CAPTULO 2.5.4.

ANEMIA INFECCIOSA EQUINA

RESUMEN
La anemia infecciosa equina (AIE) est causada por un lentivirus. Se puede diagnosticar en base a los signos clnicos, lesiones patolgicas y serologa. Los caballos infectados continan siendo portadores del virus de por vida y darn un resultado serolgico positivo. Generalmente, la respuesta de los anticuerpos es persistente, y los animales con anticuerpos positivos mayores de 6 meses, se identifican como portadores de virus (en los menores de 6 meses, las reacciones serolgicas pueden deberse a los anticuerpos maternales). Los animales infectados pueden transmitir la infeccin a otros caballos. Identificacin del agente: Se puede aislar el virus en un caballo enfermo inoculando sangre sospechosa a un caballo susceptible o a los cultivos de leucocitos preparados a partir de caballos susceptibles. El reconocimiento de la infeccin en los caballos que han sido inoculados experimentalmente se puede llevar a cabo en base a signos clnicos, a cambios hematolgicos y a una respuesta positiva de anticuerpos determinada por una prueba de inmunodifusin o por un enzimoinmunoensayo (ELISA). El aislamiento eficaz del virus en los cultivos de leucocitos de los caballos se confirma mediante la deteccin del antgeno especfico contra la AIE por la prueba de inmunofluorescencia, la reaccin en cadena de la polimerasa, la prueba RTA (reversetranscriptase assay) o por la inoculacin de fluidos de cultivo en caballos susceptibles. Raramente se intenta el aislamiento del virus debido al tiempo, la dificultad y los gastos que conlleva. Pruebas serolgicas: Las pruebas de inmunodifusin en gel agar (AGID) y ELISA son pruebas simples y fiables para demostrar la infeccin por AIE. Cuando las pruebas ELISA son positivas deben confirmarse mediante la prueba AGID. La precipitacin del antgeno se puede preparar a partir de cultivos de tejido infectados utilizando la tecnologa del ADN recombinante. Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: No existen actualmente productos biolgicos disponibles.

A. INTRODUCCIN
La anemia infecciosa equina (AIE) se presenta en todo el mundo. La infeccin se limita a los quidos. La enfermedad se caracteriza por episodios febriles recurrentes, anemia, prdida de peso y edema de las partes bajas del cuerpo; tiende a convertirse en una infeccin asintomtica sino se produce la muerte en el curso de los ataques clnicos agudos. Normalmente, el perodo de incubacin es de entre 1 y 3 semanas, pero puede prolongarse hasta 3 meses. En casos agudos, los ndulos linfticos, el bazo y el hgado se agrandan y se vuelven hipermicos. Desde el punto de vista histolgico, estos rganos estn infiltrados con poblaciones de leucocitos inmaduros y de clulas plasmticas. Las clulas de Kupffer, del hgado, generalmente contienen hemosiderina o eritrocitos. Se puede detectar hipertrofia del bazo mediante un examen rectal. Cuando el virus AIE infecta a un caballo, su sangre permanece infectada durante el resto de su vida. Ello significa que el caballo es un portador virmico y que puede transmitir la enfermedad a otros caballos (4). La transmisin se realiza por transferencia de la sangre de un caballo infectado. En realidad, es ms probable que la propagacin del virus se lleve a cabo por la interrupcin de la alimentacin de los tbanos que chupan la sangre a caballos clnicamente enfermos y luego pasan a caballos sanos susceptibles, o mediante la utilizacin de agujas contaminadas. Sin embargo, lo que s se da es la infeccin in utero de un feto (8). El ttulo del virus es ms alto en caballos con signos clnicos y el riesgo de transmisin es ms elevado desde estos animales que desde animales portadores con un ttulo de virus inferior.

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B. TCNICAS DE DIAGNSTICO
Las pruebas de inmunodifusin en gel de agar (AGID) (7) y los enzimoinmunoensayos ELISA (15) son pruebas precisas y fiables para la deteccin de la AIE en caballos, excepto para los animales que estn en las primeras etapas de la infeccin, para los potros y para las madres infectadas. En otras circunstancias poco frecuentes, pueden obtenerse resultados equvocos cuando la cantidad de virus que circulan en la sangre durante un episodio agudo de la enfermedad es suficiente para hacer que disminuya la cantidad de anticuerpos disponibles, y si la cantidad inicial de anticuerpos nunca aumenta lo suficiente para que stos sean detectables (16). Aunque con el ELISA se detectan los anticuerpos en concentraciones bajas antes que con la prueba AGID, sta se utiliza para confirmar los ELISA positivos. Esto es debido a que los resultados falsos positivos han sido detectados con ELISA. La prueba AGID tiene tambin la ventaja de distinguir entre la anemia infecciosa equina y las reacciones de los anticuerpos antgenos de AIE mediante lneas de identidad. El virus de la AIE es un lentivirus, una subfamilia del Retroviridae, que incluye tambin maedivisna, artritis y encefalitis caprina, inmunodeficiencia bovina y los virus de inmunodeficiencia humana. Las comparaciones de secuencias de cido nucleico han demostrado una relacin estrecha entre estos virus.

1.

Identificacin del agente

Generalmente, no es necesario el aislamiento del virus para realizar un diagnstico. Se puede aislar el virus en caballos sospechosos inoculando su sangre en cultivos de leucocitos preparados a partir de caballos no infectados. La produccin de virus en cultivos puede confirmarse detectando el antgeno especfico contra AIE por medio de un ELISA, por la prueba de la inmunofluorescencia o por subinoculacin en caballos susceptibles. Apenas se intenta el aislamiento del virus debido a la dificultad para obtener cultivos de leucocitos de caballos. Se ha descrito una prueba de la reaccin en cadena de la polimerasa anidada, para detectar el ADN provrico de la AIE en la sangre perifrica de los caballos (12). Cuando no se puede confirmar el estado exacto de la infeccin de un caballo, debera realizarse la inoculacin de un caballo susceptible con sangre sospecha. En este caso, a un caballo que ha sido previamente examinado en busca de anticuerpos y da un resultado negativo, se le debe realizar inmediatamente una transfusin de sangre del caballo sospechoso y debe controlarse el estado de sus anticuerpos y sus condiciones clnicas durante al menos 45 das. Generalmente, 125 ml del total de la sangre inyectada en vena es suficiente para demostrar la infeccin, pero, en algunos casos, puede ser necesaria la utilizacin de un volumen mayor de sangre (250 ml) o de los leucocitos lavados de dicha sangre. (5)

2.

Pruebas serolgicas

Debido a la persistencia del virus de la AIE en los quidos infectados, la deteccin serolgica de anticuerpos frente al virus de la AIE confirma el diagnstico de la infeccin por dicho virus.

a)

Prueba de inmunodifusin en gel de agar (prueba prescrita para el comercio internacional)

Los anticuerpos precipitantes se producen rpidamente como resultado de la infeccin por la AIE y se pueden detectar mediante la prueba AGID. Las reacciones especficas se indican por las lneas de precipitacin entre el antgeno de la AIE y el suero problema y se confirman por ser idnticas a la reaccin que se da entre el antgeno y el suero estndar positivo. Generalmente, en las primeras 23 semanas despus de la infeccin, los caballos presentarn reacciones serolgicas negativas. En algunos casos, el tiempo posterior a la infeccin previo a la aparicin de anticuerpos detectables puede durar hasta 60 das. Estn disponibles comercialmente reactivos para AGID de diversas compaas. Alternativamente, el antgeno AGID y el suero de referencia se pueden preparar como se describe a continuacin. Preparacin del antgeno

El antgeno especfico para la AIE se puede preparar a partir del bazo de caballos infectados experimentalmente con enfermedad aguda (6), del cultivo de tejidos de caballos infectados (10), de una lnea celular de timo canino con infeccin permanente (3) o de protenas recombinantes expresadas en bacterias o en baculovirus utilizando la tcnica del ADN recombinante (2,9). La preparacin del antgeno a partir de cultivos infectados o mediante la tcnica de ADN recombinante, proporciona un resultado ms uniforme que utilizando las clulas del bazo, y permite una mejor estandarizacin de los reactivos.

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Para obtener un antgeno satisfactorio a partir del bazo, debe infectarse un caballo con una cepa muy virulenta del virus de la AIE. El perodo de incubacin resultante debera durar entre 5 y 7 das, y el bazo debe recogerse 9 das despus de la inoculacin, cuando ms alto es el ttulo del virus y antes de que se produzca cualquier cantidad de anticuerpos precipitantes. La pulpa del bazo, sin diluir, se utiliza como antgeno en la prueba de inmunodifusin(6). La extraccin del antgeno del bazo con una solucin salina y una concentracin con sulfato amnico, no proporciona un antgeno tan satisfactorio como una seleccin de bazos con un ttulo alto del antgeno de la AIE. Alternativamente, se infectan clulas de rin fetal equino, clulas drmicas o clulas del timo canino con una cepa del virus de la AIE adaptado para crecer en cultivo de tejido (American Type Culture Collection). El virus se recoge de los cultivos por precipitacin con polietilenglicol al 8%, por confeccin en pellets o por ultracentrifugacin. El antgeno de diagnstico, p26, se separa del virus por tratamiento con detergente o ter. Las protenas del ncleo del virus de la AIE, expresadas en bacterias o baculovirus estn disponibles comercialmente y se utilizan como antgenos de alta calidad para el diagnstico serolgico. Existen evidencias de variacin de la cepa en la secuencia del aminocido p26; sin embargo no hay evidencias de que esta variacin influya en ninguna de las pruebas de diagnstico (19). La p26 es una protena estructural interna del virus que est codificada por el gen gag. Este gen es estable y no se han encontrado variaciones entre las cepas (11). Preparacin del antisuero estndar

Se debe recoger un antisuero positivo conocido procedente de un caballo previamente infectado con el virus de la AIE. Este suero debe producir una nica lnea de precipitacin densa, que es especfica para la AIE, tal como se ha demostrado mediante una reaccin idntica a la de un suero estndar conocido. Es esencial equilibrar las concentraciones de antgeno y de anticuerpos, con el fin de garantizar la sensibilidad ptima de la prueba. Las concentraciones del reactivo deben ajustarse para formar una lnea de precipitacin estrecha aproximadamente equidistante de los dos pocillos que contienen el antgeno y el suero. i) Procedimiento de la prueba (1, 6, 13) Las reacciones de inmunodifusin se llevan a cabo en una capa de agar en placas de Petri. Para placas de Petri de 100 mm de dimetro, se utilizan 1517 ml de agar Noble al 1%. Se perforan 6 pocillos en el agar en torno a un pocillo central del mismo dimetro. Los pocillos sern de 5,3 mm de dimetro y con una separacin de 2,4 mm. Cada pocillo debe contener el mismo volumen de reactivo. Se coloca el antgeno en el pocillo central y el antisuero estndar en uno de cada dos pocillos exteriores. Las muestras del suero problema se colocan en los tres pocillos restantes. Se mantienen las placas a temperatura ambiente en un ambiente hmedo. Transcurridas 2428 horas, se examinan las reacciones de precipitacin con un haz estrecho de luz oblicua e intensa frente a un fondo negro. Las lneas de referencia deben ser claramente visibles a las 24 horas y, en ese momento, cualquier suero problema que sea fuertemente positivo tambin puede haber formado lneas idnticas a las que se dan entre los reactivos estndar. Una reaccin positiva dbil puede tardar 48 horas en formarse, y se indica mediante una pequea inclinacin de la lnea de precipitacin del suero entre el pocillo del antgeno y el pocillo del suero problema. Los sueros con ttulos de anticuerpos de precipitacin altos, pueden formar bandas anchas de precipitina que tienden a extenderse. Tales reacciones pueden confirmarse como especficas de la AIE por dilucin al o antes del contraensayo; stas pueden ofrecer una lnea de identidad ms marcada. Los sueros libres de anticuerpos de la AIE no formarn lneas de precipitacin y no tendrn efecto sobre las lneas de reaccin de los reactivos estndar. Interpretacin de los resultados: Los caballos que estn en las primeras etapas de la infeccin pueden no dar una reaccin serolgica positiva en la prueba AGID. Tales animales deberan sangrarse de nuevo despus de 34 semanas. Con el fin de realizar un diagnstico en un potro joven, es necesario determinar el estado de los anticuerpos procedentes de la madre. Si la yegua posee algn anticuerpo de la AIE, entonces ser necesario un perodo de 6 meses o ms despus del nacimiento para que el anticuerpo materno disminuya; se somete al potro a una nueva prueba para determinar si una reaccin positiva inicial se debi al anticuerpo materno o a la infeccin.

ii) iii) iv)

v)

b)

Enzimoinmunoensayo
Existen tres tipos de ELISAue han sido aprobados por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos para el diagnstico de la anemia infecciosa equina y que estn disponibles internacionalmente; un ELISA competitivo y dos ELISAS no competitivos. El ELISA competitivo y uno de los ELISAs no competitivos detectan los anticuerpos producidos contra el antgeno proteico del ncleo p26. El otro ELISA no competitivo incorpora la protena del ncleo p26 y los antgenos gp45 (protena transmembrana vrica). Los protocolos del ELISA tpicos se utilizan en todas las pruebas. Si los materiales comerciales del ELISA

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no estn disponibles, puede emplearse un ELISA no competitivo utilizando antgeno p26 purificado procedente del material de cultivo de clulas (14). Un resultado positivo obtenido mediante ELISA debe comprobarse de nuevo utilizando la prueba AGID para confirmar el diagnstico, debido a que se han detectado algunos resultados positivos falsos mediante ELISA. Tambin se puede confirmar el resultado por la tcnica inmunobloting. Los Laboratorios de Referencia de la OIE tienen disponible un antisuero estndar para inmunodifusin que contiene una cantidad mnima de anticuerpo que debera detectarse en los laboratorios. (Vase el cuadro que aparece en la parte 3 de este Manual para Animales Terrestres). Se han publicado mtodos uniformes para el control de la AIE (17).

C. REQUISITOS PARA VACUNAS Y MATERIALES DE DIAGNSTICO

No existen productos biolgicos disponibles en estos momentos.

REFERENCIAS
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2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

10

11. MONTELARO R.C., PAREKH B., ORREGO A. & ISSEL C.J. (1984). Antigenic variation during persistent infection by equine infectious anaemia, a retrovirus. J. Biol. Chem., 16, 1053910544. 12. NAGARAJAN M.M. & SIMARD C. (2001). Detection of horses infected naturally with equine infectious anemia virus by nested polymerase chain reaction. J. Virol. Methods, 94, 97109. 13. PEARSON J.E. & COGGINS L. (1979). Protocol for the immunodiffusion (Coggins) test for equine infectious anaemia. Proc. Am. Assoc. Vet. Lab. Diagnosticians, 22, 449462.

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14. SHANE B.S., ISSEL C.J. & MONTELARO R.C. (1984). Enzymelinked immunosorbent assay for detection of equine infectious anemia virus p26 antigen and antibody. J. Clin. Microbiol., 19, 351355. 15. SUZUKI T., UEDA S. & SAMEJINA T. (1982). Enzymelinked immunosorbent assay for diagnosis of equine infectious anaemia. Vet. Microbiol., 7, 307316. 16. TOMA B. (1980). Rponse srologique ngative persistante chez une jument infecte. Rec. Med. Vet., 156, 5563. 17. UNITED STATES DEPARTMENT OF AGRICULTURE ANIMAL AND PLANT HEALTH INSPECTION SERVICE (2002). Equine Infectious Anemia Uniform Methods and Rules. http://www.aphis.usda.gov/oa/pubs/eiaumr.pdf 18. WEILAND F., MATHEKA H.D. & BOHM H.O. (1982). Equine infectious anaemia: detection of antibodies using an immunofluorescence test. Res. Vet. Sci., 33, 347350. 19. ZHANG W., AUYONG D.B., OAKS J.L. & MCGUIRE T.C. (1999). Natural variation of equine infectious anemia virus Gagprotein cytotoxic T lymphocyte epitopes. Virology, 261, 242252.

* * *

NB: Existe un laboratorio de referencia de la OIE para la Anemia infecciosa equina (ver Cuadro en la Parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar el sitio Web de la OIE para encontrar el listado ms actualizado: www.oie.int).

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