano de Gentica em 1992 no Rio de Janeiro, organizou o primeiro simpsio no pas sobre Gentica de Peixes24. 7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 1. ALMEIDA-TOLEDO,L.F.;BIGONI,A.F.V.;BERNARDINO,G. & TOLEDO-FILHO, S.A. Chromosomal location of NORs and C bands in F1 hybrids of bighead carp and silver carp reared in Brazil. Aquaculture 135: 227-284,1995. 2. CARVALHO, E.D.- Induo da reverso de sexo em Oreochromis niloticus (Tilpia do Nilo) com o uso do hormnio masculinizante 17-alfa-metiltestosterona: freqncia de machos e crescimento. Dissertao de Mestrado, UFSCar, 1985. 3. CARVALHO, E.D.; OLIVEIRA, E.; FORESTI, F; ZANIBONI-FILHO, E.; BARBOZA, N. & CASTAGNOLLI, N. Induo de triploidia em tambaqui (Colossoma macropomum) e pacu (Piaractus mesopotamicus) e sua avaliao pela anlise cromossmica. Resumos do III Simpsio de Citogentica Evolutiva e Aplicada de Peixes Neotropicais: 49,1990. 4. CARVALHO, G. R. & PITCHER, TJ. - Molecular Genetics in Fisheries, Chapman & Hall, London, 1995. 5. CALCAGNOTTO, D.; TOLEDO-FILHO, S.A. & ALMEIDA-TOLEDO,L.F. - 0 mt DNA como marcador gentico para estoques de pacu e tambaqui. Revista Brasileira de Gentica 118(suppl.3): 192,1995. 6. CLOUD, J.G. & THORGAARD,G.H.(ed.) - Genetic Conservation of Salmonid Fishes, Plenum Press, N. York, 1993. 7. CHOURROUT, D. - Genetic Manipulation in Fish: review of methods. In: Selection, Hybridization and Genetic Engineering in Aquaculture. vol.11 (Tiews, K., ed.) p. 11126, Heenemann-Verlag, Berlin, 1987.

8. DAVIS, D.L. & Bradlow, H.L. - Can environmental estrogens cause breast cancer? Scientific American 273: 144-49, 1995. 9. DONOLA, E.& TOLEDO-FI LHO, S.A. (responsveis pela redao do texto) - Paraibuna testa a produo de peixes com mais carne. Linha Direta CESP Semanal, ano IV, n. 15 11., p.2, 06/03/1991. 10.FERNANDES, F.M.C.; CALCAGNOTTO, D.; ALMEIDATOLEDO, L.F.;

TOLEDO-FILHO, S.A. & MATIOLI, S.R. -Emprego de tcnicas de Biologia Molecular associadas com tcnicas de Citogentica e Gentica Bioqumica. Resumos do V Simpsio de Citogentica Evolutiva e Aplicada de Peixes Neotropicais: 90, 1994. 11.FISCHETTI M. -A feast of gene-splicing down on the fish farm. Science 253: 512-13, 1991. 12. GALHARDO, E.; DONOLA, E.; ANDREATTA, A.A.; ALMEIDA-TOLEDO,L.F. & TOLEDO-FILHO, S.A. - Ensaio de triploidia induzida em carpa comum (Cyprinus carpio) e mtodos para deteco de triplides. Resumos do Ill Simpsio de Citogentica Evolutiva e Aplicada de Peixes Neotropicais: 48, 1990. 13. GALL, G.A.E. & BUSACK, C.A. (ed.) - Genetics in Aquaculture II. Aquaculture 57: 1-386, 1986. 14. GALL, G.A.E. & CHEN, H (ed.) - Genetics in Aquaculture IV. Aquaculture 111: 1-332, 1993. 15. GJEDREM, T. (ed.) - Genetics in Aquaculture Ill. Aquaculture 85: 1-340, 1990. 16. KINCAID,H.L. - Inbreeding in Fish populations used for Aquaculture. Aquaculture 33: 215-27, 1983. 17. KIRPICHNIKOV, V.S. - Genetics Basis of Fish Selection, Springer-Verlag, 1981. 18. LEWIS,R. - Fish: new focus for biotechnology. BioScience 38: 225-27,1988. 19. MacLEAN, N. & PENMAN,D. - The Application of Gene Manipulation to Aquaculture. Aquaculture 85:1-20,1990. 20. PURDOM, C.E. - Genetics and Fish Breeding, Chapman & Hall, London, 1993.

21. RAHAL, C.A. - Veterinrios mudam sexo de trutas e aumentam a produtividade em 20%. Folha de So Paulo (Agrofolha) p.H1, 17/10/1989. 22. TAVE, D. - Genetics for Fish Hatchery Managers, Van Nostrand-Reinhold, N.York,1993. 23. THORGAARD, G. H. - Application of Genetic Technologies to rainbow trout. Aquaculture 100: 85-97, 1992. 24. TOLEDO-FILHO, S.A. - Hibridao e Conservao Gentica de Peixes. Revista Brasileira de Gentica 15 (suppi.1): 222-26, 1992. 25. TOLEDO - FILHO, S. A.; ALMEIDA-TOLEDO, L. F.; FORESTI, F.; BERNARDINO, G. & CALCAGNOTTO, D. - Monitoramento e Conservao Gentica em Projeto de Hibridao entre Pacu e Tambaqui. Cadernos de lctiogentica 2: 1-51, 1994. 26. TOLEDO-FILHO, S.A.; ALMEIDA-TOLEDO, L.F.; FORESTI, F.; GALHARDO, E. & DONOLA, E. - Conservao Gentica de Peixes em Projetos de Repovoamento de Reservatrios. Caderno de lctiogentica 1: 1-39, 1992. 27. TOLEDO-FILHO, S.A.: ALMEIDA-TOLEDO, L.F.; GALHARDO, E. & FORESTI, F. Monitoramento, ManipuIao e Conservao Gentica de Peixes. In: Situao Atual e Perspectivas da Ictiologia no Brasil (Agostinho, A.A. & Benedito-Cecilio, E., ed.):'69-78, 1992. 28. TOLEDO-FILHO, S.A. & FORESTI, F. - A Gentica na Piscicultura. Apostila, 13 p., 1987. Palestra ministrada por um dos autores(SATF) na Reunio sobre Biotecnologia no Setor Pesqueiro no CEPTA/IBAMA,Pirassununga em 13/05/1987 29. TOLEDO-FILHO,S.A.; FORESTI, F. & ALMEIDA-TOLEDO,L.F. - Gentica aplicada Piscicultura. Apostila,22p., 1990. Palestra ministrada por um dos autores (SATF) na 1 Reunio do Grupo de Avaliao Tcnica de Siluriformes no Brasil, no CEPTA/IBAMA, Pirassununga, em 04/12/1990. 30. TOLEDO-FILHO,S.A.; FORESTI,F. & RIBEIRO, A.F. -lctiogentica: aspectos bsicos e aplicados. Cincia e Cultura,S.Paulo 30: 320-27, 1978. 31. WILKINS,N.P. & GOSLING,E.M. (ed.) - Genetics in Aquaculture. Aquaculture 33: 1-426,1983.

Universidade de So Paulo Reitor: Prof. Dr. Flvio Fava de Moraes Instituto de Biocincias da USP Diretor. Prof. Dr. Joo Stenghel Morgante Vice-Diretor. Profa. Dra. Vera Lcia Imperatriz-Fonseca Departamento de Biologia Chefe do Departamento: Prof. Dr. Paulo Alberto Otto Coordenador de Ps-Graduao Biologia/Gentica: Profa. Dra. Lurdes Foresti de Almeida-Toledo Coordenadoria de Comunicao Social Coordenador: Prof. Dr. Celso de Barros Gomes Reviso: Cleusa Conti Machado, Maria Izabel A. Leo e Silvia S. Vieira Editorao eletrnica, Fotolito, Impresso e Acabamento: Diviso de Artes Grficas da CCS