Produccin de Tubrculos-Semillas de Papa Manual de Capacitacin

Fascculo4.2

Cultivo de Tejidos para la Eliminacin de Patgenos con fines de Produccin de Semilla de Papa
Ana Panta, Ali Golmirzaie

Introduccin
Los patgenos vegetales, tales como nematodos, hongos, bacterias, micoplasmas, virus y viroides pueden ser transmitidos de plantas enfermas y plantas sanas de papa. Sin embargo, no todas as clulas resultan infectadas; los tejidos meristemticos se encuentran algunas veces libres de patgenos por lo que es posible recobrar plantas no infectadas mediante tcnicas de cultivo de meristemas in vitro, y lograr su crecimiento coma plantas sanas. La termoterapia, tratamiento de las plantas y temperaturas altas, tambin se aplica en la erradicacin de virus. Desde hace muchos aos se utiliza con xito en la erradicacin de virus de claveles, geranios, fresas y ctricos; para ella, las plantas son tratadas y temperaturas altas bajo condiciones de invernadero o cmara de crecimiento. Actualmente el mtodo estndar para erradicar virus en muchos cultivos propagados vegetativamente es la termoterapia combinada con el cultivo de meristemas.

S. Fasc. 4.2 - 97 1

CENTRO INTERNACIONAL DE LA PAPA (CIP)

Este documento describe los mtodos que pueden aplicarse para eliminar los patgenos del material infectado y producir plantas libres de patgenos, para la distribucin internacional y propagacin en programas de produccin de semillas de papa.

Naturaleza de los Patgenos

Los patgenos que afectan y la papa pueden ser transmitidos de plantas enfermas y plantas sanas por vectores y travs de la semilla. El tamao relativo de estos patgenos varia mucho. Entre los patgenos vegetales los nematodos son los ms grandes y pueden ser observados fcilmente con un microscopio estereoscpico. Los virus y viroides son los ms pequeos y se requiere de la ayuda de un microscopio electrnico para su observacin. La ocurrencia de una enfermedad no slo depende de la presencia del husped, sino tambin de las condiciones ambientales, especialmente la humedad y la temperatura que juegan un papel importante en el desarrollo de una enfermedad. La enfermedad, por tanto, puede definirse coma el producto de y interaccin del husped, el patgeno y el ambiente. La distribucin de los diferentes patgenos dentro de y planta enferma varia tambin mucha. Por ejemplo, Pseudomonas solanacearum, el virus del enrollamiento de la hoja de la papa (PLRV) y los micoplasmas estn restringidos al tejida vascular de una planta; Erwinia carotovora y el virus X de la papa (PVX), invaden tanto el tejido vascular coma el resto de los tejidos de la planta. No todas las clulas en una planta enferma llegan y ser infectadas con patgenos. Los tejidas meristemticos de la raz y brotes terminales de una planta infectada estn, algunas veces, libres de ellos. En algunas ocasiones, tal como sucede en la papa con el PVX y el TRV (Tobacco Rattle Virus), solamente la cpula y los primeros primordios foliares se encuentran libres de virus. Se desconoce la razn exacta de este problema; sin embargo, se cree que uno ms de los siguientes factores podran ser responsables de ello: Alta actividad metablica: Los virus se multiplican acompaando el curso del metabolismo del husped. Debido y la gran actividad metablica en las clulas meristemticas del husped, los virus no pueden tornar el control de la maquinaria biosinttica del mismo. Carencia de tejido vascular: Los virus se diseminan rpidamente y travs del sistema vascular. Los virus que se ubican tan solo en el floema (PLRV) no pueden invadir los tejidos meristemticos debido y la ausencia de diferenciacin celular. En esta zona meristemtica, los virus que infectan los tejidos no vasculares se diseminan de clula y clula y travs de los conductos intercelulares (plasmodesmos). Este es un proceso lento por lo quo resulta relativamente difcil que los virus infecten en su totalidad y las clulas que vienen dividindose rpidamente. Alta concentracin de auxinas: Los tejidos meristemticos de las plantas tienen una concentracin

S. Fasc. 4.2 - 97 2

CENTRO INTERNACIONAL DE LA PAPA (CIP)

ms alta de auxinas que los tejidos de otras partes de las mismas. Algunos autores indican que estas auxinas inhiben y multiplicacin de los virus.

Termoterapia
Experimentos llevados y cabo con huspedes y sus virus han demostrado que el tratamiento de plantas con temperaturas elevadas (termoterapia) lleva y una reduccin en la concentracin del virus en la planta (Kassanis, 1957; Quak, 1977]. Se han dado diferentes explicaciones para este fenmeno. Posiblemente no es solo una, sino una combinacin de ellas la responsable de y reduccin en la concentracin de virus. Entre estas explicaciones est la de la competencia entre las clulas del husped que se encuentran en proceso de rpida divisin y las partculas del virus por lugares de sntesis de cidos nucleicos y protenas lo cual puede llevar y un cambio en el balance entre la sntesis y degradacin de las partculas del virus. Otra es y del cido nucleico del virus, portador de su informacin gentica, este est protegido del ataque de enzimas degradantes por una cubierta compuesta de muchas subunidades de protena. A altas temperaturas, la unin entre estas subunidades se vuelve ms dbil, se pueden abrir aberturas temporales, y permitir el ataque de las nucleasas, lo que inactive al virus y disminuye la concentracin del mismo. La termoterapia ha sido aplicada y tubrculos de papa en reposo. Se ha observado una reduccin en la concentracin de virus, especialmente del virus del enrollamiento de la hoja (PLRV), habindose logrado eliminacin total de este virus, tan solo utilizando termoterapia. La termoterapia aplicada y la planta entera, al igual que y aplicada y tubrculos ya brotados, seguida por cultivo de meristemas, ha sido exitosamente utilizada para la eliminacin de muchos virus de y papa (StaceSmith y Mellor, 1970:Pennazio y Redolfi, 1973). En el procedimiento estndar empleado en el CIP, los mejores resultados se han obtenido cuando la planta es decapitada antes de ser tratada por termoterapia, y las yemas axilares se encuentran creciendo mientras reciben el tratamiento de calor Un rgimen de temperatura diana de 3600 por 16 horas, y 30 C por 8 horas. baja luz continua de alta intensidad (10000 lux = 108 mEm-2s-1) mejor las tasas de eliminacin de virus. Las plantas son mantenidas baja estas condiciones por cuatro semanas. Meristemas, tanto de las yemas axilares, coma de las yemas apicales, son aisladas y cultivadas coma se muestra ms adelante. La termoterapia antes descrita se puede aplicar y plntulas in vitro. Nudos (20 nudos/caja) con una yema se colocan en cajas de plstico (Magenta GA-7) que contienen medio semislido de propagacin (Espinoza, et al., 1991). Las cajas se incuban baja las condiciones antes reportadas (Espinoza, et al. 1991). Las cajas son selladas con cinta adhesiva cuando las plantas alcanzan aproximadamente 3 cm de altura y presentan un buen sistema radicular, sometindolas luego al tratamiento de termoterapia antes mencionado. Al cabo de un mes, los meristemas apicales se aislan y siembran en un medio de cultivo apropiado.

Cultivo de Meristemas
Debido y quo los tejidos meristemticos algunas veces se encuentran libros de patgenos, es posible recobrar plantas no infectadas mediante tcnicas de cultivo de meristemas in vitro, y mantenerlos hasta

S. Fasc. 4.2 - 97 3

CENTRO INTERNACIONAL DE LA PAPA (CIP)

obtener plantas adultas sanas. El cultivo de meristemas incluye un proceso de esterilizacin de superficie, la escisin y aislamiento del meristema, y su cultivo en un medio baja condiciones adecuadas. Cuando el material vegetal proviene de in vitro no es necesaria la esterilizacin de superficie. 1. Esterilizacin de superficie. Es necesaria esterilizar y superficie del material vegetal en case est, contaminada con patgenos y saprofitas dada que algunas de as contaminantes crecen rpidamente y pueden matar al tejido y rgano (explante) de la planta sembrada en un medio de cultivo. La mayora de las contaminantes de la superficie del tejida, pueden ser eliminados del material vegetal utilizando un agente esterilizador apropiada. Baja condiciones aspticas, la solucin esterilizadora normalmente se aplica por 10-15 minutas, sta es eliminada y el material vegetal lavado por agitacin en agua destilada estril 3 d 4 veces durante 5 minutas cada vez . El lavada es muy importante para eliminar el exceso del agente esterilizador el cual puede inhibir el crecimiento de la planta. Alcohol (etanol). Es un agente esterilizador comn de la superficie para eliminar bacterias y hongos. y frecuentemente es utilizada para un lavado breve (30) antes de aplicar otros tratamientos de esterilizacin de superficie. Tiene una baja tensin superficial por la cual puede penetrar fcilmente entre las pilosidades foliares y mojar la superficie de la planta. Etanol de 70% es ms efectiva cama agente esterilizador que el de 95-100%. Hipoclorito de sodio o de calcio. La superficie del material vegetal tambin puede ser esterilizada con soluciones acuosas de hipoclorito de sodio (NaOCl) y de hipoclorito de calcio (CaOCl). La sal de calcio es preferida porque es menos fitotxica. Muchas laboratorios utilizan leja (hipoclorito de sodio) de uso domstico tal como el Clorox. Estas productas comerciales contienen normalmente 5,25% de NaOCl coma producta active. Cuando se es diluye con agua (1 parte de leja 9 partes de agua), la solucin esterilizadora resultante debe contener no menos de 05% de NaOCl. Debido y la disociacin completa, el hipoclorito tiene una actividad relativamente baja y un pH superior y 8,0 y es ms efectiva fijando la solucin y alrededor de pH 6,0. La superficie del tejido recientemente disecado y sumergido completamente en la solucin de hipoclorito (de Ca Na), queda esterilizada despus de una exposicin de 10-15 minutes. Luego del tratamiento con hipoclorito, el material tratado debe ser lavada cuidadosamente con varios cambios de agua destilada, para eliminar completamente el desinfectante. Bicloruro de mercurio. El bicloruro de mercurio (HgCl2) ha sido utilizado coma desinfectante pese y que es extremadamente toxica. La solucin de bicloruro de mercurio es voltil y temperatura ambiente y puede provocar un envenenamiento por mercurio. Por lo tanto: no recomendamos su uso como agente esterilizador! Bactericidas y fungicidas. Para material altamente contaminado, se recomiendan el lavado en una mezcla

S. Fasc. 4.2 - 97 4

CENTRO INTERNACIONAL DE LA PAPA (CIP)

comercial bactericida / fungicida antes de proceder a la esterilizacin de su superficie. Debe recordarse, sin embargo, que este tratamiento no tiene efecto sobre infecciones sistmicas. 2. Aislamiento y cultivo de meristemas. El meristema es el punto activo de crecimiento del pice de la planta. Es una zona pequea compuesta de clulas (meristemticas) dividindose rpidamente. El domo de la yema apical contiene las verdaderas clulas meristemticas V est rodeada por primordios foliares y hojas primarias. Debido a que los tejidos vasculares ms diferenciados se encuentran alejados de los meristemas (hacia los tejidos ms viejos del tallo), los elementos vasculares de los primordios foliares son incipientes, y no han hecho an contacto con la parte principal del sistema vascular en el tallo. Por lo tanto, las partculas de virus que puedan estar presentes en el sistema vascular, pueden llegar a la zona meristemtica del pice slo movindose lentamente de clula en clula. Esta es una de las razones principales del porqu, en una planta infectada la concentracin de los virus disminuye desde la base hacia los meristemas tanto del pice como de las yemas axilares. El aislamiento del punto meristemtico en condiciones aspticas y su cultivo en un medio nutritivo asptico, permite el desarrollo de plntulas. El desarrollo del meristema en condiciones in vitro se lleva acabo en forma similar al que se realiza en una planta normal. Las clulas del meristema se dividen y continua la diferenciacin de tejidos nuevos. La nutricin de los tejidos de la seccin disecada es proporcionada por el medio artificial. La diseccin asptica del meristema es un proceso delicado y requiere muchas horas de prctica.

S. Fasc. 4.2 - 97 5

CENTRO INTERNACIONAL DE LA PAPA (CIP)

3. Escisin de meristemas:
Bajo un microscopio binocular de diseccin, se eliminan las hojuelas que rodean el punto de crecimiento hasta que solamente quede la cpula de la yema apical y unos cuantos primordios foliares (generalmente dos).

4. Cultivo del meristemas:

La cpula y dos primordios foliares se disecan y transfieren a! medio de cultivo de meristemas. El meristema disecado se transfiere semanalmente a medio fresco. Despus de 6-8 semanas de cultivo se obtienen plntulas, las cuales deben ser micro propagadas para su indexacin. El medio de cultivo utilizado para este trabajo esta basado en las sales de Murashige y Skoog (1962) y

S. Fasc. 4.2 - 97 6

CENTRO INTERNACIONAL DE LA PAPA (CIP)

suplementado con 2 mg/L de glicina, 0.5 mg/L de cido nicotnico 0.5 mg/L de piridoxina, 0.4 mg/L de tiamina, 0.1 mg/L de cido giberlico, 0.04 mg/L de kinetina y 2.5 % de sacarosa. El medio es gelificado con agar (0.6%) y se esteriliza en autoclave a 15 lb de presin, 12100, durante 15 minutos.

5. Pruebas de indexacin:
Las plantas desarrolladas a partir de meristemas, son probadas para detectar cualquier infeccin persistente de virus. En el CIP las pruebas que se realizan son: NASH para la deteccin de PSTVd, prueba serolgica de ELISA y prueba de plantas indicadoras (International Potato Center, 1993). La bsqueda de partculas virales mediante el microscopio electrnico se realiza en forma opcional. Todas estas pruebas se pueden realizar en un periodo de 2 meses.

Usa de Antibiticos
En cultivo de tejidos vegetales, los antibiticos solo son empleados cuando los microorganismos no pueden ser eliminados par otros mtodos. Estos compuestos son caros y no existe ninguno que ser efectivo para controlar todos los organismos contaminantes. Antes de decidir utilizar antibiticos se recomienda eliminar todas las posibles fuentes de contaminacin (Reed and Tanprasert, 1995). Las siguientes combinaciones de antibiticos se han aplicado con xito en cultivo de tejidos de plantas: Cefotaxime, Gentainicina, Rifampicina, Nystatina + Carbenicilina, Gentamicina + Amphotericina B, Vancomicina HCI + Mycostatin and Streptoinicina + Carbenicilina. Existen reportes de toxicidad causada en algunos cultivos par: Penicilina, Estreptomicina, Bactericina y Sparsomicina (Lizrraga et al., 1991]. En el dR las infecciones con bacterias y levaduras pueden ser eliminadas satisfactoriamente. Para ella los productos antibiticos son aadidos al medio de cultivo a las concentraciones que se indican a continuacin. Para bacterias se utiliza Rifampicina (Rimactan 300-) a una concentracin de 60 mg/L, 0 Cefatoxime sdica (Claforan) 200 mg/L. Cefatoxine (Mefoxin) tambin puede ser utilizado a la concentracin de 200 mg/L. Cuando la infeccin es con levaduras se aade al medio de cultivo 0.25 a 0.5 mg/L. de Amphotericin B.

Bibliografa

CIAT (Centro International de Agricultura Tropical). 1991. Cultivo de tejidos en la Agricultura: Fundamentos y aplicaciones. Roca, W. M. y Mroginski, L. A. feds.) Cali, Colombia. p. xii, 970. Espinoza, N.; Lizarraga, R.; Siguenas, C.; Buitrn, F.; Dodds, J.H. 1991. Cultivo de tejidos: Micro propagacin, conservacin y exportacin de germoplasma de papa. Gua de investigacin CIP 1. Centro Internacional de la Papa. Lima, Per. 19 p. Griffiths, H.M., S.A. Slack and .I. H. Dodds. 1990. Effect of chemical and heat therapy on virus

S. Fasc. 4.2 - 97 7

CENTRO INTERNACIONAL DE LA PAPA (CIP)

concentrations in vitro potato plantlets. Can. J. Bot. 68: 1515-1521. Kassanis, B. 1957. The use of tissue culture to produce virus free clones from infected potato varieties. Annals of Applied Biology 45: 422-427. International Potato Center (CIP). 1993. Basic techniques in plant virology. Jayashinge, U., Salazar, L. F. feds.). CIP Lima. (Technical Training Unit 1). Lizarraga, R., A. Panta, U. Jayashinge, y J.H. Dodds. 1991. Tissue culture for elimination of pathogens. DIP Research Guide 3. International Potato Center (CIP), Lima, Per. Lizrraga, R.E.; Salazar, L.F.; Roca, W.H.; Schilde-Rentscheler, L. 1980. Elimination of potato spindle tuber viroid by low temperature and meristem culture. Phytopathology 70: 754-755. Lizrraga, R.E.; Salazar, L.F. 1962. Effect of meristem size on eradication of potato spindle tuber viroid. pp. 118-119. In Hooker, W.J. fed.). Research for the potato in the year 2000. International Potato Center, Lime, Peru. 199 pp. Mellor, F. C. and R. Stace-Smith. 1977. Virus -free potatoes by tissue culture. In: Plant Cell, Tissue, and Organ Culture; edited by J. Reinert and Y.PS. Bajaj. Springer-Verlag. Berlin Heidelberg New York. pp. 6 16635. Morel, G.M.; Martin, C. 1952. Guerison de dahlias atteints dune maladie virus. Comptes rendus hebdomaire des seances de IAcademie des Sciences, Paris. 235: 1324-1325. Murashige, T.; Skoog, F.C. 1962. A revised medium for rapid growth and bioessays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15: 473-497.

S. Fasc. 4.2 - 97 8

CENTRO INTERNACIONAL DE LA PAPA (CIP)