M1 Biologie-Santé BCGP & PPP

Compte-rendu de TP

“Identification d’une potentielle mutation sur le gène CFTR”

UE “Aspects Moléculaires des Pathologies d’origine Génétique”

Enseignant Cours : T.Berges

Enseignant TD/TP : T.Berges

Participants : Doriane GUION, Romane Cancouët

 I. Introduction

La mucoviscidose est une maladie génétique liée à l’altération du gène CF codant

pour la protéine CFTR (Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator). Il s’agit de
l'une des maladies génétiques létales les plus courantes. Cette pathologie se transmet selon un
mode autosomique récessif.

En France, chaque année, 200 enfants naissent atteints de la mucoviscidose. Environ 6000
français seraient concernés par cette pathologie.
Les progrès scientifiques ainsi qu’une meilleure prise en charge de cette pathologie
permettent aujourd’hui aux patients atteints de mucoviscidose d’atteindre une espérance de
vie moyenne allant de 40 à 50 ans.

La protéine CFTR est présente dans la membrane de différentes cellules muqueuses. Cette
protéine fonctionne comme un canal qui permet l'échange d'ions chlorure entre l'intérieur et
l'extérieur de la cellule. Par conséquent, lorsque le gène codant pour cette protéine est muté,
le canal est dysfonctionnel.
Dans le cadre de cette pathologie, près de 2000 mutations ont été décrites mais l’une des
mutations la plus fréquente chez les patients atteints de mucoviscidose est nommée Delta
F508. Il s’agit de la délétion d'une phénylalanine en position 508 au sein du premier domaine
de liaison aux nucléotides de la protéine CFTR nommé NBD1 (first nucleotide binding
domain). Ce domaine joue un rôle important dans la régulation du canal. Cette mutation
affecte le repliement de la protéine ou sa circulation intracellulaire et expose donc les patients
à une forme sévère de la maladie.

Cette mutation se traduit par une diminution de l'eau excrétée par les muqueuses, une
inflammation et un épaississement du mucus. La mucoviscidose affecte principalement la
fonction respiratoire, digestive et reproductive. Au niveau pulmonaire, les sécrétions épaisses
et visqueuses génèrent des infections, des lésions ainsi qu’une mauvaise oxygénation du sang
(1).

Dans le cadre de ces travaux pratiques, le contexte est le suivant:

Le premier enfant de la famille ROSSIGNOL est atteint de mucoviscidose. Ce dernier est
hétérozygote composite F508del/G542X. Le couple de la famille ROSSIGNOL s’apprête à
accueillir un deuxième enfant et du fait des antécédents familiaux, un test prénatal de
dépistage va donc être réalisé in utéro.

Afin d’effectuer le test prénatal de dépistage, sont donc mis à disposition un échantillon
d’ADN du fœtus « Fœtus Rossignol » (FR) pour le test de diagnostic et un échantillon
d’ADN contrôle d’une personne saine non porteuse de la mutation (WT).
 II. Matériel et méthodes

Le premier enfant de la famille ROSSIGNOL étant hétérozygote F508del/G542X, une série

de réactions PCR portera sur la région de l’exon 11 concernée par la mutation F508del (PCR
série A) et une seconde série de réactions PCR portera sur la région de l’exon 12 concernée
par la mutation G542X (PCR série B).

Amorces utilisées pour la PCR

● Mutation F508del

Les séquences des amorces « reverse » suivantes ont permis d’amplifier spécifiquement
l’allèle normal (DF-N) et l’allèle muté (DF-M) respectivement:

DF-N : 5’-AAGTATCTATATTCATCATAGGAAACACCACA-3’
DF-M : 5’-GTATCTATATTCATCATAGGAAACACCACT-3’

● Mutation G542X

Les séquences des amorces « reverse » suivantes ont permis d’amplifier spécifiquement
l’allèle normal G542 (GX-N) et l’allèle muté G542X (GX-M) respectivement:

GX-N : 5’-CTCAGTGTGATTCCACCTTCTAC-3’
GX-M : 5’-AAAATCTCAGTGTGATTCCACCTTCTAA-3’ (allèle muté : GGA>TGA)

Un écart de nombre de nucléotides est observé dans les deux cas ci-dessus entre l’amorce WT
et l’amorce mutée, ce qui a pour objectif d’augmenter la spécificité de l’amplification.

● Mutation G551D

Les amorces d’une mutation annexe a été demandée. Dans ce cas, une Glycine devient un
Aspartate car le codon GGT devient GAT.

WT : 5’-TTGCTCGTTGACCTCCACTC-3’

Muté : 5’-TTGCTCTTGATCTCCACTC-3’
 Méthode utilisée

Ces expérimentations sont réalisées selon le modèle d’un kit commercialisé par la société
Elucigene Diagnostics. Ce dernier permet de détecter des mutations du gène CF parmi celles
qui ont été décrites. Ce procédé repose d’une part sur l’utilisation simultanée de plusieurs
couples d’amorces distinctes (multiplexage de la PCR) et d’autre part sur l’utilisation
d’amorces fluorescentes. Ces réactions de PCR aboutiront à l’identification des mutations
présentes au sein de l’échantillon d’ADN du patient étudié, suite à une électrophorèse en
capillaire sur un appareil analyseur génétique (qui permet de connaître avec précision la taille
des fragments d’ADN).
Ce kit a dans ce cadre été adapté à notre expérimentation afin de ne caractériser que les deux
mutations auxquelles nous nous intéressons, à savoir F508del et G542X.
Afin de caractériser les mutations liées à la mucoviscidose, il est possible d’utiliser la
méthode “Amplification Refractory Mutation System” (ARMS). Cette dernière permet, grâce
à l’utilisation d’amorces de “Polymerase Chain Reaction” (PCR), l'amplification d’une forme
allélique spécifique. En effet, grâce à cette technique, l’ADN est amplifiée uniquement si
l’allèle ciblé est présent au sein de l’échantillon étudié. Ainsi, cette méthode permet d’établir
si l’allèle cible est présent ou non selon la présence ou l’absence d’un produit PCR à l’issue
de la réaction ARMS.
L’extrémité 3’ de l’amorce correspond à la variation allélique. Par conséquent, si l’amorce
correspondant à l’un des deux allèles est correctement apparié, la réaction d’amplification par
PCR est initiée (2).

Figure 1: Principe de la méthode “Amplification Refractory Mutation System”

(ARMS).

Échantillons et matériel mis à disposition

Pour réaliser l’ensemble des réactions, ont été mis à notre disposition un tube de 5 µL d’ADN
FR à 1 ng/µL et un tube de 5 µL d’ADN WT à 1 ng/µL.
Afin d'étudier la mutation F508del, nous possédions un tube de 3 µL d’amorce DF-C à 20
µM, un tube de 3 µL d’amorce DF-N à 20 µM et un tube de 3 µL d’amorce DF-M à 20 µM.
Concernant la mutation G542X, nous disposions d’un tube de 3 µL d’amorce 12HRA à 20
µM, un tube de 3 µL d’amorce GX-N à 20 µM et un tube de 3 µL d’amorce GX-M à 20 µM.
Enfin, nous étaient fournis un tube d’eau 300 µL destiné à la dilution des amorces, un tube de
60 µL de Master Mix 2x ainsi que 9 tubes PCR stériles de 0,2 mL à paroi fine et des pipettes
automatiques avec des pointes stériles adaptées.

Préparation des mélanges réactionnels

● PCR Série A

Concernant la PCR série A, trois mélanges réactionnels ont été préparés:

Le premier [A1] contenait de l’ADN FR ainsi que les amorces DF-C/DF-N/DF-M.

Le second [A2] contenait de était composé d’ADN WT et d’amorces DF-C/DF-N/DF-M.
Le troisième [A3] contenait de l’H2O ainsi que des amorces DF-C/DF-N/DF-M.

● PCR Série B

Pour la PCR série B, six mélanges réactionnels ont été réalisés:

Le premier [B1] était composé d’ADN FR et d’amorces 12HRA/GX-N.

Le deuxième [B2] contenait de l’ADN WT ainsi que des amorces 12HRA/GX-N.
Le troisième [B3] était composé d’H2O et d’amorces 12HRA/GX-N.
Le quatrième [B4] était formé d’ADN FR et d’amorces 12HRA/GX-M.
Le cinquième mélange [B5] a été réalisé à partir d’ADN WT et d’amorces 12HRA/GX-M.
Enfin, le sixième [B6] contenait de l’H2O ainsi que d’amorces 12HRA/GX-M.

Le kit « DyNAzyme II PCR Master Mix » a permis de réaliser les réactions PCR.

Des dilutions ont été effectuées afin d’obtenir:

- Une concentration finale des préparations d’ADN (FR et WT) dans le mélange
réactionnel de 0,1 ng/µL
- Une concentration finale des amorces dans le mélange réactionnel de 0.4 µM chacune

Le volume réactionnel total est de 10 µL.

Les réactions de PCR ont été effectuées dans des petits tubes de 0,2 mL à paroi fine et les
tubes ont été placés sur de la glace.
 Programmes PCR

Les programmes de PCR suivants ont été appliqués:

Programme PCR série A « ARMS65 » :

- 5 minutes à 94° puis 25 cycles comprenant 30 secondes à 94°C, 30 secondes à 65°C,
30 secondes à 72°C, puis 5 minutes à 72°C, puis 15° (infini).

Programme PCR série B « ARMS62 » :

- 5 minutes à 94° puis 28 cycles comprenant 30 secondes à 94°C, 30 secondes à 62°C,
30 secondes à 72°C, puis 5 minutes à 72°C, puis 15° (infini).

A l’issue de ces réactions PCR, les produits ont été analysés grâce à une électrophorèse en gel
d’agarose.

III. Résultats

Tout d’abord, des gels d’agarose ont été réalisés pour déterminer la présence ou
l’absence d’une mutation sur l’exon 11 de l’ARNm CFTR.

Figure 2 : Gel d’agarose pour déterminer s’il y a présence d’une mutation sur le gène
CFTR chez un patient. A : Gel d’un premier groupe réussi. ;B : Gel de notre groupe. C : Détail du
marqueur de taille.

Le gel réalisé par nos soins n’a pas abouti à un résultat concluant, probablement suite
à une mauvaise manipulation et une erreur de mélange au préalable. Par conséquent, un autre
gel à été utilisé pour l’analyse des résultats. Un signal est présent dans les deux premiers puits
à une taille relativement similaire aux alentours de 200 pb. Aucun signal n’est présent dans le
contrôle négatif comme attendu.

Ci dessous, sur la figure 3 présente une représentation schématique des résultats

possiblement obtenus lors du génotypage.
Figure 3 : Représentation schématique des résultats potentiellement obtenus lors du
génotypage. A : Le profil du WT ; B : Il s’agit du profil obtenu si le patient présente une mutation
hétérozygote ; C : Il s’agit du profil obtenu si le patient ne présente aucune mutation ; D : Il s’agit du profil
obtenu si le patient présente une mutation homozygote.

Ci-dessous, se trouvent les résultats obtenus grâce au génotypage.

Figure 4 : Génotypage de l’ARNm CFTR WT

Ici, de nombreux signaux sont observés. Les signaux orange sont des marqueurs
permettant de savoir où se trouve l’éventuelle délétion. De nombreux pics faibles sont
observés ainsi qu’un pic élevé, proche de la 212 ème base.
Figure 5 : Génotypage de l’ARNm CFTR du patient

Comme précédemment, les deux signaux orange permettent de s’orienter dans les
résultats. Un grand pic est observé, ainsi qu’un signal moyen, et un petit signal, proche de la
121ème base.

Concernant la seconde mutation, G542X, le résultat suivant est attendu, en figure 6.

Figure 6 : Résultats attendus pour les gels d’agarose, seconde mutation, G542X.

L’amorce pour la seconde mutation permet d’augmenter l’écart entre le WT et le

muté. Par conséquent, ici, un véritable changement peut être observé directement sur le gel
d’agarose, sans génotypage.

Malheureusement, les gels obtenus ne sont pas exploitables, du fait d’une confusion
entre le tampon et l’eau lors de la réalisation du gel d’agarose. L’analyse sera effectuée avec
la figure 6, qui représente les résultats attendus. Trois signaux sont observés, un dans le WT
et deux chez le patient.

IV. Discussion

Sur la figure 2, le panneau A présente un signal dans chaque puit WT et patient aux
alentours de 200pb. Ainsi, il y a bien détection de l’ARNm exon 11 de la protéine CFTR chez
le patient. Cependant, comme attendu, la résolution du gel d’agarose est trop faible. En effet,
il y a une différence de 5 nucléotides entre l’ARNm WT et l’ARNm muté, 3 dûes à la
délétion et 2 dûes à l’amorce qui est volontairement plus petite. La résolution ne permet donc
pas d’affirmer qu’il existe une différence entre la piste WT et la piste patient.

Ainsi, un génotypage à été effectué pour confirmer ou infirmer la présence d’une

mutation chez le patient.

Concernant le WT, sur la figure 4, il n’y a aucune anomalie puisque les signaux
oranges permettent de s’orienter. Le signal bleu le plus grand est l’ARNm de l’exon 11, et les
petits signaux sont sûrement des glissements de la part de l’ARN polymérase.

Pour ce qui est du patient, sur la figure 5, deux signaux sont observés : un grand
similaire au WT et un plus petit correspondant au signal de la mutation. Ainsi, le patient
présente un profil hétérozygote avec un allèle muté.

Ensuite, une seconde analyse grâce à un gel d’agarose est réalisée. Les résultats ne
sont pas présentés, suite à une erreur de manipulation. Ainsi, les résultats analysés
proviennent de la figure 6. La piste patient présente deux signaux dont un diffère, par sa taille
légèrement plus élevée, du signal dans la piste WT. Par conséquent, il semblerait que le
patient soit hétérozygote et présente une mutation au niveau de l’ARNm du gène CFTR de
l’exon 12.

V. Conclusion

L’ensemble des manipulations réalisées dans le cadre du test de dépistage prénatal

pour le second enfant de la famille ROSSIGNOL à venir ont permis de conclure que ce fœtus
présente bien une mutation du gène CFTR. En effet, cet enfant semble être hétérozygote et de
fait porter une mutation de type G542X au niveau de l’exon 12 du gène CFTR ainsi qu’une
mutation de type F508del au niveau de l’exon 11 du gène CFTR.

Bibliographie

(1) Unité 1078 Inserm/Université De Bretagne Occidentale/EFS, Équipe Génétique

Moléculaire Et Épidémiologie Génétique, Brest, & Férec, C. (2017, 11 juillet).
Mucoviscidose ⋅ Inserm, La science pour la santé. Inserm. Consulté
le 20 avril 2022, à l’adresse https://www.inserm.fr/dossier/mucoviscidose/
(2) Little, S. (1995). Amplification‐Refractory Mutation System (ARMS) Analysis of
Point Mutations. Current Protocols in Human Genetics, 7(1).
https://doi.org/10.1002/0471142905.hg0908s07