UNIVERSIDADDESANTIAGODECOMPOSTELA FacultaddeQumica DepartamentodeQumicaAnaltica,NutricinyBromatologa InstitutodeInvestigacinyAnlisisAlimentario

DESARROLLODEMETODOLOGAANALTICAPARALA DETERMINACINDETRICLOSNYPARABENES. APLICACINALESTUDIODESUDISTRIBUCINY TRANSFORMACINENMUESTRASAMBIENTALES

MDELPILARCANOSARODRGUEZ MemoriaparaoptaralgradodeDoctoraenQumica SantiagodeCompostela,Octubre2008

D.AlbertoCepedaSez,CatedrticodeUniversidadyDirectordelDepartamentodeQumicaAnaltica, NutricinyBromatologadelaUniversidaddeSantiagodeCompostela, Informa: Que la memoria titulada DESARROLLO DE METODOLOGA ANALTICA PARA LA DETERMINACIN DE TRICLOSN Y PARABENES. APLICACIN AL ESTUDIO DE SU DISTRIBUCIN Y TRANSFORMACIN EN MUESTRAS AMBIENTALES, para optar al grado de Doctora en Qumica que presenta Da. Mara del PilarCanosaRodrguez,hasidorealizadabajoladireccindelosProfesoresTitularesD.IsaacRodrguez Pereiro y Da. Elisa Mara Rub Cano, en el Departamento de Qumica Analtica, Nutricin y BromatologadelaFacultaddeQumicadelaUniversidaddeSantiagodeCompostela. Yparaqueasconste,firmoelpresenteinformeenSantiagodeCompostela,Octubrede2008. D.AlbertoCepedaSez

D. Isaac Rodrguez Pereiro y Da. Elisa Mara Rub Cano, Profesores Titulares del Departamento de QumicaAnaltica,NutricinyBromatologadelaUniversidaddeSantiagodeCompostela, Autorizan: A la licenciada Da. Mara del Pilar Canosa Rodrguez la presentacin de la memoria titulada DESARROLLO DE METODOLOGA ANALTICA PARA LA DETERMINACIN DE TRICLOSN Y PARABENES. APLICACINALESTUDIODESUDISTRIBUCINYTRANSFORMACINENMUESTRASAMBIENTALES,que harealizadobajosudireccinenelDepartamentodeQumicaAnaltica,NutricinyBromatologadela Facultad de Qumica de la Universidad de Santiago de Compostela, para optar al grado de Doctora en Qumica. Yparaqueasconste,firmamoselpresenteinformeenSantiagodeCompostela,Octubre2008. D.IsaacRodrguezPereiro Da.ElisaMRubCano

Agradece a la llama su luz, pero no olvides el pie del candil que, constante y paciente, la sostiene en la

sombra. Rabindranath Tagore.

AGRADECIMIENTOS

Quisieramostrarmigratitudenestasbreveslneasaaquellosquehanhechoposibleesta TesisDoctoral. AgradeceralDepartamentodeQumicaAnaltica,NutricinyBromatologayalInstitutode Investigacin y Anlisis Alimentario, as como a D. Rafael Cela Torrijos, director del grupo de investigacindeCromatografayQuimiometradelDepartamentodeQumicaAnaltica,Nutriciny Bromatologa de la Universidad de Santiago de Compostela, los medios proporcionados para la realizacin de este trabajo. Asimismo, al Gobierno de Espaa, la Xunta de Galicia y fondos FEDER (proyectosDGICTCTQ200603334yPGIDIT06PXIB237039PR),yalMinisteriodeCienciaeInnovacin porlabecaFPUdisfrutadadurantelarealizacindeestaTesisDoctoral. Mi ms sincero agradecimiento a D. Isaac Rodrguez Pereiro y Da. Elisa Rub Cano, directoresdeestetrabajo.GraciasIsaacportupaciencia,tuapoyoylosconocimientoscompartidos. AElisa,tusnimos,tuayudaincondicionalylaslargascharlasenpocasdedesnimo. GraciastambinamiscompaerosdelIIAA,alosqueyanoestn,alosquesiguenestando yalosqueacabandellegar.Agradecerespecialmenteaaquellosquehancontribuidodealgnmodo enlarealizacindeestetrabajo. A Da. Mara Teresa Tena Vzquez de la Torre, profesora titular del departamento de Qumica Analtica de la Universidad de La Rioja, por facilitarme la estancia en su grupo de investigacin durante el periodo SeptiembreDiciembre de 2006. Gracias Teresa por tus sabios consejosyporhacermeverquelascosas,tardeotemprano,siempresevenrecompensadas. Especialmencinaloschicosdellaboratorio5,porsucarioysuamistad,porlasnochesde laLaurel,yporarrancarmeunasonrisaenlosmomentosdemorria. Amifamilia,amigos,yenespecialaNachoporsucomprensinyapoyoduranteestelargo periodo,aellosvadedicadaespecialmenteestaTesis.

 Amifamilia ANacho

 NDICE

ndice

NDICE JUSTIFICACINYOBJETIVOS. CAPTULOI. I.TRICLOSNYCOMPUESTOSRELACIONADOS. 1.1.Definicin,estructuraypropiedadesdeltriclosnycompuestosrelacionados.. 1.2.Aplicaciones.. 1.3.Toxicidad. 1.4.Distribucinenelmedioambiente.. 1.5.Productosdetransformacindeltriclosn. 1.5.1.Closanospolicloradosyclorofenoles.. 1.5.2.Dioxinas 1.5.3.Metiltriclosn.. II.PARABENES 2.1.Definicin,estructuraypropiedadesdelosparabenes. 2.2.Aplicaciones.. 2.3.Toxicidad. 2.4.Distribucinenelmedioambiente.. 2.5.Productosdetransformacindelosparabenes. 2.5.1.cidophidroxibenzoico. 2.5.2.Productosdehalogenacin.. III.METODOLOGAANALTICA 3.1.Preparacindemuestraparamatricesacuosas. 3.1.1.Extraccinlquidolquido(LLE).. 3.1.2.Extraccinenfaseslida(SPE) 3.1.3.Microextraccinenfaseslida(SPME). 1 5 7 7 8 9 11 17 17 18 20 21 21 22 23 24 26 26 26 27 27 27 28 31

3.2.Preparacindemuestraparamatricesslidas. 36

ndice

3.2.1.Extraccinasistidapormicroondas(MAE).. 36 3.2.2.ExtraccinSoxhlet. 38 3.2.3.Dispersindelamatrizenfaseslida(MSPD)................................................ 39 3.2.4.Extraccincondisolventespresurizados(PLE). 40 3.2.5.Ultrasonidos(US) 42

3.3.Derivatizacin 43 3.3.1.Derivatizacinenmediohomogneo. 43 3.3.2.DerivatizacincombinadaconSPME.. 45 3.3.3.Usodeagentessililantescomoreactivosdederivatizacin 46

3.4.Determinacin.. 48 3.4.1.Cromatografadegases. 48 3.4.2.Cromatografadelquidos 50 53

CAPTULOII

I.MEDIOSEXPERIMENTALESGENERALES.. 55 1.1.Compuestosymaterialesutilizados. 55 1.1.1.Reactivosydisolventes 1.1.2.Patrones. 1.1.3.AdsorbentesparaSPEyfibrasdeSPME.. 55 55 56

1.2.Instrumentacin. 56 1.2.1.Materialgeneraldelaboratorio. 1.2.2.Equiposdeextraccinutilizados 1.2.3.Programasinformticos.. 1.2.4.SistemasGCMS 1.3.Preparacindepatrones. II.METODOLOGADESARROLLADA 2.1.Protocolosdepreparacindemuestra. 56 57 57 57 58 59 59

II

ndice

2.1.1.Determinacindetriclosnysusderivadosenmuestrasacuosasmediante extraccinenfaseslida 59 2.1.2.Determinacindetriclosnysusderivadosenmuestrasacuosasmediante microextraccinenfaseslida. 60 2.1.3.Determinacindederivadosdelcidoparahidroxibenzoicoenmuestras deaguamedianteextraccinenfaseslida 61

2.1.4.Determinacindemetilparaben,etilparaben,propilparaben,butilparaben ybencilparabenenmuestrasacuosasmediantemicroextraccinenfaseslida. 62 2.1.5.Determinacindetriclosnyclorofenolesrelacionadosenmuestrasde sedimentosylodosdedepuradoramedianteextraccinasistidapormicroondas. 63 2.1.6.Extraccinconjuntadetriclosn,metil,etil,propilybutilparabenen muestrasdepolvomedianteextraccincondisolventespresurizados.. 64

2.1.7.Extraccinconjuntadetriclosn,metil,etil,propilybutilparabenen muestrasdepolvomediantedispersindelamatrizenfaseslida.. 65 2.1.8.Determinacindetriclosnymetiltriclosnenmaterialbiolgico medianteMSPD 66 2.2.Condicionesdedeterminacin 2.2.1.GCMS.. 67 67

2.2.2.GCMS/MS. 68 CAPTULOIII 71

I. DETERMINACIN DE TRICLOSN Y SUS DERIVADOS EN AGUA MEDIANTE MICROEXTRACCINENFASESLIDA 73 1.1.Introduccin. 73

1.2.Experimentosprevios. 74 1.2.1.Identificacincromatogrfica. 1.2.2.EvaluacindelaviabilidaddelmuestreomedianteSPMEcon derivatizacinonfiber 1.3.OptimizacindelprocesodeSPMEconderivatizacinonfiber. 74 77 78

III

ndice

1.3.1.Mododemuestreo. 1.3.2.Comparativadedistintasfases.. 1.3.3.OptimizacindelascondicionesdemuestreoconpoliacrilatoyPDMS DVB:Influenciadelaagitacin,fuerzainicadelmedioypH 1.3.4.Volumendemuestra 1.3.5.Tiempodeextraccin..

78 79 81 83 84

1.3.6.Optimizacindelascondicionesdederivatizacin.. 86 1.3.7.Evaluacindelosefectosmemoria. 89 1.3.8.Efectosdematriz. 1.4.Caracterizacindelmtodoanaltico. 1.4.1.Linealidad.. 90 91 91

1.4.2.Lmitesdecuantificacin. 92 1.4.3.Repetibilidaddelproceso.. 1.4.4.ExactituddelmtododeSPME.. 93 93

II. DETERMINACIN DE PARABENES EN AGUA MEDIANTE MICROEXTRACCIN EN FASE SLIDA... 95 2.1.Introduccin 2.2.Experimentosprevios 2.2.1.Eleccindelagentesililanteyestudiospreliminaresderepetibilidad.. 2.2.2.Identificacincromatogrfica. 2.3.OptimizacindelprocesodeSPMEconderivatizacinonfiber. 2.3.1.RecubrimientodelafibradeSPME. 2.3.2.Fuerzainicadelmedio.. 95 95 95 98 100 100 101

2.3.3.pHyvolumendemuestra.. 102 2.3.4.Mododemuestreoyagitacin.. 2.3.5.Tiempodeextraccin 2.3.6.Optimizacindelascondicionesdederivatizacinonfiber. 104 105 106

IV

ndice

2.3.7.Evaluacindelosefectosmemoria. 2.3.8.Efectosdematriz. 2.4.Caracterizacinanalticadelmtodopropuesto 2.4.1.Linealidad.. 2.4.2.Lmitesdecuantificacindelmtodo 2.4.3.Repetibilidaddelmtodo.. 2.4.4.ExactituddelprocesodeSPME.

108 109 110 110 111 112 113

III. ESTUDIO DE LA FORMACIN DE DERIVADOS HALOGENADOS DEL TRICLOSN Y PARABENESENAGUACLORADA. 115 3.1.Introduccin. 3.1.1.Antecedentesbibliogrficos. 3.1.2.Concentracindelasmuestras.. 3.1.3.Preparacindelamuestraparaelestudiodehalogenacin 3.1.4.Medidadelclorolibreenaguasdegrifo. 3.1.5.Valoracindeladisolucindehipoclorito. 115 115 118 121 121 121

3.1.6.Clculodeltiempodevidamedia. 122 3.2.Condicionesinstrumentalesdemedida 123

3.3. Extraccin en fase slida con derivatizacin en medio homogneo de triclosn y compuestosrelacionados. 128 3.3.1.Optimizacindelascondicionesdederivatizacinenmediohomogneoy estabilidaddeloscompuestossililados.. 3.3.2.OptimizacindelprocesodeSPEparamuestrasacuosas.. 128 130

3.3.2.1.Volumendeelucinyvolumendecorte. 130 3.3.2.2.Matricescomplejas:filtracinypurificacindeextractos. 132

3.3.3.Caracterizacindelmtodoanaltico. 134 3.3.3.1.Caracterizacindelmtododedeterminacin(GCMS):linealidad, repetibilidadylmitesdecuantificacin. 135

ndice

3.3.3.2.Exactitud,precisinylmitesdecuantificacindelmtodoanaltico

135

3.4. Extraccin en fase slida con derivatizacin en medio homogneo para la determinacindeparabenesenmuestrasdeagua 137 3.4.1.Optimizacindelascondicionesdederivatizacinenmediohomogneoy estabilidaddeloscompuestossililados 137 3.4.2.OptimizacindelprocesodeSPEparamuestrasacuosas.. 3.4.2.1.Volumendeelucindeloscartuchosyvolumendecorte. 3.4.2.2.Matricescomplejas:Purificacindelosextractos 139 140 140

3.4.3.Caracterizacindelmtodoanaltico. 141 3.4.3.1.Caracterizacindelmtododedeterminacin(GCMS):linealidad, repetibilidadylmitesdecuantificacininstrumentales 3.4.3.2.Exactitud,precisinylmitesdecuantificacindelmtodoanaltico 3.5.Halogenacindeltriclosn. 3.5.1.Pruebaspreliminares. 3.5.2.EstudiodedegradacinadistintospHsyconcentracionesdeclorolibre 3.5.3.Cinticasdecloracinenaguaultrapura 3.5.4.Identificacindelosproductosdetransformacin. 3.5.5.Evolucintemporaldelosproductosmayoritarios. 3.5.6.Estudiosdecloracinenaguadegrifo. 3.5.7.Presenciadecompuestoshalogenadosenmuestrasreales. 3.6.Halogenacindeparabenes.. 3.6.1.Pruebaspreliminares. 142 143 145 145 146 147 148 153 156 157 159 159

3.6.2.DegradacinadistintospHsyconcentracionesdeclorolibreenagua ultrapura... 159 3.6.3.Cinticasdehalogenacinenaguaultrapurayaguadegrifo.. 3.6.4.Identificacindelosproductosdetransformacin:Parabenescloradosy Bromados.... 160 162

3.6.5.Evolucintemporaldelosderivadoscloradosdelosparabenes 170

VI

ndice

3.6.6.Formacindederivadoshalogenadosdelosparabenesenaguadegrifo encontactoconproductosdecuidadopersonal. 3.6.7.Presenciadeparabeneshalogenadosenmuestrasreales.

172 174

IV. APLICACIN DE LAS METODOLOGAS DESARROLLADAS A LA DETERMINACIN DE TRICLOSN, COMPUESTOS RELACIONADOS Y PARABENES EN AGUAS RESIDUALES Y SUPERFICIALES 177 4.1.Triclosnycompuestosrelacionados. 177

4.2.Parabenes 182 Anexo 187 CAPTULOIV.. 189 I. DETERMINACIN DE TRICLOSN Y CLOROFENOLES EN MUESTRAS DE SEDIMENTO Y LODOMEDIANTEEXTRACCINASISTIDAPORMICROONDAS. 191 1.1.Introduccin.. 191 1.2.Experimentosprevios. 193 1.2.1.ViabilidaddelaextraccindeTCS,2,4DCFy2,4,6TCFdemuestrasde lodosmedianteMAE. 193 1.2.2.Identificacincromatogrfica(GCMS/MS) 195 1.3.Estrategiadepurificacindelosextractos.. 197 1.4.Optimizacindelascondicionesdeextraccinasistidapormicroondas.. 200 1.4.1.Temperatura,disolvente,volumendedisolventeyagitacin.. 200 1.4.2.Optimizacindelvolumendeextractante,proporcinmetanol:acetonay modificadororgnico 202 1.5.Caracterizacindelmtodoanaltico.. 205 1.5.1.Caracterizacindelmtododedeterminacin(GCMS/MS):linealidad, repetibilidadyLOQs.. 205 1.5.2.Exactitud,precisinylmitesdecuantificacindelmtodoanaltico. 206 1.6.Aplicacinalanlisisdemuestrasreales.. 209

VII

ndice

CAPTULOV 211 I.DETERMINACINCONJUNTADETRICLOSNYPARABENESENMUESTRASDEPOLVO 213 1.1.Introduccin. 1.2.Condicionesexperimentalesdemedida.. 213 215

1.3.Extraccincondisolventespresurizados.. 216 1.3.1.Estrategiadepurificacin.. 216

1.3.2.Optimizacindelascondicionesdeextraccin.. 220 1.3.2.1.Disolventedeextraccin 220

1.3.2.2.Temperatura,tiempoymasadecoadsorbente 221 1.3.2.3.Ciclosdeextraccin 225 1.3.3.Optimizacindelascondicionesdederivatizacin.. 226 1.3.4.Caracterizacindelmtodoanaltico. 227 1.3.4.1.Caracterizacindelmtododedeterminacin(GCMS/MS):linealidad, repetibilidadyLOQs. 1.3.4.2.Exactitud,precisinylmitesdecuantificacindelmtodoanaltico 228 229

1.4.Extraccinmediantedispersindelamatrizenfaseslida 231 1.4.1.Optimizacindelascondicionesdeextraccin.. 231 1.4.1.1.Eleccindelcoadsorbente.. 231 1.4.1.2.Disolventedeelucin 232 1.4.1.3.Optimizacindelamasadedispersante,disolventedeeluciny Volumen 234 1.4.1.4.Masadecoadsorbenteyvolmenesdedisolventesdelavadoyelucin.. 236 1.4.2.Optimizacindelascondicionesdederivatizacinenacetonitrilo.. 238 1.4.3.Caracterizacindelmtodoanaltico. 240 1.4.3.1.Caracterizacindelmtododedeterminacin(GCMS/MS):linealidad, repetibilidadyLOQs. 1.4.3.2.Exactitud,precisinylmitesdecuantificacindelmtodo. 240 241

VIII

ndice

1.5.Anlisisdemuestrasreales 243 CAPTULOVI. 245

I. DETERMINACIN DE TRICLOSN Y METILTRICLOSN EN MUESTRAS DE MATERIAL BIOLGICO.. 247 1.1.Introduccin. 247

1.1.1.Antecedentesbibliogrficos. 247 1.1.2.Determinacindecontenidograsodelasmuestras.MtodoBligh&Dyer.. 250

1.1.3.Condicionesinstrumentalesdemedida 251 1.2.MSPDconretencindelpidos 253 1.3.MSPDconeliminacindelpidos 257 1.3.1.Porcentajedecidosulfricoenelcoadsorbente.. 258 1.3.2.Tipoyvolumendeextractante.. 1.3.3.EstabilidaddeTCSyMTCSenlasmuestrasconadicin.. 1.4.Caracterizacindelmtodoanaltico. 1.4.1.Caracterizacindelmtododedeterminacin(GCMS/MS):linealidad, repetibilidadyLOQs. 259 260 261 262

1.4.2.Exactitud,precisinylmitesdecuantificacindelmtodoanaltico. 262 1.5.Aplicacindelametodologadesarrollada. 264 CONCLUSIONES.. 267 BIBLIOGRAFA.. 273 ACRNIMOS. 287

IX

JUSTIFICACINYOBJETIVOS

Justificacinyobjetivos

JUSTIFICACINYOBJETIVOS Hastamediadosdelosaos90,unnmerocrecientedecompuestosorgnicosconelevada toxicidad, muy estables qumicamente y con carcter bioacumulativo, como los PCBs, dioxinas, diversospesticidas,etc,fueronincluidosenlaslistasdecontaminantesorgnicospersistentes(POPs) y sometidos a intensos programas de monitorizacin, a la vez que se desarrollaron las distintas legislacionesenreferenciaalosnivelesmximosemitidosypermitidosenelmedioacutico. Apartirdeestemomento,enlosestudiosmedioambientales,sehaempezadoaconsiderar otro tipo de sustancias, denominados contaminantes emergentes, como son los productos farmacuticos y de cuidado personal (PPCPs) [Loos R; 2003][Petrovi M; 2003]. Un contaminante emergente corresponde, en muchos casos, a un compuesto no regulado, el cual es un futuro candidatoparaunaposteriorregulacin,dependiendodesusefectospotencialessobrelasaludyel medioambiente[BarcelD;2003].Losproductosdecuidadopersonalincluyenunamplionmero de compuestos, como, por ejemplo, frmacos, esteroides y hormonas, fragancias, estabilizantes, antispticos,Lacaractersticaprincipaldeestoscompuestosesquenoprecisanserpersistentesen el medio ambiente para ejercer efectos negativos, ya que su continua descarga, compensa la eliminacin y transformacin de los mismos. La introduccin de PPCPs en el medio ambiente provienededistintasvas: Enlamayoradeloscasos,latoxicidaddeestoscompuestosesbaja,sinembargopueden serprecursoresdeotrasespecies,consideradoscontaminantesprioritarios,comoporejemplolas dibenzopdioxinas policloradas o sustancias cloradas aromticas [Arnold WA; 2003][Hell K; 2000][TixierC;2002].Adems,lapresenciaconstantedeantibiticos,frmacos,bactericidas,etc,en el medio ambiente ha provocado el desarrollo de cepas bacterianas resistentes a dichos agentes, malformaciones de los rganos sexuales en animales, cambio de sexo en los peces y descenso de fertilidad en humanos [http:www.ayaba.es/diario]. Incluso algunos autores han puesto de manifiesto la posible relacin entre ciertos tipos de cncer y el uso de estos compuestos en productosdecuidadopersonal[DarbrePD;2004]. 3 Descargasdeaguasresiduales(tratadasynotratadas)enrosymares. Frmacosexcretadossinmetabolizar. Jabones, desinfectantes, etc, que se vierten directamente a los ros y mares [Kanda R; 2003][AgeraA;2003][ArnoldWA;2003]. Empleo de aerosoles y otros preparados en actividades cotidianas de aseo y limpieza del hogar.

Justificacinyobjetivos

Lacontinuaintroduccindeestassustancias,aparentementeinocuas,ascomolosescasos controles medioambientales de los mismas, hace necesario el desarrollo de una serie de metodologasanalticasquepermitanobtenerdatosrespectoasudistribucinmedioambiental,as comoelriesgopotencial,alargoplazo,derivadodesuusocotidianoennuestroshogares.Deeste modo,esposibleestablecerlanecesidaddesarrollar,ono,unalegislacinencaminadaalcontrolde estassustancias,aparentementeinofensivasporcontactodrmicooporingestin,ascomodelos subproductosgeneradosapartirdelosmismasmediantereaccionesfotoqumicasuoxidativas. En este trabajo se han desarrollado distintos mtodos analticos, aplicados a matrices medioambientales, para la determinacin de un bactericida de amplio uso, el Triclosn, as como clorofenoles relacionados (2,4diclorofenol, 2,3,4triclorofenol, 2,4,6triclorofenol) [Kanetoshi A; 1987][Canosa P; 2005 A], un producto de biometilacin del mismo, el metiltriclosn [Balmer ME; 2005], y por ltimo, una familia de compuestos utilizados como conservantes, los parabenes (metilparaben,etilparaben,propilparaben,butilparabenybencilparaben)[BenijtsT;2004]. Agua, lodo, polvo de atmsferas interiores y msculo de pescado han sido seleccionados como matrices, para evaluar su distribucin en el medio ambiente. En general, se ha optado por optimizarmetodologasdepreparacindemuestrasencillasydebajocoste,comosonlaextraccin enfaseslida,lamicroextraccinenfaseslidayladispersindematrizenfaseslida.Adems,se han utilizado la extraccin asistida por microondas y la extraccin acelerada con disolventes en variasaplicaciones. Adicionalmente al desarrollo de metodologas de determinacin de estos compuestos, se hanllevadoacabodiversosestudiosenloreferenteasutransformacinqumicaenaguascloradasy laposibilidaddemigracindelTriclosndesdesuperficiestratadasconestebactericidaaalimentos encontactoconlasmismas. 4

CAPTULOI

Triclosnycompuestosrelacionados

I.TRICLOSNYCOMPUESTOSRELACIONADOS 1.1.Definicin,estructuraypropiedadesdeltriclosnycompuestosrelacionados El triclosn [5cloro2(2,4diclorofenoxi)fenol], TCS, es un fenoxifenol triclorado comercializado con el nombre de Irgacare MP o Irgasan DP 300 que presenta propiedades antibacterianas. Es un polvo blanquecino escasamente soluble en agua, hidrolticamente estable y poco voltil, con una elevada hidrofobicidad. Debido a su reactividad, se estudiar conjuntamente con varios de sus productos de transformacin: el metiltriclosn, el 2,4diclorofenol, el 2,3,4 triclorofenolyel2,4,6triclorofenol,loscualessemuestranenlafiguraI.1. Figura I.1. Estructuras del triclosn (TCS), metiltriclosn (MTCS), 2,4diclorofenol (2,4DCF), 2,3,4 triclorofenol(2,3,4TCF)yel2,4,6triclorofenol(2,4,6TCF).

Cl O Cl TCS Cl OH Cl 2,4DCF

OH

Cl O Cl Cl MTCS Cl

OMe

Cl

Cl OH Cl OH Cl 2,4,6TCF

Cl Cl

2,3,4TCF

El metiltriclosn [5cloro2(2,4diclorofenoxi)anisol], MTCS, es un anisol generado en procesosdebiometilacindeltriclosn,cuyaspropiedadesfsicoqumicasleproporcionancarcter bioacumulativo[BalmerME;2005].Losclorofenolesanterioresseconsideranposiblesproductosde hidrlisisdeltriclosnenmedioacuoso.El2,4diclorofenol(2,4DCF)yel2,3,4triclorofenol(2,3,4 TCF)fueronpropuestosinicialmentecomosubproductosdehidrlisis[OnoderaS;1987],aunque estudios posteriores, pusieron de manifiesto que son el 2,4,6triclorofenol (2,4,6TCF) junto con el 2,4diclorofenollosproductosfinalesgeneradosenreaccionesdeoxidacinehidrlisisdeltriclosn [RuleKL;2005][CanosaP;2005A].

Introduccin

EnlatablaI.1,semuestranalgunasdelaspropiedadesdescritasparaestoscompuestos. TablaI.1.Propiedadesdeltriclosnycompuestosrelacionados. Propiedades Pm(g/mol) pKa LogKow Puntoebullicin(C) Puntofusin(C) Pvapor(Torr) Solubilidad,pH3(g/L) Solubilidad,pH7(g/L) Solubilidad,pH9(g/L) 1.2.Aplicaciones El triclosn exhibe un amplio espectro bactericida contra las bacterias Gram + y Gram , ademsdehongosylevaduras.Suefectoantibacterianoesdebidoalainhibicinqueejercesobrela protena transportadora enoilacil reductasa (ENR), encargada de la biosntesis de cidos grasos necesariosparalaformacindelasparedescelularesylareproduccindelasbacterias[SingerH; 2002][McAvoyD;2002][GlaserA;2004]. El triclosn est presente en mltiples productos relacionados con la desinfeccin en un rango que va desde 0.1 a 0.3 % (10003000 g/g), como jabones, desodorantes, limpiadores, champs y cosmticos [http://www.listadeespera.net/guia/pdf/RD1599_1997_17oct.pdf]. Adems, es adecuado para su introduccin en polmeros y fibras, en almohadillas de colchn, tablerosdecorte,zapatosyropadeportiva[OrvosDR;2000][BirkelM;1993][GlaserA;2004].Para lospolmerosytejidos,contenidosdetriclosn(Microban)de300g/gofrecenproteccincontra las bacterias Gram +, 7501000 g/g frente a bacterias Gram + y , 3005000 g/g proteccin adicional al desarrollo de hongos; con 4000 g/g es posible mantener las propiedades antibacterianasenaquellosproductosquesonlavadosconfrecuencia[GacnJ;2001].Suusoms conocido es como aditivo en dentfricos, ya que se considera un agente activo contra la gingivitis, ejerciendoestaaccinaconcentracionessuperioresa0.050.06mM(1417g/g)[ZuckerbraumHL; 1998]. 8 TCS 289.5 7.80 4.8 345 162 3.26105 0.004 0.005 0.069 MTCS 303.6 5.4 359 128 5.18105 0.001 0.001 0.001 2,4DCF 163 8.05 2.99 210 113 0.136 3.6 3.9 36 2,3,4TCF 197.4 7.10 3.66 260 111 0.008 0.79 1.4 61 2,4,6TCF 197.4 6.59 3.57 246 96 0.0177 0.87 3.2 190

Triclosnycompuestosrelacionados

1.3.Toxicidad El triclosn es un compuesto de baja toxicidad aguda. Diversos estudios sobre su uso en productosdecuidadopersonalrevelanque,alasconcentracionesutilizadas(0.3%,segnRD1599 del17octubre1997),noestxico,carcinognico,teratognico,niirritantedeojosypiel.Eltriclosn penetra en el cuerpo humano por contacto con la piel, las mucosas y el tracto intestinal, reducindosesuconcentracinalamitadtras21horas,retornandofinalmentealosnivelesiniciales alcabode8das[McAvoyD;2002][AllmyrM;2006A]. El mayor problema derivado de la introduccin de triclosn en las formulaciones de productos de cuidado personal es su continua descarga en el medio ambiente, ya que puede producirefectosadversossobrelaflorayfaunaacutica.Lasalgas,organismosunicelularesypeces hansidolosprincipalesorganismosenlosquesehaestudiadosutoxicidad. Dado que las algas comprenden el primer escaln en la pirmide alimentaria, un efecto adverso en ellas puede desembocar en un efecto en cadena para organismos de mayor tamao [ShipperO;2003].Lasalgasunicelulares,particularmentelasalgasverdesylascianobacterias,son delordende30a80vecesmssensiblesalaexposicinatriclosnqueotrosorganismosacuticos [TatarazakoN;2004][OrvosDR;2002].Elcrecimientodeestasalgasesinhibidoaconcentraciones de TCS comprendidas entre 1.3 y 13 ng/mL en un tiempo de exposicin de 4 das, con una concentracinmediainhibitoria,conocidacomoIC50,de4.7ng/mL.UnestudiorealizadoporOrvosy colaboradores [Orvos DR; 2002] mostr que al disminuir la concentracin de triclosn, el crecimientodelasalgassereanudaba,sugiriendoquelosorganismosseencuentranenunestado latente. As mismo, descubrieron que el mayor efecto txico se produjo sobre la especie Scenedesmus Subspicatus, dado que este organismo es capaz de transformar qumicamente el triclosnen2,4diclorofenol,demayortoxicidadqueelcompuestodepartida. Bioensayos realizados por Wilson y colaboradores [Wilson BA; 2003] sugirieron que la estructura y funcin de las comunidades de algas pueden experimentar modificaciones cuando sufrencontinuasdescargasdeefluentesdeplantasdetratamientodeaguasresidualesconteniendo triclosn.Anivelesinferioresa0.015ng/mLseobservunaligeradisminucindelapoblacinde dosespeciesdealgas,siendomssignificativacuandosealcanzaronconcentracionescomprendidas entre0.15y1.5ng/mL.Deigualmodo,estudiosinvivosobrelareproduccinsexualyasexualdel algaC.Ehrenbergii,realizadosporCinigliaycolaboradores[CinigliaC;2005],pusierondemanifiesto que niveles inferiores a 0.1255 mg/L no afectaron al tamao de los cloroplastos y su morfologa, aunqueseinhibielcrecimientovegetativocuandolosnivelesalcanzaronlos0.5mg/L,mermando inclusosureproduccinsexualanivelesde0.937mg/L.

Introduccin

Dentro de los vertebrados, la toxicidad del TCS ha sido estudiada en peces y anfibios, principales pobladores de ros y lagos. En un estudio inicial, el grupo de Orvos [Orvos DL; 2002] descubri que las cras de la trucha arcoiris presentaban una disminucin de su supervivencia cuandoeranexpuestasduranteunperiodode35a61dasanivelesdetriclosndelordende71.3 ng/mL, sin que hubiese diferencia de longitud y peso con respecto a las muestras control. Sin embargo, se manifestaron malformaciones en la mandbula, curvatura de la espina dorsal, inactividad y natacin errtica, factores que afectan negativamente a la supervivencia. Estimaron tambin la concentracin media letal (EC50) del triclosn para la carpa cabezona (Pimeaples promelas) y para la perca (Leponis macrochirus), siendo del orden de 260440 ng/mL. Por ltimo, observaron que el factor de bioconcentracin del TCS aument prcticamente el doble cuando su concentracinenaguadisminuyde30a3ng/mL. Ishibashi y colaboradores [Ishibashi H; 2004] investigaron como afecta la presencia del triclosnaldesarrolloreproductivodelmedaka(OryzasLatipes).Estimaronen601ng/mLelEC50(24 h) para las larvas, adems de observar una reduccin y retraso de la eclosin de 14 das. En esta mismalnea,Tatarazakoycolaboradoresdeterminaronqueelpezcebra(DanioRerio)yelmedaka (Oryziaslatipes)presentaronunadisminucindel50%desuspoblaciones(IC50)aconcentraciones de triclosn del orden de 220 ng/mL y 400 ng/mL respectivamente, similares a los resultados obtenidosporOrvos[TatarazakoN;2004]. Conrespectoalosanfibios,losgruposdeFrakeryVeldhoenhanevaluadolatoxicidaddel TCS para dos especies de rana diferentes. Para la rana leopardo (Rana pipiens), niveles de concentracin de 230 ng/mL provocaron alteraciones del sistema nervioso, mientras que a concentraciones1000vecesinferiores,seobservunadisminucindepesoimportante,ascomoun aumento de mortandad en las cras [Fraker SL; 2004]. Para la rana toro (Rana catesbeiana), Veldhoenycolaboradoresobservaroncambiosenlametamorfosismediadaporlahormonatiroidea en presencia de niveles de triclosn inferiores a 150 ng/mL durante 4das, traducindose en una disminucindepesoyunaumentodeltamaodelacolaenlosrenacuajos[VeldhoenN;2006]. Laactividadtiroideatambinhasidoestudiadaenratas[CroftonKM;2007]disminuyendo losnivelesdehormonastiroideasalaumentarlacantidaddetriclosninoculado,aligualquesuceda en la rana toro. En este caso, los niveles necesarios para observar efectos adversos fueron de 30 mg/kgporda. Entre las aplicaciones del triclosn, la utilizacin como agente antimicrobiano en desodorantesocremas,haceposiblequeseproduzcalapenetracincutneadelmismo.Estudiosin vivo en ratas y humanos, pusieron de manifiesto que entre un 21 y un 28 % del triclosn era adsorbidodrmicamenteporlasratas,mientrasqueparaloshumanossloel15%delacantidad 10

Triclosnycompuestosrelacionados

aplicadapenetrabaenlapiel.Dentrodelorganismo,eltriclosnestransformadoporelhgadoensu conjugadoglucurnido [Moss T;2000], elcual tiene un tiempo depermanencia medio de 4horas cuandoesadministradooralmenteahumanos[SioufiA;1997]. El mayor problema derivado del uso del triclosn, se debe a su reactividad, ya que se considera precursor de contaminantes prioritarios como los clorofenoles, dioxinas y compuestos policloradosgeneradosendistintasreaccionesdetransformacinqueseenumerarnmsadelante [HellK;2000][GraovacCM;1995][OnoderaS;1987][TixierC;2002]. 1.4.Distribucinenelmedioambiente Enlabibliografaexistente,sehapuestodemanifiestolapresenciadetriclosnendistintas matricesmedioambientales,talescomoaguasresidualesysuperficiales,sedimentos,lodos,eincluso muestrasdematerialbiolgico(msculoygrasadepescado,lechematerna,etc). Sabaliunasycolaboradores[SabaliunasD;2003]afirmaronqueesimportanteconocerlos procesos que determinan la estabilidad del TCS, y por tanto, su cantidad disponible en el medio acutico,paralaestimacindelosposiblesriesgosderivadosdesupresenciaenelmedioambiente y,encasonecesario,establecerlacorrespondientelegislacinencaminadaacontrolarelusodeeste bactericida. En general, se observa que la distribucin del TCS en el medio ambiente depende de variosfactoresentrelosquecabedestacar: ElpHylaconcentracindeslidosensuspensin.Eltriclosnesunasustanciaionizable,yla variacinenestosparmetrosmodificasudistribucinenelmedioacutico,demodoquesi elpHaumenta,larelacintriclosnionizado/triclosnsinionizartambinseincrementa.Una cantidadimportantedemateriaparticuladaprovocaunaumentodeltriclosnadsorbidoensu superficie, siempre que el pH del agua sea inferior al pKa del compuesto [Sabaliunas D; 2003][TixierC;2002]. Fotlisis. El triclosn es susceptible de sufrir una transformacin fotoltica en las aguas superficiales,bajolaaccindelaluzsolar.LaextensindeestareaccinesfuncindelpHdel medio(seproduceunincrementodeunfactorde30delrendimientodelareaccincuandoel pHseincrementade5.9a11.0)ydelacantidaddeluzsolarquerecibe.Encualquiercaso,la fotodegradacin del triclosn slo es significativa en la superficiede las masas de agua. Por estarazn,losprocesosdefotlisissonimportantesenaguassuperficialesperonoenaguas subterrneasoresiduales[FerrerI;2004][AranamiK;2007][SnchezPradoL;2006AyB]. Biodegradacin. El triclosn puede ser biodegradado por los organismos presentes en el agua.Esteprocesodependedelatemperaturadelmedioydelaprofundidad.Porejemplo,la bacteriaAchromobacterXylosoxidasasdegradaeltriclosnenlasuperficiedelaspartculasen

11

Introduccin

suspensingenerandocomoproductoprincipaldedegradacinel2,4diclorofenol,delmismo modoqueelalgaScenedesmusSubspicatus[TixierC;2002][OrvosDR;2000]. Cloracin. En presencia de cloro libre, el triclosn puede sufrir la halogenacin de su anillo fenlico, dando lugar a los tetra y al penta closano, y a dos productos de ruptura de su molcula,el2,4diclorofenolyel2,4,6triclorofenol[RuleKL;2005][CanosaP;2005A]. Actualmente,existenmltiplesestudiosenlosqueseevalalaconcentracindetriclosn en distintos tipos de matrices medioambientales. En el caso de muestras acuosas, las concentracionesvaranenormementeentreaguasresidualesyaguassuperficiales,perotambinen distintas zonas del planeta. Con estos datos, se pueden valorar los porcentajes de eliminacin de triclosn por parte de las estaciones depuradoras de agua residual. Se estima que durante los tratamientos primarios se elimina entre un 7 y un 48 % del compuesto [Sabaliunas D; 2003][van SteeLLP;1999],mientrasqueeneltratamientosecundario,laeliminacinesdelordendel8195.5 %[LeeHB;2003][BesterK;2003],tablaI.2.Encualquiercaso,estosvaloresdebenconsiderarsecon suma precaucin, puesto que hacen referencia nica y exclusivamente a las concentraciones del compuestoendisolucin,sintenerencuentalafraccinadsorbidaenellodo. TablaI.2.Nivelesdetriclosnenaguaresidualtratadaysintratar. Localizacin Aguaresidualsintratar (ng/mL) 1.337.8 Espaa(Almera) Espaa(Barcelona) Espaa(Corua) Suiza 2.3562 0.394.2 na 0.1950.228 0.61.3 0.5841.3 0.11.5 Suecia 0.38 0.090.7 na nd Alemania 1.11.3 0.010.6 Aguaresidualtratada (ng/mL) 0.422.1 0.1269 0.080.40 0.045 nd 0.110.65 0.0700.65 <0.2 0.16 na nd0.50 nd 0.0430.059 na Referencia
AgeraA;2003 MezcuaM;2004 GmezMJ;2007 KusterM;2008 QuintanaJB;2007 EnvProy861;2003 LindstromA;2002 EnvProy861;2003 BendzD;2005 PaxusN;2004 PaxusN;1996 QuintanaJB;2004 BesterK;2003 BesterK;2005
a a

12

Triclosnycompuestosrelacionados

Localizacin Dinamarca ReinoUnido Noruega

Aguaresidualsintratar (ng/mL) 1.63.0 5.921.9 <3.1 0.0432.8 1.66.1 3.816.6 314

Aguaresidualtratada (ng/mL) <11.8 0.3413.35 nd 0.160.48 0.0200.035 3.48.0 0.160.46 <0.002 na 0.072 0.010.02 na 0.030.74 na nd 0.063 0.1 na 0.0230.434

Referencia
EnvProy861;2003 SabaliunasD;2003 KandaR;2003 WeigelS;2004 HaldenRU;2005 McAvoyD;2002 ShelverWL;2007 VanderfordSA;2006 StackelbergPE;2004 ThomasPM;2004 BoydGH;2003 GibsonR;2007 LeeHB;2003 LeeHB;2005 BoydGH;2003 HuaW;2005 NakadaN;2006 WuJL;2007 YingGG;2007
a

EstadosUnidos

1.3 1 na na

Mxico

0.662.04 0.373.24 0.871.83 na na 0.30.8 0.0220.213 na

Canad

Japn China Australia

nd:pordebajodeloslmitesdedeteccin na:noanalizado a http://www.mst.dk/udgiv/Publications/2003/8779729843/HTML/kap04_eng.htm

Salvoalgunaexcepcin,elnivelmediodetriclosnenelaguaresidualsintratamientoesdel ordende2ng/mL,mientrasqueenelaguaresidualtratada,losnivelessoninferioresa0.1ng/mL. En general, el porcentaje de eliminacin del triclosn por parte de las estaciones depuradoras de aguaresidualoscilaentreun40yun100%.Todoellodependerdeltipodetratamientoquereciba elaguaresidual,siendoelmsefectivoeltratamientoconlodosactivos[HeidlerJ;2007][Thompson A;2005]. LosnivelesdeTCSpresentesenotrasmatricesacuosasseresumenacontinuacin,tablaI.3. 13

Introduccin

TablasI.3.Nivelesdetriclosnenotrasmuestrasdeagua. Tipodemuestra Concentracin (ng/mL) 0.032 Aguadegrifo Aguagrifo(previo tratamiento) Aguaspluviales Aguamanantial <0.734 <0.001 1.43 0.00160.029 0.0010.0012 nd nd 0.0030.010 0.0030.014 0.0810.130 0.14 0.087 Ro nd 00.14 0.0090.035 0.010.12 0.0040.008 0.0260.038 0.0351.023 <0.075 0.02 Lago <0.010 nd nd Mar 0.0160.099 0.0550.134
nd:pordebajodeloslmitesdedeteccin

Localizacin Noruega EstadosUnidos EstadosUnidos EstadosUnidos Mxico Espaa(ACorua) Alemania Suiza Dinamarca Noruega

Referencia
BonesJ;2006 LoraineGA;2007 VanderfordSA;2006 LoraineGA;2006 BoydGH;2004 GibsonR;2007 QuintanaJB;2007 QuintanaJB;2004 BesterK;2005 LindstromA;2002 BarberLB;2006 ErikssonE;2003 BonesJ;2006 BoydGH;2003

EstadosUnidos

KolpinDW;2004 ZhangS;2007 CooganMA;2007

Canad China Australia Suiza EstadosUnidos Canad Noruega China Japn

HuaW;2005 WuJL;2007 PengX;2008 YingGG;2007 SingerH;2002 VanderfordSA;2006 BoydGH;2003 WeigelS;2004 WuJL;2007 NishiI;2008

Aunque los valores de triclosn encontrados en aguas de ro y lago son inferiores a los presentes en las aguas residuales, debido a su alta lipofilia, este compuesto es susceptible de

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Triclosnycompuestosrelacionados

bioacumularse en animales y plantas presentes en ecosistemas que sufren continuasdescargas de aguaresidual.Dentrodelosorganismosvivos,sehaestudiadolapresenciadeltriclosnenpecesde ro.AlaeeyValters[AlaeeM;2003][ValtersK;2005]cuantificaronnivelesdetriclosnenplasmadel orden de 0.6110.4 ng/g, mientras que AdolfssonErici [AdolfssonErici M; 2002] y Houtman [Houtman CJ; 2004] analizaron bilis de pescado para determinar las concentraciones de triclosn presentesenesteorganismo.Losvalorescuantificadososcilaronentre10710ng/g(referidoapeso total) y 1480 g/mL (referido a bilis), respectivamente. En algas, las concentraciones fluctuaron entre10y146ng/g[CooganMA;2007]. Ladistribucindeltriclosntambinhasidoestudiadaenmatricesslidas,principalmente enlodosprocedentesdeestacionesdepuradorasdeaguaresidualysedimentosderosquereciben descargasdeaguaresidualtratada.Debidoasualtocarcterlipoflico,cabeesperarquelosniveles seanmuchomselevadosenestasmuestrasqueenaguasresidualesosuperficiales,tablaI.4. TablaI.4.Nivelesdetriclosnencontradosenmuestrasdelodoysedimento. Tipodemuestra Sedimentoro Concentracin (g/g) nd0.036 0.13070.00027 Sedimentomarino 0.012 0.050 0.250.45 Sedimentolago 0.053 0.45.4 137 0.0286.4 Lododepuradora 1.21.3 0.6211.55 0.0916.79 7.514.7 Localizacin Espaa(ACorua) Espaa(Almera) Espaa(Crdoba) EstadosUnidos Alemania Suiza Espaa(ACorua) Grecia Dinamarca Alemania Canad Australia EstadosUnidos Referencia
MoralesS;2005 AgeraA;2003 MoralesMuozS;2005 BurkhardtMK;2005 KronimusA;2004 SingerH;2002 MoralesS;2005 GatidouG;2007 EnvProy861;2003 BesterK;2003 ChuS;2007 YingGG;2007 McAvoyD;2002
a

XuJ;2008 Suelo 0.00060.009 EstadosUnidos ahttp://www.mst.dk/udgiv/Publications/2003/8779729843/HTML/kap04_eng.htm Talcomosemuestraenlatablaanterior,losnivelesdetriclosnenloslodosdedepuradora son hasta 1000 veces superiores a los detectados en las aguas residuales sin tratar. En ocasiones,

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Introduccin

estos lodos son utilizados como abonos. Por ello, es necesario controlar de algn modo la distribucindeltriclosnenestamatrizslida[HeidlerJL;2007]. Porltimo,cabedestacarestudiosenlosqueseevalulapresenciadetriclosnenleche materna, en plasma humano y orina procedente de individuos que usaban productos de cuidado personalquecontienenensuformulacinestebactericida.Losnivelesdetectadosenlechematerna estuvieron comprendidos entre 0.022 y 9 ng/g [Allmyr M; 2006 A y B][AdolfssonErici M; 2002][DayanAD;2007].Enplasma,losnivelesoscilaronentre0.4y38ng/g[AllmyrM;2006B]yen orinafuerondelordende127ng/mL[YeX;2005]. Losposiblesproductosdetransformacindeltriclosntambinhansidoanalizadosenlas matrices anteriormente indicadas. Quiz el ms importante de todos ellos, y directamente relacionadoconl,eselmetiltriclosn,generadoprincipalmenteenlasplantasdepuradorascomo producto de biometilacin. En los lodos, sus concentraciones estn comprendidas entre 0.050.45 g/g[McAvoyD;2002],mientrasqueeninfluentesyefluenteslosvaloresoscilanentre0.0010.04y 0.0020.011ng/mL[Irgasan;1998].Sonlasmatricesbiolgicasaquellasenlasquesehaanalizado exhaustivamente la presencia del metiltriclosn, principalmente en peces de ro. Balmer y colaboradores cuantificaron niveles de metiltriclosn del orden de 1300 ng/g, referido a tejido graso,entruchasprocedentesdeunlagosuecoendondelosnivelesdemetiltriclosnenaguaeran de 0.021.2 ng/L [Balmer ME; 2004]. Niveles similares de metiltriclosn fueron encontrados uno y dosaosdespusdelprimermuestreoenesemismolago(nd233ng/gy1302100ng/genlpidos, respectivamente) [Valters K; 2005][Buser HR; 2006]. En el plasma de pescado los niveles de metiltriclosncuantificadosson1000vecesinferioresalosencontradosengrasadebidoalaelevada lipofilidaddeestecompuesto(logKow5.1)[AlaeeM;2003]. Los clorofenoles relacionados con el triclosn: el 2,4diclorofenol, 2,3,4triclorofenol [Onodera S; 1998] y el 2,4,6triclorofenol [Canosa P; 2005 A y B][Rule KL; 2005] tambin fueron cuantificadosenalgunosestudios.Parael2,4diclorofenol,sehandetectadoconcentracionesenel influente de una depuradora del orden de 0.030.20 ng/mL, mientras que para el efluente correspondiente, los niveles oscilaron entre 0.01 y 0.21 ng/mL, con lo que se concluy que prcticamente no hay eliminacin de este compuesto [Lee HB; 2003]. Para el caso de los dos triclorofenoles supuestamente relacionados, es el 2,4,6triclorofenol el que presenta mayores niveles de concentracin en el influente (0.020.1 ng/mL) frente al 2,3,4triclorofenol [Eriksson E; 2003]. Concentraciones similares de 2,4,6triclorofenol fueron detectadas por Quintana y colaboradores[QuintanaJB;2007]enaguaresidualnotratada.

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Triclosnycompuestosrelacionados

Los clorofenoles relacionados con el triclosn no slo fueron analizados en muestras de aguaresidual,sinoquetambinfuerondetectadosenorina.ElgrupodeYe[YeX;2005]encontr 2,4diclorofenoly2,4,6triclorofenolanivelesde1.9y0.5ng/mL,respectivamente,enestamatriz. Otros compuestos relacionados con el triclosn son los closanos clorados. Estos son derivadoshalogenadosdeltriclosnloscualesseformanenpresenciadecloroenelmedioacuoso. Mc Avoy y colaboradores detectaron estos compuestos en agua residual sin tratar y agua residual tratada a niveles inferiores a 0.6 ng/mL, mientras que en el lodo la concentracin media de estos fenoxifenolestetraypentacloradosfuede0.42g/g[McAvoyD;2002]. Porltimo,lasdioxinasrelacionadasconeltriclosnsehandetectadoenaguasresiduales sin tratar y tratadas a niveles de 0.028.9 ng/mL y 0.0040.4 ng/mL, respectivamente [Mezcua M; 2004]. 1.5.Productosdetransformacindeltriclosn El triclosn, como producto de cuidado personal, presenta una baja toxicidad aguda y un porcentaje apreciable de eliminacin o degradacin medioambiental. Como resultado de procesos naturales o industriales (por ejemplo, el tratamiento de aguas residuales) parte del triclosn sufre procesosdemineralizacincompleta[FederleTW;2002][HeidlerJ;2007].Sinembargo,unafraccin apreciable del mismo es introducido en el medio ambiente donde puede transformarse en otros compuestosclorados,comoporejemplo,elmetiltriclosn,lasdioxinas,clorofenolesyotrosclosanos clorados,loscualesposeenunaelevadatoxicidady/ounimportantecarcterbioacumulativo. 1.5.1.Closanospolicloradosyclorofenoles En relacin a la formacin de derivados clorados del triclosn, la primera referencia existenteseremontaa1987.Onoderaycolaboradores[OnoderaS;1987]observaronlaformacin de 2,4diclorofenol, 2,3,4triclorofenol, 4,5dicloro2(2,4diclorofenoxi)fenol [tetraclosano II], 5,6 dicloro2(2,4diclorofenoxi)fenol [tetraclosano I] y 4,5,6tricloro2(2,4diclorofenoxi)fenol [pentaclosano] cuando trataban agua residual conteniendo triclosn con hipoclorito sdico. Kanetoshi y colaboradores [Kanetoshi A; 1987] tambin identificaron los tres closanos anteriores como resultado de la inmersin de tejidos tratados con triclosn en una disolucin de hipoclorito sdico. Aos ms tarde, el grupo de Rule [Rule KL; 2005] estudi la cintica de reaccin del triclosnenaguaclorada.AligualqueOnoderayKanetoshi,observaronlaaparicindelosclosanos anteriores y el 2,4diclorofenol, aunque el triclorofenol que identificaron fue el 2,4,6triclorofenol. 17

Introduccin

Estos resultados fueron obtenidos paralelamente al trabajo llevado a cabo en esta Tesis Doctoral [Canosa P; 2005 A]. Trabajos posteriores del grupo de Rule demostraron la evolucin de los compuestosanterioresacloroformo[FissEM;2007]. La formacin de 2,4diclorofenol no solamente es debida a reacciones de halogenacin y posterior ruptura del enlace ter, sino que cierto tipo de algas y bacterias, son capaces de transformar el triclosn en 2,4diclorofenol [Orvos DR; 2000]. Adems, se forma en procesos de cloracindefenoles,procedentesdecidoshmicosyflvicos,enaguadesinfectadaconclorolibre. El2,4,6triclorofenolsegeneraporsucesivassustitucionesdeldiclorofenol[PatnaikP;2000]. Conrespectoalatoxicidaddeestassustancias,el2,4diclorofenolesconocidoporserun potencial disruptor endocrino [Graovac M; 1995][Mol HGJ; 2002]. Los fenoles, y en general, los fenoles clorados, son txicos a concentraciones de partes por billn (ng/mL). La Agencia de ProteccinMedioambiental(EPA)recomiendaqueelaguapotablenocontengamsde0.03g/mL de fenoles clorados para exposiciones de 1 a 10 das en el caso de un adulto sano [http://www.atdsr.cdc.gov/e/toxfaqs/estfacts107.html]. Adems, el 2,4diclorofenol est incluido enlalistadecandidatosdecontaminantesprioritariosdelaEPA[http://www.epa.gov/iris]. El 2,3,4triclorofenol y el 2,4,6triclorofenol son considerados predioxinas, ya que experimentosdedescomposicintrmicasobrecenizasmuestranlaformacindedioxinasapartir de estos compuestos [Hell K; 2000][Capdeville J; 2002]. Asimismo, el 2,4,6triclorofenol est clasificadocomoposiblecarcinognico[http://www.epa.gov/iris][FissEM;2007],siendolosniveles mximospermitidosde0.012g/mL.Porltimo,conrespectoalosclosanospoliclorados,Kanetoshi evaluunadosisletalmedia,LD50,pararatonesdeentre430y710mg/kg[KanetoshiA;1992]. 1.5.2.Dioxinas Eltriclosnesconocidocomounapredioxina.Lasdioxinassonsustanciasaltamentetxicas y consideradas por la EPA como contaminantes prioritarios, de modo que sus niveles en el medio ambienteestnestrictamentecontrolados.Laformacindedioxinasapartirdeltriclosn,sepuede producirmediantedosvas: Vafotoqumica.Laformacindedioxinasrelacionadasconeltriclosn,principalmentela2,8 diclorodibenzodioxina,puedellevarseacabomediantefotlisisdirectaoindirecta. Fotlisis directa. La formacin de dioxinas mediante fotlisis directa es ms rpida a pH superior al pKa del triclosn [SnchezPrado L; 2006 A]. El grupo de Arnold [Arnold WA; 2003] estudilafotodegradacindelTCSadistintospHsylongitudesdeonda.Lalongituddeondamxima de absorcin en el espectro del triclosn corresponde a 279 nm, mientras que para la especie desprotonada es de 292 nm, coincidiendo en la zona del ultravioleta cercano. De este modo, 18

Triclosnycompuestosrelacionados

evaluaronlavidamediadeltriclosnenaguaenfuncindelapocadelao(cantidaddeluz)ydela formaqumicaexistente,tablaI.5. TablaI.5.Tiempodevidamediadeltriclosnenfuncindelaformaexistenteydelapocadelao. Tiempodevidamedia Verano Invierno Tambin es importante la presencia de materia orgnica disuelta en el medio acuoso, ya queelrendimientodelareaccindisminuyeenun20%,debidoalaadsorcindeltriclosnsobrela superficiedelaspartculasensuspensin[TixierC;2002]. Fotlisis indirecta. La formacin de dioxinas tambin est descrita mediante la fotlisis indirecta, debido a la reaccin del triclosn con los radicales hidroxilo o con el oxgeno singlete generadosporlaaccindelaradiacinsolar.Tixierycolaboradores[TixierC;2002]estudiaroneste fenmeno y concluyeron que era muy favorable, debido a las altas constantes de velocidad de reaccinyalaconcentracinrelativamenteelevadaderadicalesenagua. Mezcua [Mezcua M; 2004] y Ferrer [Ferrer I; 2004] estudiaron detalladamente los productos que se generan en la fotlisis del triclosn. Mezcua y colaboradores observaron la formacin, como producto mayoritario, de la 2,7/2,8dibenzodicloropdioxina y evaluaron su presenciaenaguasresiduales.Concluyeronquelaconcentracinmximadedioxinasealcanzabaa los1000minutosdeexposicinsolar.Ferrerycolaboradoresinvestigaronlapresenciadeproductos intermedios generados en la degradacin fotoqumica del triclosn, utilizando como tcnica de deteccinlacromatografadelquidosacopladaaunespectrmetrodemasasdetiempodevuelo. Estos productos intermedios presentaron prdidas de cloro, ruptura del enlace ter formando un monoclorodihidroxilado,ysustitucindeuntomodecloroporungrupohidroxilo. Lavelocidaddelareaccindefotodegradacindependedesistaseproduceenaguadulce o en agua salada. Aranami y colaboradores [Aranami K; 2007] observaron que el tiempo de vida mediadeltriclosnenaguadulceesde4das,frentealos8dasparaelaguasalada. Combustin de lodos conteniendo triclosn. El hecho de que se formen dioxinas mediante la combustindelodosesdegranrelevancia,yaqueseconocequeun1520%deltriclosneliminado en las plantas de tratamiento de agua residual, se adhiere a los lodos. En algunas estaciones depuradoras,estoslodossoneliminadosmedianteincineracin. Formaprotonada 2.55horas 5.5das Formadesprotonada 6.15minutos 5.35horas

19

Introduccin

Kanetoshi y colaboradores [Kanetoshi A; 1987] estudiaron la pirolizacin del triclosn y closanos clorados relacionados. Observaron la formacin de diversas dioxinas tricloradas, tetracloradas,pentacloradaseinclusohexacloradas.Enlasiguientetabla,semuestraelporcentaje dedioxinageneradarespectoalacantidadtotaldeclosanos,tablaI.6. TablaI.6.Porcentajededioxinasformadoapartirdelacombustindelodosconteniendotriclosny closanosrelacionados. %Dioxinaformadaenlacombustindeloslodos TCS TetraI TetraII Penta 1.5.3.Metiltriclosn El triclosn puede ser biotransformado por diversos organismos en su anisol, el metiltriclosn. Este compuesto es mucho ms estable frente a la degradacin fotoqumica, bioacumulndoseenlostejidos(principalmenteenloslipdicos)deaquellosseresvivosexpuestosa descargascontinuasdeaguasconteniendotriclosn.Porlotanto,puedeserconsideradocomoun marcador de los niveles de triclosn en aquellos medios que sufrendescargas de aguas residuales [Balmer ME; 2004][Lindstrom A; 2002]. Adems, los niveles de metiltriclosn detectados son superioresenlosefluentesdelasplantasdepuradorasfrentealosinfluentes,loqueindicaquese generaprincipalmenteenlasdepuradorasdeaguaresidual[CooganMA;2007]. DiCDD TriCDD TetraCDD PentaCDD HexaCDD 42 44 22 25 46 16 1

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Parabenes

II.PARABENES 2.1.Definicin,estructuraypropiedadesdelosparabenes Los parabenes son esteres del cido 4hidroxibenzoico ampliamente utilizados como estabilizantes y preservativos en cosmticos, jabones, alimentos, etc. Los ms empleados son el metilparabenoparahidroxibenzoatodemetilo(E218),eletilparabenoparahidroxibenzoatodeetilo (E214), el propilparaben o parahidroxibenzoato de propilo (E216), butilparaben o parahidroxibenzoato de butilo y el bencilparaben o parahidroxibenzoato de bencilo en niveles inferiores al 0.8 % (p/p), expresados como cido parahidroxibenzoico. Las estructuras de los parabenesjuntoconladelcidodelqueprocedensemuestranenlafiguraII.1. Figura II.1. Estructura del metilparaben (MeP), etilparaben (EtP), propilparaben (PrP), butilparaben (BuP),bencilparaben(BzP)ydelcidophidroxibenzoico(ApOH).

O C HO OCH3 HO

O C OC2H5 HO

O C OC3H7

MeP
O C HO OC4H9 HO

EtP
O C OCH2Ph HO

PrP
O C OH

BuP

BzP

ApOH

Losparabenessonslidosrelativamentesolublesenaguaehidrolticamenteestablesque presentan mayor carcter hidrofbico al aumentar el tamao de su cadena hidrocarbonada. En la tablaII.1,semuestranlaspropiedadesfsicoqumicasmsrelevantesdelosmismos.

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Introduccin

TablaII.1.Propiedadesfsicoqumicasdelosparabenesyelcidophidroxibenzoico. Propiedades Pm(g/mol) pKa LogKow Puntoebullicin(C) Puntofusin(C) Pvapor(Torr) Solubilidad,pH3(g/L) Solubilidad,pH7(g/L) Solubilidad,pH9(g/L) 2.2.Aplicaciones Los steres del cido phidroxibenzoico (parabenes) son ampliamente utilizados como preservativos en productos de cuidado personal y en alimentos. Son activos frente hongos y levaduras y contra algunos microorganismos Gram + y Gram , provocando disrupcin en los procesosdetransportedemembrana,inhibicindelasntesisdeADNyARNounindoseaenzimas (ATPasasyfosfotransferasas)claveparaeldesarrollodelasbacterias[ValkovaN;2001]. Los parabenes no estn incluidos en el Anexo I de la lista de sustancias peligrosas de la Directiva67/548/CE;sinembargo,ladirectiva76/768/CEdelaUninEuropearestringesusniveles encosmticosaunaconcentracinmximade0.4%paracadauno,0.8%(expresadocomocido) para mezclas de los mismos [Borremans M; 2004]. Debido a su sinergia de actuacin y a que su toxicidadrelativaaumentaconeltamaodelacadena,esimportantetenerlosencuentaalahora de preparar mezclas de los mismos para minimizar los riesgos al consumidor [Charnock C; 2007][DoronS;2001]. Comoaditivosencosmticos,elmetilparabenyelpropilparabensonlosmsutilizadosen unrangodeconcentracionesnormalmenteinferiora0.3%y0.1%respectivamente,aunquepueden llegaraencontrarsenivelesprximosal1%.DebidoasugranestabilidadtrmicaadiferentespHs,y asuescasaadsorcinsobrelasuperficiedelosenvoltorios,sonampliamenteutilizadosencosmtica e incluso son usados como antimicrobianos en alimentos. De hecho, se aaden en bebidas alcohlicas, productos congelados, gelatinas, pulpa de tomate, zumo de frutas, siropes, etc, en dondesusnivelesoscilanentre4502000g/g,loquesuponeunaingestade46mg/Kg/daparaun adulto [Darbre PD; 2004]. Tambin se incorporan en frmacos, supositorios, anestsicos, colirios, MeP 152.15 8.30 1.86 265 116 5.55103 64 67 377 EtP 166.17 8.30 2.40 297 120 7.59104 25 25 140 PrP 180.20 8.20 2.90 294 125 9.30104 12 12 81 BuP 194.23 8.22 3.46 309 129 3.56104 5 5 35 BzP 228.24 8.20 3.60 390 168 1.24106 1.2 1.2 8.9 ApOH 138.12 4.57 1.40 336 171 4.48105 8.3 1000 1000

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Parabenes

pldoras, jarabes e inyectables en concentraciones inferiores al 1 % [Soni MG; 2002][Peck AM; 2006]. Enlanaturalezatambinpuedenencontrarseenalgunasfrutas,vinoblanco,einclusoseha descubiertoqueelmetilparabenactacomounaferomonaenlosperros[SoniMG;2002]. 2.3.Toxicidad El comit cientfico de alimentacin de la Unin Europea estableci una ingesta diaria aceptable (Aceptable Daily Intake) para los parabenes del orden de 10 mg/kg, expresado como la sumadeMeP,EtPyPrPydesussalessdicas[HarveyPW;2004AyB]. No existe una legislacin respecto a las dosis considerada como txica, pero la Directiva EuropeadeCosmticos76/768/CEE,ensuAnexoVI,indicaquelosnivelesmximosencosmticos no deben superar el 0.4 % como compuestos individuales y el 0.8 % para mezclas de los mismos. Muchos estudios indican que no son mutagnicos, pero que pueden causar aberraciones cromosmicas, particularmente en presencia de bifenilos policlorados. A nivel celular pueden provocardisrupcindelafuncincelularatravsdelainhibicindeloslisosomas[DarbrePD;2004]. Losparabenesseencuentranenunagranvariedaddeproductosenbajasconcentraciones. Suimportanciavienedadaporlaexposicincontinuaalaqueestsometidalapoblacin[ByfordJR; 2002].Sonadsorbidosinmediatamenteporeltractogastrointestinalyporlasangre,hidrolizadosal cido phidroxibenzoico o su conjugado, y excretados por la orina. Tambin son adsorbidos por la piel y gracias a las carboxilesterasas, se convierten en el cido phidroxibenzoico [Pugazhendhi D; 2005]. Encontactoconlapiel,sonacumuladosenloscomponentesgrasosdelostejidoshumanos debidoasusmoderadoscoeficientesdeparticinoctanol/agua(logKow1.8a3.6).Adems,algunos estudiosrecientesmostraronlapresenciadeparabenesenloscnceresdemama(nivelesinferiores de20ng/g),demodoqueseespeculaconquepuedaninfluirenelcrecimientoydesarrollodelos tumores [Darbre PD; 2004 y 2006][Harvey PW; 2004 A y B][Zhang Q; 2005]. Estudios in vitro, utilizando las clulas cancerosas MCF7, muestran que tienen la capacidad de desplazar al 17 estradiol del receptor estrognico citoslico, responsable de la proliferacin y crecimiento de tumoresmamarios[GoldenR;2005].Enestudiosinvivoconroedores,seobservunincrementoen la pared vaginal y en el peso del tero en hembras, y disminucin de la calidad del esperma en machos, cuando se les aplic tpicamente un preparado conteniendo en su formulacin los parabenes. Su subproducto ms importante, el cido phidroxibenzoico, aplicado tpicamente provocestosefectosanivelesde5g/g,500vecessuperioraladosisde17estradiolnecesaria paraprovocarlamismarespuesta[GoldenR;2005].

23

Introduccin

Dentrodelosparabenes,elmspotentecomodisruptorendocrinoeselbutilparaben,an as,sucarcterestrognicoes10000vecesinferiorqueel17estradiol,porloquelosnivelesalos que estamos expuestos no deberan afectar al ser humano [Byford JR; 2002][Harvey PW; 2004 y 2006]. Losefectosdelbutilparabensobrehormonastiroideasyreproductorasenelhombrefueron estudiados por Janjua y colaboradores [Janjua NRQ; 2007]. La administracin cutnea del butilparaben, en preparados conteniendo un 2 % de este compuesto, durante dos semanas consecutivas a niveles de 23 mg/cm2, di lugar a una concentracin de 135 ng/mL en suero. La cantidadencontradaparecenomodificarlosnivelesdehormonastiroideasysexuales. El mayor problema que pueden desencadenar estos compuestos son los productos de reaccin que se puedan generar en los distintos medios. As, en aguas potables, en presencia de cloro a niveles bajos (g/mL), los parabenes son susceptibles de transformarse en compuestos monoydihalogenados,cuyasposiblesrepercusionesenelmedioambienteyenelserhumanoson desconocidas[AlumA;2004][CanosaP;2006A]. 2.4.Distribucinenelmedioambiente Los parabenes, al igual que el triclosn, son introducidos en el medio acutico por la continuadescargadeaguaresidual,ascomoelvertidodirectodedetergentes,jabonesoproductos quepuedancontenerensuformulacinestoscompuestos. Los parabenes, en general, son estables en medio acuoso a diferentes pHs y a elevadas temperaturas. Por otra parte, su moderado coeficiente de particin octanolagua indica la posibilidad de ser adsorbidos en matrices slidas, principalmente en medios cidos, ya que a pH bsicosusolubilidadseveincrementadaunas50veces. Son fotoqumicamente estables, de modo que en presencia de luz no se descomponen, pero, en cambio, son biodegradables por organismos dando lugar al cido parahidroxibenzoico, considerado un potencial disruptor endocrino. Estudios de cloracin en agua realizadas en la presente Tesis Doctoral, mostraron la posibilidad de transformarse en compuestos clorados en tiemposrelativamentecortosaligualqueeltriclosn[CanosaP;2006A]. Algunostrabajoshanevaluadosupresenciaenelmedioacutico.Enaguasdero,sehan detectadonivelesinferioresalos80ng/Lparaelpropil,etilymetilparaben[BenijtsT;2004][Canosa P; 2006 B]. En aguas residuales, tambin se ha analizado la presencia de los parabenes, siendo el propilparabenlaespeciemayoritaria[LeeHB;2005].Engeneral,lasconcentracionesdetectadasde estoscompuestossoninferioresa2.5ng/mLparaaguaresidualsintratar,mientrasqueelefluente delaplantadepuradorapresentanivelesinferioresa100ng/L.EnlatablaII.2seresumenlosniveles descritosenlabibliografaenmatricesacuosas. 24

Parabenes

TablaII.2.Concentracindeparabenesenaguasresidualesysuperficiales. Tipode MeP muestra (ng/mL) 0.101.47 Influente 2.6 Influente 0.020.03 Efluente nd0.30 Efluente 0.002 Efluente 0.004 Efl.industrial 0.025 Ro EtP (ng/mL)
0.020.27 0.6 <0.01 <0.10.2 nd nd nd

PrP (ng/mL)
0.202.43 na <0.010.04 <0.10.3 0.003 0.006 0.078

BuP (ng/mL)
0.020.26 na <0.01 na na na na

BzP (ng/mL)
nd na nd nd na na na

Localizacin Canad Dinamarca Canad Suecia Blgica Blgica Blgica

Referencia
BenijtsT;2004 ErikssonE;2003 BenijtsT;2004 PaxusN;1996 BenijtsT;2004 BenijtsT;2004 BenijtsT;2004

nd:pordebajodeloslmitesdedeteccin na:noanalizado

Supresenciaenlodos,procedentesdelasplantasdepuradorasdeaguaresidualtodavano ha sido estudiada, en cambio, su distribucin en atmsferas interiores fue evaluada por Rudel y colaboradores[RudelRA;2003].EstosautoresinvestigaronlosnivelesdeMeP,EtPyBuPenairey polvode120hogaresestadounidenses,encontrandolosnivelesdeconcentracinquesemuestran enlatablaII.3. TablaII.3.Distribucindeparabenesenatmsferasinteriores[RudelRA;2003]. Aire(ng/m3) Polvo(g/g) En relacin a las matrices biolgicas, la deteccin de parabenes en tumores mamarios ha destapado la alarma sobre la posible relacin existente entre el uso de cosmticos conteniendo parabenes en su formulacin y el posible desarrollo de cncer de mama. El grupo de Darbre, dedicadoalestudiotoxicolgicodelosparabenes,analiztumoresde20individuosconcncerde mama. Todas las muestras fueron positivas, siendo los niveles mximos detectados de 12.8 ng/g paraMeP,2ng/gparaEtP,2.6ng/gparaPrPy2.3ng/gparaBuP[DarbrePD;2004].Losparabenes tambin han sido detectados en fluidos biolgicos como leche materna [Ye X; 2008A] y en suero humano[YeX;2008B]anivelesdelordendelosbajosng/mL. MeP nd21 nd8.24 EtP nd4 nd2.18 BuP 3.2 nd0.223

nd:pordebajodeloslmitesdedeteccin

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Introduccin

2.5.Productosdetransformacindelosparabenes 2.5.1.cidophidroxibenzoico El cido phidroxibenzoico es un producto de degradacin de los parabenes. Estudios con animalesmuestranquelosparabenessonadsorbidosinmediatamenteporeltractointestinalypor lasangre,hidrolizadosalcidocorrespondientedandolugarasuconjugadoglucurnido,siendoste excretado por la orina. Los parabenes tambin pueden ser adsorbidos rpidamente por la piel en dondelascarboxilesterasassoncapacesdehidrolizarlosalcido,quepenetrarporvadrmicaen elorganismo.Elcidophidroxibenzoicosecaracterizaportenerpropiedadesestrognicassimilares alestradiol,tantoenensayosinvivocomoinvitro[PugazhendhiD;2005][DarbrePD;2006][Golden R;2005]. 2.5.2.Productosdehalogenacin Cuandolosproductosdecuidadopersonalentranencontactoconaguadegrifoclorada,el cloropresenteenelaguapuedereaccionarconlosparabenespresentesensuformulacin. Ensuestructura,losparabenespresentanunsteryenposicinparaalmismo,ungrupo hidroxilo.Elgrupohidroxiloesungrupodador,demodoquelospareselectrnicosnocompartidos sedeslocalizanenelanilloaumentandosudensidadelectrnica,sobretodoenlasposicionesortoy paraalmismo.Porotraparte,elgruposteresloquesedenominaungrupodesactivanteenortoy para,dirigiendolasustitucinelectrfilaaromticahacialaposicinmeta.Estasdoscontribuciones favorecen la introduccin de electrfilos en las dos posiciones en orto al grupo hidroxilo. Los productosderivadosdeestareaccinenaguascloradassonel3cloro4hidroxibenzoatodealquiloy 3,5dicloro4hidroxibenzoato de alquilo. Del mismo modo, la presencia de bromuro en las aguas naturales,principalmentedeciudadescosteras,ennivelesdelordende2660ng/mL,haceposible que reaccione con el anillo aromtico mediante una sustitucin electrfila aromtica cuando es oxidadoabromoenpresenciadecloro[RicharsonSD;2003][vonGuntenU;2003].Porlotanto,es posible tambin la formacin de hidroxibenzoatos de alquilo bromados. En general, estos compuestossonmslipoflicosquelosparabenes(logKow2.486.78),demodoquetendranmayor tendencia a bioacumularse en los tejidos, y por lo tanto a ser potencialmente ms txicos, principalmente los bromados [Hansch C; 1972], aunque, a da de hoy, no hay ningn estudio que demuestreestosdatos.Porotraparte,susolubilidadesmayorapHsentornoa7,debidoaquesus pKas oscilan entre 3.1 y 6.78, con lo que cabe esperar que se encuentren mayoritariamente en disolucinacuosa.

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Metodologaanaltica

III.METODOLOGAANALTICA El fin de cualquier metodologa de preparacin de muestra es disponer del analito en el estadomspuroposibleyenundisolventecompatibleconlatcnicadedeterminacinutilizada. Paraello,enlamayoradelosproblemasanalticosesnecesariorealizarunaprimeraetapaenlacual aislaremoslosanalitosdelamatrizqueloscontieneconsiguiendosupurificacinyconcentracin.En muchos casos, es inevitable una etapa de transformacin de los analitos, variando una serie de propiedadesdelosmismosparafacilitarsudeterminacin. Enestetrabajosehanconsideradodistintostiposdemuestras,slidasylquidas,utilizando diversastcnicasdepreparacindemuestraquedescribiremosacontinuacinenfuncindeltipo dematrizalacualseaplican. 3.1.Preparacindemuestraparamatricesacuosas Las matrices acuosas suelen contener los compuestos a concentraciones muy inferiores a los lmites de deteccin de los equipos utilizados en la etapa de determinacin. Adems, es muy probablequelamatriznoseacompatibleconlatcnicademedida,porlocualsuelesernecesaria unaetapadepreparacindemuestraque,sobretodoenmatricesmedioambientales,nospermita concentrar los analitos y a su vez separarlos de otros compuestos que puedan interferir en su determinacin. Entre los mtodos preparacin de muestra empleados en esta Tesis Doctoral figuran la extraccinlquidolquido(LLE),laextraccinenfaseslida(SPE)ylamicroextraccinenfaseslida (SPME). 3.1.1.Extraccinlquidolquido(LLE) Laextraccinlquidolquidoesunatcnicadepreparacindemuestraenlacualseproduce una transferencia de los analitos desde una fase, generalmente acuosa, a otra orgnica, transferenciaregidaporunaconstantedereparto.Elmayorproblemaderivadodeestatcnicaesel granconsumodedisolventes,conelcorrespondientegastoyproblemamedioambiental. La LLE ha sido utilizada para extraer triclosn [Graovac M; 1995][Bester K; 2003 y 2005] [Sabaliunas D; 2003], metiltriclosn [Shelver WL; 2007], clorofenoles [Hanada Y; 2002][Mol HGJ; 2002]einclusoloscompuestospolicloradosprocedentesdelahalogenacindeltriclosn[Okumura T;1996]enmuestrasdeaguaresidualyaguasuperficial.Enestostrabajos,elpHdelamuestraseha ajustadoa2,ylaextraccinhasidollevadaacaboconhexano,toluenoodiclorometano.Elextracto obtenidoesconcentradoaunvolumenconocidoyderivatizadocondiazometano[KandaR;2003], 27

Introduccin

anhdrido actico [AdolfssonErici M; 2002], o agentes sililantes [Sabaliunas D; 2003][Shelver WL; 2007]parasuposterioranlisisporcromatografadegases.Ademsdeparamatricesacuosas,laLLE sehautilizadocomotcnicadeextraccindeltriclosndealimentos,potencialmentecontaminados porunaposiblemigracindelbactericidadesdeelfilmprotector,enzumos,fiambres,etc[Sanches Silva A; 2005], y para determinar la cantidad de triclosn en los plsticos que lo contienen como aditivo[JunkerLM;2004]. La extraccin con disolventes orgnicos tambin se ha empleado en la determinacin de triclosnymetiltriclosnenmatricesbiolgicas,talescomoorina[SioufiA;1997],plasmahumano [Birkel M; 1993][Sioufi A; 1997] y de pescado [Allmyr M; 2006 A y B][Alaee M; 2003], bilis [HoutmanCJ;2004],lechematerna[AdolfssonEriciM;2002][AllmyrM;2006AyB]yplacadental [RasmussenHI;1996].Tambinseutilizparaextraerlosparabenesentejidotumoraldepacientes con cncer de mama [Darbre PD; 2004]. En todas las aplicaciones descritas es necesaria una purificacinposteriordelextractodebidoalagrancomplejidaddelmismo. 3.1.2.Extraccinenfaseslida(SPE) LaSPEsedesarrollamediadosdelosaos70comoalternativaalaLLE.Hoyendaesuna de las tcnicas de preparacin de muestra ms ampliamente utilizadas en el caso de matrices lquidas o incluso gaseosas. Mediante la SPE, conseguimos concentrar y/o purificar los analitos mediantesuretencinenunafaseslida,ounafaselquidainmovilizadasobreunsoporteslido, para a continuacin proceder a su elucin con un disolvente adecuado [Rodrguez I; 2000][ThurmannEM;1998].Entrelasmltiplesventajasquepresentadestacanlassiguientes: El adsorbente de extraccin en SPE est contenido en tres posibles formatos: discos, cartuchos y jeringas. El primero se utiliza principalmente para concentrar grandes volmenes de muestra,entre2y4L[LoraineGA;2006][BoydGH;2003y2004],permitiendoflujosdepasode 28 bajamanipulacindelamuestra altopoderdeconcentracin obtencindeextractospurificadosconaltasrecuperaciones menorconsumodedisolventesencomparacinconLLE ausenciadeemulsiones posibilidaddeautomatizacin versatilidadeneltipodeadsorbentesutilizados[CmaraC;2002][CelaR;2002].

Metodologaanaltica

lquido muy elevados debido a la escasa Figura III.1. Distintos formatos de SPE: Jeringa, resistencia al paso de muestra que poseen, CartuchoyDiscos. mientras que los cartuchos y jeringas pueden ser fcilmente integrados en sistemas online con el equipo de medida, generalmente un cromatgrafo de lquidos. De este modo, la manipulacindelamuestraesmnima,aunque losvolmenesconcentradossoninferioresalos empleados en las aplicaciones offline [Bones J; 2006][YeX;2005y2006]. ElprocesodeconcentracindelamuestraenSPEconstadelassiguientesetapasbsicas, descritasenlafiguraIII.2. FiguraIII.2.EsquemadepreparacindemuestramedianteSPE. 1. Acondicionamiento de la fase Pasodela Limpiezade Elucindelos Acondicionamiento muestra columna compuestos estacionaria. Se hace pasar a travs del cartucho un disolvente o mezcla de disolventesadecuados,eliminandoaslas impurezas, hidratando la fase estacionariayfacilitandolatransferencia demateriaconlamuestra. 2. Paso de la muestra a travs del material adsorbente. El objetivo de esta etapa es retener cuantitativamente el Elucinde analito, consiguiendo adems un cierto Analitos interferencias gradodeselectividad. 3.Lavado.Seutilizandisolventescongranafinidadporlasinterferencias. 4.Elucin.Conundisolventeapropiadoserecuperaelanalitodelafaseadsorbente.Porlogeneral se utiliza un pequeo volumen de disolvente orgnico, aunque tambin se puede realizar una desorcintrmica[CelaR;2002]. Las fases adsorbentes en SPE son similares a las empleadas en cromatografa de lquidos. Las ms comunes son las de slices enlazadas, polmeros de tipo estirenodivinilbenceno, carbn grafitizado,silicatodemagnesio,slicagelyxidosdealuminio(tablaIII.1). 29

Introduccin

TablaIII.1.AdsorbentesmscomunesenSPE. Adsorbente Octadecilsilano(C18) Octilsilano(C8) Fenilsilano Slice Cianopropil Diolsilano SCX SAX CBA AmberlitaXAD2 BondElutENV IsoluteENV+ LiChrolutEN OasisHLB Tipodefase Invertida Invertida Invertida Normal Normal Normal Cambiadorinico Cambiadorinico Cambiadorinico Polimrica Polimrica Polimrica Polimrica Polimrica Estructura Si(CH2)17CH3 Si(CH2)7CH3 SiPh SiOH Si(CH2)3CN Si(CH2)4CHOHCH2OH Si(CH2)3SO3 Si(CH2)3N+(CH3)3 Si(CH2)3COO Poliestirenodivinilbenceno Poliestirenodivinilbenceno Poliestirenodivinilbenceno Poliestirenodivinilbenceno Divinilbencenovinilpirrolidona

Dentro de las aplicaciones encontradas para los analitos estudiados, la SPE es una de las tcnicasdeconcentracindemuestrasacuosasmsutilizada.Paraaguasresidualesysuperficiales, los polmeros ms empleados son slices funcionalizadas y materiales polimricos de fase reversa como el C18 [Agera A; 2003][Mc Avoy D; 2002][Benijts T; 2003] y el Oasis HLB [Singer H; 2002][HaldenRU;2005][HuaW;2005][BenijtsT;2004].Ademshayalgunaaplicacinenlaquese ha empleado adsorbentes mixtos conteniendo grupos funcionales apolares e intercambiadores aninicos (por ejemplo, Oasis MAX), para la extraccin conjunta de cidos orgnicos, fenoles, triclosnyparabenes[LeeHB;2005].Loseluyentescomnmenteusadossonacetatodeetilo[WuJL; 2007][Gmez MJ; 2007][Thomas PM; 2004], acetona [Gibson R; 2007][Paxus N; 2004], metanol [Lee HB; 2003][Quintana JB; 2004][Nakada N; 2006][Vanderford BJ; 2006][Bendz D; 2005] y acetonitrilo[HebererT;1997]. Tambin se ha seleccionado la SPE, combinada online, con cromatografa de lquidos (LC) paraextraereltriclosnydiversosclorofenolesenmuestrasdeorina[YeX;2005]ylechematerna [Ye X; 2006]. En el caso de los parabenes, existen mltiples estudios en donde la SPE ha sido seleccionada para la extraccin de estos aditivos en suspensiones de medicamentos [Rebbeck C; 2006],cosmticos[ShenHY;2007],colutorios[KokoletsiMX;2005]einclusoaire[RudelRA;2003]. 30

Metodologaanaltica

3.1.3.Microextraccinenfaseslida(SPME) Lamicroextraccinenfaseslidaesunatcnicadepreparacindemuestradesarrolladapor Belardi y Pawliszyn en 1989 [Cmara C; 2002][Pawliszyn J; 1997]. Se basa en la utilizacin de una fibra de slicefundida recubierta deuna fase adsorbente de naturaleza polimrica (figura III.3). Los analitospresentesenlamuestra,porlogeneral,noseextraencuantitativamenteenlafibra,sinoque seestableceunequilibrioentrelasfasesexistentesenelvialenelquesellevaacaboelprocesode extraccin[CelaR;2002].AdiferenciadelaSPE,SPMEnoprecisadedisolventesorgnicosyrequiere unamanipulacinmnimadelamuestra. FiguraIII.3.DispositivoparaSPME.
Cuerpodela jeringa Guadel mbolo

Muelle Ferrula y septum

Cuerpo ajustable

Piezade acerode fijacinde lafibra

Agujadeacero

Fibrade slicefundida

Elprocesodemicroextraccinenfaseslidasedesarrollaendosetapasbsicas: 1. Etapa de extraccin: Se expone la fibra a la muestra contenida en un vial sellado para que se produzcalamigracindelosanalitosdesdestahastalafibraduranteuntiempodado. 2.EtapadedesorcindelafibradeSPME:Seintroducelafibraenelinyectordeunsistemaanaltico (cromatgrafo de gases o de lquidos) donde los analitos sern desorbidos trmicamente o por disolucinenlafasemvil[CelaR;2002]. Elmuestreopuedellevarseacabodetresmodosdiferentes,segnlascaractersticasdelos analitosydelamuestra,esquematizadosenlafiguraIII.4: Extraccin directa o por inmersin (A): Se introduce la fibra directamente en la muestra lquida, producindoselamigracindirectadelosanalitosdesdelamatrizhastalafibra.Sesueleseleccionar cuandolasmuestrassonrelativamentesencillasylosanalitospocovoltiles.

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Introduccin

Extraccinenespaciodecabeza(HSSPME)(B):Lafibraesexpuestaalespaciodecabezaexistente sobre la muestra, de modo que los analitos pasan de la muestra al espacio de cabeza, y de ah, al recubrimiento polimrico. Es adecuado para compuestos voltiles en matrices que sufren tratamientos drsticos (modificaciones de pH, digestiones cidas o bsicas, etc), siendo adems selectivoconrespectoaaquellosanalitosdeelevadopesomolecular. Microextraccinenfaseslidaindirectaoatravsdeunamembrana(C):Entrelafibraylamuestra, sesitaunamembranaqueevitaeldeterioroquesepuedeproduciralanalizarmuestrascomplejas enlamodalidaddeinmersin[PawliszynJ;1997].Sumayorlimitacinradicaenlaexistenciadeuna barrera fsica entre la muestra y la fibra, que ralentiza enormemente la cintica del proceso de extraccin. FiguraIII.4.ModosdemuestreoenSPME:A)Muestreodirecto,B)MuestreoenespaciodecabezayC) SPMEindirectaoconmembrana.

La microextraccin en fase slida es una tcnica de equilibrio en la que se produce la distribucin del analito en las distintas fases existentes en el sistema. Los equilibrios se producen entre el polmero que recubre la fibra y la muestra, el espacio de cabeza y la muestra, y el recubrimientodelafibrayelespaciodecabeza.Encondicionesdeequilibrio,elbalancedemateria anteriorseresumeenlasiguienteecuacin:
C0Vs = Ch Vh + Cs Vs + CVf f

donde C 0 eslaconcentracininicialdeanalitoenlamuestra, C h , C s y C f son,respectivamente,la concentracinenelespaciodecabeza,enlamuestrayenlafibratrasalcanzarseelequilibrio.Por otraparte,Vseselvolumendemuestra,VhyVfsonlosvolmenesdelespaciodecabezaydelafibra. 32

Metodologaanaltica

Los coeficientes de reparto entre las tres fases presentes en el vial de extraccin vienen dadospor:
f K fh = C

Khs = Ch

f K fs = C

As, la cantidad de analito en el recubrimiento de la fibra ( n = C f Vf ) se puede expresar como:

n=

K fhKhs Vf C o Vs K fhKhs Vf + Khs Vh + Vs

Cuandosealcanzaelequilibrio:

Kfs=KfhKhs
Ysustituyendoenlaecuacinanterior:

n=

K fs Vf C 0 Vs K fs Vf + K hs Vh + Vs

Cuando no existe espacio de cabeza, es decir, la muestra llena por completo el vial de extraccin,eltrminoKhsVhdesaparecedelaexpresinanterior:

n=

K fs Vf C 0 Vs K fs Vf + Vs

Considerandoqueelvolumendelamuestraacuosa(Vs)esmuchomayorqueelvolumendel recubrimientodelafibra(Vf),puedecumplirsequeKfsVf<<Vs,enestecaso:

n=KfsVfCo

Estoes,unavezalcanzadoelequilibrio,lacantidaddeanalitoextradoserindependiente del volumen de muestra y directamente proporcional a su concentracin inicial en la muestra, el volumendefasecontenidaenlafibradeSPMEylaconstantederepartoentrelafibraymuestra.

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Introduccin

Comoseobservaenladeduccinanterior,laconstantededistribucinKfs,nosindicaquela eficaciadelaextraccinesdependientedelpolmeroquerecubrelafibradeSPMEascomodesu espesor,tablaIII.2.Unaelevadaafinidaddelafibraporlosanalitosesesencial,yaquelamatrizyla fibraestncompitiendoporlasespecies[CelaR;2002]. Desdeelpuntodevistacintico,laSPMEsebasaenlasegundaleydedifusindeFick,ya que se produce una difusin de los analitos desde el seno de la disolucin acuosa a la fase estacionariaquerecubrelafibra[PawliszynJ;1997][LordH;2000]. Cabedestacarquelasfrmulasdesarrolladasslosonaptascuandoelpolmeroquerecubre lafibradeSPMEesunlquido.Parapolmerosslidos,eltratamientoesanlogocuandosetrabaja con concentraciones bajas de analito, ya que el rea superficial disponible para la adsorcin ser proporcionalalvolumendelrecubrimiento,asumiendoquelaporosidadeshomognea. Tabla III.2. Recubrimientos comerciales utilizados, ms habitualmente, como fases extractantes en SPME. Faseestacionaria PDMSa PAa CWDVB PDMSDVB CARPDMS DVBCARPDMS
a

Espesordefase(m) 100 30 7 85 65 65 75 50/80

Polaridad Apolar Polar Polar Semipolar Semipolar Semipolar

Tmximadesorcin(C) 280 280 340 320 260 270 340 270

Fasespolimricaslquidas

EntrelosparmetrosqueafectanalaeficaciadelaSPME,losmsimportantesson: Temperatura. Afecta a la cintica de extraccin y a la cantidad de analito sobre la fibra en el equilibrio. Al aumentar la temperatura se acelera la transferencia de materia desde la matriz a la fibra, haciendo que la cintica sea ms rpida, mientras que en condiciones de equilibrio, al ser la SPMEunprocesoexotrmico,disminuyelamasadeanalitoincorporadaenlafibra. Tiempodeextraccin.LaSPMEesunatcnicadeequilibrioentrelasfasesexistentes,peromuchas vecesesimposibletrabajarenestascondiciones.Porello,desdeelpuntodevistaprctico,seutilizan tiempos menores que el necesario para alcanzar el equilibrio, trabajando entonces en condiciones cinticas.Eshabitualajustareltiempodemuestreoaladuracindelaetapaposteriordeseparacin cromatogrfica. 34

Metodologaanaltica

Efecto salino.Laadicindesales(NaCl,KCl,etc)provocaunaumentodelafuerzainica,variando entonceslasconstantesdedistribucindelosanalitosentrelamuestrayfibrayconello,laeficacia del proceso extactivo [Canosa P; 2006 B]. En general, la masa de analito extrada aumenta con la fuerza inica, aunque cuando la concentracin de sal es muy elevada puede provocar el efecto contrarioparaciertoscompuestos[LordH;2000][CanosaP;2005B]. pHdelamuestra.Cuandotenemoscompuestoscongruposcidosobsicos,elpHafectaalgradode disociacin de los mismos, y por lo tanto a su solubilidad. Para obtener la mxima eficacia de extraccin,sehadetrabajaraunpHdosunidadespordebajodelpKaencasodecompuestoscidos, ydosunidadesporencimaencasodelosbsicos. Volumendelamuestra.Engeneral,paraespeciesnoinicas,elvolumendelamuestraesmayorque eldelafibra,demodoquelacantidaddeespecieaextraerpuedesersimplementeproporcionalala concentracinen la muestra, el volumen de la fibra y el coeficiente de reparto Kfs. En ocasiones la cantidad de analito en la fibra aumenta con el volumen de muestra (Vs) hasta que se cumple que Vs>>KfsVf. A partir de ese momento, la eficacia de extraccin no aumenta con el volumen de la muestra, denominndose volumen infinito. En todo caso en SPME es muy poco habitual usar volmenesdemuestraporencimade100mL. Volumen de espacio de cabeza. Cuando se lleva a cabo el muestreo en la modalidad espacio de cabeza, el volumen del mismo ser muy importante, ya que si es muy grande, los compuestos voltilessediluyeneneste,disminuyendosuconcentracinenlafibra.Adems,amenortamaodel espaciodecabeza,msrpidaeslacinticadelprocesodeextraccin. Agitacin de la muestra. La agitacin favorece la difusin de los analitos que se encuentran en la matriz acuosa hasta la fibra, acelerando la cintica de extraccin. La influencia de la agitacin es especialmente significativa cuanto mayor sea el peso molecular de los compuestos y, sobre todo, cuandoseoperaenlamodalidaddemuestreoporinmersin. Adicindedisolvente.Laadicindedisolventesorgnicosamuestrasacuosasnormalmentereduce lacantidaddeanalitoextrada.Sinembargo,paramuestrasslidasaumentalaeficaciadeextraccin, yaquefavoreceladifusindelosanalitosdesdelamatrizalafibra[PawliszynJ;1997]. Dentro de las aplicaciones de la SPME a muestras acuosas, el anlisis de clorofenoles relacionadosconeltriclosneselcampoquepresentaunmayornmerodeaplicaciones,dentrode los analitos considerados en este estudio. Generalmente, se selecciona el muestreo en espacio de cabeza, para lo cual es necesario incrementar previamente la volatilidad de los compuestos derivatizndolos con anhdrido actico [Bartk P; 1997][Llompart M; 2002] o con un agente alquilantecomoelalquilcloroformiato,compatiblesconlasmuestrasacuosas [HenricksenT;2001]. LasfibrasqueproporcionanmayorrespuestaparaestoscompuestosderivatizadossonPA [BartkP; 1997][Ribeiro A; 2002], PDMS [Henricksen T; 2001][Llompart M; 2002] y CARPDMS [Llompart M;

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Introduccin

2002],siendorecomendableempleartemperaturaselevadasyadicindesalparamejorarlaeficacia delaextraccin. Enelcasodelosparabenes,laSPMEsehaempleadoparaelanlisisdecosmticosmediante espectrometra de movilidad inica, en donde la fibra triple DVBCARPDMS present mejores resultadosfrenteaPDMS,PAyPDMSDVB[LokhnauthJK;2006]. 3.2.Preparacindemuestraparamatricesslidas Laextraccinyrecuperacindelosanalitosenmatricesslidaspuederesumirseencuatro etapas:desorcindeloscompuestosdelossitiosactivosdelamatriz,difusindelosmismosatravs de la matriz, solubilizacin de los analitos en el extractante y la recoleccin de los extractos. La interaccinentrelosanalitosylasmuestrasslidassuelesermuchomsintensaqueenelcasodelas matrices lquidas, de modo que es necesario emplear tcnicas de extraccin ms enrgicas. En consecuencia, son tcnicas poco selectivas, de modo que muchas veces ser necesario considerar etapasposterioresdelimpieza. Dentro de las tcnicas utilizadas para la extraccin de parabenes y triclosn en muestras slidas, se encuentra la extraccin asistida por microondas (MAE), Soxhlet, la extraccin por ultrasonidos (US), la dispersin de la matriz en fase slida (MSPD) y la extraccin con disolventes presurizados(PLE)[CamelV;2001]. 3.2.1.Extraccinasistidapormicroondas(MAE) La extraccin asistida por microondas se basa en el uso de la energa de microondas para conseguir que los compuestos de inters pasen de la muestra a un disolvente adecuado. Es una tcnicarpida,queutilizavolmenespequeosdeextractanteyquepermiteelcontroldeunaserie deparmetrosqueafectanalaeficaciadeextraccin[CamelV;2000]. Elcalentamientoinducidoporlaenergademicroondassefundamentaenlaorientacinde dipolossometidosaunaradiacinelectromagnticadefrecuenciacomprendidaentrelos100mHzy los3GHz.Enpresenciadelcampoelectromagntico,losdipolosseorientanpreferentementeenuna determinadadireccin,volviendoaunestadodesordenadocuandoelcampocesa.Lafriccinentre molculas causada por estos movimientos provoca la emisin de energa calorfica. A 2.5 GHz (frecuencia a la que operan los extractores de microondas), el alineamiento de molculas polares seguidodelcorrespondienteretornoalestadodesordenado,ocurreaproximadamente5X109veces porsegundo,locualprovocauncalentamientosumamenterpido.

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Metodologaanaltica

Laaplicacindelaenergademicroondaspuedellevarseacaboenrecipientessellados(bajo control de presin y temperatura) o en vasos abiertos (presin atmosfrica). En el primer caso, el disolvente puede calentarse por encima de su punto de ebullicin a presin atmosfrica, mientras queusandorecipientesabiertos,latemperaturamximaalcanzadacorresponderaladelpuntode ebullicindeldisolventeapresinatmosfrica[BlangerJMR;2006]. Losparmetrosqueafectanalaeficaciadelaextraccinsonlanaturalezadeldisolvente,la temperatura,lapotencia,eltiempodeextraccinylanaturalezadelamatriz.Latemperaturaayuda a aumentar la difusividad de los analitos desde la matriz al disolvente. El efecto de la energa de microondas es fuertemente dependiente de la naturaleza del disolvente y de la matriz. Aquellos disolventes que tienen una elevada constante dielctrica experimentan una elevada temperatura, aumentandoladifusividaddelosanalitosdesdelamatrizaldisolvente,mientrasquelosdisolventes con una baja constante dielctrica prcticamente no son calentados, actuando simplemente como solubilizadoresdelosanalitos.Enestecaso,slosecalientalamatrizgraciasalapresenciadeagua ensuestructura[LettelierM;1999]. Lacantidaddeenergaaplicadaesunparmetroacontrolar,debidoaquepuedeproducir un calentamiento excesivo de la muestra. El tiempo de extraccin tambin es estudiado, debido a que valores excesivamente largos podran causar la degradacin de compuestos termolbiles. La mayoradeestosparmetrospuedenoptimizarsemediantediseosdeexperimentos,loquepermite establecerlascondicionesptimasconunmenornmerodeensayos,reduciendotiempo,trabajoy considerandolasposiblesinteraccionesquepuedentenervariosfactoresentres[EgizabalE;1998]. Por otra parte, las caractersticas de la matriz tambin pueden provocar variaciones en la recuperacin de los compuestos, sobre todo en matrices con alto contenido en materia orgnica, debidoainteraccionesanalitomatriz [CamelV;2000y2001].As,MahugoSantanaycolaboradores [MahugoSantana C; 2005] observaron que la naturaleza del suelo afect significativamente a la extraccindeclorofenolesmedianteextraccinmicelarasistidapormicroondas.Amayorcontenido de materia orgnica, se observ un descenso de la recuperacin de los mononitrofenoles y un aumentodelasealdelosalquilfenoles.Adems,laeficaciadeextraccindelosclorofenolesresult mseficazenaquellossuelosdenaturalezacida. En la mayora de las aplicaciones, es necesario llevar a cabo la purificacin del extracto obtenido debido a la escasa selectividad de esta tcnica. Rice y colaboradores [Rice SL; 2007] desarrollaronunametodologaparalaextraccindediversoscompuestosutilizadosenproductosde cuidadopersonal,entreloscualesseencontrabaeltriclosn,enmuestrasdesueloysedimentos.La extraccin,realizadaconunamezcladediclorometano:metanol(2:1),a115C,durante15minutos, proporcionextractosquetuvieronqueserpurificadosconslicapreviamenteasuanlisismediante GCMS.

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Introduccin

3.2.2.ExtraccinSoxhlet Soxhlet es la tcnica ms antigua para la extraccin de compuestos orgnicos en matrices slidas. Desarrollada en 1879, sigue siendo hoy en da una tcnica aceptada por la Agencia de Proteccin Medioambiental (EPA), como el mtodo 3540C, y usada como procedimiento de referenciaconrespectoalquesevalidanotrastcnicasmsactuales[FidalgoUsedN;2007]. FiguraIII.5.EquipodeextraccinSoxhlet. La extraccin exhaustiva de componentes Salidadeagua orgnicos en un sistema Soxhlet se lleva a cabo Condensador usando un disolvente orgnico, el cual refluye a Entradadeagua travsdelamuestracontenidaenundedalporoso AparatoSoxhlet de celulosa o vidrio, figura III.5. Las ventajas ms Slidoendedal importantes de la extraccin Soxhlet son el decelulosa contactocontinuodelamuestraconunaporcin Disolvente fresca de disolvente, simplicidad, bajo coste de adquisicin y la posibilidad de procesar grandes cantidadesdemuestra. Dentro de sus limitaciones, nos encontramos el tiempo necesario para la extraccin y los volmenesdedisolvente,engeneralmuyelevadosfrenteotrastcnicas,loqueimplicalanecesidad deconcentrarlosextractosorgnicosobtenidos[LuquedeCastroMD;1998]. Enloreferentealafamiliadecompuestosestudiados,sehanencontradoaplicacionesdela extraccinSoxhletparatriclosnymetiltriclosnenlodosdedepuradora,sedimentosyalgas.Parael caso de lodos, se ha utilizado acetato de etilo durante 6 horas. Los extractos fueron purificados mediantecromatografadepermeacinengel(GPC)paraeliminarlasmacromolculascoextradas [BesterK;2003].Paralasalgaselprotocolofueelmismoperosehautilizadodiclorometanoenvez deacetatodeetilocomodisolventedeextraccin[CooganMA;2007]. La combinacin del procedimiento Soxhlet con el uso de energa de microondas permite realizarextraccionesmuchomsrpidasconlamismaeficaciaqueunSoxhletconvencional.Morales Muoz y colaboradores [MoralesMuoz S; 2005] utilizaron esta combinacin para extraer contaminantescomoelbisfenolA,elestradiolyeltriclosndesedimentosmarinos.Enslo5ciclos deextraccinde120segundos,usando35mLdediclorometanoa100Wdepotencia,extrajeronlos compuestoscuantitativamente.ConlametodologaSoxhletconvencionalfueronnecesarios100mL dediclorometanoy24horasparaobtenerresultadosequivalentes.

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Metodologaanaltica

3.2.3.Dispersindelamatrizenfaseslida(MSPD) Ladispersindelamatrizenfaseslida(MSPD)esunatcnicadepreparacindemuestra con una gran aceptacin para la extraccin de compuestos orgnicos en matrices slidas o semislidas.Desarrolladaen1989porBarker [BarkerSA;1989],MSPDsebasaenladisrupcindela estructuradelamatrizconayudadeunmorteroylahomogenizacindelamismasobreunsoporte slido.Eldispersadoestransferidoauncartucho,normalmentedepolipropileno,ylosanalitosson eluidosconundisolventeapropiado(figuraIII.6). FiguraIII.6.EsquemadelprocesodeMSPD.
Elucin

Dispersin dela muestra Coadsorbente

Preparacindel cartucho

Laparticin(faseestacionarialquida)oelequilibriodeadsorcin(faseestacionariaslida), similaralexistenteenunacolumnacromatogrfica,esresponsabledeladistribucindelosanalitos entrelamuestradispersadayeldisolventedeelucin.LaeficaciayselectividadenMSPDdependede varios factores entre los cuales destacan la seleccin del material dispersante, utilizacin de co adsorbentes,eltipodedisolventeylasecuenciadeelucin. Naturalezadelsoporteslidoydelafaseenlazada.Losmaterialesderivadosdelaslicason los ms empleados en la disrupcin de la matriz en MSPD, ya que presentan la ventaja de poseer grupos silanoles no enlazados, tanto en la superficie de las partculas como en los poros, que interaccionanconelaguadelamuestra,actuandoasuvezcomoagentedesecante. Dentrodelosadsorbentesdenominadosdefasereversa,elmsempleadoeseloctadecil silano (C18), frente a otros como el C8 y el C30. El C18 est formado por partculas de slice con cadenashidrocarbonadasde18carbonos,unidasqumicamentealosgrupossilanoles.Laspartculas deslicaactancomodispersantes,mientrasqueelC18solubilizaloscomponentesdelamatrizsobre susuperficie.Conestetipodefasesesposibleobtenerextractosrelativamentelibresdegrasaspara muestrasdemsculo[KubalaDrinicH;2003][LeBoulaireS;1997],hgado[CrescenziC;2001][Horne

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Introduccin

C;1998],rin[RuizMJ;2005]ypescadosconaltocontenidolipdico[TollsJ;1999][GarcaReyesJR; 2007][CanosaP;2008],usandoacetonitrilocomodisolvente. En la actualidad, las fases reversas basadas en las cadenas hidrocarbonadas se estn sustituyendo por aminopropilslica o por aminas primariassecundarias (PSA) [GarcaReyes JF; 2007][Ferrer C; 2005][Cunha SC; 2007] para reducir el contenido de lpidos en los extractos procedentesdemuestrasbiolgicasdeorigenanimal. ElFlorisil(MgSiO3),laalmina(Al2O3)ylaslica(SiO2)sonadsorbentesdenominadosdefase normalutilizadosparalaextraccindepesticidas,herbicidasycontaminantesprioritariosenmatrices biolgicas [GmezAriza JL; 2002][Martnez A; 2005], vegetales y frutas [Hu YY; 2006] mediante MSPD. Adems, se han usado como dispersantes de muestras medioambientales (lodos de depuradora, sedimentos, polvo de aspiradora,) para la extraccin de contaminantes tanto prioritarios como emergentes [Pena MT; 2007][Blanco E; 2006][Shen X; 2006]. Estos adsorbentes puedenserutilizadostalcomoseencuentrancomercialmenteomodificadosmediantelaadicinde agua,cidosobasesenfuncindelascaractersticasyelcomportamientoquequeramosconferirles [CarroMA;2005]. Coadsorbente.Enmuchoscasosesposibleobtenerextractoslibresdeimpurezasmediante la purificacin onlinedel extractoprimario obtenido enMSPD.Estopuede lograrsecolocandouna capadecoadsorbente,generalmentededistintanaturalezaqueelslidoutilizadoparadispersarla muestra,alfondodelcartuchodeMSPD.Enmuchoscasos,estecoadsorbenteactareteniendolas interferencias [Pensado L; 2005], pero tambin puede destruirlas cuando presenta algn tipo de modificacinqumica[CarroMA;2005][CanosaP;2008]. Naturalezadelamatrizdelamuestra.Loscomponentesdelamatrizdispersadasemueven a travs de la fase cromatogrfica, contenida en el cartucho de MSPD, lo que hace posible un fraccionamientoenfuncindelanaturalezadeestoscompuestospresentesenlamatriz,ascomode lassustanciasinterferentesquepuedenhacermscomplicadosudeterminacinanaltica. Disolventeysecuenciadeelucin.AligualqueencromatografaoenSPE,lapolaridaddel disolventeesdegranimportanciaalahoradedeterminarqueanalitoseluyendelcartuchodeMSPD yenqueordenlohacen.Lacorrectaeleccindeldisolventeyeldiseodelperfildeelucinpermite obtener extractos libres de impurezas en base a la retencin de las mismas en la fase estacionaria [PensadoL;2005],omedianteunaprimeraelucinparaeliminarlasdelcartuchodeMSPD [Canosa P;2007B][GarcaM;2007]. 3.2.4.Extraccincondisolventespresurizados(PLE) La extraccin con disolventes presurizados, tambin denominada extraccin acelerada con disolventes(ASE),fuecomercializadaporlacompaaDionexen1995[FidalgoUsedN;2007].PLEes

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Metodologaanaltica

una tcnica de extraccin slidolquido que combina la utilizacin de temperaturas (50200C) y presiones elevadas (5003000 psi), con disolventes en estado lquido para proporcionar una extraccinrpidayeficazdelosanalitosdesdedistintostiposdematrices,contenidasenunacelda deacerosellada [GarridoLpezA;2005].Sehademostradoqueestatcnicaesequivalenteaotras metodologas como Soxhlet, siendo incluso utilizada como mtodo de referencia por la Agencia de ProteccinMedioambiental(USEPAMethod3545).Lapresinelevadaesnecesariaparamantenerel disolventeenestadolquidoalastemperaturasdetrabajo,normalmentesuperioresasupuntode ebullicin a presin atmosfrica. A estas temperaturas, ligeramente inferiores al punto crtico, las propiedades del disolvente se modifican, de modo que su viscosidad disminuye, penetrando con facilidadenlosporosdelamatriz,favoreciendoladifusindelosanalitos.Deestemodo,laeficacia deextraccinseincrementa,minimizandoelvolumendedisolventeempleada[RichterBE;1996]. Eltipodedisolventeylatemperaturadetrabajosonlosparmetrosquemsafectanala eficacia de PLE. El disolvente debe ser capaz de solubilizar los analitos sin arrastrar el resto de los componentesdelamatriz.Porsuparte,latemperaturatienequesersuficientementeelevadacomo paraaumentarlasrecuperacionesyfavorecerlacinticadeextraccin,sindegradaraloscompuestos objeto de estudio [ConchaGraa E; 2004][Rodil R; 2006]. Otros factores a estudiar a la hora de desarrollarunmtododePLEsonelnmerodeciclos,eltiempodeextraccinysecado,yenmenor medidalapresinenlasceldasdeextraccin,aunque,engeneral,esteltimonoesunparmetro queafecteengranmedidaalaeficaciadeextraccin,demodoquepuedeserfijadodeantemano [CamelV;2001]. Enlaextraccinenmodoesttico,eldisolventeesintroducidoenlacelda,mantenindolaa presinconstanteduranteuntiempopredeterminado.Trasestaetapa,laceldasevacarecogiendo todoelextractoenunvialcolector.Acontinuacin,sehacepasarunvolumendedisolvente,elcual viene expresado como tanto por ciento del volumen de celda (porcentaje de flush) para arrastrar posiblestrazasdelosanalitosquepudiesenquedarenlacelda.Esevolumen,enelcasodequese produzcan dos o ms ciclos de extraccin, es dividido entre el nmero de los mismos [Richter BE; 1996].AlgunosequiposdePLEposeenunavlvularestrictoraquepermiterealizarlaextraccinen mododinmico,demodoqueestpasandocontinuamenteunflujoconstantededisolventeatravs delaceldapresurizada.Enestecaso,laextraccinesmsefectiva,peropresentaelinconvenientede obtenerextractosconunvolumenelevado[CamelV;2001]. Elesquemadeunequipodeextraccincondisolventespresurizadossemuestraenlafigura III.7. 41

Introduccin

FiguraIII.7.Equipodeextraccincondisolventespresurizados.
Vlvulade mezcla Bomba

Horno

Vlvula depurga Celda Vlvulade esttica Vial colector Nitrgeno

Disolventes

Los equipos de PLE constan de una bomba paraimpulsareldisolvente,unhornodonde se introducen las celdas de acero presurizadas, para mantenerlas a la temperatura seleccionada, un vial colector en donde se recoge el extracto lquido, y nitrgeno para purgar la celda una vez terminadoelprocesodeextraccin.

La aplicacinde esta metodologa a laextraccin de triclosn y metiltriclosn en muestras slidassehacentradoensedimentosylodosdedepuradora.Lamuestraesmezcladaconunslido, generalmenteunsoporteinerte(arenaohidromatrix),pararellenartodoelvolumendelacelda.La utilizacin de diclorometano, como disolvente para la extraccin, a 100C durante 5 minutos, proporciona recuperaciones del orden del 100 % para el triclosn [Agera A; 2003][Singer H; 2002][ChuS;2007]yelmetriltriclosn [SingerH;2002].Burkhardtycolaboradores [BurkhardtMK; 2005] seleccionaron mezclas polares de agua:isopropanol a 120C y 200C para la extraccin de contaminantes antropognicos, entre los cuales se encontraba el triclosn, en sedimentos. PLE ha sidoaplicadatambinaladeterminacindetriclosnymetiltriclosnenpescado,seleccionandouna mezcladeciclohexano:diclorometano(1:1)paralaextraccindelosanalitos,conjuntamenteconla fraccinlipdica,yposteriorpurificacinporcromatografadepermeacinengel(GPC) [BalmerME; 2004y2005]. 3.2.5.Ultrasonidos(US) Es una tcnica sencillade extraccin slidolquido(USEPA 3550), endonde la muestra se poneencontactoconundisolventeadecuado,ysesometealosultrasonidosgeneradosenunbao deaguaoporunasondadeultrasonidos.Deestemodo,seproducelaagitacincontinuadelamatriz coneldisolventeorgnico.Elefectomecnicodelosultrasonidosprovocaunamayorpenetracindel disolvente en los materiales slidos, facilitando la transferencia de los analitos de la matriz al disolvente.Unavezfinalizadalaetapadesonicacin,secentrifugalamuestrayelsobrenadantese trata de modo adecuadopara realizar el anlisis. La eleccin deldisolvente es esencial para que el

42

Metodologaanaltica

mtodo permita obtener elevadas recuperaciones de los analitos de inters [FildalgoUsed N; 2007][CelaR;2002]. Debidoasusencillez,estatcnicaesutilizadaampliamenteenlaextraccindeparabenesen cosmticos[LabatL;2000][ZhangQ;2005],siendoseleccionadaenlaDirectiva96/45/ECdelaUnin Europeacomomtododereferenciaparaverificarlacomposicinenproductosdecuidadopersonal [ShenHY;2007][http://eurlex.europa.eu].Tambinsehandesarrolladometodologasdeextraccin detriclosnyparabenesenmatricesmedioambientalesbasadasenelusodeenergadeultrasonidos. As,Rudelycolaboradores [RudelRA;2003]determinaronlapresenciadediferentesparabenesen muestras de polvo, previamente sometidas a una etapa de lixiviacin en medio cido, mediante sonicacinenpresenciadediclorometano.Gatidou [GatidouG;2007]extrajolodosdedepuradora con una mezcla de metanol y agua para la determinacin de triclosn y otros contaminantes emergentes.ElextractoobtenidotraslasonicacinfuepurificadomedianteSPE. 3.3.Derivatizacin Laderivatizacinesunaoperacinorientadahacialatransformacindelosanalitosenotras especiesmscompatiblesconlatcnicadedeterminacin,oquepresentenmejorescaractersticas para su deteccin [Mol HGJ; 2002][Rodrguez I; 2000][Blau K; 1993]. En el caso de usar tcnicas cromatogrficas en la etapa de determinacin, los objetivos concretos de los procesos de derivatizacinson: 1. Mejorarlaestabilidadtrmicadelosanalitos 2. Mejorarlaresolucincromatogrficaentrepicos 3. Modificarindirectamentelasensibilidaddeldetector,introduciendoenlasmolculasgrupos orgnicosadecuadosqueincrementansurespuesta[CelaR;2002]. 3.3.1.Derivatizacinenmediohomogneo La derivatizacin en medio homogneo es aquella en la cual el agente derivatizante se adicionadirectamentealmedioodisolventequecontieneelanalito.Segnlaformaexperimentalde llevaracaboelproceso,podemoshablarde: Derivatizacindiscontinuauoffline.Laderivatizacinserealizapreviamentealaintroduccindelos analitosenelsistemacromatogrfico. Derivatizacinencontinuouonline.Laderivatizacinserealizaenelpropiosistemacromatogrfico [CelaR;2002]. 43

Introduccin

En el caso concreto de la cromatografa de gases, la modalidad ms utilizada es la derivatizacin offline, con distintos tipos de reacciones entre las que destacan las siguientes para compuestosfenlicos: Acetilacin. Se lleva a cabo utilizando anhdrido actico y una base, en medio acuoso u orgnico [HenriksenT;2001].AdolfssonErici,SioufiyBirkelhanseleccionadoestareaccinparaderivatizarel triclosn en extractos de leche humana, orina y plasma [AdolfssonErici M; 2002][Sioufi A; 1997][BirkelM;1993].Delmismomodo,losextractosobtenidosdemuestrasdecorchoybarricade robleparaelanlisisdeanisolesy2,4,6triclorofenol,fueronderivatizadosconestereactivoparaser determinadosposteriormenteenunsistemaGCECD[PizarroC;2006AyB]. Metilacin.Unadelasopcionesmsutilizadasalahoradederivatizareltriclosneslametilacin con diazometano. Este agente derivatizante presenta varios inconvenientes como la necesidad de generarse insitu,escarcinognicoydalugaraunareaccinmuyexotrmica [HellK;2000][BlauK; 1993].Porlogeneral,eldiazometanonoescompatibleconeldisolventequecontienelasespeciesa derivatizar, siendo necesaria la evaporacin a sequedad del extracto antes de aadir este derivatizante, as como eliminar el exceso del mismo al finalizar la reaccin [Ternes TA; 2002], adems de no permitir la distincin entre el triclosn y su anisol (metiltriclosn) presente en la muestra [Singer H; 2002]. An as, varios autores han utilizado la metilacin como reaccin de derivatizacindeltriclosn.Lamayoradeellosutilizarondiazometano[LindstromA;2002][KandaR; 2003][Alaee M; 2003][Nakada N; 2006][Graovac M; 1995][Agera A; 2003][Okumura T; 1996][Kronimus A; 2004], aunque algunos han recurrido a otros reactivos como el metil clorometanoato[WeigelS;2004][BendzD;2005][PaxusN;2004]. Sililacin.Sindudaeslareaccinmsverstilalahoradedeterminarsustanciascongruposcidos utilizandocromatografadegases.Mediantelaformacindelenlacesiliciooxgeno,sebloqueanlas interacciones dipolodipolo reduciendo la polaridad de aquellas especies con grupos hidroxilos o carboxilos.Laderivatizacindeberealizarseenmedioorgnico,empleandodisolventesnoprticos [BlauK;1993].Algunosautoreshanseleccionadoestareaccin,utilizandodiversosagentessililantes entre los que destacan el N,Ndietiltrimetilsililamina [Mc Avoy D; 2002], el N,Obis (trimetilsilil)trifluoroacetamida [Boyd GR; 2003 y 2004][Lee HB; 2005], el NmetilN (trimetilsilil)trifluoroacetamida [Ternes TA; 2002] y el N(tertbutildimetilsilil)N metiltrifluoroacetamida[QuintanaJB;2007][HebererT;1997][CanosaP;2005By2006A]. Formacin de pentafluorobencil y pentafluropropionil derivados. Esta reaccin se lleva a cabo con los correspondientes bromuros alquilfluorados, dando lugar a compuestos altamente estables [Allmyr M; 2006 B][Lee HB; 2005][Rule KL; 2005] y fcilmente detectables mediante ECD espectrometrademasasempleandoionizacinqumicaenmodonegativo. 44

Metodologaanaltica

3.3.2.DerivatizacincombinadaconSPME Enlosprocesosdemicroextraccinenfaseslida(SPME),laderivatizacinpuedellevarsea cabodedistintasmaneras. Derivatizacin directa sobre la muestra. La derivatizacin se produce en el vial que contiene la muestra, de modo que las formas derivatizadas son las extraidas por la fibra de SPME. En varias referencias se utiliza este modo de derivatizacin. Por ejemplo, la determinacin de ms de 30 fenolesenaguamedianteHSSPMEhasidollevadoacaboutilizandoanhdridoacticoparaacetilar los compuestos en disolucin acuosa [Llompart M; 2002]. Esta estrategia de anlisis haba sido utilizadatambinporBartk[BartkP;1997]. DerivatizacinsobrelafibradeSPMEoderivatizacinonfiber.Laderivatizacin onfibersepuede realizarincorporando,previamentealmuestreo,elderivatizanteenlafasepolimricadelafibrade SPME, de modo que el proceso de extraccin y derivatizacin tienen lugar de manera simultnea. Estamodalidaddetrabajonecesitaqueelderivatizanteseaestablecuandoseponeencontactocon lamuestra.Acontinuacin,enumeramosalgunostrabajosqueaplicanestametodologa. Tsai y colabradores [Tsai SW; 2003] expusieron la fibra a O2,3,4,5,6 (pentafluorobencil)hidroxilamina, para determinar aldehidos en una muestra acuosa mediante HS SPME.Kosterycolaboradores [KosterEHM;2002]emplearonladerivatizacin onfiber,exponiendo la fibra previamente al agente derivatizante (cloruro de pentafluorobenzoilo) para la posterior extraccindeanfetaminasenmuestrasdeorinamedianteSPMEporinmersin. Cuandoladerivatizacinserealizadespusdelaetapadeextraccin,lafibraconteniendo losanalitosseexponealespaciodecabezadeunvialdondesesitaelderivatizante.Engeneral,este mtodo se utiliza para especies poco voltiles presentes en muestras acuosas, usando agentes derivatizantesquesedegradanencontactoconagua[RodrguezI;2004]. Shaoycolaboradores [ShaoY;2003]aplicaronladerivatizacin onfiberalanlisisdetrans resveratrol, un compuesto fenlico, en vino, frutas y soja. Tras el muestreo mediante inmersin, derivatizaronelanalitoconbis(trimetilsilil)trifluoroacetamida. La determinacin de monosteres de cidos ftlicos mediante SPME por inmersin y posterior derivatizacin onfiber con diazometano fue llevada a cabo por Alzaga y colaboradores [AlzagaR;2003].Ensutrabajo,observaronquelaexposicindelasfibrasdeCWDVBalosvapores de diazometano daaba gravemente dicho recubrimiento. Engelmann y colaboradores [Engelmann MD; 2003] tambin escogieron esta metodologa para determinar clenbuterol en agua. Tras el 45

Introduccin

muestreo por inmersin con la fibra de PA, sta fue expuesta a un vial conteniendo hexametildisilazano. Musshoff y colaboradores [Musshoff F; 2002] propusieron un mtodo similar para la determinacin de cannabinoides en pelo. Tras una digestin bsica, extrajeron los analitos medianteHSSPMEyposteriormenteexpusieronlafibraaNmetilN(trimetilsilil)trifluoroacetamida [MusshoffF;2002].Brownycolaboradores [BrownH;2003]derivatizaronanfetaminaspresentesen fluidosbiolgicoscondiferentesalquilcloroformiatos,utilizadosespecficamenteparaespeciescon grupos amino, transformndolos en los correspondientes carbamatos. Rodrguez y colaboradores [Rodrguez I; 2004] analizaron frmacos cidos mediante SPME por inmersin y posterior derivatizacinonfiberconN(tertbutildimetilsilil)Nmetiltrifluoroacetamida. Derivatizacin en el puerto de inyeccin. En esta modalidad, la derivatizacin tiene lugar en el inyector del cromatgrafo de gases cuando los analitos y el reactivo derivatizante, presentes en la fibra,sesometenaaltastemperaturasdurantelaetapadedesorcin[CelaR;2002]. 3.3.3.Usodeagentessililantescomoreactivosdederivatizacin LautilizacindeagentessililantescomoderivatizantesdecompuestoscongruposOH,NH2 ySHesmuyhabitual,yaqueelsiliciotieneunagranafinidadporestosheterotomos [HebererT; 1997].Lareaccinpuedellevarseacaboenmedioorgnico,atemperaturamoderada,siempreque el disolvente empleado no contenga los grupos anteriormente descritos que consumiran el derivatizante[BesterK;2003][MusshoffF;2002]. Entre los agentes sililantes ms utilizados se encuentran el bis (trimetilsilil)trifluoroacetamida (BSTFA), el NmetilN(trimetilsilil)trifuoroacetamida (MSTFA) y el N (tertbutildimetilsilil)Nmetiltrifluoroacetamida(MTBSTFA)(figuraIII.8). Figura III.8. Estructura de los principales agentes sililantes utilizados para la derivatizacin de los compuestosestudiados.
HC 3 Si 3 3 CF 3 HC 3 N Si CH CH 3 3 CH 3 CH

HC O 3 Si CF 3 N CH 3

CH

O 3 CF 3

HC 3 Si N CH 3

CH

3 CH CH 3

CH

CH

MSTFA

MTBSTFA

BSTFA

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Metodologaanaltica

Diversos autores han seleccionado estos reactivos para la determinacin de triclosn, clorofenoles o parabenes mediante cromatografa de gases, tabla III.3. Para el desarrollo de las distintas metodologas descritas en esta memoria, se ha utilizado el MTBSTFA como derivatizante. Estereactivopresentaunagranventajafrenteaotrosagentessililantes:elgrupotertbutil,conun gran impedimento estrico, evita la hidrlisis de los enlaces oxgenosilicio, lo que hace que los derivadosobtenidosseanrelativamenteestablesfrentealahumedad [HebererT;1997][Spaulding RS;2002].Adems,encomparacinconotrosagentessililantes,presentabajotiempodereacciny normalmentestapuedeserllevadaacaboatemperaturaambiente[BlauK;1993]. Otraventajaadestacardeesteagentederivatizante,eslamayorestabilidadquepresentan las fibras de SPME a los vapores del MTBSTFA, en comparacin con otros agentes sililantes ms voltiles[RodrguezI;2004]. Tabla III.3. Resumen de aplicaciones empleando agentes sililantes como derivatizantes de los compuestosestudiados. BSTFA Analito
VariosPPCPS,TCS VariosPPCPs,TCS Contaminantesorgnicos, MeP,EtP,BuP PPCPs,TCS

Matriz
Lodosdepuradora Aguassuperficialesy residuales PolvoyAire Sedimentosysuelos

Condicionesderivatizacin
50Lderivatizante+50Lpiridinaal residuoseco,65C,20minutos 1mLderivatizantealextractoevaporado, 80C,20minutos Piridina:derivatizante(2:1)alresiduoseco, 70C,20minutos

Autor
GatidouG;2007 BoydGR;2003y 2004 RudelRA;2003 RiceSL;2007

MSTFA Analito
Clorofenoles

Matriz
Agua

Condicionesderivatizacin
50Ldeextracto+50Lderivatizante, 25C,60minutos

Autor
HebererT;1997

MTBSTFA Analito
Frmacos,estrgenos, fenoles,TCS Frmacoscidos,TCS

Matriz
Aguaresidual Aguaresidualynatural

Condicionesderivatizacin
50Lderivatizante+10Lpiridinaal residuoseco,60C,30minutos 75Lderivatizante+75Lextractoen acetonitrilo,75C,30minutos

Autor
GibsonR;2007 LeeHB;2005

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Introduccin

MTBSTFA Analito
TCS TCS;2,4DCF;2,4,6TCF Clorofenoles

Matriz
Aguaconsumo Aguaresidual Agua

Condicionesderivatizacin
20Lderivatizante+20Lextractoen nonano,25C,60minutos 20Lderivatizante+500Lextractoen acetatodeetilo,25C,5minutos 50Ldeextracto+50Lderivatizante, 25C,1h

Autor
ShelverWL;2007 QuintanaJB;2007 HebererT;1997

3.4.Determinacin Entrelasdistintastcnicasempleadasparalaseparacinydeterminacindeloscompuestos estudiados,lasmshabitualessonlacromatografadegasesacopladaaespectrometrademasasy, en menor medida, con sistemas de deteccin de captura electrnica y emisin atmica; y la cromatografa lquida de alta resolucin con deteccin ultravioletavisible o en combinacin con espectrometrademasas. 3.4.1.Cromatografadegases La cromatografa de gases (GC) se basa en la distribucin de los analitos entre una fase estacionaria,depositadaenlacolumnacromatogrfica,yunafasemvilogasportador.Lamayora delasaplicacionesaladeterminacindelosanalitosdeintersutilizancolumnasconfase5%difenil 95%dimetilsiloxanode30mdelongitud,comercialmenteconocidascomoHP5oDB5, [AgeraA; 2003][ZhaoRS;2007],condimetrosinternoscomprendidosentre0.25mmy0.32mm,yespesores defasede0.25m [BalmerME;2004][AdolfssonEriciM;2002].Normalmente,seutilizainyeccin enmodosplitless[SingerH;2002],aunquealgunosautoreshanconsideradoelempleodeinyectores de temperatura programada [Bester K; 2003 y 2005] para mejorar los lmites de cuantificacin obtenidos. Dentro de los distintos detectores utilizados para la determinacin de los compuestos estudiados,losmsselectivossoneldetectordecapturaelectrnica(ECD)yeldetectordeemisin atmica(AED). El ECD proporciona una respuesta selectiva hacia las molculas que poseen tomos electronegativos como el triclosn, metiltriclosn y clorofenoles [Birkel M; 1993][Graovac M; 1995][Sioufi A; 1997]. Evidentemente, carece de inters para parabenes. El detector de emisin atmica(AED)permiteladeteccindelaradiacinemitidaporlosdiferenteselementospresentesen losanalitosseparadosporlacolumnacromatogrfica.Elplasmaalimentadoporhelio,einducidopor microondas,consigueexcitaralostomos,dandolugaraunespectrodeemisinqueserdetectado 48

Metodologaanaltica

porunareddediodos.Muypocosautoreshanseleccionadoestatcnicaparadeterminartriclosnen muestras de agua residual [Van Stee LLP; 1999] debido a sus elevados lmites de deteccin para especiescloradas.Sinembargo,hasidoutilizadacomotcnicadedeteccinenladeterminacinde triclosnenplacadental[RasmussenHI;1996]. Sinduda,latcnicamsutilizadahoyendaparaladeterminacindecompuestosorgnicos a niveles traza es la cromatografa de gases combinada con la espectrometra de masas (GCMS). Mediante esta tcnica es posible obtener registros tridimensionales, es decir, para cada tiempo de retencin, obtenemos un espectro de masas de las especies que emergen de la columna cromatogrfica. ElanalizadordemasasutilizadoduranteeldesarrollodeestaTesisDoctoralesunatrampa de iones. El efluente cromatogrfico llega a la fuente de ionizacin, en este caso de impacto electrnico,consistenteenunfilamentodewolframioqueemiteelectronesaceleradosgraciasaun potencial aplicado entre el filamento y el nodo, figura III.9. Este chorro de iones impacta perpendicularmente con las molculas neutras procedentes de la columna cromatogrfica provocando su ionizacin. Las especies ionizadas pasan al analizador de masas que se encuentra a alto vaco (105 psi), para evitar la colisin y reconstruccin de los fragmentos cargados, sometindolosaunacorrientederadiofrecuenciasporpartedelelectrodoanular,queestabilizala trayectoriadeunfragmentoconunadeterminadamasa/carga(m/z)enunarbitacircular,mientras quelosrestantesfragmentoscolisionanconloselectrodoscolectoresconectadosatierra.Cuandoel potencialvara,esosfragmentossedesestabilizandesurbitaypasanaldetector,unmultiplicador deelectrones,dondeseintensificalasealdebidoalacascadadeelectronesquesegeneraencada colisin. En cada barrido, se registra un espectro de masas completo del efluente cromatogrfico [CelaR;2002][SkoogDA;1994]. FiguraIII.9.Trampadeionesutilizadacomoanalizadorenelespectrmetrodemasas.

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Introduccin

Otra posibilidad que tenemos dentro de la espectrometra de masas es realizar una refragmentacindelosionesprimarios.Laespectrometrademasasentndem(MS/MS)contrampa deiones,acopladaaGC,sehaconvertidoenlaherramientaanalticamspopularparaelanlisisde matricescomplejasdebidoasualtaespecificidadymoderadocoste.Laidentificacindelosanalitos sebasaenlostiemposderetencinylafragmentacinespecficadecadainprecursoraisladoenla trampa.Laespectrometrademasasentndemproporciona: - Mayor informacin estructural de los analitos, debido a la obtencin del espectro de los iones producto. - Incrementodelarelacinsealruido,eliminandoposiblesinterferenciasquepudiesenexistiren elespectrodemasas. Existen varios tipos de barridos para la obtencin de espectros de MS/MS, aunque el ms utilizadoparaelanlisisdemuestrasmedioambientaleseslaformacindeionesproducto.stosse generanpordisociacininducidaporcolisin(CID)delinprecursorcuandosesometeacolisiones sucesivasconhelioenlatrampa.Normalmente,esascolisionessonpocoenergticas,perolaenerga transicional del in precursor aumenta, convirtiendo la energa cintica en energa vibracional. Cuando el in precursor adquiere una gran cantidad de energa vibracional, los enlaces pueden romperse,formandoespeciesdemenorrelacinm/z. DentrodelasaplicacionesdeGCaladeterminacindetriclosn,parabenesycompuestos relacionados, lo ms habitual es utilizar espectrometrade masas conionizacin mediante impacto electrnico,registrandoloscromatogramasdecorrienteinicatotalTIC(totalioncurrent) [Sanches SilvaA;2005][LoresM;2005][AllmyrM;2006AyB],enmodoSIM(singleionmonitoring)[BesterK; 2005][CooganMA;2007][LeeHB;2005]oempleandoMS/MS[SingerH;2002][WuJL;2007]. 3.4.2.Cromatografadelquidos La cromatografa de lquidos (LC) se basa en la distribucin de los analitos entre una fase estacionariayunafasemvillquida.Esunatcnicaampliamenteutilizadaparaladeterminacinde triclosnyparabenes.Engeneralsesuelenemplearfasesestacionariasdenaturalezaapolar,deltipo C18 [YeX;2005][GanzeraM;2006], C8 [ZhangQ;2000][AgeraA;2003] ofenilhexil [QuintanaJB; 2004]ymezclasmetanol:aguaoacetonitrilo:agua,conalgnmodificadortipocidoactico [Halden RU;2005][LabatL;2000],acetatoamnico[KokoletsiMS;2005]otributilamina[QuintanaJB;2004], como fases mviles. Los sistemas de deteccin habitualmente empleados son ultravioletavisible y espectrometra de masas o masasmasas. La deteccin mediante espectroscopa ultravioletavisible se ha utilizado principalmente para el determinacin de parabenes en cosmticos [Borremans M; 50

Metodologaanaltica

2004][LabatL;2000],seleccionandolalongituddeondade254nmpararegistrarloscromatogramas. Enelcasodemuestrasmedioambientales,laespectrometrademasasylaespectrometrademasas en tndem son las opciones ms utilizadas para la determinacin tanto de triclosn como de parabenes [Ganzera M; 2006][Chu S; 2007]. Normalmente, la ionizacin se realiza mediante electrospray en modo negativo (ESI). Benijts [Benijts T; 2003] compar varias de las fuentes ms usadas en LCMS: la ionizacin qumica a presin atmosfrica (APCI), el electrospray (ESI) y la ionizacinconsprayinico(SSI)paraladeterminacinde20disruptoresendocrinos,entreloscuales seencontrabanlosparabenes.Losresultadosqueobtuvieronmostraronunpatrndefragmentacin y una sensibilidad similar para todas ellas, aunque APCI produjo espectros con peor relacin seal/ruido. Por ltimo, cabe destacar el uso de tcnicas como la electrocromatografa capilar [Huang HY;2004],unhbridoentrelacromatografalquidadealtaresolucinylaelectroforesiscapilar,yla electroforesis micelar electrocintica o electrocromatografa micelar [Mahuzier PE; 2001][Han F; 2008],paraelanlisisdeparabenesencosmticosyalimentos.

51

CAPTULOII

Mediosexperimentalesgenerales

I.MEDIOSEXPERIMENTALESGENERALES 1.1.Compuestosymaterialesutilizados 1.1.1.Reactivosydisolventes Aguaultrapura(MilliQ). Disolventes:nhexano,diclorometanoyacetonaparaanlisisdetrazas,Merck;acetatodeetilo, acetonitriloymetanolgradoHPLC,Merck. cidosybases:cidoclorhdrico(36%),Prolabo;cidosulfricoconcentrado(96%),AnalytiCals; cidoacticoglacialparaanlisis(99%),Merck;cidofrmico(96%),Aldrich;hidrxidosdico (98%),Merck. Sales:sulfatosdicoanhidro(99%),Merck;carbonatopotsico(99%),Aldrich;clorurosdico (99.9%), Vorqumica S.L.; tiosulfato sdico (99 %), Panreac; yoduro potsico (99 %), Aldrich; yodatopotsico(99%),Aldrich;bromuropotsico(99%),Aldrich. Reactivos clorantes: Hipoclorito sdico con una concentracin de cloro libre de 4 % (p/v), Aldrich. Derivatizantes:N(tertbutildimetilsilil)Nmetiltrifluoroacetamida,MTBSTFA(97%)Aldrich;bis (trimetilsilil)trifluoroacetamida,BSTFA(97%),Aldrich. 1.1.2.Patrones Triclosn(5cloro2(2,4diclorofenoxi)fenol)97%,Aldrich. 2,4diclorofenol, 2,3diclorofenol, 2,5diclorofenol, 2,6diclorofenol, 3,4diclorofenol, 3,5 diclorofenol,todosellosconpureza>98%,Merck. 2,3,4triclorofenol,2,4,6triclorofenol,2,3,5triclorofenol,2,4,5triclorofenol,2,3,6triclorofenol, todosellosconpurezadel99%,Merck. Metiltriclosn(5cloro2(2,4diclorofenoxi)anisol)>98%,TorontoResearchChemicals. Metilparaben,Etilparaben,Propilparaben,ButilparabenyBencilparaben,todosellosde99%de pureza,Fluka. 3clorometilparaben98%deAPINChemicalsLTDy3cloroetilparaben97%depureza,Aldrich. 2,4,6triclorobifenilo(PCB30)98.5%,DrEhrenstorfer.

55

Experimental

1.1.3.AdsorbentesparaSPEyfibrasdeSPME AdsorbentesdeSPE:CartuchosOasisHLB(60mg),Waters;cartuchosdeslicaSepPak,(500 mg)Waters; Florisil (60100 mesh), Aldrich; almina neutra (150 mesh), Aldrich; slica neutra (230400mesh),Aldrich;slicacida(5,10y20%cidosulfrico,preparadaenellaboratorioa partirdeslicaneutra);C18(70230mesh),Aldrich;arenalavadaconcidosulfrico,VWR. Fibras de SPME: Polidimetilsiloxano (PDMS) de 100 m, PolidimetilsiloxanoDivinilbenceno (PDMSDVB) de 65 m, Poliacrilato (PA) de 85 m, CarbowaxDivinilbenceno (CWDVB) de 70 myCarboxenPolidimetilsiloxano(CARPDMS)de75m,Supelco. 1.2.Instrumentacin

1.2.1.Materialgeneraldelaboratorio 56 Materialdevidriodeusohabitualenellaboratorio Balanzaelectrnicadeprecisin(SartoriusBP3150) Granatario(SartoriusBP310S) Placaagitadoracalefactora(Selecta) Barrasagitadorasmagnticasrecubiertasdetefln SoportemanualdefibrasparaSPME(Supelco) VialesdevidriodedistintosvolmenesparaSPME(10,20y100mL)conseptasdeelastmero recubiertasdetefln Vialesdevidrioparacromatografadegasesde1.5mLparamuestreadorautomtico Pipetasautomticasde20200Ly1001000L(Kartell,Eppendorf,Transferpette) ElectrododemembranadevidrioparamedidadepH(Methrom654) Filtrosdefibradevidriode47mmdedimetroy1mdetamaodeporo(Millipore) Filtrosdemembranade47mmdedimetroy0.45mdesterdecelulosa(Millipore) Filtrosdejeringade13mmdedimetroy0.22mdetamaodeporo(MillexGV) Jeringasde2mL Bombadevaco,modeloAspiratorA35(Eyela) Fritasdevidrio Tubosyconectoresdeteflon Baodeultrasonidos(Selecta) Estufa(Reyoe) Centrfuga(Unicen) TubosdecentrifugadePyrex

Mediosexperimentalesgenerales

EmbudosdeExtraccinLquidoLquidode250mL CartuchosdeSPEdepolipropilenode15mL(IST) Fritasdepolietilenode20mm(IST) Botellasdevidriombarde300mL Morterodevidriode100mLdecapacidad FiltrosdecelulosaparaPLEde20mm(Ahlstrom) MedidordecloroHI93710(HannaInstruments) Equipo de concentracin de muestras lquidas, por corriente de nitrgeno, Turbo Vap II Workstation(ZymarkCorporation) Tamizadorconplacasdedistintaluzdemalla(Retsch) LiofilizadorCryodoscon8bocas(Telstar) 1.2.2.Equiposdeextraccinutilizados Sistemadeextraccinpormicroondas:extractorEthos(Millestone)equipadocon12vasosde tefln. Sistema de extraccin condisolventes presurizados: ASE 200(Dionex) equipado con celdas de acerode11mLyvialescolectoresde60mL. ExtractorSoxhletconcapacidadpara125mLycartuchosdecelulosaparaextraccin(Supelco). 1.2.3.Programasinformticos PaqueteestadsticoStatgraphicsPlus5.1yStatgraphicsCenturionXV.I SaturnGCMSworkstationsoftware(versin5.4y6.42). 1.2.4.SistemasGCMS CromatgrafodegasesVarianCP3900conpuertodeinyeccintiposplitsplitlessacopladoaun espectrmetrodemasasdetrampadeionesSaturn2100T,provistodeunautosamplerVarian CP8400.Columna:HP5MS(30mx0.25mmd.i.x0.25mdf). CromatgrafodegasesVarianCP3800conpuertodeinyeccintiposplitsplitlessacopladoaun espectrmetrodemasasdetrampadeionesSaturn2200,provistodeautosamplerCombiPal. Columna:CPSil8(30mx0.25mmd.i.x0.25mdf). CromatgrafodegasesVarianGCStarCxconpuertodeinyeccintiposplitsplitlessacopladoa un espectrmetro de masas de trampade iones Saturn3. Columna: CPSil8 CB LowBleed/MS (30mx0.25mmd.i.x0.25mdf). 57

Experimental

1.3.Preparacindepatrones Se prepararon por pesada, en una balanza analtica de precisin, disoluciones stock individuales de 2 mg/g en metanol para cada uno de los compuestos objeto de estudio. Posteriormente,apartirdelasdisolucionesstock,seprepararon(tambinporpesada)disoluciones mezcladetrabajoenmetanol(parahacerlasadicionesamuestrasdeagua,lodos,polvoymaterial biolgico) y patrones de calibracin en acetato de etilo y en acetonitrilo de distintas concentraciones. Los patrones se almacenaron en congelador y los stock se prepararon aproximadamente cada12mesesparaprevenirposiblesproblemasderivadosdesudegradacin.

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Metodologadesarrollada

II.METODOLOGADESARROLLADA 2.1.Protocolosdepreparacindemuestra 2.1.1. Determinacin de triclosn y sus derivados en muestras acuosas mediante extraccinenfaseslida El protocolo desarrollado para concentrar muestras acuosas mediante SPE consta de los siguientespasos: 1. AcidificacindelamuestraapH23concidoclorhdrico2M. 2. Filtracinconfiltrosdefibradevidrio. 3. AcondicionamientodelcartuchoOasisHLB(60mg/3mL)con3mLdeacetatodeetilo,3 mLdemetanoly3mLdeaguaapH2. 4. Pasodelamuestraatravsdelcartuchoconunflujoaproximadode10mL/min. 5. Secadodelcartuchoconcorrientedenitrgenoa14psidurante30minutos. 6. Elucindelcartuchoconacetatodeetilo,recogiendo2mLdeeluyente. 7. En el caso de anlisis de muestras de agua residual, se procede a la purificacin de los extractos primarios con cartuchos de slica SepPak de 500 mg (Waters). Se deposita el eluato procedente del cartuchoOasis HLB en este adsorbente, eluyendo posteriormente unafraccinde5mLdeacetatodeetilo,queesconcentradaaunvolumenfinalde2mL. 8. Una alcuota de 0.5 mL del extracto se derivatiza con 20 L MTBSTFA a temperatura ambientedurante5minutos 9. Lospatronesdecalibradoseprepararonapartirdelasmezclascorrespondientesenacetato deetilo,siendoderivatizadosdelmismomodoquelosextractosdelasmuestrasdeagua. Figura II.1. Esquema del proceso de extraccin en fase slida para la determinacin triclosn, clorofenolesymetiltriclosn.

AjustarapH2 Filtrarconfibradevidrio Acondicionarcartucho(3mL AcOEt,MeOH,H2OpH2) Pasarlamuestraa10mL/min Secarcartuchoencorrientede N2 14psi,30min

Eluir 2mLdeacetatode etilo Sloaguasresiduales: PurificarconSepPak0.5g slica,elucin5mL y concentracina2mL 0.5mLextracto+20L MTBSTFA5min aT Ambiente

Oasis HLB

1L GCMS HP5MS

59

Experimental

2.1.2. Determinacin de triclosn y sus derivados en muestras acuosas mediante microextraccinenfaseslida Paraladeterminacindetriclosn,metiltriclosnyclorofenolesrelacionadosenaguaseha desarrolladootrametodologaanalticabasadaenlamicroextraccinenfaseslidacombinadacon una etapa posterior de derivatizacin onfiber. El protocolo se describe detalladamente a continuacin: 1. Acidificacindel agua a analizar a pH 4.5 con cidoclorhdrico 0.05 M. En el casode que contenga materia particulada, se proceder a la filtracin previa con filtros de fibra de vidrio. 2. Tomarunvolumendemuestrade20mLydepositarlaenunvialde22mL. 3. Adicin del patrn correspondiente en metanol para obtener la concentracin deseada, manteniendoelporcentajedemetanolenelvialdeSPMEpordebajode1%(v/v).Sellar concpsuladealuminioyconseptadetefln.Agitara500rpmdurante2minutos. 4. IntroduccindelafibradePAoPDMSDVBatravsdeunorificiopracticadoenelsptum, exponindoladirectamentealamuestraduranteeltiemposeleccionado(30minutos). 5. Traselmuestreo,retraerlafibraysacardelvial. 6. Exponer al espacio de cabeza de un vial de 1.5 mL, conteniendo 20 L de derivatizante (MTBSTFA)atemperaturaambiente,durante10minutos. FiguraII.2.Procesodemicroextraccinenfaseslidaparaladeterminacindetriclosn,clorofenoles ymetiltriclosn.
FibradePAoPDMSDVB 20mLmuestrapH4.5 Muestreoporinmersin. Agitacina500rpm 30min atemperatura ambiente

Derivatizacinonfiber 20LMTBSTFA Enespacio decabeza 10min

3min desorcin GCMS CPSil8LowBleed

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Metodologadesarrollada

2.1.3. Determinacin de derivados del cido parahidroxibenzoico en muestras de agua medianteextraccinenfaseslida El protocolo para la determinacin de metilparaben, etilparaben, propilparaben, butilparabenybencilparabenenaguasedetallaacontinuacin: 1. AcidificacindelamuestraacuosaapH23concidoclorhdrico2M. 2. Filtracindelamismaconfiltrosdefibradevidrio. 3. AcondicionamientodelcartuchoOasisHLB(60mg/3mL)con3mLdeacetatodeetilo,3 mLdemetanoly3mLdeaguaapH2. 4. Pasodelamuestraatravsdelcartuchoconunflujoaproximadode10mL/min. 5. Secadodelcartuchoconcorrientedenitrgenoa14psidurante30minutos. 6. Elucindelcartuchoconacetatodeetilo,recogiendo2mLdeeluyente. 7. Enelcasodeanlisisdemuestrasdeaguaresidual,seprocedealalimpiezadelosextractos con cartuchos de slice SepPak de 500 mg, Waters. Para ello, se deposita el eluato obtenido anteriormente en este segundo cartucho, y se eluye una fraccin de 5 mL con acetatodeetilo,queposteriormenteseconcentraraunvolumenfinalde2mL. 8. Setoman0.5mLdeeseextractoyseleaade40Ldelagentederivatizante(MTBSTFA).Se agitaysedejareaccionara70Cdurante1hora. 9. Lospatronesdecalibradoseprepararonapartirdelasmezclascorrespondientesenacetato deetilo,siendoderivatizadosdelmismomodoquelasmuestras. FiguraII.3.Esquemadelprocesodeextraccinenfaseslidaparaladeterminacindeparabenesen muestrasacuosas.

AjustarapH2 Filtrarconfibradevidrio Acondicionarcartucho(3mL AcOEt,MeOH,H2OpH2) Pasarlamuestraa10mL/min. Secarcartuchoencorrientede N2 14psi,30min

Eluir 2mLdeacetatode etilo Sloaguasresiduales: PurificarconSepPak0.5g, elucin5mL y concentracina2mL 0.5mLextracto+40L MTBSTFA60min a70C

Oasis HLB

1L GCMS HP5MS

61

Experimental

2.1.4. Determinacin de metilparaben, etilparaben, propilparaben, butilparaben y bencilparabenenmuestrasacuosasmediantemicroextraccinenfaseslida Para la determinacin de parabenes en muestras acuosas, se ha desarrollado tambin una metodologa basada en la microextraccin en fase slida con derivatizacin en la fibra de los compuestosestudiados: 1. VerificarqueelpHdelamuestraseencuentraentornoa67unidades.Enelcasodeque contengamateriaparticulada,seprocederalafiltracinconfiltrosdefibradevidrio. 2. Tomarunvolumendemuestrade10mLyadicionar150mg/mLdeNaCl,depositndolosen unvialselladode11mL. 3. Adicin del patrn correspondiente en metanol para obtener la concentracin deseada, manteniendo el porcentaje de metanol por debajo del 1 % (v/v) en el vial de extraccin. Sellarconcpsuladealuminioyconseptadetefln.Agitara500rpmdurante2minutos. 4. IntroduccindelafibradePAatravsdeunorificiopracticadoenelsptum,exponindola directamentealamuestraduranteeltiemposeleccionado(40minutos). 5. Traselmuestreo,retraerlafibrayretirarelvial. 6. Exponerlafibraalespaciodecabezadeunvialdevidriode1.5mL,conteniendo20Lde derivatizante(MTSBTFA),atemperaturaambientedurante10minutos. FiguraII.4.Procesodemicroextraccinenfaseslidaparaladeterminacindeparabenes.

FibradePA 1020mLmuestra 150mg/mL NaCl Muestreoporinmersin. Agitacina500rpm 40min atemperatura ambiente

Derivatizacinonfiber 20LMTBSTFA Enespacio decabeza 10min

3min desorcin GCMS/MS HP5MS

62

Metodologadesarrollada

2.1.5.Determinacindetriclosnyclorofenolesrelacionadosenmuestrasdesedimentos ylodosdedepuradoramedianteextraccinasistidapormicroondas La metodologa desarrollada para el anlisis de muestras de lodo de depuradora y sedimentossebasaenlaextraccinasistidapormicroondas.Elprocesocomienzaconlaliofilizacin de las muestras, seguido de la homogeneizacin de las mismas con un triturador. El protocolo se describeacontinuacin: 1. Se deposita 1 g de sedimento, 0.5 g de lodo liofilizados, en un vaso de microondas de teflncon30mLdeacetona:metanol(1:1)y300Ldecidofrmico. 2. Procederalaextraccinenelmicroondasa130Cdurante20minutosconunapotenciade 500Watios. 3. Centrifugar el extracto a 3500 rpm, recoger el sobrenadante y mezclarlo con 100 mL de NaOH0.2M(pH12.7). 4. Extraccinlquidolquidocon2x15mLdenhexano. 5. RecuperarlafaseacuosayajustarapH2.5conHCl2M. 6. RealizarlaSPEdeesafaseacuosatalcomosehadescritoenlaseccin2.1.1.,realizandoun lavado, previo al secado de los cartucho Oasis HLB 60 mg, con 25 mL de una disolucin acuosaal20%demetanol.LosextractossepurificarontambinconcartuchosdeslicaSep Pakde500mg. 7. Derivatizacin de 0.5 mL de extracto con 20 L de MTBSTFA durante 5 minutos a temperaturaambiente. 8. Inyeccin de 1 L de extracto en el cromatgrafo de gases, con determinacin mediante MS/MS. Figura II.5. Esquema de preparacin de las muestras de sedimentos y lodos de depuradora para el aislamientodetriclosnyclorofenolesrelacionados.
Mezclarcon100 mL NaOH 0.2M LLEcon2X15mL Hexano MAE:0.51g, 30mL acetona:metanol 1:1 300L cidofrmico 130C,20min,500W AcidificarFAapH2.5.SPE conelprotocolo2.1.1. Derivatizacinde0.5mL con20L MTBSTFA5min a TAmb 1L GCMS/MS HP5MS

63

Experimental

2.1.6.Extraccinconjuntadetriclosn,metil,etil,propilybutilparabenenmuestrasde polvousandoextraccincondisolventespresurizados Dentro del anlisis de muestras de polvo de ambientes interiores, se ha desarrollado una metodologa de extraccin con disolventes presurizados para los compuestos anteriores. Las muestras, recogidas de aspiradores domsticos, fueron tamizadas considerando la fraccin con tamaodepartculapordebajode60mparasuanlisis,almacenndolasatemperaturaambiente enrecipientesestriles.Lapreparacindelamuestrasellevaacabodelsiguientemodo: 1. Sepreparalaceldade11mLdeacero,introduciendodeabajoaarriba:2filtrosdecelulosa de20mmdedimetro,1gdesulfatosdicoanhidro,1gdeFlorisilactivado(130C/48h), lamuestradispersadacon3gdeFlorisilactivadoy1gdesulfatosdicoanhidro.Rellenarla celdaconsulfatosdicoanhidroycolocarunfiltrodecelulosa. 2. Seprocedeaunalimpiezapreviadelamuestraconnhexanoa40Cenuncicloestticode 4minutosa3.4MPa.Elflushseprogramaa50%ylapurgadelaceldasefijaen1minuto. 3. Laextraccindelamuestraserealizaconacetatodeetiloa103C,en3ciclosde1minutoa 13.8 MPa en esttico. El volumen de flush se fija en 100 % y el tiempo de purga en 60 segundos. 4. Concentrarelextractodeacetatodeetiloa2mLyfiltrarconfiltrosde0.22m. 5. Derivatizar 0.5 mL con 20 L de MTBSTFA, a 65C, durante 5 minutos e inyectar en el cromatgrafo1L. Figura II.6. Protocolo de preparacin de muestras de polvo mediante extraccin acelerada con disolventes.
1filtrodecelulosa Na2SO4 0.5gpolvo+1gNa2SO4+ 3gFlorisil activado 1gFlorisil activado 1gNa2SO4 Cleanup:nhexano 40C/4min/1 ciclo/3.4MPa/esttico/ 50%flush/60seg purga Extraccin:acetatodeetilo103C/1min/3 ciclos/13.8MPa/esttico/100%flush/60seg purga Concentracina2mL yderivatizacin0.5mL con20L MTBSTFAa65C/5min 1L GCMS/MS CPSil8

11mL

2filtrosdecelulosa

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Metodologadesarrollada

2.1.7.Extraccinconjuntadetriclosn,metil,etil,propilybutilparabenenmuestrasde polvomediantedispersindelamatrizenfaseslida Eltipodemuestrasempleadoenesteestudioylafraccinanalizadafueronlasmismasque enelcasoanterior.Elprotocolooptimizadodepreparacindemuestrasedetallaacontinuacin: 1. Pesar 0.5 g de polvo y 0.5 g de sulfato sdico anhidro y depositarlos en un mortero de vidrio. 2. Pesar 1.25 g de C18, aadirlos al mortero y realizar la dispersin de la muestra hasta la obtencindeunpolvomuyfino. 3. Enelcartuchode15mLdepolipropileno,conteniendounafritadepolietileno,sedepositan 2gdeFlorisilactivadoa130durante48horas. 4. Seaadeeldispersadodelmorteroyparacompactarelcontenido,seintroduceotrafrita. 5. Sehaceunlavadodelcartuchocon10mLdediclorometano,descartndolo. 6. Sesecaelcartuchoavaco. 7. Elucincon10mLdeacetonitriloyconcentracindelextractoa1mL.Filtrarconfiltrosde 0.22m. 8. Derivatizacinde0.5mLcon0.1mLdeMTBSTFAa45Cdurante5minutos. 9. Inyeccinde1LenGCMS/MS. FiguraII.7.EsquemadelprocedimientoparalaextraccindeparabenesytriclosnmedianteMSPD.
MSPD:0.5gpolvo+0.5gNa2SO4+1.25gC18,co adsorbente2gFlorisil activadoa130C/48h Fraccionamiento: Fr 1:10mL DCM(descartar) Secado Fr 2:10mL AcN

Concentrara1mL fraccinAcN Derivatizar 0.5mL +0.1mL MTBSTFA a45C,5min 1L GCMS/MS HP5MS

65

Experimental

2.1.8.DeterminacindetriclosnymetiltriclosnenmaterialbiolgicomedianteMSPD Se ha optimizado tambin un mtodo para la extraccin de triclosn y metiltriclosn en muestras de pescado y alimentos. En el caso del pescado, se eliminan espinas, piel y agallas. El msculoseliofilizahastaobtenerunamuestracompletamentesecayhomognea.Lasmuestrasde alimento, se utilizaron tal como se adquieren en el supermercado.El protocolo depreparacin de muestrasedescribeacontinuacin: 1. Se dispersan 0.5 g de muestra con 1 g de sulfato sdico anhidro y 1.5 g de slica neutra activada. 2. Enelcartuchodepolipropilenode15mLsedepositan,despusdelafritadepolietileno,3g deslicaimpregnadaconun10%(p/p)decidosulfrico. 3. Serecogen10mLdediclorometanoyseconcentranasequedad 4. Reconstituirelresiduocon1mLdeacetatodeetiloyfiltrarconfiltrosdejeringade0.22 m. 5. Sederivatizan0.5mLdeextractocon50LdeMTBSTFAdurante5minutosatemperatura ambiente. 6. SeinyectaunmicrolitroenelsistemaGCMS/MS. FiguraII.8.Protocoloparalaextraccindetriclosnymetiltriclosnenmuestrasbiolgicas.
MSPD:0.5gmuestra+1g Na2SO4+1.5gslica neutra, coadsorbente3gslica con 10%(p/p)H2SO4 Elucin10mL DCM Concentrarasequedad

Reconstituircon1 mL deAcOEt Derivatizar 0.5mL +50L MTBSTFA 20C,5min 1L GCMS/MS HP5MS

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Metodologadesarrollada

2.2.Condicionesdedeterminacin Los mtodos de determinacin propuestos utilizan la cromatografa de gases acoplada a espectrometra de masas, tanto simple (GCMS) como en tndem (GCMS/MS), como tcnicas de determinacin.Enelprimercaso,esposibleidentificarlasespeciespresentesenelcromatograma por sus espectros de masas, considerando la fragmentacin existente y comparando con la biblioteca de espectros. En el segundo caso, tal como ya ha sido mencionado anteriormente, es posibleincrementarlarelacinsealruido,ascomoobtenermayorselectividad.Porestarazn,la espectrometra de masas se ha seleccionado como tcnica de deteccin en muestras de agua, especialmenteenlosestudiosdedegradacindelosanalitosenaguaclorada,paralaidentificacin de los subproductos generados. Encambio, en elcasode las muestras slidas, se ha seleccionado MS/MSparaaumentarlaselectividadyreducirloslmitesdecuantificacinalcanzados. 2.2.1.GCMS Enlassiguientestablassemuestranlosparmetroscromatogrficos,ascomolosrelativos alespectrmetrodemasas,paraladeterminacindelosanalitosdeinters. Tabla II.1. Parmetros de determinacin de triclosn, metiltriclosn, clorofenoles y parabenes medianteGCMS. Parmetroscromatogrficos Columnacromatogrfica Inyector ModoInyeccin Tinyector Tiemposplitless Flujosplit Tinicial Rampa Tfinal Flujogasportador(He) SPME(TCS) CPSil8LowBleed Split/splitless Splitless PA:270C PDMSDVB:260C 3min 20mL/min 70C(3min) 10C/min 270C(10min) 1mL/min Iny.Directa(TCSyParabenes) HP5MS Split/splitless Splitless 280C(1L) 2min 20mL/min 50C(2min) 10C/min 270C(10min) 1mL/min

67

Experimental

ParmetrosMS Mododeionizacin Corrientedeemisindelfilamento Voltajedelmultiplicador Rangomasas Tmanifold Tlneadetransferencia Ttrampadeiones Tiempodedelay 2.2.2.GCMS/MS LassiguientestablassemuestranlascondicionesdedeterminacinenGCMS/MS.Parael desarrollodelmtododeMS/MSunavezseleccionadoelinprecursor,laventanadeaislamientoy el offset del multiplicador, se ha de optimizar el nivel de almacenamiento (Storage Level) y la amplitud de excitacin. La eleccin del in precursor o padre se hace en base a los espectros de masas de impactoelectrnico obtenidos realizandoun barrido completo (full scan). La ventanade aislamiento(IsolationWindow)permiteaislarenlatrampaunrangoprximoalinprecursor.Los valoresrecomendadososcilanentre1y14unidadesdem/z,aunquelomshabitualeslautilizacin de3unidadesdem/z,loqueimplicaquetomaunsegmentode1.5unidadesinferiorysuperiorala relacin m/z del in padre. El offset del multiplicador permite mejorar los lmites de deteccin incrementandoelvoltajedeldetector.Engeneral,seobservaunagananciade105cuandotenemos unoffsetde300V. Una vez fijados los parmetros anteriores, con ayuda de la herramienta de desarrollo automatizado de mtodos (AMD) que posee el software empleado, se han optimizado el nivel de almacenamientoylaamplituddeexcitacin. Elniveldealmacenamientodependedelamasadelinprecursor.Parasuclculo,seutiliza laherramientaqqueposeeelsoftware.Esteparmetrodependedelarelacinm/zdelinpadre o precursor y nos indica la masa ms baja que va a ser almacenada en la trampa una vez fragmentado ste, teniendoen cuentaque debe fijarse al menos dos unidades por debajo del in productoconmenorrelacinm/z. Para la optimizacin de la amplitud de excitacin se hace un barrido variando, hasta un mximo de 10 valores, el voltaje aplicado al in precursor. Este depender del tipo de onda que EI(70eV) 20A 2000V 100550m/z 50C 280C 220C 10min

68

Metodologadesarrollada

seleccionemos, siendo noresonante en el caso de iones de naturaleza lbil, frente al modo resonanteparaaquellosmsdifcilesdefragmentar,yaqueamayorvoltaje,menoreslaenergade laondaderadiofrecuenciasnecesariapararefragmentarelinprecursor. TablaII.2.ParmetrosdeGCMS/MSparaladeterminacindetriclosn,metiltriclosn,clorofenolesy parabenes. Parmetroscromatogrficos Columnacromatogrfica Inyector ModoInyeccin Tinyector Tiemposplitless Flujosplit Tinicial Rampa Tfinal Flujogasportador(He) SPME(Parabenes) HP5MS Split/splitless Splitless PA:270C 3min 20mL/min 70C(3min) 10C/min 270C(10min) 1mL/min ParmetrosMS/MS Mododeionizacin Corrientedeemisindelfilamento Voltajedelmultiplicador Tmanifold Tlneadetransferencia Ttrampaiones Tiempodedelay Mododepreparacin Ventanaaislamiento EI(70eV) 70A 2000V(offset+100V) 50C 280C 220C 10min CID,resonante 3m/z Iny.Directa(ParabenesyTCS) HP5MS/CPSil8 Split/splitless Splitless 280C(1L) 2min 20mL/min 50C(2min) 10C/min 270C(10min) 1mL/min

69

Experimental

AdquisicinMS/MS Compuesto 2,4DCF 2,4,6TCF 2,3,4TCF MTCS TCS MeP EtP PrP BuP BzP In precursor (m/z) 219 255 255 304 347 209 223 237 251 285 Nivelde almacenamiento (m/z) 96 110 110 130 140 92 98 104 110 90 Amplitudde excitacin(V) 0.53 1.10 1.10 1.50 1.50 0.5 0.5 0.5 0.5 0.4 Rangode adquisicin (m/z) 90230 100270 100270 120330 130360 85220 90240 90250 100260 80300 Ionesde cuantificacin (m/z) 183 217 217 232+252+254 200+310 177 151+177+195 151+195 151+195 163+241

70

CAPTULOIII

SPMEaplicadaalaextraccindeTriclosnycompuestosrelacionados

I. DETERMINACIN DE TRICLOSN Y SUS DERIVADOS EN AGUA MEDIANTE MICROEXTRACCINENFASESLIDA 1.1.Introduccin La extraccin lquidolquido y en fase slida son las modalidades ms comunes para la determinacin de contaminantes emergentes en muestras lquidas. En general, son tcnicas que precisangrandesvolmenesdemuestra,disolventesmuchasvecestxicosyetapasposterioresde concentracinylimpieza[SabaliunasD;2003][SingerH;2002][BoydGR;2003][LindstromA;2002]. Lamicroextraccinenfaseslida(SPME)hasidoseleccionadaparalaextraccinconjunta de triclosn, metiltriclosn, 2,4diclorofenol y 2,3,4triclorofenol en muestras acuosas como alternativa a otras tcnicas de concentracin. De este modo, se reduce el volumen de muestra, la manipulacin de la misma y el uso de disolventes orgnicos. Combinada con la cromatografa de gases, permite obtener lmites de cuantificacin muy bajos, ya que los analitos son desorbidos directamente en el inyector del cromatgrafo a alta temperatura. El problema lo encontramos cuandotenemosgrupospolaresenlasmolculasdelasespeciesadeterminar,comoeselcasodel triclosn y los clorofenoles, puesto que ser necesario la derivatizacin de los mismos para incrementar la eficacia de las separaciones cromatogrficas as como reducir los lmites de cuantificacindelmtodoanaltico.LaderivatizacinenSPME,talcomoseindicenlaintroduccin, puedellevarseacaboenlapropiamatrizosobrelafibra.Enelprimercaso,lomshabitualesaadir alamuestraelagentederivatizante,porejemploelanhdridoactico[LlompartM;2002],mientras que en el segundo, el derivatizante se deposita, previa o posteriormente a la extraccin de los analitos,sobrelafasepolimricadelafibradeSPME[RodrguezI;2004]. Dentro de las aplicaciones desarrolladas para la determinacin de triclosn en muestras acuosas, solamente hay una referencia relativa a la utilizacin de la SPME. Lores y colaboradores [LoresM;2005][SnchezPradoL;2006AyB]utilizaronlafibradepolidimetilsiloxano(PDMS)para estudiarladegradacinfotoqumicadeltriclosneidentificarlosproductosgenerados.Laeleccin delrecubrimientodePDMSsehaceenbasealaestructuradelpolmero,sinconsiderarsueficacia en la extraccin de los compuestos, puesto que este no presenta dobles enlaces que puedan absorberlaradiacinutilizadaparairradiarloscompuestosadsorbidos. Conrespectoalmetiltriclosn,nosehaencontradoningunaaplicacinenlaqueseutilicela microextraccinenfaseslidacomotcnicadeextraccin. Enelcasodelosclorofenoles,laSPMEhasidoampliamenteutilizadaparasudeterminacin enmatricesacuosas.EnlatablaI.1,seresumenlasaplicacionesmsrelevantes. 73

Determinacinyreactividadenagua

TablaI.1.AplicacionesdeSPMEparaladeterminacindeclorofenolesenmuestrasacuosas.
Analitosymatriz Procedimiento
Derivatizacin:anhdridoactico4L/mLy0.02gKHCO3 SPME1:HSSPMEconCARPDMS,12mLmuestracon0.6 g/mLNaCl,30mina100C SPME2:HSSPMEconPDMS,12mLmuestracon0.6g/mL NaCl,30mina60C. SPMEdirectaconPA,2mLmuestraapH2,saturadacon NaCl,60mina40Cconagitacina500rpm. Derivatizacin:1.2mLmuestra+50Ldepiridina(204 mg/L),fenantrenod10(0.1mg/L)y2,4Dd3(0.5mg/L)+ 300mgNaCl,mezclar30min.Aadir5L butilcloroformiato.Dejar24hreaccionando. SPME:PDMS20minHSSPME. SPMEdirectaconPA,20mLmuestra,10%NaCl,pH4, agitacin1000rpm,40mina35C. HSSPMEconPA,7.5mLmuestra,50mMHCl,0.2MKCl, 30mina80C. SPMEdirectaconPA,5mLmuestra,15%NaCl,40mina 70C. Derivatizacin:ExposicindelafibraPDMSDVBalHSdel vialcon1.5mLclorurodepentafluorobencilo0.1%(v/v) entolueno,20mina40C Extraccin:SPMEdirectacon3mLmuestra,2%(p/v) K2CO3,agitacin,10mina40C. SPME:SPMEdirectaconCarbowax/TPR100,4mL muestra,30%NaCl,pH2.7,agitacin550rpm,40mina 40C. Desorcin:introducirfibraen60Lde5%polioxietileno 10laurilter10min.

Detec.

LOD (ng/L)

RSD (%)
0.3 7.7

Ref.

30fenolesenagua(2,4 DCF,2,4,6TCF,2,3,4 TCF) 13clorofenoles(2,4 DCF,2,3,4TCF,2,4,6, TCF)enlixiviadosde suelos

GCMS

313

(1)

GCMS

525

4.5 5.2

(2)

Pesticidascidos,entre ellos2,4DCF,enagua

GCMS

160

4.6 8.3

(3)

10fenoles(2,4DCF, 2,4,6TCF)enagua Variosclorofenoles(2,4 DCF,2,4,6TCF)enagua Variosfenoles(2,4DCF) enagua

GCMS GCFID GCFID

5360 4060 350

6.3 11 3.6 4.7 1.2

(4) (5) (6)

Variosclorofenoles(2,4 DCF,2,4,6TCF)enagua

GCECD

105

6.4 10.3

(7)

8clorofenoles(2,4DCF, 2,4,6TCF)enagua

HPLC DAD

1100 2200

7.5 11.5

(8)

(1)LlompartM,2002;(2)RibeiroA,2002;(3)HenriksenT,2001;(4)GuerraSimesN,2007;(5)PortilloM,2006;(6)Lanas FM,2007;(7)BianchiF,2002;(8)MahugoSantanaC,2007.

1.2.Experimentosprevios 1.2.1.Identificacincromatogrfica Laidentificacindelosanalitos,enelmtododeSPME,sellevacaboutilizandoeltiempo deretencindelospicosregistrados,ascomolosespectrosdemasasobtenidosenfullscanparalos

74

SPMEaplicadaalaextraccindeTriclosnycompuestosrelacionados

compuestos derivatizados. Los clorofenoles y el triclosn presentan en su estructura un grupo hidroxiloelcualessusceptibledesufrirunareaccinconelagentesililantedandolugaraunterde siliciocon114unidadesdemasasobreelpesomoleculardelanalitodepartida,figuraI.1. FiguraI.1.ReaccinentreeltriclosnyelMTBSTFA.
Cl O Cl Cl H 3C Si N C H3 C H3 CH 3 CH 3 CH3
Cl CH3 Cl O Cl O Si CH3

OH

CF3

Elcompuestotertbutildimetilsililado,alentrarencontactoconlafuentedeionizacin,da lugar a un fragmento caracterstico de m/z [M57]+, correspondiente a la prdida del grupo tert butilo.Debidoalapresenciadetomosdecloroenlasmolculasdelosanalitos,seobtuvoelpatrn de fragmentacin derivado de la abundancia isotpica de este elemento. Para el cloro elemental existendosistoposenlanaturaleza:el 35Clyel 37Cl,conabundanciasrelativasde75.77%y24.23 %,respectivamente.Dadoqueestamosconsiderandocompuestosdiclorados(2,4DCF)ytriclorados (2,3,4TCF,TCSyMTCS),losionesdefragmentacin[M57]+y[M+257]+presentarnabundancias relativas 3:2 para el caso de compuestos diclorados y 1:1 para los triclorados. En la figura I.2 se puedenobservarlosespectrosdemasasdelosanalitosconsiderados. FiguraI.2.Espectrosdemasasparael2,4DCF,2,3,4TCFyTCSderivatizados,yelMTCS.
219 100%
Cl Cl O Si+

Triclosn

MTBSTFA

Triclosnsililado

100%

253 255
Cl Cl

Cl O

Si+

75%
O Si+

221

75%
Cl Si

50%

Cl

183
Cl

50%
Cl O Cl

Si+

Cl

257

Cl Cl

Si

25%

185

[M.]+276+278

25% 183

217

219 225 250 275

[M.]+310+312 300 m/z

0% 175 200 225 250 m/z

0% 200

75

Determinacinyreactividadenagua

[M.]+302+304 100%
O

302 304
O + Cl Cl Cl O Cl OMe
Cl O O Cl Cl

100%

345
Si+

347

75%

Cl

252

75% 200

50%
O Cl

OMe +

254 306

50%
O

Si+ Cl Cl Cl O Cl O Si+

349

Cl O

Si

25%

232 234

267

25%

202

Cl

310

312 350

[M.]+402+404 m/z

0% 230 250 270 290 310 m/z

0% 200 250 300

En base a estos primeros experimentos, se establecieron los parmetros de identificacin delosanalitos,utilizandocomotcnicadedeteccinGCMS,tablaI.2. TablaI.2.ParmetrosdeidentificacinenGCMSparatriclosnycompuestosrelacionados.
Tr(min)1 Ionescuantificacin(m/z) Ionesidentificacin (m/z) 219 221 183 253 255 257 217 302 304 252 232 345 347 349 310 200 Intensidades relativas(%) 100 73 24 90 100 37 10 93 100 41 11 95 100 36 7 28

2,4DCF

17.01

219+221

2,3,4TCF

19.51

253+255

MTCS

22.64

302+304

TCS

24.73

345+347

ColumnatipoCPSil8LowBleed

76

SPMEaplicadaalaextraccindeTriclosnycompuestosrelacionados

1.2.2.EvaluacindelaviabilidaddelmuestreomedianteSPMEconderivatizacinonfiber Inicialmente,seevalulaposibilidadderealizarlaextraccinmedianteSPMEylaposterior derivatizacinonfiberconMTBSTFA.Paraello,enunvialde22mL,sedepositaron20mLdeagua ultrapura con adicin de un patrn en metanol que contiene triclosn, metiltriclosn, 2,4 diclorofenol y2,3,4triclorofenol, de modo que la concentracin aproximada fue de 5 ng/mL en la muestra.Serealizelmuestreoporinmersinconagitacina500rpm,conunagitadormagntico recubierto de tefln, durante 15 minutos. Para las pruebas preliminares, se seleccion la fibra de poliacrilato (PA) debido a que su naturaleza polar hace que sea adecuada para la extraccin de fenolesporinmersin[RibeiroA;2002].Traselmuestreo,lafibraseexpusoalespaciodecabezade un vial de 1.5 mL conteniendo 50 L de MTBSTFA durante 20 minutos a 40 C, utilizando las condiciones de derivatizacin descritas previamente por Rodrguez y colaboradores para anti inflamatorioscongruposcarboxlicos[RodrguezI;2004].Trasesetiempo,lafibrasedesorbienel puerto de inyeccin del sistema GCMS. Los experimentos, llevados a cabo por cuadruplicado, mostraronunavariabilidadenlasealparaloscompuestosderivatizadosinferioral7%,tablaI.3. Porotraparte,seevalusiduranteesteprocesoelmetiltriclosnsufraalgntipodedegradacin. Laconclusinfuequesurespuestanosemodificabaporlapresenciadelderivatizante. TablaI.3.Repetibilidaddeextraccin(N=4)yderivatizacinonfiberpara2,4DCF,2,3,4TCF,MTCSy TCS.
Compuesto 2,4DCF 2,3,4TCF MTCS TCS RSD(%) 1.8 5.0 4.2 6.2

En los cromatogramas de GCMS se han encontrado seales intensas que correspondena especiestertbutildimetilsililadas,figuraI.3.Porotraparte,nohubopresenciadeloscompuestossin sililar,loqueimplicaqueelprocesodederivatizacinenlafibraescuantitativo.

77

Determinacinyreactividadenagua

Figura I.3. Cromatograma de GCMS para una muestra de agua (5 ng/mL) extrada con SPME y derivatizacinonfiber.
100% 75% 50% 25% 0% 219

MCts 6

183 175 200 225 250 m/z 302

100% 75% 50% 25% 183 0%

255

2 4

217 200 225 250 275 300 m/z 347

TCS

MTCS
4
100% 252 75% 50% 25% 232 267 0% 230 250 270

290

310 m/z

100% 75% 50% 200 25% 0% 200

310 250 300

387 350 m/z

2 1 1

2,3,4TCF

2,4DCF

0 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 minutos

1.3.OptimizacindelprocesodeSPMEconderivatizacinonfiber Unavezdemostradalaviabilidaddelprocesodederivatizacinonfiberdeloscompuestos objeto de estudio, se ha llevado a cabo la optimizacin sistemtica de las distintas variables que pueden afectar a la eficacia del proceso de preparacin de muestra con objeto de maximizar su rendimiento. Enprimerlugar,seestudiaronlosfactoresquepuedenafectaralaeficaciadeextraccin, manteniendolascondicionesdederivatizacinusadasenlaspruebaspreliminares(exposicindela fibraalespaciodecabezadeunvialconteniendo50LdeMTBSTFAdurante20minutosa40C). Para estos experimentos, el nivel de adicin de 2,4DCF, 2,3,4TCF, TCS y MTCS a las muestras de agua se fij en 10 ng/mL, y el tiempo de muestreo, salvo que se indique lo contrario, fue de 30 minutos. 1.3.1.Mododemuestreo Laposicindelafibraesunodelosparmetrosmsimportantesalahoradeoptimizarun mtododeSPME.Losmodosdemuestreoevaluadoshansido:

78

SPMEaplicadaalaextraccindeTriclosnycompuestosrelacionados

o o o

Muestreoporinmersin(directo)atemperaturaambiente Muestreoenespaciodecabeza(HS)atemperaturaambiente MuestreoenHSa100C.

Para identificar el modo de muestreo que permite obtener las mayores eficacias de extraccin,sellevaronacabounaseriedeexperimentosexponiendolafibradepoliacrilatodurante 30 minutos a 15 mL de agua ultrapura ajustada a pH 2 con HCl 0.1 M, en viales de 22 mL. Los resultadosobtenidossemuestranenlasiguientefigura,figuraI.4. FiguraI.4.Sealrelativaparalosdiferentesmodosdemuestreoconsideradosfrentealmuestreopor inmersin.
Sealrelativaalmuestreopor inmersin 6 5 4 3 2 1 0 Inmers i n HSa TAmb HSa 100C 2,4DCF 2,3,4TCF TCS MTCS

En el grfico anterior se puede observar que, con la excepcin del metiltriclosn que presentaunarespuestaelevadaparaelmuestreoenespaciodecabezaa100C,lamejoropcines efectuarelmuestreoporinmersin,atemperaturaambiente.Puestoqueelobjetivodeltrabajoes ladeterminacinconjuntadeloscuatrocompuestos,seseleccionelmuestreoporinmersinpara proseguirelestudio. 1.3.2.Comparativadedistintasfases Laseleccindelafaseextractanteesunparmetroimportantealahoradedesarrollarun mtododeSPME,yaquelaeficaciadeextraccinseveclaramenteafectadaporlanaturalezadel recubrimientodelafibra. La eleccin previa de la fibra de poliacrilato (PA) se ha hecho en base a las propiedades polares que presenta este polmero, que lo hacen adecuado para la extraccin de clorofenoles, aunquelascaractersticasdeltriclosny,especialmente,delmetriltriclosn,menospolaresquelos

79

Determinacinyreactividadenagua

clorofenoles, sugieren la posibilidad de utilizar otras fases. Las fibras estudiadas, as como las temperaturasyeltiempodedesorcinempleadossemuestranenlasiguientetabla,tablaI.4. TablaI.4.Fibrasutilizadas. Faseest.
PDMS PDMSDVB PA CARPDMS CWDVB

Espesor(m)
100 65 85 75 65

Toperacin
200270C 200270C 200310C 240300C 220250C

Tdesorcin
260C 260C 270C 270C 220C

Tiempodesorcin
3min 3min 3min 3min 3min

Los experimentos se llevaron a cabo exponiendo las fibras directamente a 20 mL deagua ultrapura,conadicindeloscompuestos(10ng/mL),durante30minutos.Losresultadosobtenidos, figura I.5, muestran que las fibras de PA, CWDVB y PDMSDVB, con caractersticas polares y semipolares, son las que presentaron mejores resultados para la extraccin conjunta de los compuestos. FiguraI.5.RespuestasnormalizadasconrespectoalafibradePAparalasdistintasfasesevaluadas (N=3).
PA PDMS CWDVB PDMSDVB CARPDMS

RespuestanormalizadarespectoaPA

2.00 1.80 1.60 1.40 1.20 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 2,4DCF 2,3,4TCF MTCS Compues to TCS Res pues ta promedi o

Porotraparte,lafibradePDMStambinproporcionbuenosresultadosparaeltriclosny, sobre todo, para el metiltriclosn, pero, en cambio, el rendimiento de la extraccin fue muy bajo paralosclorofenoles,observandouncomportamientoinversoenelcasodelafibradeCARPDMS.El

80

SPMEaplicadaalaextraccindeTriclosnycompuestosrelacionados

triclosn y el metiltriclosn presentan constantes de particin octanolagua elevadas (4.8 y 5.4) frentealosclorofenoles(2.99y3.66),demodoquelautilizacindefasesdecaractersticasapolares, como es el caso de PDMS, favorece la extraccin de aquellos compuestos ms lipoflicos. Por otra parte, la fibra de CARPDMS posee una naturaleza bipolar debido a la combinacin de ambos polmeros. Esta fibra presenta mayor afinidad por los compuestos de menor tamao (2,4DCF y 2,3,4TCF), ya que la relacin entre el tamao molecular de los analitos y el tamao de poro del carboxeninfluyeenormementeenlacapacidaddeadsorcindeestepolmero.Lasfasespolimricas denaturalezapolar,PAyCWDVB,ylafibradePDMSDVB(semipolar),resultaronadecuadasparala extraccinconjuntadeloscuatroanalitos.Finalmente,seseleccionaronlasfibrasdePDMSDVByPA paracontinuarelestudio,descartandolafibradeCWDVB,debidoaquevariosautoreshandescrito problemas de estabilidad para este recubrimiento, adems de que no aporta ventajas adicionales respectoapoliacrilatoyPDMSDVB[AlzagaR;2003][RodrguezI;2003]. 1.3.3. Optimizacin de las condiciones de muestreo con poliacrilato y PDMSDVB: Influenciadelaagitacin,fuerzainicadelmedioypH Utilizando el programa estadstico Statgraphics 5.1, se evalu la influencia de estas tres variables en la eficacia de la SPME mediante un diseo factorial 23, con 2 puntos centrales. Los valoresdeestasvariablesenlosdistintosexperimentosfueronlosindicadosenlatablaI.5.Comose puedecomprobar,entodosloscasos,elpHsemantienepordebajodelpKadeloscompuestos.Los experimentosdescritosenlatablaI.5sellevaronacaboconambasfibras,empleandomuestrasde agua ultrapura (15 mL) con adicin de los compuestos a 10 ng/mL. Los resultados obtenidos para cadaunodelosanalitossegnlafaseutilizada,semuestranenlatablaI.5. TablaI.5.Experimentosrealizadosparaevaluarlascondicionesptimasdeextraccinparalasfibras dePAyPDMSDVB.Respuestasobtenidasenreasdepico.
Exp. NaCl(g) 1 2 3 4 5 6 2.0 0.0 0.0 4.0 0.0 2.0 Agitacin (500rpm) Sin Sin Sin Sin Con Con pH 4.5 6.0 3.0 3.0 6.0 4.5 PA(readepicox104) DCF 18 102 64 90 334 88 TCF 26 160 98 130 960 139 MTCS 60 182 273 99 1900 904 TCS 29 119 67 84 492 529 PDMSDVB(readepicox104) DCF 50 89 128 68 691 255 TCF 46 109 158 92 992 126 MTCS 233 237 252 184 2234 1075 TCS 77 88 118 124 913 730

81

Determinacinyreactividadenagua

Exp. NaCl(g) 7 8 9 10 4.0 0.0 4.0 4.0

Agitacin (500rpm) Con Con Sin Sin

pH 6.0 3.0 6.0 3.0

PA(readepicox104) DCF 83 299 120 522 TCF 126 763 189 865 MTCS 467 1248 51 226 TCS 95 586 170 529

PDMSDVB(readepicox104) DCF 307 749 105 856 TCF 184 1065 106 1141 MTCS 464 2630 226 580 TCS 610 1026 148 628

Traseltratamientodelosdatos,conelpaqueteestadsticoStatgraphics5.1,seobtuvieron loscoeficientesestandarizadosparalosefectosprincipalesasociadosconlosfactoresconsiderados, tablaI.6.Estoscoeficientesestimanelefectodeunfactordadoenelrendimientodelaextraccin paracadacompuesto.Suvalorabsolutoesproporcionalalainfluenciadelcorrespondientefactoren elprocesodeSPME.Unsignopositivo,indicaunincrementoenlaeficaciadeextraccincuandoel factorcambiadelnivelbajoalaltoeneldominiodeldiseo,mientrasqueelsignonegativoindicaun comportamientoopuesto. Latendenciafuesimilarparaambasfibras:laagitacinresultserelfactormsimportante conunefectopositivoenlaeficaciadelaextraccin,sobretodoparaloscompuestosmslipoflicos (TCS y MTCS), probablemente debido a sus bajos coeficientes de difusin en agua. La adicin de clorurosdicoprovocunadisminucindelasealparatodosloscompuestos,siendosignificativa (95%confianza)paraelMTCSconambasfasespolimricas,yparaelTCSconPDMSDVB.Porltimo, el pH parece ejercer un efecto negativo aunque no significativo en la extraccin. En base a estos resultados, el pH se fij en 4.5 unidades, un valor intermedio en el dominio del diseo, para asegurarsedequeloscompuestosestnenformaprotonada(2unidadespordebajodesupKa).La agitacin, dado que mejora significativamente la eficacia de extraccin se mantuvo en 500 rpm duranteelmuestreo. TablaI.6.Coeficientesestandarizadosdelosefectosprincipalesparalosfactoresconsideradosenla optimizacindelprocesodeSPMEutilizandoPAyPDMSDVB.
Agitacin NaCl pH
a

PA DCF 2.1 0.02 0.8 TCF 2.3 0.07 0.4 MTCS 12.0a 9.1a 2.5 TCS 9.5a 1.8 0.9 DCF 3.2a 0.5 0.9

PDMSDVB TCF MTCS 2.3 8.7a 0.7 6.5a 0.9 0.6

TCS 26.0a 5.5a 1.2

Factoresestadsticamentesignificativosparaunniveldeconfianzadel95%

82

SPMEaplicadaalaextraccindeTriclosnycompuestosrelacionados

Dentro del rango estudiado en el diseo, la adicin de sal provoc una reduccin en las respuestasdelosanalitos.EnconcretoparaelcasodelMTCS,conambasfibras,yparaelTCS,conla fibradePDMSDVB,elefectofueestadsticamentesignificativo.Desdeelpuntodevistacinticola sal ralentiza la difusin de los analitos desde la muestra a la fibra, sobre todo para las especies lipoflicas.Porotrolado,atendiendoalatermodinmicadelaSPME,deberaresultarpositivapara especiespolaresynoinicas(porejemplo,el2,4DCFyel2,3,4TCF).Portanto,antesdefijarelvalor ptimodeestefactor,sereevalusuefectoadiferentesniveles.LafiguraI.6muestraque,incluso paralosfenoles,laeficaciadeextraccin(usandolafibradePA)disminuyeconlaadicindecloruro sdico.Portanto,seprescindidelaadicindesalparaexperimentosposteriores. FiguraI.6.Efectodelasalenlaextraccindeloscompuestosmspolares(fibradePA).
2,4DCF 2000 reas(x10 ) 1500 1000 500 0 0 0.05 0.1 0.15 NaCl(g/mL) 0.2 0.25 0.3
4

2,3,4TCF

TCS

1.3.4.Volumendemuestra El volumen de muestra est relacionado con la sensibilidad del mtodo, de modo que se consiguelacantidadmximadeanalitoenlafibracuandosellegaaldenominadovolumeninfinito.A partir de este punto, la cantidad de analito extrada es independiente del volumen de la muestra empleadoyvienedadopor n=KfsVfC0

Paraevaluarlainfluenciadeestavariableenlaeficaciadeextraccinserealizaronunaserie deexperimentosutilizandovolmenesdemuestrade10,20y110mL,envialesde11,22y120mL, conteniendo la misma concentracin de los analitos (10 ng/mL) y considerando un tiempo de extraccinde30minutosparaambasfibras(PAyPDMSDVB),figuraI.7.Talcomosepuedeobservar enlagrfica,nohaydiferenciassignificativasentrelosvolmenesde10y20mLparaambasfibras. 83

Determinacinyreactividadenagua

Para100mLdeagua,seapreciunapequeadisminucinenlaseal,principalmenteparaelTCSy MTCS con la fibra de PA. Este comportamiento puede deberse a problemas de agitacin y, por lo tanto,unadifusinmenoseficazdelosanalitoshacialafibra. Elvolumendemuestrautilizadoenexperimentosposterioresfuede20mL,noobstanteen elcasodedisponerdepocamuestra,sepuedereducira10mL. FiguraI.7.InfluenciadelvolumendemuestraenlaeficaciadelaSPME(N=3).
10mL 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 24DCF 234TCF PA MTCS TCS 24DCF 234TCF MTCS TCS 20mL 100mL

Seal(reasx10 )

PDMSDVB

1.3.5.Tiempodeextraccin Uno de los aspectos a considerar en los mtodos de SPME es la influencia del tiempo de extraccin en la cantidad de analito concentrado sobre la fibra. Hasta alcanzar condiciones de equilibrio,elrendimientodelaextraccinaumentaconeltiempodeexposicinalamuestra. Se realiz el estudio de la cintica de extraccin para ambas fibras, utilizando 20 mL de agua, ajustada a pH 4.5, con un nivel de adicin de los compuestos de 5 ng/mL. Los tiempos de extraccinestudiadosfueron5,10,30,45,60,90y120minutos.Posteriormente,seprocediala derivatizacindelosanalitosretenidosenlafibra,exponindolaalespaciodecabezadeunvialcon 50LdeMTBSTFAdurante20minutosa40C,traslocualsedesorbienelinyectordelsistemaGC MS. En la figura I.8 se puede observar que tras dos horas de muestreo todava no se ha alcanzadoelequilibrio.Porotraparte,cabedestacarlasimilitudenlosperfilesdeextraccindelos compuestosconambasfibras.Laexcepcinfueel2,4diclorofenol,quepresentunamayoreficacia deextraccinconlafibradePDMSDVBfrentePA,dentrodelintervalodetiempoestudiado.

84

SPMEaplicadaalaextraccindeTriclosnycompuestosrelacionados

Debidoaquenosealcanzaelequilibriotrasdoshorasdemuestreo,stehaderealizarse bajocondicionescinticasparaqueelprocedimientodesarrolladoseaaceptabledesdeelpuntode vista del tiempo dedicado a la preparacin de la muestra. Para ajustar la duracin de la etapa de preparacindemuestra(extraccinyderivatizacin)aladeseparacincromatogrfica,selimitel tiempodemuestreoa30minutos. FiguraI.8.Cinticasdemicroextraccinparalosanalitosobjetodeestudio.
2,3,4TCF,PA 2500 2000 reasx10
4

2,3,4TCF,PDMSDVB

MTCS,PA

MTCS,PDMSDVB

1500 1000 500 0 5 10 30 45 Tiempo(min) 60 90 120

2,4DCF,PA 1600 1400 1200 reasx10
4

2,4DCF,PDMSDVB

TCS,PA

TCS,PDMSDVB

1000 800 600 400 200 0 5 10 30 45 Tiempo(min) 60 90 120

85

Determinacinyreactividadenagua

1.3.6.Optimizacindelascondicionesdederivatizacin El efecto del tiempo (1040 minutos), temperatura (4070C) y volumen de derivatizante (20100L)enlasealanaltica(reasdepico)sehaestudiadoutilizandoundiseoexperimentala 2 niveles con 3 puntos centrales. La matriz de experimentos utilizada se muestra a continuacin, tablaI.7. Lasextraccionessellevaronacaboconmuestrasdeaguaultrapura,apH4.5,conadicinde loscompuestosanivelde5ng/mL.Trasunmuestreode30minutos,seexpusolafibraalespaciode cabeza de un vial conteniendo MTBSTFA, en las condiciones indicadas en la tabla I.7 para cada experimento.Losresultadosobtenidos,enreadepico,semuestranenlasiguientetabla. TablaI.7.Matrizdeexperienciasyresultadosobtenidosenlaoptimizacindeladerivatizacinon fiber.
Exp. T(C) Tiempo (min) 25 10 40 40 40 10 10 25 40 10 25 PA(readepicox104) Vol.(L) DCF 60 20 100 100 20 20 100 60 20 100 60 136 155 165 56 211 181 117 129 91 193 144 TCF 576 520 691 393 619 521 471 556 527 596 514 MTCS 1602 1255 1762 1107 1276 1276 1088 1158 1438 1401 1198 TCS 780 632 904 532 670 547 602 742 716 685 617 DCF 316 263 341 149 372 498 319 383 219 436 399 TCF 549 473 526 417 554 701 562 651 566 618 651 MTCS 1290 1125 1344 1212 1299 1759 1401 1750 1724 1355 1613 TCS 590 488 559 504 550 771 606 712 711 609 681 PDMSDVB(readepicox104)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

55 70 40 70 40 40 70 55 70 40 55

Tras el tratamiento estadstico de los datos, se obtuvieron los valores de los coeficientes estandarizadosparalosefectosprincipalesylasinteraccionesdeordendosentrefactores,figuraI.9. Slo se encontraron factores estadsticamente significativos (95 % confianza) para el 2,4DCF y el

86

SPMEaplicadaalaextraccindeTriclosnycompuestosrelacionados

2,3,4TCF.Enelcasodeltriclosn,ningnfactorafectalaeficaciadeladerivatizacin,mientrasque paraelmetiltriclosn,talcomoeslgico,nohubovariacindelasealdelmismo,figuraI.9. Para el 2,3,4TCF y sobre todo para el 2,4DCF, el tiempo y la temperatura afectaron significativa y negativamente a las respuestas obtenidas para ambas especies, lo cual puede ser explicadoporunadesorcinparcialdeestoscompuestosdurantelaexposicindelafibradeSPME alagentederivatizanteatemperaturaselevadas. Figura I.9. Carta Pareto correspondiente a la optimizacin de las condiciones de derivatizacin on fiber,usandoMTBSTFA,paralasfibrasdePAyPDMSDVB.
2,4DCF BC AC PDMSDVB AB C:T B:MTBSTFA A:Tiempo BC AC AB PA C:T B:MTBSTFA A:Tiempo 10 8 6 4 2 0 2 4 2,3,4TCF MTCS TCS

Efectosestandarizados

Porotraparte,lainteraccintiempotemperatura(AC)yvolumendeMTBSTFAtemperatura (BC)influyerontambindemodonegativoenlassealesobtenidasparaalgunoscompuestosconla

87

Determinacinyreactividadenagua

fibra de PA. Este comportamiento sugiere de nuevo la posibilidad de prdidas en la etapa de derivatizacinatiemposytemperaturaselevadas,ademsdedesplazamientodelosanalitosporel agentederivatizante,figuraI.10. FiguraI.10.Grficosdeinteraccionesparael2,4DCFyel2,3,4TCFconlafibradePA.
Interacciones2,4DCF 220 190 160 130 100 70 10.0 AB 40.0 10.0 AC + + 40.0 20.0 BC + 100.0 + + +
2,3,4TCF(reax104) 670 630 590 550 510 470 430 10.0 AB 40.0 10.0 AC 40.0 20.0 BC + + + + + 100.0 + Interacciones2,3,4TCF

En vista de los resultados anteriores, el tiempo y el volumen de derivatizante se mantuvieronensusvaloresbajos(10minutosy20LdeMTBSTFA,respectivamente)conobjetode minimizarladuracindelmtodopropuestoademsdelconsumodederivatizante.Alobservarque unamenortemperaturaredundabaenmayoresrespuestas,serealizaronpruebasadicionalespara evaluarlaviabilidaddellevaracaboladerivatizacinonfiberatemperaturaambiente,figuraI.11. FiguraI.11.Derivatizacinonfiberatemperaturaambienteversus40C(N=3).
40C 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 2,4DCF 2,3,4TCF PA MTCS TCS 2,4DCF 2,3,4TCF MTCS TCS TAmbiente

2,4DCF(reax104)

reasx10

PDMSDVB

Tanto los valores medios de las respuestas obtenidas como sus coeficientes de variacin, fueron similares en ambas condiciones para las dos fibras. Por conveniencia, en experimentos posteriores,laderivatizacinsellevacaboatemperaturaambiente,evitandoaslanecesidadde

88

SPMEaplicadaalaextraccindeTriclosnycompuestosrelacionados

utilizarsistemasdecontroldetemperatura.Porlotanto,lascondicionesfinalesdederivatizacinon fiber fueron 20 L de agente derivatizante (MTBSTFA), temperatura ambiente (20 2C) y 10 minutos,paraambasfibras. 1.3.7.Evaluacindelosefectosdememoria Despus de la desorcin de la fibra, en el puerto de inyeccin del cromatgrafo, pueden quedarrestosdelosanalitosenlafasepolimricaquedaranlugaraproblemasdecontaminacin en el anlisis de la siguiente muestra. Por esa razn, es necesario evaluar si la temperatura y el tiempodedesorcinutilizadossonsuficientesparaeliminarcompletamentelosanalitosdelafibra. Traslarealizacindeunmuestreosobreaguaconunniveldeadicindelosanalitosdelordende3 ng/mL, con posterior derivatizacin e inyeccin en un GCMS, se desorbi de nuevo la fibra para determinarlosposiblesrestosdelosanalitossobrelamisma.Adems,paraponerdemanifiestola presencia de especies sin derivatizar en el recubrimiento, se repiti el experimento anterior pero exponiendolasfibrasdenuevoaunafraccinfrescadelagentederivatizante,antesdelasegunda desorcin.Losporcentajesdeseal,respectoalaprimeradesorcindelafibra,semuestranenla tablaI.8paraambasfibras. TablaI.8.SealrelativaenlasegundadesorcindelasfibrasdeSPME.
%Seal relativa 2desorcin Derivatizacin +2desorcin PA 24DCF 0.0 0.0 234TCF 0.0 0.0 MTCS 0.4 0.5 TCS 0.9 1.2 24DCF 0.0 0.0 PDMSDVB 234TCF 0.0 0.0 MTCS 0.7 1.3 TCS 0.9 1.7

Enprimerlugar,cabedestacarlasimilitudentrelosresultadosobtenidosparalasdosfibras. Se puede observar que, tras tres minutos de desorcin, se eliminaron completamente los analitos msvoltiles(2,4diclorofenoly2,3,4triclorofenol)mientrasqueparaelmetiltriclosnyeltriclosn los efectos de memoria representaron entre el 0.4 y el 1.7 % de sus reas de pico en la primera desorcin. Las seales relativas en la segunda desorcin fueron similares tanto considerando la etapaadicionaldeexposicinalagentederivatizantecomosinconsiderarla,loqueindicaqueestas seales proceden de restos de los analitos derivatizados remanentes en la fibra despus de su desorcindurante3minutosa270C(PA)y260C(PDMSDVB).

89

Determinacinyreactividadenagua

Paraminimizarlosefectosmemoria,traslaprimeradesorcin,lasfibrassesituaronenel inyector de otro sistema cromatogrfico a la misma temperatura de desorcin (270C para PA y 260CparaPDMSDVB)duranteotrostresminutos.Trasestasegundadesorcin,nosedetectaron problemasdecontaminacincruzada. 1.3.8.Efectosdematriz Cuandounmtodoanalticoesaplicadoamuestrasreales,lasealobtenidapuedevariar en funcin de la matriz analizada. Concretamente en la tcnica de SPME, puede producirse una disminucindelacantidadextradaalaumentarlacomplejidaddelamuestra. Paraevaluarlaposibleexistenciadeefectosdematriz,serealizunaadicindelamezcla delosanalitosencuatromatricesdistintas(aguaultrapura,aguadero,aguaresidualtratadaysin tratar)anivelde3ng/mL.Elanlisisdelasmuestras,portriplicado,serealiztalcomosedetallen la parte experimental. Los resultados para cada uno de los analitos segn la fibra seleccionada se muestranacontinuacin,figuraI.12.Enelcasodelasaguasresidualessesustrajo,alasealdelas muestrasconadicin,elcorrespondienteblanco(muestrasinadicin). FiguraI.12.Comparacinderespuestas(%sealrelativaaaguaMilliQ)utilizandodistintasmatrices acuosas(N=3).
MilliQ 140%
Porcentajerelativo(PDMSDVB)

Ro

Efluente

Influente

MilliQ 140% 120% 100% 80% 60% 40% 20% 0%

Ro

Efluente

Influente

Porcentajerelativo(PA)

120% 100% 80% 60% 40% 20% 0% 2,4DCF 2,3,4TCF MTCS TCS Compuesto

2,4DCF

2,3,4TCF

MTCS

TCS

Compuesto

90

SPMEaplicadaalaextraccindeTriclosnycompuestosrelacionados

Engeneral,estasfigurasnosmuestranquelaeficaciadelaextraccinnoseveafectadapor la naturaleza de la matriz, con lo cual no es necesario realizar adiciones a cada muestra, para cuantificarlosnivelesdeestoscompuestosenlosdistintostiposdeagua. 1.4.Caracterizacindelmtodoanaltico El mtodo analtico desarrollado, figura I.13, ha sido caracterizado en lo referente a linealidad, lmites de cuantificacin y exactitud, considerando como tcnica de deteccin la cromatografadegasesacopladaaespectrometrademasas(GCMS). FiguraI.13.EsquemadelprocesodeSPMEparaladeterminacindeTCS,MTCS,2,4DCFy2,3,4TCF enagua.

FibradePA PDMSDVB 20mL muestrapH4.5 MuestreoporinmersinaT.A. Agitacina500rpm 30min

Derivatizacinonfiber 20LMTBSTFA, HS,10min

1.4.1.Linealidad Se procedi al estudio de la linealidad en las respuestas de los compuestos objeto de estudioparamuestrasconadicin,anivelesdeconcentracincomprendidosentre0.03ng/mLy10 ng/mL.Serealizaronsietenivelesdeadicinenelrangoanteriordeconcentracionessobreaguaa pH4.5.EnlatablaI.9,semuestranlasecuacionesdelasrectasdeadicinobtenidasparacadauno de los analitos con ambas fibras, y sus coeficientes de determinacin (R2). Como se puede comprobarlarespuestasemantuvolinealenelrangoevaluado.

91

Determinacinyreactividadenagua

Tabla I.9. Rectas de calibrado y coeficientes de determinacin obtenidos con las dos fibras estudiadas,utilizandocomotcnicadedeterminacinGCMS.
2,4DCF Ecuacin R 2,3,4TCF Ecuacin R MCTS Ecuacin R TCS Ecuacin R2
2 2 2

PA Y=180602X+5902 0.999 Y=412432X+23768 0.996 Y=791457X51462 0.998 Y=836108X10920 0.999

PDMSDVB Y=409714X+37951 0.999 Y=470739X+22327 0.999 Y=829610X1374 0.999 Y=837032X+21116 0.999

1.4.2.Lmitesdecuantificacin Los lmites de cuantificacin (LOQs) se definen como la cantidad mnima de analito que puede ser cuantificada con fiabilidad, correspondiente a una relacin S/N de 10. Los lmites de cuantificacin obtenidos para el mtodo desarrollado con deteccin por GCMS son los que se muestranenlatablaI.10. Tabla I.10. Lmites de cuantificacin para el mtodo desarrollado utilizando como tcnica de determinacinGCMS.
LOQ (ng/L) Fibra PA PDMSDVB 2,4DCF 7 4 2,3,4TCF 2 2 MTCS 2 2 TCS 1 1

ComparandolosLOQsdelametodologadesarrolladaenestaTesisDoctoral,frenteaotras basadas en la SPME para la determinacin de clorofenoles en agua, se observa que utilizando la mismafibraymododemuestreosonequivalentesoinclusoinferioresquelosobtenidosporotros autorestalcomoseapreciaenlatablaI.1delpresentecaptulo[GuerraSimesN;2007][RibeiroA; 2002]. 92

SPMEaplicadaalaextraccindeTriclosnycompuestosrelacionados

1.4.3.Repetibilidaddelproceso Serealizunestudioderepetibilidaddelprocesodemuestreoyderivatizacinparalasdos fibras evaluadas, utilizando como tcnica de determinacin GCMS. Para ello, se analizaron, por quintuplicado,muestrasde20mLdeaguaultrapuraapH4.5,conadicindelosanalitosanivelde 0.5ng/mL.Losresultadosobtenidossemuestranacontinuacin,tablaI.11. TablaI.11.EstudioderepetibilidadutilizandocomotcnicadedeterminacinGCMS(N=5).
Adicinenagua (ng/L) 15 2,4DCF 2,3,4TCF MCTS TCS 490 488 519 497 7.2 7.6 9.2 8.7 PA(CV%) PDMSDVB(CV%) Ndeciclosdeextraccinprevios 70 9.5 10.3 6.8 8.0 0 8.0 7.8 6.4 5.9 40 18.2 15.8 23.3 21.3 60 17.2 17.4 21.1 17.5

La variabilidad obtenida con la fibra de PA es inferior, en todos los casos a 10 %, sin embargo se observa que hay una prdida de repetibilidad al aumentar el nmero de ciclos de extraccinderivatizacin para la fibra de PDMSDVB. Este comportamiento podra ser debido a la obturacin de los poros del polmero de DVB debido a especies poco voltiles coextradas, incrementandoaslavariabilidaddelosresultados. 1.4.4.ExactituddelmtododeSPME LaexactituddelmtododeSPMEseevaluconunamuestradeaguaresidualsobrelacual sepracticunaadicindelosanalitosanivelde1ng/mL.Paralaextraccindelamuestraseemple la fibra de PA en las condiciones seleccionadas, tanto para la muestra sin adicin como para la muestraconadicin.Unavezrestadalasealparalamuestrasinadicin,secalcullarecuperacin como la relacin (en tanto por cien) entre la concentracin encontrada y la concentracin terica aadida.Losresultadosobtenidossemuestranenlasiguientetabla. 93

Determinacinyreactividadenagua

TablaI.12.ExactituddelmtododeSPME.Muestraconadicinde1ng/mL.
Aadido(ng/L) Encontrado(ng/L) Recuperacin% 2,4DCF 941 98170 104.3 2,3,4TCF 986 96448 97.8 MTCS 940 98253 104.5 TCS 989 100562 101.6

94

SPMEaplicadaalaextraccindeParabenes

II. DETERMINACIN DE PARABENES EN AGUA MEDIANTE MICROEXTRACCIN EN FASE SLIDA 2.1.Introduccin En esta seccin de la memoria, se describe la aplicacin de SPME a la extraccin de los steres alqulicos y benclicos del cido parahidroxibenzoico en muestras de agua. Previamente al desarrollo de esta metodologa [Canosa P; 2006 B], slo exista una aplicacin de SPME para la determinacindeparabenesenformulacionescosmticas.LokhnauthySnow[LokhnauthJK;2005] llevaron a cabo la optimizacin de los parmetros que afectan a la microextraccin de estos compuestos,utilizandolaespectrometrademovilidadinicacomotcnicadedeterminacin.Estos autores,compararonvariasfibras(PDMSde100m,PDMSde7m,PAde85m,PDMSDVBde65 m y DVBCARPDMS de 50/30 m), considerando un tiempo de extraccin de 15 minutos. Los mejoresresultados,enloreferenteaeficacia,fueronlosobtenidosconPA,PDMSDVByDVBCAR PDMS, seleccionando finalmente la fibra triple ya que alcanz el equilibrio en 15 minutos para muestras de cosmticos (50 mg) diluidas con 100 mL de agua. El pH del medio se mantuvo por debajodel pKa de los compuestos y el porcentaje decloruro sdico se fij en un 20%. Aunque la precisin obtenida con esta metodologa ha sido aceptable (RSDs inferiores a 7 %), sus lmites de cuantificacin, del orden de 30 ng/mL, fueron muy superiores a los niveles presentes en aguas residualesysuperficiales.Estohacequeseanecesarioeldesarrollodeunametodologamssensible para muestras de agua. Con este fin, adems de derivatizar los analitos retenidos en la fibra, se decidi utilizar la espectrometra de masas en tndem, acoplada a cromatografa de gases, como tcnicadedeterminacin. 2.2.Experimentosprevios 2.2.1.Eleccindelagentesililanteyestudiospreliminaresderepetibilidad Losparabenessonderivadosfenlicossusceptiblesdesufrir,aligualqueeltriclosnylos clorofenoles, una reaccin de derivatizacin cuando se ponen en contacto con un agente sililante. Para poner de manifiesto el incremento de sensibilidad, as como la mejora en la forma de pico, proporcionado por la derivatizacin se tom una alcuota de 500 L de un patrn de 2 g/mL en acetato de etilo (de MeP, EtP, PrP y BuP), y se mezcl con 20 L de N(tertbutildimetilsilil)N metiltrifluoroacetamida(MTBSTFA).Trascincominutosdereaccin,seinyect1Ldelamezclaen elsistemaGCMS.Asmismo,sehainyectadoelpatrnsinprocederalaetapapreviadesililacin. LoscromatogramasobtenidossemuestranenlafiguraII.1. 95

Determinacinyreactividadenagua

Figura II.1. Cromatograma reconstruido con los iones caractersticos del MeP, EtP, PrP y BuP sin derivatizar(B;m/z121)ycomoderivadossililados(A,m/z209,223,237,251).ColumnaHP5MScon 12mesesdeuso.
100% PrPSilil 75% 50% 151 25% 195 135 169 91 0% 100 150 200 235 280 250 300 m/z 237 100% 75% 50% 25% 0% BuPSilil 251

151 135 100 150

195 200

235 250

309 300 m/z

kCts 750

100% 75% 50% 25% 0%

EtPSilil

223

294 250

300 m/z

151 177 195 100 150 200

500

250

MePSilil 209 100% 75% 177 50% 235 135 25% 91 266 195 0% 100 125 150 175 200 225 250 275 m/z

0 kCts 20 15 10 5 0 14 15 16 17 18 19 20 minutos
100% 75% 50% 93 25% 0%

MeP

121 152

100% 75% 50% 93 25% 0% 100

121

EtP
121 138 152 166 180 m/z 100% 75% 50% 93 25% 0% 100 138 149 177 125 150 175 121 200 m/z

PrP

B
BuP

120

140

160

100

120

140

160 m/z

100% 75% 50% 25% 93 0% 100

138

149 120 140 160

177 180 m/z

La eleccin del agente derivatizante se hizo en base a los espectros de masas correspondientes a impacto electrnico, al utilizar bis(trimetilsilil)trifluoracetamida (BSTFA) o N (tertbutildimetil)Nmetiltrifluroacetamida(MTBSTFA)comoagentessililante,figuraII.2.

96

SPMEaplicadaalaextraccindeParabenes

FiguraII.2.EspectrosdemasasparalosparabenesderivatizadosconBSTFAyMTBSTFA. BSTFA
100% 75% 50% 25% 0% 125
100% 75% 195 50% 25% 0% 100 125 150 175 200 225 250 m/z 135 105 151 163 177 210

209 224 193

100% 75%

MTBSTFA
209

177

177 235 135 149 125 150 166 175 195 200 225 251 266 250 275 m/z

149 135 121 150 166 175

193

MeP
195

50% 25% 91 0%

200

225

m/z
100%

100

223

223

238

75%

EtP

50% 25% 0% 100 150 200 250 300 m/z 135 151 195 163177 235 280

100% 75% 50% 25% 0% 125

100% 75% 50% 25% 0% 100 125 150 175 135 151 169

195 210 151 135 150 169 175 200

195 210 193

237 100% 75%

PrP
237 225 252 250 m/z

50% 25% 0% 100 150 200 250

251

151 91 135 169

195

294 300 m/z

100% 75%

BuP
251 200 225 250 m/z

50% 25% 0% 100 150 135 151 169 195 200 235 250
285

309 300 m/z

100% 75% 50% 25% 0% 100 150 91

193

100% 75% 91

BzP
285 200 250 m/z

50% 25% 0% 100 163 150 200 250 300 179 235 342 350 m/z

Como se puede observar en la anterior figura, la utilizacin de BSTFA como derivatizante proporciona espectros de masas con mayor fragmentacin (a excepcin del BzP) frente a la utilizacindeMTBSTFA,dondeelpicobasecorrespondeconelindem/z[M57]+.Dadoqueesun

97

Determinacinyreactividadenagua

fragmento intenso, es posible seleccionarlo como in precursor a la hora de llevar a cabo la optimizacin de los parmetros de masasmasas para la determinacin de los compuestos estudiados. Una vez seleccionado el agente derivatizante, se evalu la posibilidad de realizar la extraccindeloscompuestosconlafibradepoliacrilato,previamenteutilizadaparalaextraccinde triclosnyclorofenoles,ysuposteriorderivatizacinexponindolaalespaciodecabezadeunvial conteniendoMTBSTFA.Laextraccinsellevacaboenunamuestradeaguaultrapura,apH4.5,con adicindelosanalitos(20ng/mL),durante30minutosyconagitacina500rpm.Traslaextraccin, seprocedialaderivatizacinonfiberdeloscompuestosexponiendolafibraalespaciodecabeza de un vial conteniendo 20 L de MTBSTFA, durante 15 minutos a temperatura ambiente. Los resultadosobtenidosmostraronunavariabilidadinferior al11%paratodosloscompuestos,tabla II.1. TablaII.1.Repetibilidad(%RSD)delprocesoSPMEconderivatizacinonfiber(N=5rplicas).Pruebas preliminares.
MeP 11.0% EtP 8.4% PrP 4.8% BuP 4.4% BzP 5.2%

2.2.2.Identificacincromatogrfica Laidentificacindelospicoscromatogrficoscorrespondientesalosanalitosestudiadosse realiz considerando sus tiempos de retencin, as como los espectros de MS y MS/MS para sus derivadostertbutildimetilsililados.ParalaoptimizacindelascondicionesdeMS/MSseinyectun patrnenacetatodeetilo,conunaconcentracinde0.5g/mLparacadacomponente,derivatizado con 50 L de MTBSTFA. Con ayuda de la herramienta de desarrollo automatizado de mtodos (Automated Methods Development, AMD) se optimizaron los parmetros que afectan a la fragmentacin, como son el nivel de almacenamiento de excitacin o excitation storage level y la amplituddeexcitacin.EnelcasodelMeP,EtP,PrPyBuPlosespectrosdeMS/MSpresentaronun patrn de fragmentacin similar, correspondiente a la sustitucin de la cadena alqulica por un protn(sealesam/z195)seguidodeprdidasdeCO2(sealesam/z151),y/oagua(sealesam/z 177),figuraII.3.Paraelbencilparaben,sufragmentacinresultmscompleja,presentandounin productoa241correspondientealaprdidadeCO2apartirdelinprecursor(m/z285).Unsegundo in producto de m/z 163 procede de la prdida del anillo aromtico (78 unidades) y CO2 (44 unidades),figuraII.3.

98

SPMEaplicadaalaextraccindeParabenes

Figura II.3. Espectros de masasmasas obtenidos para los parabenes, tertbutildimetilsililados, en modoresonante.
MeP
100% 75% 50% 25% 0% 125 150 121 135 149 166 181 175 195 209 177
100% 75% 50% 25% 0% 135 125 150

EtP
151 163

177 195

169 175

205 200

223 235 225 m/z

200 m/z

100% 75%

PrP
100% 75% 50% 25% 0% 100 133 123 163 177 150 200 213 250 m/z 235 237 151 195

BuP
151 195

50% 25% 0% 123133 100 150 169 251 177 200 250 m/z

241

BzP
100% 75% 50% 25% 0%

163

225

285

150

200

250

300 m/z

LostiemposderetencinylascondicionesdedeteccinenMSyMS/MSsemuestranenla siguientetabla. TablaII.2.TiemposderetencinyparmetrosdeMS/MSparaladeterminacindeparabenes.

MeP EtP PrP BuP BzP
1

Tr(min)1 15.80 16.58 17.60 18.62 22.37

In precursor (m/z) 209 223 237 251 285

Nivelde almacenamiento (m/z) 92 98 104 110 90

Amplitudde excitacin(V) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.4

Ionesproducto (m/z) 195,177,149 195,177,163,151 195,163,151 195,151 241,225,163

Iones cuantificacin (m/z) 177 195+177+151 195+151 195+151 241+163

ColumnaHP5MS

99

Determinacinyreactividadenagua

2.3.OptimizacindelprocesodeSPMEconderivatizacinonfiber Los distintos parmetros que afectan al proceso de SPME se han optimizado de modo sistemticoparaobtenereficaciasdeextraccinadecuadasparaladeterminacindeparabenesen muestras acuosas a niveles de las partes por trilln (ng/L). En todos los ensayos realizados, se emple agua ultrapura con adicin de los compuestos a nivel de 2 ng/mL, manteniendo las condicionesdederivatizacinutilizadasenlaspruebaspreliminares. 2.3.1.RecubrimientodelafibradeSPME Seestudilaeficaciadeextraccindecincofibras(PDMS,PDMSDVB,PA,CARPDMSyCW DVB)paralaconcentracindeparabenesenmuestrasdeaguaajustadasapH2.5.Laextraccinse llev a cabo en la modalidad de inmersin, durante20minutos, a temperatura ambiente. Al igual queenelcasodeltriclosn,setuvoencuentaelrangodetrabajodelasfibrasparaseleccionarla temperatura del puerto de inyeccin, considerando para todas ellas un tiempo de desorcin de 3 minutos(tablaI.4deestecaptulo).LosresultadosobtenidossemuestranenlafiguraII.4. Figura II.4. Eficacias de extraccin para las fibras de PDMS, PDMSDVB, PA, CARPDMS y CWDVB. SealrelativaalafibradePA.
PA SealnormalizadarespectoaPA 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 MeP EtP PrP BuP BzP PDMSDVB PDMS CARPDMS CWDVB

Como se puede comprobar, las respuestas ms elevadas corresponden a PA, seguida de CARPDMS (excepto para BzP) y PDMSDVB. Estos resultados fueron comparables a los obtenidos porLokhnauthycolaboradores,paraelanlisisdeparabenesenproductoscosmticos[Lokhnauth JL;2005].Laafinidaddeloscompuestosporlasfasespolimricaspuedeserexplicadaenbaseasus polaridades, siendo ms afines a recubrimientos de naturaleza polar (PA) y semipolar (CARPDMS,

100

SPMEaplicadaalaextraccindeParabenes

PDMSDVB) frente a los de naturaleza apolar (PDMS). Sorprendentemente, la fibra de CWDVB, tambinconcarcterpolar,proporcioneficaciasdeextraccinmuybajas. 2.3.2.Fuerzainicadelmedio Lafuerzainicapuedeafectarconsiderablementealaeficaciadelaextraccin.Laadicin de cloruro sdico se utiliz para poner de manifiesto como vara la seal de los compuestos estudiadosenfuncindelafuerzainicadelmedio.Enesteestudio,seprepararonalcuotasde18 mLdeaguaultrapura,apH2.5,conconcentracionescrecientesdeclorurosdicodesde0hasta300 mg/mL.ElmuestreofuellevadoacabousandolafibradePA,porinmersin,duranteuntiempode 40 minutos. Tal como se aprecia en la siguiente figura (figura II.5), inicialmente se observ un incremento en las respuestas de los analitos hasta 100150 mg/mL de cloruro sdico, mantenindoseconstante,oinclusodisminuyendo,paraloscompuestosmslipoflicos(BuPyBzP), aconcentracionesdesalsuperiores. Tericamente,laadicindesalprovocaunincrementodelafuerzainicadelmedioconel consecuente aumento de la cantidad de analito extrado por la fibra. Desde el punto de vista termodinmico, este comportamiento puede explicarse, para compuestos polares y no inicos, comounainteraccindelasmolculasdeaguaconlosionessalinosenlugardeconlosanalitos.Por otra parte, la presencia de grandes cantidades de sal, provoca un aumento de la viscosidad de la muestraquehacequeladifusindelosanalitoshacialafibraseamslenta,fenmenoqueyahaba sidoobservadoparaeltriclosn. FiguraII.5.InfluenciadelaadicindesalenlaeficaciadelaSPMEdeparabenes.FibradePA,n=3 rplicas.
MeP 1000000 900000 800000 700000 600000 500000 400000 300000 200000 100000 0 0 50 100 150 mg/mLNaCl 200 250 300 350 EtP PrP BuP BzP

reas

101

Determinacinyreactividadenagua

Enbaseaestosresultados,seseleccion150mg/mLcomolaconcentracinptimadesal, ya que hasta este valor se observ un incremento en la respuesta de todos los compuestos. Bajo estas condiciones, se revisaron las eficacias relativas de extraccin para los recubrimientos que proporcionaronlasmayoresrespuestasenausenciadesal:PA,PDMSDVByCARPDMS,figuraII.6. DenuevolafibradePAproporcionrespuestasclaramentesuperioresalasdosrestantes,adems se observ que las respuestas relativas obtenidas para PDMSDVB aumentaron al aadir sal a las muestras,mientrasqueparaCARPDMSseobtuvoelcomportamientocontrario,sobretodoparalos compuestosmslipoflicos. FiguraII.6.ComparativaderespuestasobtenidasconPA,PDMSDVByCARPDMS.Muestrasconsal (150mg/mL)ysinsal,40minutosdemuestreo.
PA 1.2 SealrelativaaPA 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0mg/mL 150 mg/mL 0mg/mL 150 mg/mL EtP 0mg/mL 150 mg/mL 0mg/mL 150 mg/mL 0mg/mL 150 mg/mL PDMSDVB CARPDMS

MeP

PrP CantidaddeNaCl

BuP

BzP

2.3.3.pHyvolumendemuestra El efecto del pH en la eficacia de extraccin fue evaluado considerando los parmetros anteriormente ajustados (150 mg/mL NaCl y PA). Su influencia se investig a tres niveles distintos (2.5,4.5y6.5),todosellos,almenos,2unidadespordebajodelpKadeloscompuestos(8.28.3).As mismo, se realizaron tambin extracciones a pH 8.1, figura II.7. En conjunto, se observa que la eficacia de extraccin es independiente del valor de pH considerado. Por tanto, en experimentos posterioresnoseajustelpHdelasmuestras. 102

SPMEaplicadaalaextraccindeParabenes

FiguraII.7.InfluenciadelpHenlaeficaciadeextraccindelosparabenesmedianteSPME(N=3).
300000 250000 200000 reas 150000 100000 50000 0 MeP EtP PrP BuP BzP pH2.5 pH4.5 pH6.6 pH8.1

El volumen de muestra es otro factor a optimizar ya que de acuerdo con la teora de la SPME para un sistema en dos fases, en condiciones de equilibrio termodinmico, la cantidad de analitoextradovienedadopor
n= K fs Vf C 0 Vs K fs Vf + Vs

De modo que a mayor volumen de muestra, mayor ser la cantidad de analito extrada, hasta que el trmino KfsVf sea ms pequeo que Vs. A partir de este momento, la masa de analito extradaesindependientedelvolumendemuestraysuvalorvienedadoporlasiguienteexpresin: n=KfsVfC0 En base a estos argumentos, se realizaron extracciones considerando varios volmenes diferentesdemuestra(10,20y110mL)conteniendolosanalitosaidnticoniveldeconcentracin. Los resultados obtenidos muestran que las eficacias son similares para todos los compuestos, con excepcin del BzP que parece presentar un ligero incremento de seal al utilizar volmenes de muestramayores,endetrimentodesurepetibilidad,figuraII.8. FiguraII.8.Influenciadelvolumendemuestraenlaeficaciadelaextraccin(N=3).
600000
1.5E+05

10mL

20mL

110mL

500000 400000 reas 300000 200000 100000 0

1.0E+05 5.0E+04 0.0E+00 MeP EtP PrP

MeP

EtP

PrP

BuP

BzP

103

Determinacinyreactividadenagua

Teniendoencuentaestosresultados,elvolumendeaguaempleadoselimita1020mL (dispuestaenvialesde1122mL)enfuncindelacantidaddemuestradisponible. 2.3.4.Mododemuestreoyagitacin LaeficaciadelaextraccinenSPMEhasidoevaluadaconsiderandotresmodosdiferentes demuestreo(inmersinatemperaturaambiente,espaciodecabezaHSatemperaturaambientey HSa100C)paramuestrasdeaguaultrapura,conteniendo150mg/mLdeNaCl,duranteunperiodo de40minutos.Trasladerivatizacin,lafibrafuedesorbidaenelpuertodeinyeccindelsistemaGC MS/MS,obteniendoloscorrespondientesregistroscromatogrficos.Losresultadosrevelaronqueel muestreoenmododirectoproporcionmayoreseficaciasdeextraccinfrentealespaciodecabeza, tantoatemperaturaambiente(TA)comoa100C.SalvoenelcasodelMeP,larespuestaobtenida conelmuestreoenespaciodecabezarepresentamenosdel5%delacorrespondientealmuestreo porinmersin,figuraII.9. FiguraII.9.MododemuestreoparalafibradePA.Sealrelativaamuestreoporinmersin(N=3).
SealrelativaainmersinaTA 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 MeP EtP PrP BuP BzP Inmers in HSa TA HSa 100C

Una vez demostrado que la extraccin por inmersin es la que proporcion resultados ptimos,elefectodelaagitacinsehaevaluadounivariantemente.Sellevaronacabounaseriede experimentossinagitacinyconagitacina500rpm,generandounvrtexhomogneoenelvialde la muestra. Los resultados obtenidos mostraron que la agitacin favorece en gran medida la extraccindeloscompuestosdemayorlogKow,yaquemejorasudifusinenelmedioacuosodesde elsenodelamuestraalasuperficiedelafibra,mientrasqueenelcasodelMePsuefectonoresult significativo,figuraII.10.

104

SPMEaplicadaalaextraccindeParabenes

FiguraII.10.Efectodelaagitacinenlasealdelosparabenes.DatosparaSPMEporinmersincon fibradePA(N=3).
Sealrelativaamuestreoa500 rpm 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 MeP EtP PrP BuP BzP conagitacin 500rpm sinagitacin

2.3.5.Tiempodeextraccin Una vez fijados el volumen de muestra (10 mL), la cantidad de NaCl (150 mg/mL), la agitacin (500 rpm), el modo de muestreo (inmersin) y el tipo de fibra (PA), se evalu el tiempo necesario para llegar a una situacin de equilibrio en la extraccin. Para la realizacin del estudio cintico,seprepararonunaseriedemuestrasdeaguaultrapuraconadicindelosparabenesanivel de2ng/mL.Lostiemposdemuestreofueronde5,10,20,30,45,60,90y170minutos,obteniendo losperfilesdeextraccinquesemuestranenlafiguraII.11. FiguraII.11.Cinticasdeextraccinparalosparabenes.
MeP 3.00E+05 2.50E+05 reas 2.00E+05 1.50E+05 1.00E+05 5.00E+04 0.00E+00 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Tiempo(min) EtP

105

Determinacinyreactividadenagua

PrP(sealx2)

BuP

BzP

2.50E+06 2.00E+06 reas 1.50E+06 1.00E+06 5.00E+05 0.00E+00 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Tiempo(min)

Los grficos anteriores revelan que 60 minutos de exposicin fueron suficientes para alcanzarelequilibrioenelcasodelMeP.ParaEtP,PrP,BuPyBzPnosealcanzelequilibriodentro del intervalo de tiempo evaluado. Finalmente, se decidi limitar el tiempo de extraccin a 40 minutosparaincrementarlaproductividaddelmtodo,referidaanmerodemuestrasprocesadas porunidaddetiempo. 2.3.6.Optimizacindelascondicionesdederivatizacinonfiber Latemperatura,eltiempodederivatizacinyelvolumendederivatizantesonfactoresque afectan directamente a la derivatizacin sobre la fibra. Sus efectos potenciales en la seal de los parabenes derivatizados fueron evaluados simultneamente, empleando un diseo factorial de modomixto3x22, condospuntoscentrales,conayudadelprogramaestadsticoStatgraphicsPlus 5.1.Enestetipodediseos,unodelosfactoresesestudiadoatresnivelesdentrodelespaciodelas variables,demodoqueesposibleobtenereltrminocuadrticoasociadoalmismo.Dentrodelos factores evaluados, la temperatura se seleccion como la variable a estudiar a tres niveles: 20C (temperatura ambiente), 45C y 70C. Volumen de derivatizante (2080 L) y el tiempo de derivatizacin(1040minutos)seestudiaronadosniveles.Paratenersuficientesgradosdelibertad yestimaraselerrorexperimental,seincluyerondospuntoscentraleseneldiseo. Parallevaracabolosexperimentosseutilizaron10mLdeaguaultrapura(conadicindelos compuestos a nivel de 2 ng/mL), conteniendo 150 mg/mL de NaCl. El muestreo, con la fibra de poliacrilato,sellevacabodurante40minutos,conagitacina500rpm.Unavezfinalizadalaetapa deextraccin,ysecadalaagujadelajeringadeSPME,seprocedialaderivatizacinonfiberenlas condicionesindicadasenlatablaII.3.Losresultadosobtenidos(readepico)tambinsemuestran enlasiguientetabla. 106

SPMEaplicadaalaextraccindeParabenes

TablaII.3.Matrizdeexperienciasparalaoptimizacindelascondicionesdederivatizacinonfiber delosparabenes,yrespuestas(reasdepico)obtenidasmedianteGCMS/MS.
Temperatura (C) 45 20 70 70 20 70 20 45 20 45 45 45 70 45 Volumen (L) 20 80 80 20 80 20 20 80 20 50 80 20 80 50 Tiempo (min) 10 10 40 40 40 10 40 40 10 25 10 40 10 25 MeP 117125 157808 69773 65599 90668 72742 75172 77366 89135 152782 78167 77435 66075 103420 EtP 172911 207277 111101 112078 170129 140032 144829 143203 178071 141325 139644 154507 144235 154710 PrP 415511 536774 267276 282820 360302 295392 338346 314748 389166 316257 312642 342570 353531 352565 BuP 884877 1090911 626188 629675 767988 691161 785112 685058 888333 905918 697832 810312 889005 843442 BzP 80787 986334 587871 604691 629756 603352 723726 603486 773942 680502 653764 686343 807883 766278

El anlisis de los datos anteriores mostr que ni el trmino cuadrtico asociado con la temperatura,nilasinteraccionesdeordendosentrefactoresfueronestadsticamentesignificativos (95%deconfianza),conlocuallainterpretacindelosresultadosresultsencilladebidoaquelos factoressonindependientesentres.Losefectosprincipalesestandarizadossepuedenobservaren latablaII.4.Estosseobtienenrelacionandoelvalordelefectoestimadoconelerror,demodoque su valor absoluto es proporcional al cambio de respuesta del compuesto derivatizado cuando una determinada variable pasa del nivel inferior al superior, dentro del dominio del diseo. El signo indica si la eficacia en la derivatizacin incrementa (signo positivo) o si tiende a disminuir (signo negativo). TablaII.4.Valoresestandarizadosdelosefectosprincipalesasociadosconlosfactoresconsiderados enlaoptimizacindeladerivatizacinonfiberdelosparabenes.

Temp.(C) Tiempo(min) Vol.MTBSTFA(L)

a

MeP 2.46a 1.81 0.62

EtP 4.36a 2.70a 0.24

PrP 2.79a 2.12 0.44

BuP 2.24 2.20 0.18

BzP 1.90 2.43a 0.21

Factoresestadsticamentesignificativosaunniveldeconfianzade95%

Los resultados obtenidos mostraron que la temperatura y el tiempo son factores que afectan negativamente al rendimiento de la reaccin de derivatizacin, siendo estadsticamente 107

Determinacinyreactividadenagua

significativos para MeP, EtPy PrP la temperatura, ypara el EtP y BzPel tiempo. Por otra parte, el volumen de derivatizante result ser un factor no significativo. En base a estos resultados se seleccion como tiempo, temperatura de derivatizacin y volumen de derivatizante ptimo 10 minutos,20C(temperaturaambiente)y20LdeMTBSTFA.Estascondicionesresultaronidnticasa las optimizadas para triclosn, 2,4diclorofenol y 2,3,4triclorofenol en la primera parte de este captulo. 2.3.7.Evaluacindelosefectosmemoria Aligualqueparaeltriclosn,seevalulapresenciadetrazasdeparabenesenlafibrade SPMEunavezrealizadaladesorcindelosanalitosenelpuertodeinyeccindelcromatgrafo.Tras realizarlaextraccindeunamuestradeaguaconteniendo2ng/mLdecadaunodelosparabenes,y procederaladesorcindelafibradePA(270Cdurante3minutos),sevolviadesorberdurante otros 3 minutos. La seal obtenida para esta segunda desorcin fue normalizada respecto a la registradaenlaprimera.Igualmente,serealizlamismaoperacin,peroantesdellevaracabola segunda desorcin de la fibra, se expuso al espacio de cabeza de un vial conteniendo 20 L de MTBSTFA,atemperaturaambiente,durante10minutos. Losresultadosobtenidossemuestranenlasiguientetabla,enlacualsepuedecomprobar queenlasegundadesorcinseobtienensealesinferioresal0.1%paraelMePyelPrP.Cuandola fibrafueexpuestadenuevoalderivatizanteestassealesaumentaronligeramente,llegandoal0.2 %.Ladistribucindelosparabenessobrelafibra,alahoradeevaluarlosefectosmemoria,result ser similar al existente en los cosmticos (mayor cantidad de MeP y PrP), lo que sugiere que su presencia sobre el polmero puede ser debida a la contaminacin existente en las atmsferas interiores,ointroducidaporeloperadorduranteelprocesodeSPME,msqueaefectosdememoria propiamentedichos[RudelRA;2003]. TablaII.5.SealrelativaenlasegundadesorcindelafibradeSPME.
Porcentajedesealrelativa (%) 2desorcin Derivatizacin+2 desorcin MeP 0.15 0.23 EtP 0.00 0.00 PrP 0.03 0.12 BuP 0.00 0.00 BzP 0.00 0.00

108

SPMEaplicadaalaextraccindeParabenes

2.3.8.Efectosdematriz Lapresenciadeotrassustancias(cidoshmicos,macromolculas,etc)enlamatrizacuosa puede afectar en gran medida a la eficacia de extraccin en SPME. Para investigar como afecta el tipo de agua al rendimiento del mtodo propuesto, se utilizaron cuatro matrices diferentes: agua ultrapura,aguadero,aguaresidualtratada(efluente)yaguaresidualsintratar(influente).Todas estasmuestrasfueronfortificadasconlosanalitosanivelde2ng/mL,yanalizadasenlascondiciones descritasanteriormente.Cabedestacarqueaquellasquepresentaronmateriaensuspensinfueron pasadas a travs de filtros de fibra de vidrio con un tamao de poro de 1 m. Las muestras sin adicin tambin fueron analizadas para tenerlas en cuenta a la hora de cuantificar los niveles encontrados. En la figura II.12 se comparan las respuestas obtenidas para cada matriz. Los resultados, correspondientes a extracciones en triplicado, se representaron como seal relativa a la obtenida paramuestrasdeaguaultrapura.Enbaseaellos,sepuedeafirmarquelasealdeloscompuestoses independientedeltipodemuestra,demodoqueseraposiblellevaracabosucuantificacinusando una calibracin externa sobre agua ultrapura, en lugar de recurrir a realizar adiciones sobre cada muestraaprocesar. FiguraII.12.Comparacinderespuestas(%desealrelativaaaguaMilliQ)paralosparabenesen distintasmatricesacuosas.
1.2 SealrelativaaaguaMilliQ 1 MilliQ 0.8 Ro 0.6 0.4 0.2 0 MeP EtP PrP BuP BzP Efluente Influente

109

Determinacinyreactividadenagua

2.4.Caracterizacinanalticadelmtodopropuesto UnavezoptimizadaslascondicionesdeSPMEyderivatizacinonfiberconMTBSTFA,figura II.13, se procedi a la caracterizacin del mtodo propuesto en base a su linealidad, repetibilidad, exactitud y lmites de cuantificacin, utilizando la cromatografa de gases acoplada a la espectrometrademasasentndemcomotcnicadedeteccin. Figura II.13. Esquema del mtodo desarrollado basado en la microextraccin en fase slida y derivatizacinonfiberparaladeterminacindeparabenesenmuestrasdeagua.

FibradePA 1020mLmuestra 150mg/mL NaCl MuestreoporinmersinaT.A. Agitacina500rpm 40min

Derivatizacinonfiber 20LMTBSTFA, HS,10min

2.4.1.Linealidad Lalinealidaddelmtodofueevaluadautilizandomuestrasdeaguaultrapuraconadicinde los compuestos a concentraciones crecientes desde 0.02 hasta 5 ng/mL. Los coeficientes de determinacinoscilaronentre0.996y0.999dependiendodelcompuesto,tablaII.6.Comosepuede comprobar en la figura II.14, la respuesta se mantiene lineal para el rango de concentraciones estudiado. Tabla II.6. Rectas de calibrado y coeficientes de determinacin para los parabenes utilizando GC MS/MScomotcnicadedeteccin.
MeP EtP PrP BuP BzP

Ecuacin Y=76793X+35272 Y=77914X+7808 Y=265044X+29999 Y=360160X+17191 Y=38185X+1721 R2

0.999

0.997

0.998

0.996

0.999

110

SPMEaplicadaalaextraccindeParabenes

FiguraII.14.CurvasdecalibradoparaMePyBzPenunrangodeconcentracionescomprendidasentre 20ng/Ly5ng/mL.
450000 400000 350000 300000 reas 250000 200000 150000 100000 50000 0 0.000 y=38185x+1721 R =0.999
2

MeP
y=76793x+35272 R =0.999
2

BzP

1.000

2.000

3.000 ng/mL

4.000

5.000

6.000

2.4.2.Lmitesdecuantificacindelmtodo Paraevaluarloslmitesdecuantificacindelmtodopropuesto,setuvieronencuentalos blancos del procedimiento analtico. Una vez realizado el muestreo en las condiciones ptimas, se observlapresenciadeunapequeasealdeMePequivalenteaunaconcentracindelordende5 10ng/Lenmuestraenlosblancosdeaguaultrapura,mientrasqueparalosdemscompuestos,la seal result despreciable. En base a esta observacin, los lmites de cuantificacin estimados (correspondientesaunarelacinS/N=10)semuestranenlatablaII.7. Tabla II.7. Lmites de cuantificacin para los parabenes aplicando la metodologa SPME derivatizacinonfiberydeteccinmedianteGCMS/MS.
LOQ ng/L MeP 25 EtP 5 PrP 2 BuP 1 BzP 5

ElorigendelasealdeMePenlosblancosfueinvestigadoconsiderandodiversosfactores por separado. Ni los septas de tefln, ni el agua ultrapura, ni el NaCl, ni el agitador magntico parecenserlascausasdelapresenciadeMePenlafibra,yaquecuandosetomunafibranueva acondicionada, y sta fue expuesta a un vial conteniendo 20 L de MTBSTFA, la seal obtenida permaneciprcticamenteconstante,tablaII.8. 111

Determinacinyreactividadenagua

TablaII.8.ContribucindediferentesfactoresalasealdeMePenlosblancos.
Factor Agitadoresmagnticos Septastflon NaCl AguaMilliQ Derivatizante Fibra Procedimiento
MuestreodeMilliQsinagitacin,conNaCl(150mg/mL),fibradePAy exposicinalderivatizante MuestreodeMilliQconagitacin,NaCl(150mg/mL),fibradePAy exposicinalderivatizante.Noseencapsulaelvial MuestreodeMilliQ,agitacin,fibradePAyexposicinalderivatizante DerivatizacinsobrelafibradePAsinmuestreoprevio Utilizarunnuevolotedederivatizanteparaexponerlafibrasin muestreoprevio Fibranueva Sinexponeralderivatizante Expuestaalderivatizante

MeP(rea depico) 2966 3900 2789 2662 3685 39 3671

LapresenciadeMePenlafibradeSPMEpreviamentealusodelamisma,indicaqueste compuestopuedeprocederdelaatmsferadellaboratorio[RudelRA;2003]y/odelasresinasque seutilizanparaadherirlafibradeslicealcuerpodeacerodelaagujadeSPME[BraunP;2003].Por lotanto,paraevitarfalsospositivosenladeterminacindeMePenaguamedianteSPME,espreciso verificardeformasistemticalasealdelosblancos. 2.4.3.Repetibilidaddelmtodo Larepetibilidaddelmtodopropuestofueevaluadautilizandomuestrasdeaguaultrapura fortificadasconlosparabenesadiferentesnivelesdeconcentracin.Lasextraccionessellevarona cabo por cuadruplicado en las condiciones descritas en la figura II.13. Los resultados obtenidos muestranunabuenaprecisininclusoanivelesprximosalosLOQs,tablaII.9. TablaII.9.Repetibilidad(%RSD)delprocesodemicroextraccinyderivatizacinonfiber(N=4).
ng/L
20a 200 500
a

MeP 11.9 10.7 8.3

EtP 7.3 8.5 6.3

PrP 7.3 1.1 2.4

BuP 10.4 5.5 4.7

BzP 7.6 13.3 9.0

50ng/LparaMeP

112

SPMEaplicadaalaextraccindeParabenes

2.4.4.ExactituddelprocesodeSPME Se evalu la exactitud del mtodo desarrollado usando agua de ro con adicin de los compuestosadosconcentracionesdiferentes:200y1000ng/L.Fuenecesarioanalizarlapresencia previadelosmismosenelagua,ytenerlaencuentaparaelclculodelaexactitud.Losresultados obtenidos, tabla II.10, mostraron que el mtodo de SPME permite evaluar de manera fiable las concentracionesdelosparabenesenmuestrasdeagua,conunaexactitudyprecisinalrededordel 10%. TablaII.10.ExactituddelmtododeSPMEparamuestrasdeaguaderoconadicin(N=3).
Con.aadida (ng/mL) 0.21 0.21 0.23 0.21 0.21 Con.medida (ng/mL) 0.220.02 0.230.01 0.220.03 0.200.02 0.200.03 Exactitud Con.aadida (ng/mL) 1.01 1.01 1.12 1.02 1.02 Con.medida (ng/mL) 1.130.03 1.060.08 1.260.06 1.090.04 1.080.09 Exactitud

MeP EtP PrP BuP BzP

105% 109% 96% 95% 95%

112% 105% 112% 107% 106%

113

Consideracionesgenerales

III. ESTUDIO DE LA FORMACIN DE DERIVADOS HALOGENADOS DEL TRICLOSN Y PARABENESENAGUACLORADA 3.1.Introduccin EnestecaptulodelaTesisseinvestigalareactividaddeltriclosnylosparabenesenaguas cloradas, evaluando el riesgo de formacin de subproductos halogenados cuando estas especies, biendeunaformadirectaoatravsdeproductosdecuidadopersonal,entranencontactoconagua degrifoclorada.Paraello,ademsdeconsiderarlasposiblesreaccionesquepuedendarlugarestos compuestos, se desarroll una metodologa analtica sencilla para la extraccin de los analitos de partidaysusposiblesderivadosenmuestrasacuosas. 3.1.1.Antecedentesbibliogrficos Una de las lneas de investigacin de mayor actualidad, en relacin con la presencia de contaminantes emergentes en el medio acutico, es el estudio de las posibles reacciones de transformacindeestasespecies,laidentificacindelosproductosquegeneranylaestimacinde laestabilidaddelosmismos,supersistenciaytoxicidadenelmedioambiente[RichardsonSD;2005 y 2006]. En el medio acutico, las reacciones de transformacin ms importantes son de tipo fotoqumicoyredox.Dentrodelareactividadporvafotoqumica,eltriclosnesuncompuestoque sufreimportantestransformacionesenelmedioambiente,dandolugaracompuestostxicoscomo la 2,8dibenzopdioxina [SnchezPrado L; 2006 A]. En el caso de las reacciones redox, estas se producen con reactivos que se introducen de un modo intencionado en el medio acutico para eliminar compuestos de naturaleza orgnica. Dentro de los agentes oxidantes, el cloro libre (combinacindelcidohipoclorosoehipocloritodesodio)eselmsutilizadojuntoconelozono,el dixidodecloroylacloramina.Elclorolibresiguesiendoempleadohoyendaparadesinfectarlas aguas de consumo y asegurar su calidad bacteriolgica. Incluso a aquellas aguas tratadas previamenteconozonooradiacinultravioleta,selesaadeposteriormenteunacantidaddecloro residual para que mantengan su asepsia a lo largo de las redes de distribucin en las grandes ciudades.Enalgunospases,elclorolibreesusadotambinenlostratamientosterciariosaplicados enlasestacionesdepuradorasdeaguasresidualesurbanas.Loscompuestosorgnicos,enpresencia deestosagentesoxidantespuedenreaccionardandolugaraespeciesconcaractersticasdistintasa los productos de partida. En algunos casos, estos subproductos son especies voltiles fcilmente eliminables, aunque txicos, como los trihalometanos; aunque, tambin puede dar lugar a otros productos txicos y ms persistentes que los analitos de partida [Gallard H; 2002][Huber MM; 2005][RichardsonSD;2003]. 115

Determinacinyreactividadenagua

Loscompuestosquecontienengruposfenlicosensuestructurapresentanunascinticas decloracinmuyfavorables[GallardH;2002][AlumA;2004][PatnaikP;2000].Estasreacciones,de sustitucinelectrfilaaromtica,estnfavorecidasporlapresenciadelgrupohidroxiloqueaumenta la densidad electrnica del anillo bencnico, debido a los pares de electrones no compartidos del oxgenoquesedeslocalizanporlosenlacestipo,principalmenteenlasposicionesenortoyparaal mismo.Estohacequeelfenol,porejemplo,sea1000vecesmsreactivofrentealbencenoyquese formen principalmente productos de halogenacin en orto y para al grupo hidroxilo frente a las sustituciones en meta, las cuales no estn favorecidas ni desde el punto de vista cintico ni termodinmico. Estudios de cloracin de frmacos (estradiol, etinilestradiol, ibuprofeno, ketoprofeno,) y otrosproductosdecuidadopersonal(filtrossolares)mostraronlaposibilidaddesufrirreaccionesde transformacin en presencia de cloro [Pinkston KE; 2004][Negreira N; 2007], dixido de cloro [HuberMM;2005]yozono[vonGuntenU;2003],siendolasozonizacionesaquellasquepresentan cinticas ms rpidas, seguidas de las cloraciones con dixido de cloro, y por ltimo, cloro libre [HuberMM;2005].ElpHesunfactormuyimportanteenalgunasdeestasreacciones,yaqueenel casodelosfenoles,laformafenolatoeslamsreactivayenelcasodelasaminas,laformabsicaes la que presenta mayor reactividad. En lo referente al cloro libre, considerado como la suma de concentracionesdecidohipoclorosoyelhipoclorito,laformacidaeslareactiva,demodoquelos pHsptimosdereaccinparaespeciesfenlicassernloscomprendidosentreelpKadelcompuesto yelpKadelcidohipocloroso[PinkstonKE;2004]. En el caso del triclosn, experimentos realizados en 1987 pusieron ya de manifiesto la formacin de derivados halogenados en medio acuoso conteniendo cloro libre. El grupo de Kanetoshi [Kanetoshi A; 1987] estudi la formacin de derivados clorados del triclosn cuando materialestextiles,productosdecuidadopersonalyplsticos,quecontenanestebactericida,eran puestosencontactoconconcentracioneselevadasdeclorolibre.Losproductosquesedetectaron fueron dos tetras y un pentacloro fenoxifenol (closanos). Onodera y su grupo [Onodera S; 1987] confirmaron la formacin de estos compuestos cuando trataban aguas residuales, conteniendo triclosn, con hipoclorito sdico durante una hora. A diferencia de los primeros autores, identificaron otros dos productos de degradacin, el 2,4diclorofenol y el 2,3,4triclorofenol. Aos mstarde,en2005,paralelamentealasinvestigacionesllevadasacaboenestaTesisDoctoral,Rule y colaboradores [Rule KL; 2005] obtuvieron resultados anlogos a los observados con condiciones diferentesalasnuestras.Ensutrabajo,eltriclosnseencontrabaenexceso(0.728g/mL)frenteal hipoclorito sdico (0.1921.77 g/mL) en disoluciones tamponadas con bicarbonato sdico. La determinacin por cromatografa de gases acoplada a espectrometra de masas (GCMS) de los compuestosderivatizadosconbromurodepentafluorobencilo,revellapresenciadelosdostetrasy 116

Consideracionesgenerales

el pentacloro fenoxifenol, as como de 2,4diclorofenol en el medio de reaccin. Los productos finalesdecloracindeltriclosnfueroncidoscarboxlicoscloradosytrihalometanos. Los mismos productos de halogenacin del triclosn, descritos en esta Tesis Doctoral [Canosa P; 2005 A], han sido hallados en estudios posteriores por Greyshock y colaboradores [GreyshockAE;2006]cuandoevaluaronlareactividaddelbactericidaconexcesodemonocloramina. La cintica de degradacin del triclosn fue entre 2 y 4 veces ms lenta que con cloro libre, y adems, no se detectaron los productos de ruptura del mismo cuando existe exceso de triclosn frente a la monocloramina. Por otra parte, el grupo de investigacin de Fiss [Fiss EM; 2007], basndose en los estudios de Canosa y colaboradores [Canosa P; 2005 A y 2006 A], estudi que sucedacuandounproductoconteniendotriclosnensuformulacin(1.23mg/g)seaadisobre agua con 2 g/mL de cloro libre. En menos de un minuto se haba consumido todo el triclosn, dandolugaravariossubproductosdecloracinyderupturadelenlaceterexistenteentrelosdos anillosaromticosdelcompuesto,ascomocloroformocomoproductofinal. El caso de los parabenes, el trabajo realizado en esta Tesis Doctoral es el nico, hasta el momento, en el cual se ha estudiado su reactividad en agua clorada. Algunas referencias sobre subproductos del cido parahidroxibenzoico y del metahidroxibenzoico, mostraron que el primero precisunamayorconcentracindecloroparareaccionarfrentealsegundo,ademsdepresentar unacinticamuylenta,yaqueelgrupocarboxlicoactacomodesactivantecuandoestionizado, puestoquedisminuyeladensidadelectrnicaenelanilloaromtico[ChangE;2006].Shaydullinay colaboradores[ShaydullinaGM;2005]estudiaronlaformacindesubproductosdeoxidacinpara el cido ortometoxibenzoico en presencia de ozono y cloro libre. En el primer caso, observaron la rupturadelanillobencnicoylaformacindediversosproductosdeoxidacin,mientrasqueenel segundo, la halogenacin se produjo en las posiciones orto y para al grupo OMe, as como sustitucionesdelCOOHporCl.Lasimpurezasquepresentabaelreactivodecloracindieronlugara laaparicindelosproductosbromados.Lapresenciadehaluros(bromurosoyoduros)enunmedio conteniendo un agente oxidante, como es el hipoclorito, provoca la formacin de compuestos halogenadosdebidoalaoxidacininicialquesufrenabromooyodo,yposteriorataqueelectrfiloal anilloaromtico.Lapresenciadeestassalespuedeocurrirdemodonatural,sobretodoenacuferos situadosenzonascosteras,anivelescomprendidosentre140g/Lenaguadelluvia,20150g/Len aguaderoy65mg/Lenaguademar[vonGuntenU;2003][InabaK;2006].Cabedestacarquela formacin de compuestos bromados es 10 veces ms rpida que los clorados. Por otra parte, estudios de toxicidad, con cidos haloacticos, pusieron de manifiesto que los compuestos bromadospresentanunamayortoxicidadquelosclorados[RichardsonSD;2003]. 117

Determinacinyreactividadenagua

3.1.2.Concentracindelasmuestras La tcnica ms habitual para la preparacin de muestras acuosas es la extraccin en fase slida(SPE),permitiendoconcentrardeformaparalelagrandesvolmenesdemuestraalavezque proporcionarecuperacionescuantitativasparaungrannmerodecompuestosorgnicos.LaSPEse haseleccionadoenmuchoscasoscomomtododeconcentracinparaladeterminacindetriclosn oparabenesenaguasresidualesysuperficiales. Para la realizacin de los estudios de halogenacin citados anteriormente, nos hemos decantado por esta tcnica, no slo por su versatilidad y sencillez, sino porque permite realizar variasextraccionessimultneasy,adiferenciadelaSPME,esposiblereanalizarelextractousando diferentescondicionescromatogrficas.Portanto,previamentealosestudiosdehalogenacindel triclosn y los parabenes, se llev a cabo la optimizacin de las condiciones de extraccin en fase slida.EnlatablaIII.1seresumenvariasdelasmetodologasdesarrolladasenlabibliografaparala determinacindeltriclosnylosparabenes. Tabla III.1. Preparacin de muestras acuosas mediante SPE para la determinacin de triclosn y parabenesenaguas.
Analitosy matriz
TCSyotros PPCPsen aguaresidual ysuperficial TCS,PBsy otrosPPCPs enagua residual TCSyMTCS enagua residualy superficial TCS,frmacos cidosen aguaresidual ysuperficial TCS,AINEs, cafenaen aguaresidual

Procedimiento
Filtrarconfibradevidrio,acidificarapH2, concentrarcondiscosSDBXC.EluirconDCMy MeOH.Concentrara0.5mLyderivatizarcon BSTFA. Filtrar1Ldemuestra,ajustarapH3.Concentrar conOasisMAX150mgyeluirconMeOHyMeOH con2%cidofrmico.DetivatizarconPFPAycon MTBSTFA. AjustarapH2,200mLdeaguaresidual1Lde aguasuperficial.Concentrarconpoliestireno divinilbenceno.EluirconMeOH:DCM.Etilarcon diazoetanoypurificarconslica. Extraccinde50100mLdeaguaapH2conOasis HLB60mg.Elucincon6mLdeMeOH.Adicinde cidomeclofenmico,ac.2,4diclorobenzoicoy fenopropcomopatronesinternos. AjustarapH7.ConcentrarconOasisHLB60mg. LavarcontampnfosfatopH7,hexanoyeluir3mL AcOEt.DerivatizarconBSTFA.

Deteccin

LOD (ng/L)

RSD(%)

Rec (%)

Ref.

GCMS

0.2

23

60

(1)(2)

GCMS

10

87

(3)

GCMS

(4)

LCESI() MS/MS

1124

48

(5)

GCMS

84

(6)

118

Consideraciones generales

Analitos y matriz
TCS, AINEs, cafena, insecticidas agua residual y mar TCS en agua residual y superficial TCS, AINEs en agua residual TCS, PPCPs, AINEs, frmacos agua residual y superficial TCS, PPCPs y otros DE en agua residual TCS, MTCS, PPCPs en agua de consumo TCS, AINEs en agua residual

Procedimiento
Filtrar agua a pH 7, concentrar con Oasis HLB 500 mg. Eluir 5 mL hexano, 5 mL AcOEt y 14 mL MeOH. Concentrar a 0.5 mL y aadir metilcloroformiato para derivatizar. Concentrar de 1 L de agua a pH 2, conteniendo C12-TCS, con Florisil activo. Lavar con 5 mL 5% MeOH en agua y elucin con 6 mL AcOEt. Concentrar a 0.2 mL

Deteccin

LOD (ng/L)

RSD (%)

Rec (%)

Ref.

GC-MS

0.07

15

85

(7)

13

GC-MS/MS

0.25

14

96

(8)

Ajuste de 1 L de agua a pH 6.8 y concentrar con 900 mg C18. Elucin con DCM. Derivatizar con anhdrido actico y piridina. Ajuste a pH 2 de 250 mL de agua residual filtrada 3 L agua superficial. Concentrar con Oasis HLB 200 mg. Lavado con varios disolventes, elucin con acetona. Derivatizacin con BSTFA. Extraccin de 0.5 L muestra con Oasis HLB 60 mg. Elucin con 5 mL MeOH y 5 mL MeOH:MTBE. Extraccin de 2-4 L de agua a pH 3 con discos Empore SDB-RPS de PE-DVB, utilizando con surrogado el cido 2,4-diclofenoxiactico y patrn interno 4,4-dibromooctafluorobifenol. Extraccin de 0.5-1 L de agua con cartuchos C18 de 1 g. Elucin con 10 mL de acetona. Derivatizacin con metilcloroformiato. Aadir 20 mL de MeOH a 50-100 mL de agua a pH 2. Concentrar sobre 1 g de C18. Elucin con acetato de etilo, tolueno y hexano. Concentracin a 0.5 mL, adicin de PCB-52 y derivatizacin con N,Ndietiltrimetilsililamina. Extraccin de 50 mL de muestra filtrada con PEDVB. Lavado con agua ultrapura, secado y elucin con 100 L AcOEt. Utilizan para cidos discos de intercambio aninico, neutros Oasis HLB y C18, y bsicos intercambio catinico. Elucin secuencial con varios disolventes. Derivatizacin de grupos cidos con MeI.

GC-MS

--

--

--

(9)

GC-MS

10

12

93

(10)

LC-ESI(-)MS/MS

0.34

13

99

(11)

GC-MS

110128

--

--

(12)

GC-MS

50

10

79

(13)

TCS, closanos y MTCS en agua residual TCS y otros compuestos clorados en agua residual 900 sustancias, TCS, MeP y EtP en agua residual

GC-MS

10

21

79

(14)

GC-AED

200500

--

--

(15)

GC-MS

--

--

--

(16)

AcOEt: acetato de etilo; AINEs: Antiinflamatorios no esteroideos; BSTFA: bis-(trimetilsilil)trifluoroacetamida; DE: disruptores endocrinos; DCM: diclorometano; MeOH: metanol; MTBE: metil-tert-butilter PE-DVB: poliestireno-divinilbenceno; PFPA: anhdrido pentafluoropropinico; PPCPs: productos de cuidado personal.

119

Determinacinyreactividadenagua

Analitosy matriz
TCS,frmacos enagua residual DE,MeP,EtP, PrP,BzPen aguaresidual TCSy triclorocarban enagua superficial

Procedimiento
Concentracindelamuestradeaguaconcartuchos OasisHLB60mg.ElucinconMeOHycambiode disolventeaMTBE. Concentracinde0.5LdeaguaconOasisHLB200 mg.Elucincon6mLPropanol:MTBE(1:9). Concentrarasequedadyredisolverenfasemvil. Extraccinde2LdeaguaconcartuchosOasisHLB 60mg.Elucincon4mLdeacetona:MeOH(1:1), 10mMdecidoactico.Concentrarasequedady reconstituircon1mLdeMeOH:acetona. Pasar0.5Ldeaguaporfiltrosdecelulosa.Ajustara pH3yaadirelsurrogado5bromo2(2,4 dibromofenoxi)fenol.ExtraerconOasisHLB500mg yeluirconAcOEt:acetona(1:1).Concentrara sequedadydiluirconagua:MeOH(1:1). Concentracinde500mLdeaguaapH4con columnasdeC18.Lavadocon20mLdeACNen aguayelucinconlafasemvil. Concentracinde50mLdeaguacon200mgde C18,lavadoconaguayelucincon6mLde DCM:Isopropanol(8:2).

Deteccin

LOD (ng/L)
1020

RSD(%)

Rec (%)
84

Ref.

GCMS

(17)

LCMS/MS

0.54

95

(18)

LCMS

(19)

TCSenaguas superficiales

LCMS

12

82

(20)

TCSy frmacosen agua superficial DE,MeP,EtP, PrPyBzPen aguaresidual

LCUV

90

11

102

(21)

LCMS

311

98

(22)

(1)BoydGR,2003;(2)BoydGR,2004;(3)LeeHB,2005;(4)LindstromA,2002;(5)QuintanaJB,2004;(6)ThomasPM,2004; WeigelS,2004;(8)WuJL,2007;(9)NakadaN,2006;(10)GibsonR,2007;(11)VanderfordBJ,2006;(12)LoraineGA,2006;(13) PaxeusN,2004;(14)McAvoyD,2002;(15)vanSteeLLP,1999;(16)ErikssonE,2003;(17)LeeHB,2003;(18)BenijtsT,2004; (19)HaldenRU,2005;(20)HuaW,2005;(21)BonesJ,2006;(22)BenijtsT,2003 AcOEt:acetatodeetilo;AINEs:Antiinflamatoriosnoesteroideos; BSTFA:bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida; DE:disruptores endocrinos; DCM: diclorometano; MeOH: metanol; MTBE: metiltertbutilter PEDVB: poliestirenodivinilbenceno; PFPA: anhdridopentafluoropropinico;PPCPs:productosdecuidadopersonal.

De acuerdo con la bibliografa revisada, la eleccin de los cartuchos Oasis HLB es la ms habitual, ya que este tipo de polmero posee un balance hidroflico (Nvinilpirrolidona) y lipoflico (divinilbenceno)queproporcionaunaretencinycapacidadsuperioresfrenteaotrosadsorbentes [http://www.cienytech.com/ES/pysdisextoasis.htm]. La versatilidad de este polmero permite extraercompuestostantopolarescomoapolares,locualresultaimprescindibleeneltipodeestudio que vamos a realizar, donde se prev la formacin de compuestos halogenados con diferentes propiedadesfsicoqumicasyestructurasaprioridesconocidas. 120

Consideracionesgenerales

3.1.3.Preparacindelamuestraparaelestudiodehalogenacin En los estudios de formacin de productos de halogenacin se han utilizado muestras de agua ultrapura (100250 mL). Los experimentos se llevaron a cabo a temperatura ambiente (temperatura del agua 15 2 C) utilizando botellas de vidrio mbar de 300 mL. El pH de las muestrasfueajustadoconayudadetamponesfosfato,acetatoobicarbonato(0.1M)enfuncindel pHrequerido(entre5y9unidades),aadiendo5mLdeladisolucintampnporcada100mLde muestra.TraselajustedelpH,seadicionunacantidadconocidadeclorolibre(sumadeHClOyClO ) as como del compuesto de partida en metanol (el porcentaje de metanol en la muestra fue siempreinferioral0.1%).Lasmuestrasseagitaronmanualmentedurantedosminutos,ysedejaron reaccionar un tiempo determinado. Pasado ese tiempo, se aadieron 10 mg de tiosulfato sdico (reductor) para eliminar el exceso de cloro presente en el medio. Una vez que la reaccin fue detenida,elpHdelamuestraseajusta2conHCl1M,yserealizlaSPEtalcomosehadescritoen elcaptuloII,secciones2.1.1y2.1.3. Enelcasodelasmuestrasdeaguadegrifo,sedeterminpreviamentelacantidaddecloro presente en la misma con ayuda de un fotmetro, tal como se indica en el siguiente apartado. A continuacin,seprocedidelmismomodoqueconlasmuestrasdeaguaultrapura. 3.1.4.Medidadelclorolibreenaguasdegrifo Enlosestudiosrealizadosconaguadegrifofuenecesariodeterminarlaconcentracinde cloro libre (HClO y ClO) presente en la muestra, para lo cual, se utiliz un fotmetro de filtro. La determinacin se basa en la reaccin que tiene lugar entre el cloro libre y la N,Ndietil1,4 fenildiamina (DPD) dando lugar a un complejo de color rosado que absorbe a 555 nm. Antes de realizarlamedida,seprocespreviamenteunblancodeaguaenausenciadelDPD;lamedidadela muestrasehaceaadiendoelagentecomplejantealagua.Laconcentracindeclorolibreesleda directamente,expresadaenmg/L(ppm)[ClesceriLS;1998]. 3.1.5.Valoracindeladisolucindehipoclorito Dado que las disoluciones de hipoclorito tienen una estabilidad limitada, es necesario controlarlaconcentracinexactadeclorolibrepresenteenlamismasemanalmente.Paraello,se realizunavaloracinredoxcontiosulfatosdico.Estecompuestonoespatrnprimario,conlocual es necesario estandarizarlo previamente con KIO3 (patrn primario). En un matraz erlenmeyer se aaden 25 mL de disolucin de KIO3 (0.0200 M), 2 mL de H2SO4 3M y 2 g de KI, de modo que se generaI2(colorpardorojizo)segnlareaccin: 121

Determinacinyreactividadenagua

KIO3+5KI+3H2SO43I2+3K2SO4+3H2O (1) Enlaburetatenemosladisolucindetiosulfatosdico,Na2S2O3,aproximadamente0.1M,y vamos aadiendo esta disolucin hasta que aparece un color amarillo plido. En ese momento se aadenunasgotasdeengrudodealmidn(indicador)demodoquelacoloracindeladisolucinse torna azul, debido al complejo que se forma entre el yodo y el engrudo. Se aade ms tiosulfato hasta que la disolucin vira a transparente lo que significa que se ha consumido todo el I2. La reaccinredoxseproduceentreelyodoyeltiosulfatosdico: I2+2Na2S2O3Na2S4O6+2NaI (2) Conociendo el volumen gastado, es posible conocer la concentracin real del tiosulfato sdico,segnlafrmula: (3) MNa2S2O3=6x(MKIO3xVKIO3)/VNa2S2O3 Unavezconocidalaconcentracinexactadeltiosulfato,serealizalavaloracinpropiadela disolucindehipoclorito.Paraello,sediluye10vecesladisolucincomercial(40g/Ldecloroactivo) conaguaultrapura,yseaade10mLdelamismaa10mLdecidoactico3My2gKIcontenidos enunmatrazerlenmeyer.DeestamaneraseformaI2debidoalapresenciadelhipocloritosegnla reaccin: ClO+2I+2H+Cl+H2O+I2 (4) Unavezgeneradoelyodoenelmedio,seprocedealavaloracintalcomosehaballevado a cabo para la estandarizacin del tiosulfato. Considerando la ecuacin (2), los moles de yodo generadosvienendadosporlaexpresin: molesI2=1/2x(MNa2S2O3xVNa2S2O3) (5) De acuerdo con la ecuacin 4, los moles de hipoclorito (ClO) coinciden con los moles de yodo.Laconcentracindeestaespeciesepuedeexpresarcomocloroactivoatravsdelareaccin: (6) ClO+Cl+2H+Cl2+H2O 3.1.6.Clculodeltiempodevidamedia Los experimentos de degradacin del triclosn, metil, etil, propil y butilparaben fueron llevados a cabo usando concentraciones de los mismos en el rango de los ng/mL, mientras que la concentracin de cloro se mantuvo a los niveles presentes en las aguas de consumo domstico (mg/L). La velocidad de reaccin del compuesto considerado para dar lugar a los productos de cloracinsedefinesegnlasiguienteecuacin: Analito+ClorolibreProductosdecloracin 122

Consideracionesgenerales

t La concentracin de cloro libre se mantiene en exceso, de modo que la expresin puede ajustarsedelsiguientemodo: x V = k[Analito] t

V=

[Analito]

y x = k [Analito] t [Cloro]0

siendo k = k [Cloro] 0 laconstanteaparentedelavelocidaddereaccin. Los datos experimentales mostraron que x=1, esto es el orden parcial de la reaccin respectoalTCSylosparabenesfuelaunidad.Portanto:
= k[Analito] t t Reorganizandoestaexpresin,obtenemoslasiguienteintegral:
t [Analito] t = kt 0 [Analito] 0 t Integrando,llegamosalasiguienteexpresin:
t = kt 0 Eltiempodevidamedia(t1/2)eseltiempoquetardaenreducirselaconcentracininiciala lamitad,porlotanto,vienedadopor: Ln [Analito] [Analito]

V=

[Analito]

Ln(0.5) k DondekeslapendientedelarectaobtenidaalrepresentarLn[Analito]frentealtiempodereaccin. 3.2.Condicionesinstrumentalesdemedida ParaelseguimientodelasreaccionesdehalogenacindeTCSyparabenesfuenecesariola utilizacindeunatcnicaquenospermitaponerdemanifiestolapresenciadelasdistintasespecies generadas,ascomoseguirladisminucinenlaconcentracindelanalitodepartida.Conayudade lacromatografadegasesacopladaalaespectrometrademasasen fullscan,esposiblerealizarla separacindelasdistintasespeciesascomolaidentificacindelosproductosdehalogenacinen baseadoscriterios:comparacindetiemposderetencinyespectrosdemasasconpatronespuros, einterpretacindelosespectrosdemasasdelospicoscromatogrficoscorrespondientesaespecies desconocidas, teniendo en cuenta que sufren la misma reaccin de sililacin que el analito de partida y que en su mayora se trata de especies policloradas, polibromadas y combinaciones de t
1/2

123

Determinacinyreactividadenagua

ambas.Lasintensidadesrelativasdelosclustersdeionesdeestasespeciesvienencontroladaporlas abundanciasnaturalesdelosistoposdelbromo(79Bry 81Br,50.5%y49.5%)ydecloro(35Cly 37Cl, 75.77%y24.23%).LatablaIII.2recogelasintensidadesrelativastericasparalos clustersdeiones enlosespectrosdemasasdeimpactoelectrnicoparaespeciespolihalogenadas. TablaIII.2.Relacindeintensidadesenlosespectrosdemasas(EI)paracompuestoshalogenados.

ClBr Cl Cl2 Cl3 Cl4 Cl5 ClBr Cl2Br Cl3Br ClBr2 Cl2Br2 Cl3Br2 ClBr3 Cl2Br3 Br Br2 Br3 Br4 X 100 100 100 76.9 61.5 76.6 61.4 51.2 43.5 38.3 31.3 26.1 20.4 100 51.0 34.0 17.4 X+2 32.5 65.0 97.5 100 100 100 100 100 100 100 92.0 85.1 73.3 98.0 100 100 68.0 X+4 10.6 31.7 48.7 65.0 24.4 45.6 65.0 69.9 89.7 100 100 100 49.0 98.0 100 X+6 3.4 10.5 21.1 6.6 17.6 13.7 31.9 49.9 48.9 63.8 32.0 65.3 X+8 0.9 3.4 1.7 3.9 11.6 8.0 18.7 16.0 X+10 0.2 1.0 2.0

En las siguientes tablas se muestran los tiempos de retencin, as como los iones de identificacindeloscompuestosdepartidaydelosproductosdecloracinybromacindetectados paraTCSyparabenes. TablaIII.3.Parmetrosdeidentificacin(GCMS)paraeltriclosnysusproductosdehalogenacin, ascomodelmetiltriclosn.
Compuesto Tr(min)1 Ionescuantificacin (m/z) 219+221 Ionesidentificacin (m/z) 219 221 183 Intensidadesrelativas (%) 100 73 24

2,4DCF

15.80

124

Consideracionesgenerales Tr (min)1 Ionescuantificacin (m/z) Ionesidentificacin (m/z) 253 255 257 217 253 255 257 315 317 302 304 252 254 349 351 314 316 383 385 387 291 345 347 349 200 379 381 383 379 381 383 413 415 417 419 Intensidadesrelativas (%) 94 100 37 18 90 100 37 100 35 88 100 53 36 100 76 30 18 100 83 32 33 95 100 36 28 73 100 54 72 100 57 52 100 75 27

Compuesto

2,4,6TCF

17.43

253+255

2,3,4TCF

18.21

253+255

Clhidroxifenol

20.05

315+317

MTCS

21.19

302+304

diClhidroxifenol

21.38

349+351

triClhidroxifenol

22.95

383+385

TCS

23.28

345+347

TetraI

24.67

379+381+383

TetraII

25.12

379+381+383

Penta

26.76

413+415+417

columnaHP5MS

125

Determinacinyreactividadenagua

Tabla III.4. Parmetros de identificacin (GCMS) para MeP, EtP, PrP, BuP y sus productos de halogenacin,ascomodelbencilparaben.

Compuesto
MeP

Tr (min)1
15.59

Ionescuantificacin (m/z)
209

Ionesidentificacin (m/z)
209 177 195 223 151 195 177 243 245 237 151 195 169 257 259 149 287 289 251 151 169 195 277 279 301 303 271 273 291 293 183 321 323 325

Intensidadesrelativas (%)
100 56 33 100 35 30 21 100 38 100 50 44 44 100 37 36 93 100 100 151 169 195 100 71 94 100 100 37 100 68 30 68 100 27

EtP

16.35

223

3ClMeP

17.19

243+245

PrP

17.38

237

3ClEtP 3BrMeP

17.88

257+259

18.06

287+289

BuP

18.39

251

3,5DClMeP 3BrEtP 3ClPrP 3,5DClEtP

18.54 18.70 18.82

277+279 301+303 271+273

19.17

291+293

ClBrMeP
1

19.38

321+323

columnaHP5MS

126

Consideracionesgenerales Tr (min)1 19.60

Compuesto

Ionescuantificacin(m/z) Ionesidentificacin(m/z) Intensidadesrelativas(%) 315 317 319 285 287 335 337 339 305 307 309 365 367 369 329 331 319 321 379 381 383 349 351 353 393 395 397 363 365 367 91 285 235 407 409 411 100 99 18 100 37 67 100 29 100 67 15 43 100 53 90 100 100 74 52 100 53 71 100 25 61 100 60 70 100 30 100 76 24 50 100 54

3BrPrP

315+317

3ClBuP

19.76

285+287

ClBrEtP

20.01

335+337

3,5DClPrP

20.06

305+307

3,5DBrMeP

20.21

365+367+369

3BrBuP 3,5DClBuP

20.55 20.99

329+331 319+321

3,5DBrEtP

20.79

379+381+383

ClBrPrP

20.83

349+351

3,5DBrPrP

21.60

393+395+397

ClBrBuP

21.69

363+365

BzP

22.05

285

3,5DBrBuP
1

22.43

407+409+411

columnaHP5MS

127

Determinacinyreactividadenagua

3.3. Extraccin en fase slida con derivatizacin en medio homogneo de triclosn y compuestosrelacionados Previamente a los estudios de halogenacin del triclosn, se desarroll un mtodo de extraccinmedianteSPEconderivatizacinenmediohomogneoparaloscompuestosestudiados (triclosn,2,4diclorofenol,2,3,4triclorofenolymetiltriclosn).Lacromatografadegasesacopladaa laespectrometrademasas(GCMS)fueseleccionadacomotcnicadedeterminacin. 3.3.1. Optimizacin de las condiciones de derivatizacin en medio homogneo y estabilidaddeloscompuestossililados Conelobjetivodeoptimizarlascondicionesdederivatizacindetriclosn,2,4diclorofenoly 2,3,4triclorofenol se llev a cabo un diseo factorial completo tipo 23, con dos puntos centrales, para evaluar cuales son los factores que afectan, de modo estadsticamente significativo, a la derivatizacin. En concreto se estudi la influencia de la temperatura, el tiempo y el volumen de derivatizante(MTBSTFA). Pararealizaresteestudiosepreparpreviamenteunpooldeextractosdeaguaresidual,sin tratar,conunaadicinde2ng/mLdetriclosn,2,3,4,triclorofenoly2,4diclorofenol.Paraello,se concentraron4muestrasde500mL,ajustadasapH2,utilizandocartuchosOasisHLBde60mg.Los compuestosfueronextradoscon2mLdeacetatodeetilo,ystossecombinaron.Paralarealizacin de los diez experimentos del diseo factorial, se utilizaron alcuotas de 0.5 mL de este pool y el volumencorrespondientedederivatizante.Entodosellos,elvolumen finalseajusta700Lcon acetato de etilo. Se inyect 1 L del extracto en el sistema GCMS y los resultados obtenidos se trataron en el programa estadstico Statgraphics 5.1, obteniendo el valor de los efectos estandarizados, los cuales se muestran junto con las condiciones experimentales en la siguiente tabla(tablaIII.5).Comosepuedeobservar,ningnfactorfueestadsticamentesignificativoparalos trescompuestos.Cabedestacarquelasdesviacionesestndarrelativasdelasreasdepicoparalos 10 experimentos del diseo fueron inferiores al 5 %. En base a estos resultados se seleccion el volumeninferiordederivatizante(20L),untiempodereaccinmnimo(5minutos)ytemperatura ambiente,simplificandoaselprocesodederivatizacin.

128

SPEaplicadaalaextraccindeTCSycompuestosrelacionados

TablaIII.5.Dominioexperimentalyefectosprincipaleseinteraccionesestandarizadosobtenidospara laoptimizacindelascondicionesdederivatizacindeltriclosnycompuestosrelacionados.
Dominioexperimental Factor A:V.MTBSTFA(L) B:Tiempo(min) C:Temperatura(C) AB AC BC
t=3.20paran=3yun95%

Efectosprincipaleseinteracciones 2,4DCF 1.35 1.33 0.07 0.05 0.84 0.48 2,3,4TCF 0.72 1.88 0.53 0.49 1.09 0.18 TCS 0.72 1.28 0.77 0.59 0.85 9104 200 60 70

Rangodevalores 20 5 20

Se estudio tambin la estabilidad de los compuestos sililados en el tiempo, puesto que podransersusceptiblesdesufrirlahidrlisisdelenlaceSiO.Paraello,seprepararondospatrones en acetato de etilo de concentracin aproximada 200 ng/mL para cada compuesto, as como dos extractosde500Ldeunamuestradeaguaresidual,deconcentracinentornoa800ng/mL.Se derivatizaroncon20y50LdeMTBSTFAenamboscasos,y1Ldecadaunofueinyectadoenel sistemaGCMS,endassucesivostrassupreparacin.Paraevitarlaconcentracindelosextractos, estos fueron almacenados a 4C entre inyecciones. Los resultados obtenidos para el triclosn se muestranenelgrficoadjunto,endondepodemosversusealrelativafrentealPCB30,utilizado comopatrninternoparaminimizarlasvariacionesenlarespuestadelsistemadeGCMSduranteel estudio. FiguraIII.1.Estabilidadtemporaldeltriclosnsililadoparaunpatrn(200ng/mL)yunextractode agua(800ng/mL)usandodistintosvolmenesdederivatizante.

1DIA 16 14 12 10 8 6 4 2 0 Extracto,MTBSTFA50L SealTCSrelativaaPCB30

2DIA

3DIA

6DIA

9DIA

Extracto,MTBSTFA20L

Patrn,MTBSTFA50L

Patrn,MTBSTFA20L

129

Determinacinyreactividadenagua

ComosepuedeobservarenlafiguraIII.1,elcompuestoderivatizadoresultserestableal menos durante 9 das tras el proceso de sililacin, lo que implica la posibilidad de almacenar extractosypatronesdecalibracintrassupreparacinparasureinyeccinencasonecesario.El2,4 diclorofenol y el 2,3,4triclorofenol mostraron un perfil similar al del triclosn en lo referente a la estabilidadtemporaldesusderivadossililados. 3.3.2.OptimizacindelprocesodeSPEparamuestrasacuosas Una vez fijadas las condiciones de derivatizacin, se procedi a la optimizacin de un mtododeSPEparaladeterminacindeloscompuestosanteriores,ademsdelmetiltriclosn,en muestras acuosas. En primer lugar, se estudi el volumen de elucin y el volumen mximo de muestra a concentrar con los cartuchos de Nvinilpirrolidona y divinilbenceno. A continuacin, se considerlaposibilidaddepurificarlosextractoscorrespondientesaaguaresidualparalaposterior aplicacin del mtodo al anlisis de muestras reales, as como a los estudios de halogenacin del triclosn. 3.3.2.1.Volumendeelucinyvolumendecorte LaextraccindeloscompuestosestudiadossellevacaboempleandoloscartuchosOasis HLBde60mg.Laeleccindeacetatodeetilocomodisolventedeelucinenlugardemetanol,tal como indica el protocolo genrico de preparacin de muestra, se hizo en base a estudios previos realizadosconestrgenosporRodrguezycolaboradores[RodrguezI;2003].Larecuperacindelos analitosconacetatodeetilopermitiladerivatizacindirectadelextractoobtenidosinnecesidadde un cambio de disolvente, ya que el metanol reaccionara con el agente sililante. Para evaluar el volumendedisolventenecesariopararecuperarloscompuestos,sehizopasar1Laguaultrapura, con adicin de los analitos a nivel de 4 ng/mL a travs de un cartucho Oasis HLB de 60 mg, procediendoalsecadodelmismoylaelucinde4fraccionesdeacetatodeetilode2mLcadauna. Tras la etapa de derivatizacin, se inyect 1 L del extracto en el sistema GCMS. Los resultados obtenidos mostraron que los compuestos son eluidos cuantitativamente con 2 mL de acetato de etilo,figuraIII.2.

130

SPEaplicadaalaextraccindeTCSycompuestosrelacionados

Figura III.2. Elucin de un cartucho Oasis HLB de 60 mg con fracciones consecutivas de 2 mL de acetatodeetilo.
2,4DCF 2,3,4TCF MTCS TCS

100.00% 80.00% Sealrelativa 60.00% 40.00% 20.00% 0.00% 1 2 Fra cci n 3 4

El volumen de ruptura del cartucho de 60 mg, se estudi haciendo pasar 2 L de agua ultrapura, con adicin de los compuestos del orden de 4 ng/mL, a travs de dos cartuchos conectadosenserie,paraqueelsegundocartuchoretengalasposiblesprdidasquepuedasufrirel primero.Losresultadosobtenidosmostraronqueelvolumendecortedelcartuchoessuperiora2L, puestoqueloscompuestosnofuerondetectadosenelextractoprocedentedelsegundocartucho, figuraIII.3. Figura III.3. Seales (reas de pico) correspondientes a la evaluacin del volumen de corte de los cartuchosOasisHLBde60mgempleando2Ldemuestra.

2E 6 +0 + 1E 06 5 +0 6E 0 +0 0E

reasdepico

2,4DCF

2,3,4TCF

MTCS

TCS

1 ho tu c r Ca

131

Determinacinyreactividadenagua

3.3.2.2.Matricescomplejas:filtracinypurificacindeextractos

Las matrices reales (agua de ro, agua residual) contienen materia particulada, macromolculas y compuestos orgnicos que pueden obturar el cartucho de extraccin, as como interferirenladeterminacindeloscompuestosdeinters.Paraevitarambosproblemas,seestudi laviabilidadderealizarlafiltracin,previaalaSPE,delamuestradeaguaparaeliminarlamateria particulada,evitandolaobturacindeloscartuchos,ascomolaposteriorpurificacindelextracto enacetatodeetiloconcartuchoscomercialesdeslica. Con respecto a la filtracin, se ha tenido en cuenta que muchos compuestos sufren retencin en la superficie de los filtros. Singer y colaboradores [Singer H; 2002] indicaron que el triclosneraretenidoporlosfiltrosdepoliamida,adiferenciadelosfiltrosdecelulosaregenerada. Losfiltrosconsideradosfuerondemembranadeacetatonitratodecelulosade0.45mydefibrade vidriode1mdetamaodeporo.Enamboscasos,sefiltraronmuestrasdeaguaultrapura(pH2) conteniendoloscuatroanalitosanivelde25ng/mL.PosteriormenteseconcentraronmedianteSPE. Tambinseprocesunareferenciasinfiltrarparaponerdemanifiestoelnivelderetencindelos compuestossobrelosfiltros.LosresultadosobtenidossemuestranenlafiguraIII.4. FiguraIII.4.Evaluacindelaretencindelosanalitosendistintosfiltros.Sealrelativaalareferencia nofiltrada(N=3).
Referenci a 1.2 Concentracinrelativa 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 2,4DCF 2,3,4TCF Compues to MTCS TCS Cel ul os a (0.45m) Fi bra devi dri o

El triclosn y especialmente el metiltriclosn, mostraron una adsorcin importante en los filtrosdeacetatonitratodecelulosa,siendomsacusadacuantomayoressuconstantedeparticin

132

SPEaplicadaalaextraccindeTCSycompuestosrelacionados

octanolagua (4.8 y 5.4, respectivamente). En base a estos resultados, se decidi utilizar filtros de fibradevidrio. Conrespectoalosextractosprocedentesdeaguasresiduales,seconsiderlaposibilidadde llevar a cabo su purificacin con cartuchos comerciales de slica neutra de 500 mg (SepPak 500 mg/3mL).Estetipodeadsorbenteretienemolculasdenaturalezapolar,lascualespuedenacortar lavidatildelacolumna,ademsdeconsumirparcialmenteelderivatizanteaadidoalosextractos. Elprimerpasofueevaluarlacantidaddedisolventenecesarioparaeluircuantitativamente loscompuestosdeladsorbenteenfasenormal.Paraello,secargaron2mLdeunpatrnenacetato deetilo(2g/mL)sobreuncartuchodeslica,recogiendofraccionesdeacetatodeetilo,laprimera de ellas de 5 mL y las sucesivas de 2 mL. La primera fraccin fue concentrada a 2 mL, y posteriormente derivatizada junto con las otras tres. Los resultados obtenidos se muestran en la figuraIII.5. FiguraIII.5.Perfildeelucindelosanalitosenloscartuchosdeslicade500mg(N=3).
2,4DCF 120% 100% Sealrelativa 80% 60% 40% 20% 0% 1 Fraccin 2
4.00% 3.00% 2.00% 1 .00% 0.00% 2

2,3,4TCF

MTCS

TCS

Comosepuedecomprobar,5mLdeacetatodeetilofueronsuficientesparalaelucinde loscompuestosdelcartuchodeslica. En la figura III.6 se muestran los cromatogramas de GCMS (corriente inica total) correspondientes al extracto de una muestra de 1 L de agua residual, con y sin etapa de limpieza sobreslica.Lareduccindelacomplejidaddelcromatogramaesevidente,figuraIII.6,noslodesde elpuntodevistadelasealcromatogrfica,sinoquelareduccindelacoloracindelextractofue tambinimportante.

133

Determinacinyreactividadenagua

Figura III.6. Superposicin de cromatogramas (GCMS) para un agua residual con limpieza (lnea continua)ysinlimpieza(lneadiscontinua).
MCts 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 10 15 20 25 30 minutos

3.3.3.Caracterizacindelmtodoanaltico

Unavezoptimizadaslascondicionesdeconcentracindelosanalitos,medianteextraccin en fase slida, con derivatizacin en medio homogneo y anlisis mediante GCMS, figura III.7, se caracteriztantoelmtododedeterminacincomoelprocesoanalticoensuconjunto. FiguraIII.7.EsquemadelprocesodepreparacindemuestramedianteSPEparaladeterminacinde triclosnycompuestosrelacionadosenagua.
AcondicionamientoOasisHLB60mg: 3mL AcOEt,MeOH,H2OpH2

Pasodelamuestra: 1L,pH2,filtrada confibradevidrio

SecadoconN214psi/30min Elucin 2mLacetatodeetilo PurificacinSepPak0.5g (sloaguasresiduales)

Derivatizar 0.5mL con20L MTBSTFAaT Amb.5min

Eluir 5mLAcOEt y concentrara2mL

134

SPEaplicadaalaextraccindeTCSycompuestosrelacionados

3.3.3.1. Caracterizacin del mtodo de determinacin (GCMS): linealidad, repetibilidad y lmitesdecuantificacin La linealidad de la respuesta analtica se evalu mediante un calibrado a 10 niveles de concentracincomprendidosentre25ng/mLy3g/mL.Lasregresionesobtenidasalrepresentarel valor de rea de pico frente a la concentracin de los analitos, mostraron coeficientes de determinacinde0.999. Larepetibilidaddeinyeccinfueestudiadainyectando1Ldeunpatrnde400ng/mLpor quintuplicado.Loscoeficientesdevariacinobtenidosparacadaunodeloscompuestosseindican enlatablaIII.6,siendoinferioresentodosloscasosa2.5%. Loslmitesdecuantificacin(LOQs)sedefinencomolacantidadmnimadecompuestoque produce una seal cromatogrfica con una relacin S/N de 10, cuando se registran los cromatogramasalasrelacionesdem/zdelpicobasedelespectrodemasasdelcompuesto.LosLOQ del equipo (GCMS) para los cuatro analitos estudiados se evaluaron inyectando niveles de concentracin inferiores a 5 ng/mL. Con ayuda del software GCMS Saturn Workstation 5.4 se calcularonloslmitesdecuantificacinparaloscompuestos.Estesoftwareintegralasealderea (ruido)delos5scansobtenidospreviayposteriormentealpicocromatogrficoparadarlugaralos lmitesdecuantificacin,tablaIII.6. TablaIII.6.Ecuacionesdelasrectasdecalibrado,coeficientesdedeterminacin,LOQsyrepetibilidad paralosanalitosestudiados.
2,4DCF 2,3,4TCF MTCS TCS Recta Y=1091X+16070 Y=857X+11349 Y=784X+1315 Y=1164X+25057 R2 0.999 0.999 0.999 0.999 LOQ(ng/mL) Repetibilidad(%RSD,n=5) 4 3 2 3 1.2 1.4 2.4 1.0

3.3.3.2.Exactitud,precisinylmitesdecuantificacindelmtodoanaltico Los lmites de cuantificacin (LOQs) se definen como la cantidad mnima de analito que puede ser cuantificado con fiabilidad, correspondiente a una relacin S/N de 10. En base a esta definicin y teniendo en cuenta el factor de concentracin obtenido, as como los blancos de proceso, se establecieron los siguientes LOQs para un volumen de muestra de 1 L, tabla III.7. Los

135

Determinacinyreactividadenagua

LOQsobtenidosconlametodologadeSPEdesarrolladason2vecessuperioresalosobtenidospor SPME,tablaI.10. TablaIII.7.LmitesdecuantificacindelmtododeSPE(Vol.1L).

Compuesto 2,4DCF 2,3,4TCF MTCS TCS LOQ(ng/L) 8 6 4 6

La exactitud y precisin del mtodo desarrollado se evaluaron para cada uno de los compuestosendistintasmatricesacuosas.Pararealizaresteestudio,sehautilizado1Ldeaguacon adicindelosanalitosanivelde0.5ng/mL,realizando4rplicasdelprocesoanalticoparacadatipo demuestra.Enelcasodelefluente(aguaresidualtratada),secompararonlasrecuperacionesylos coeficientes de variacin obtenidos con y sin etapa de purificacin. Las recuperaciones se determinaron mediante un calibrado externo, con patrones en acetato de etilo de distintas concentraciones, teniendo en cuenta las seales obtenidas para las muestras sin adicin. Las recuperaciones obtenidas oscilaron entre 77 y 116 %, con RSDs inferiores al 10 %, prcticamente paralamayoradelasmuestras,tablaIII.8. TablaIII.8.Recuperaciones(%)delmtodopara1Ldemuestraconadicindeloscompuestosanivel de0.5ng/mL(N=4).
Matriz AguaMilliQ Aguaro Res.tratadasinlimpieza Res.tratadaconlimpieza Res.sintratarconlimpieza 2,4DCF 945 1083 1124 924 903 2,3,4TCF 954 1054 1064 775 893 MTCS 953 10311 1164 1104 1082 TCS 983 887 1143 1026 985

136

SPEaplicadaalaextraccindeParabenes

3.4. Extraccin en fase slida con derivatizacin en medio homogneo para la determinacindeparabenesenmuestrasdeagua Paraladeterminacindeparabenesenmuestrasdeaguaseoptimiztambinunmtodo deextraccinenfaseslida.Estametodologafueaplicadaalanlisisdemuestrasdeaguaderoy aguaresidual,ascomoparaseguirlosestudiosdehalogenacinalos cualesnosreferiremosms adelante. 3.4.1. Optimizacin de las condiciones de derivatizacin en medio homogneo y estabilidaddeloscompuestossililados Lascondicionesdederivatizacinenmediohomogneodelosparabenesenloreferentea volumen de derivatizante (20100 L), tiempo (560 minutos) y temperatura (2070C), fueron estudiadosmedianteundiseoexperimentalfactorialfraccionalenmodomixto3x22conunpunto central. Este tipo de diseo permite estudiar uno de los factores a 3 niveles (en nuestro caso la temperatura),estimandoaseltrminocuadrticoasociadoalmismo. Parallevaracabolosdistintosexperimentossepreparunpooldeextractos,enacetatode etilo, correspondientes a agua residual tratada a la que se adicion los parabenes a nivel de 700 ng/mL. Una vez obtenido este pool, se aadi a 500 L de extracto el volumen de derivatizante indicadoenlatablaIII.9,diluyendoconacetatodeetilohastaunvolumenfinalde600Lencaso necesario.LosextractosfueroninyectadosenelsistemaGCMSobteniendolasreasdepicoquese muestranenlatablaIII.9. Tabla III.9. Experimentos realizados y reas de pico obtenidas durante la optimizacin de la derivatizacinenmediohomogneo.
Temperatura (C) 45 70 70 20 45 45 70 20 45 V.MTBSTFA (L) 100 100 20 20 100 20 20 20 60 Tiempo (min) 5 5 60 5 60 5 5 60 32.5 MeP 178940 162922 173866 39231 184084 56168 137631 50095 166651 EtP 156294 145024 164183 39959 170689 55400 119913 50644 166589 PrP 152202 147815 158159 38311 151894 57169 120735 39134 158907 BuP 225023 200001 222404 51694 238164 72217 174833 75725 224407 BzP 135059 140083 155725 39612 175905 33142 143094 70025 150386

137

Determinacinyreactividadenagua Temperatura (C) 70 45 20 20 V.MTBSTFA (L) 100 20 100 100 Tiempo (min) 60 60 60 5

MeP 168919 194579 172321 171392

EtP 147106 173437 152592 155645

PrP 156030 165120 157493 157094

BuP 209399 240398 213701 215901

BzP 147308 162801 153918 151517

Traseltratamientodelosresultadosobtenidos(reasdepico)conelprogramaestadstico Statgraphics 5.1, se obtuvieron las cartas Pareto para los 5 compuestos estudiados, y las correspondientes superficies de respuesta. MeP, EtP, PrP y BuP presentaron cartas Pareto y superficiesderespuestasimilares.ElBzPdifiereligeramente,aunquelasconclusionesalasquese llegaronfueronlasmismas,figuraIII.8. FiguraIII.8.CartasParetoysuperficiesderespuestaparaeletilparabenyelbencilparaben.
CartaParetoEtP B:Volumen AB A:Temperatura
reas SuperficiederespuestaEtP Tiempo=60,0 Tiempo=60min

+ -

(X10000) 20 17 14 11 8 5 20 30 40 50 60 Temperatura (C) 0 20 60 40 80 100

C:Tiempo BC AA AC 0 1 2 Efectosestandarizados 3 4

70

Volumen (L)

CartaParetoBzP B:Volumen AB C:Tiempo A:Temperatura BC AA AC 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 reas SuperficiederespuestaBzP Tiempo=60,0 Tiempo=60min

+ -

(X10000) 21 18 15 12 9 6 20 30 40 50 60 Temperatura (C) 0 20 40 80 60 100 Volumen (L)

70

Efectosestandarizados

EnlascartasParetosepuedeobservarquevaloresaltosdetemperatura,tiempoyvolumen deMTBSTFAafectarondemodopositivoalaeficaciadederivatizacin.InclusoparaMeP,EtP,PrPy BuP el volumen de derivatizante fue estadsticamente significativo (95% confianza), as como la interaccin temperaturavolumen (AB). Las superficies de respuestas obtenidas para 60 minutos, mostraron que a temperaturas elevadas, la seal result ser mucho mayor frente a temperatura ambiente.Conrespectoalderivatizante,paraobtenermejoresresultadosserequierenvolmenes

138

SPEaplicadaalaextraccindeParabenes

mayoresdeMTBSTFA,aunqueatemperaturaselevadas,seobservquelarespuestaprcticamente no variaba con el volumen de derivatizante, con lo cual, se seleccion un valor medio (40 L de MTBSTFA)dentrodeldominioexploradoeneldiseo. Una vez fijadas las condiciones de derivatizacin (40 L de MTBSTFA a 70C durante 60 minutos)seevalulaestabilidaddeloscompuestosderivatizadoseneltiempo.Paraello,seprepar unpatrnenacetatodeetilode1.2g/mLyunextractodeunefluenteconadicindelosanalitosa nivelde500ng/mL.Quinientosmicrolitrosdelasdisolucionesanterioresfueronderivatizadoscon40 L de MTBSTFA a 70C durante una hora, inyectando posteriormente 1 L en el sistema GCMS durante varios das. Al igual que en el caso del triclosn, se utiliz como patrn interno el PCB30 para compensar los posibles cambios de respuesta que puede haber en el equipo. Los resultados obtenidos, mostraron que los parabenes derivatizados son estables durante un periodo de 7 das cuandosonalmacenadosa4C,figuraIII.9. FiguraIII.9.Estabilidaddeloscompuestossililadoseneltiempo.SealrelativaalPCB30.
Da1 12 10 8 6 4 2 0 MeP EtP PrP Patrn BuP BzP MeP EtP PrP Muestra BuP BzP Da2 Da3 Da6 Da7 Da8

3.4.2.OptimizacindelprocesodeSPEparamuestrasacuosas Unavezfijadaslascondicionesptimasdederivatizacin,losparmetrosdeextraccinde los parabenes en muestras de agua fueron optimizados usando el mismo adsorbente que para el triclosn.Lascondicionesdepartidafueronlasmismas:aguaapH2.5,cartuchosOasisHLBde60 mgyacetatodeetilocomoeluyente.

SealrelativaaPCB30

139

Determinacinyreactividadenagua

3.4.2.1.Volumendeelucindeloscartuchosyvolumendecorte La cantidad de acetato de etilo necesaria para recuperar los compuestos del cartucho de SPE, as como el volumen mximo de muestra a concentrar con la fase polimrica seleccionada fueronevaluadossimultneamente.Paraelloseconcentrunamuestradeaguaultrapurade2La pH2.5conunniveldeadicinde2ng/mL.Estamuestrasehizopasarpordoscartuchosconectados en serie, de modo que en el caso de que el volumen de corte sea menor, el eluato del segundo cartucho presentar seal para los compuestos estudiados. Por otra parte, el primer cartucho fue eluidocon3fraccionesdeacetatodeetilo(2mLcadauna)paraestablecerelvolumenmnimode disolventenecesariopararecuperarcuantitativamenteloscompuestos.Losresultadosobtenidosse muestranenlafiguraIII.10. FiguraIII.10.VolumenderupturaydeelucindelosparabenesusandocartuchosOasisHLBde60 mg.
1200000 1000000 reasdepico 800000 600000 400000 200000 0 Fr1 Fr2 Cartucho1 Fr3 Fr1 Cartucho2 EtP MeP BzP BuP PrP

ComosepuedeobservarenlafiguraIII.10,2mLdeacetatodeetilofueronsuficientespara eluirconjuntamenteloscincocompuestos.Porotraparte,elvolumendecortedelcartuchoresult sersuperiora2Ldemuestra,puestoquenohaypresenciadelosparabenesenelsegundocartucho. 3.4.2.2.Matricescomplejas:Purificacindelosextractos Losextractosprocedentesdeaguasresidualespresentaronunagrancomplejidaddebidoa la presencia de sustancias coextradas. Del mismo modo que se ha hecho para el triclosn, se 140

SPEaplicadaalaextraccindeParabenes

planteunaestrategiadepurificacindelosextractosprocedentesdeloscartuchosdefasereversa, utilizandocartuchosdeslicaneutracomerciales,SepPakde500mg. Fue necesario conocer el volumen de acetato de etilo necesario para recuperar los compuestosdeloscartuchosdefasenormal.Paraello,sedepositsobreestecartuchounaalcuota deunpatrndelosanalitosconunaconcentracinde2g/mL.Serecogieronfraccionessucesivas de2mLdeacetatodeetilo,que,unavezderivatizadas,fueroninyectadosenelsistemaGCMS.Las reasdepicoobtenidasserepresentaronenlasiguientefigura,figuraIII.11. FiguraIII.11.PerfildeelucinparalosparabenesdeloscartuchosdeslicaSepPakde500mgcon acetatodeetilo.
MeP 100% 80% Sealrelativa 60% 40% 20% 0% 1 2 Fraccin(2mL) 3 4 EtP PrP BuP BzP

En la figura anterior se puede apreciar que son necesarios, al menos, 4 mL de acetato de etilo para recuperar cuantitativamente los parabenes de los cartuchos de slica. Por lo tanto, la purificacindelosextractosdeaguasresidualesserealizarpasandoatravsdelcartuchodeslica los2mLdeacetatodeetiloeluidosdelcartuchoOasisHLByrecuperandoloscompuestoscon5mL delmismodisolvente.Acontinuacin,esos5mLsernconcentradosencorrientedenitrgenohasta unvolumende2mLparaprocederasuderivatizacinydeterminacincromatogrfica. 3.4.3.Caracterizacindelmtodoanaltico Una vez optimizadas las condiciones de extraccin de las muestras de agua conteniendo parabenes,figuraIII.12,sepresentanlascaractersticasdelmtododedeterminacin(GCMS)enlo referenteaexactitud,precisinylmitesdecuantificacin.

141

Determinacinyreactividadenagua

FiguraIII.12.EsquemadepreparacindemuestramedianteSPEparaladeterminacindeparabenes enagua.
AcondicionamientoOasisHLB60mg: 3mL AcOEt,MeOH,H2OpH2

Pasodelamuestra: 1L,pH2,filtrada confibradevidrio

SecadoconN214psi/30min Elucin 2mLacetatodeetilo PurificacinSepPak0.5g (sloaguasresiduales)

Derivatizar 0.5mL con40L MTBSTFAa70C,60min

Eluir 5mLAcOEt y concentrara2mL

3.4.3.1. Caracterizacin del mtodo de determinacin (GCMS): linealidad, repetibilidad y lmitesdecuantificacininstrumentales La linealidad del sistema GCMS para parabenes fue estudiada inyectando una serie de patronescuyasconcentracionesestabancomprendidasentre20ng/mLy2g/mL.Loscoeficientes dedeterminacindelasrectasobtenidasoscilaronentre0.9970.998. ParalaobtencindelosLOQsdelequiposeprocedideformaidnticaqueenelestudio realizado con el triclosn. La repetibilidad de inyeccin se evalu con un patrn de concentracin 100ng/mLparacadaanalito,inyectadoseisvecesenelsistemacromatogrfico.Losparmetrosque caracterizanalsistemaGCMSsemuestranenlasiguientetabla(tablaIII.10). TablaIII.10.Rectasdecalibrado,coeficientesdedeterminacin,LOQsyrepetibilidadparaparabenes utilizandoGCMScomotcnicadedeterminacin.
Recta R2 LOQ(ng/mL) Repetibilidad(%RSD,n=6) 5 5 6.1 4.1

MeP Y=306X+6812 0.998 EtP Y=274X+6361 0.998

142

SPEaplicadaalaextraccindeParabenes

PrP BuP

Recta Y=264X+6597 Y=405X5289

R2 0.998 0.998

LOQ(ng/mL) Repetibilidad(%RSD,n=6) 3 2 13 4.6 7.1 8.3

BzP Y=256X10705 0.997

3.4.3.2.Exactitud,precisinylmitesdecuantificacindelmtodoanaltico

Los lmites de cuantificacin para los parabenes en muestras acuosas se obtuvieron considerandolosblancosdelprocesoascomolosLOQsproporcionadosporelsistemadedeteccin (GCMS), considerando un factor de concentracin de 500 veces (1 L a 2 mL de acetato de etilo), tabla III.11. En el caso de matrices sencillas (aguas superficiales), estos LOQs se podrn reducir incrementando el volumen de muestra hasta 2 L. Para aguas residuales no es posible concentrar volmenessuperioresa1LdebidoalaobturacindeladsorbenteenelcartuchodeSPE. TablaIII.11.LmitesdecuantificacindelmtododeSPE(Vol.1000mL).
LOQ ng/L MeP 10 EtP 10 PrP 6 BuP 3 BzP 26

LosLOQsobtenidosutilizandoSPEcomotcnicadeconcentracinfueronsimilaresquelos obtenidosparaSPME(tablaII.7)conexcepcindelMePparaelquenosedetectaronsealesenlos blancosdeSPE. Laexactitudyprecisindelmtodoanalticofueronevaluadasconunconjuntodemuestras de agua ultrapura, agua de grifo (tratada previamente con tiosulfato sdico para eliminar el cloro presenteenlamisma),aguadero,aguaresidualtratadaysintratar.Paraello,seprocesaronpor cuadruplicado1litrodecadatipodemuestraconadicindelosparabenesanivelde0.5ng/mL.Las concentracionesenmuestrafueroncuantificadasmediantecalibradoexterno,sustrayendolaseal delasfraccionessinadicinenelcasodelasmuestrasdeaguaderoyresidual.Lasrecuperaciones obtenidassemuestranenlatablaIII.12.Losextractoscorrespondientesamuestrasdeaguaresidual fueron purificadas con 500 mg de slica, tal como se ha descrito en el apartado 3.4.2.2. de este captulo.

143

Determinacinyreactividadenagua

Tabla III.12. Recuperaciones (%) del mtodo para 1 L de muestra con adicin de los compuestos a nivelde0.5ng/mL(N=4).
Matriz AguaMilliQ Aguadegrifo Aguadero Res.tratada Res.sintratar MeP 1062 805 1075 1054 796 EtP 1093 943 1045 1124 916 PrP 1121 984 1122 1195 964 BuP 1071 973 1102 1082 1031 BzP 999 812 885 1084 1182

144

HalogenacinTriclosn

3.5.Halogenacindeltriclosn

3.5.1.Pruebaspreliminares Eltriclosnesunfenoxifenoltricloradoque,dadaasuestructura,essusceptibledesufrir reaccionesdehalogenacinenelanillofenlicocuandoseponeencontactoconelectrfiloscomoel hipoclorito sdico. Inicialmente, se llevaron a cabo una serie de experimentos con objeto de confirmar esta hiptesis. Se emplearon alcuotas de agua ultrapura con una cantidad conocida de triclosn,40ng/mL,yconcentracionesvariablesdeclorolibre(0.08,0.2,0.4y8mg/L).Todasestas pruebasserealizaronatemperaturaambiente(temperaturadelagua152C),enausenciadeluzy sin ajuste del pH del medio, seleccionando un tiempo de reaccin de 1 hora. Tras ese tiempo, se concentraron las muestras aplicando la metodologa de SPE y se inyectaron en el sistema GCMS, obteniendoloscorrespondientescromatogramas,figuraIII.13. FiguraIII.13.CromatogramasdeGCMSobtenidosenlosestudiospreviosdecloracindeltriclosn.
kCts 750 500 250 0 750 500 250 0 750 500 250 0 750 500 250 0 750 500 250 0 22.5 23.0 23.5 24.0 minutos 0 17.2 17.3 17.4 17.5 17.6 17.7 minutos 150

0mg/LClorolibre

345+347

kCts 200

219+221

0.08mg/LClorolibre

100 50 0 15.4 15.5 15.6 15.7 15.8 15.9 16.0 16.1 16.2 minutos kCts 250

0.2mg/LClorolibre

0.4mg/LClorolibre
200 150

253+255

8mg/LClorolibre

100 50

Comosepuedecomprobar,trasunahora,eltriclosnreaccioncuantitativamenteconel agente oxidante a las cuatro concentraciones evaluadas. Por otra parte, result significativa la formacinde2,4diclorofenol,ascomodeuntriclorofenol,a17.4minutos,quenosecorresponde 145

Determinacinyreactividadenagua

con el 2,3,4triclorofenol (tr 18.2 minutos). La seal de estos ltimos aument con la cantidad de cloroenelmediodereaccin. Tal como se aprecia en estas pruebas iniciales, el triclosn es susceptible de sufrir una degradacin relativamente rpida en presencia de niveles bajos de cloro libre, formndose varios subproductos durante este proceso. Por tanto, se procedi al estudio sistemtico de aquellos factoresqueinfluyenenlareactividaddeltriclosnenpresenciadeclorolibre. 3.5.2.EstudiodedegradacinadistintospHsyconcentracionesdeclorolibre LainfluenciadelpHydelaconcentracindeclorolibreenladegradacindetriclosnfue investigada utilizando alcuotas de 100 mL de agua ultrapura, tamponada a cinco pHs diferentes, comprendidosentre5y9,yconconcentracionesdeclorolibrecrecientes,de0a2.4mg/L.Trasla adicin de triclosn, la mezcla se dej reaccionar durante 5 minutos en botellas cerradas y en ausenciadeluz.Pasadoesetiempo,seeliminelexcesodeagenteoxidantecon10mgdetiosulfato sdico(reductor)yseprocedialaconcentracindelasmuestrasmediantelametodologadeSPE desarrolladaenestecaptulo.EnlafiguraIII.14,sepuedeobservarlaestabilidaddeltriclosnfrente alasdistintasconcentracionesdecloroyelpHdelagua. FiguraIII.14.EstabilidadrelativadeltriclosnadistintospHsyconcentracionesinicialesdeclorolibre. ConcentracininicialdeTCS50ng/mL.
pH5 120% 100% Sealrelativa 80% 60% 40% 20% 0% 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 mg/LClorolibreinicial pH6 pH7 pH8 pH9

En la figura III.14 se puede apreciar un aumento de la degradacin del triclosn con la concentracin de agente oxidante. Adems, el pH ejerci un efecto notable en su estabilidad, observndose la mxima reactividad en el intervalo entre pH 7 y 8, lo cual concuerda con la informacin existente para especies fenlicas. En general, este tipo de reacciones son ms favorablescuandoelcompuestoseencuentraenformafenolato,mientrasqueeloxidante(pKa7.5)

146

HalogenacinTriclosn

seencuentraensuformacida.Enelcasodeltriclosn,pKade7.80,elrangoentrepH7y8result serelmsfavorableparasudegradacin. 3.5.3.Cinticasdecloracinenaguaultrapura LacinticadecloracindeltriclosnenaguaultrapurafueestudiadaatrespHsdiferentes (6.3,7.3y8.3)alosquepuedenencontrarselasaguassuperficiales.Laconcentracindeclorolibre semantuvoen0.4mg/L,concentracinmediaestipuladaparaelaguadegrifo.Cabedestacarqueel clorolibreestenexcesofrentealtriclosn(9ng/mL),portanto,lavelocidaddereaccinesfuncin nicamentedelaconcentracindetriclosnpresenteenelmedio.Puestoquelarepresentacindel logaritmoneperianodelaconcentracindetriclosnfrentealtiempodereaccinrespondeauna lnearecta,laecuacindevelocidadseajustaaunacinticadepseudoprimerorden.Aspues,el tiempodevidamediadeltriclosnpuedecalcularsesegnlaexpresin: k DondekeslapendientedelarectaobtenidacuandoserepresentaelLn[TCS]frentealtiempo. LasecuacionesdelarectaobtenidasparaesostrespHssemuestranenlafiguraIII.15,junto conlostiemposdevidamedia. Figura III.15. Cinticas de cloracin y tiempos de vida media para el triclosn, obtenidos para 0.4 mg/LdeclorolibreapHs6.3,7.3y8.3.ConcentracininicialdeTCS9ng/mL.
pH6.3
4 3.5 y=0.0705x+3.3196 3 2.5 Ln[TCS] 2 1.5 1 y=0.3109x+3.5691 0.5 0 R =0.9871
2

t 1/2 =

Ln(0.5)

pH8.3

pH7.3

R =0.9959

pH 6.3 7.3 8.3

t1/2(min)
9.8 2.2 3.7

y=0.1845x+3.3058 R =0.9932
2

8
Tiempo(min)

10

12

14

16

Lostiemposdevidamediaobtenidosconfirmanquelamximareactividaddeltriclosnse observapH7.3. 147

Determinacinyreactividadenagua

3.5.4.Identificacindelosproductosdetransformacin

Los experimentos realizados por Onodera y colaboradores en 1987 [Onodera S; 1987], pusierondemanifiestolaexistenciadedosderivadostetracloradosdeltriclosn(TetraIyII)yuno pentaclorado(Pentaclosano),ascomolarupturadelenlaceterdelfenoxifenoldandolugaral2,4 diclorofenol y el 2,3,4triclorofenol. En los estudios de cloracin del triclosn se identificaron los siguientescompuestos: Atiemposderetencinsuperioresaltriclosn,seencontrarontrespicoscromatogrficos. Los dos primeros presentaron el mismo espectro de masas, con una distribucin isotpica correspondiente a un compuesto tetraclorado, cuyo pico base (m/z 379+381+383) aparece 34 unidadesporencimadelin[M57]+deltriclosn(m/z345+347).Estosdospicosseasignaronalos dos ismeros posicionales 4,5dicloro2(2,4diclorofenoxi)fenol y 5,6dicloro2(2,4 diclorofenoxi)fenol,loscualesprovienendelasustitucinelectrfilaaromticadeunH,porunCl,en lasposiciones ortoo paraalgrupohidroxiloenlaestructuradeltriclosn.Enelespectrodemasas delafiguraIII.16,semuestraelpatrndefragmentacinparaestoscompuestos.Dadoquenoestn disponibles comercialmente, no se ha podido confirmar su identidad con patrones, y por lo tanto establecercualdelosdosismerostetracloradosemergeantesdelacolumnacromatogrfica.Por estarazn,loshemosdenominadoTetraIyTetraII,enbaseasustiemposderetencin. FiguraIII.16.CromatogramayespectrodemasasparalosclosanosTetraIyTetraII,comoespecies sililadas.
kCts m/z=379+381+383

150

Cl O Cl

OH Cl Cl
100% 75% 50% 25% 0% 200 250 300 234 346 350 400 m/z 381

100

50

0 24.0 24.5 25.0 25.5 26.0 26.5 minutos

148

HalogenacinTriclosn

Atiempoderetencintresminutosymedioporencimadeltriclosn,seidentificotropico cromatogrfico cuyo espectro de masas corresponde a una especie pentaclorada de masa 68 unidadessuperioraladeltriclosn,provenientedelasustitucindedoshidrgenospordostomos decloro.TalcomodescribiOnodera,correspondealderivadopentacloradodeltriclosn,el4,5,6 tricloro2(2,4diclorofenoxi)fenol,figuraIII.17. FiguraIII.17.Cromatogramayespectrodemasasparaelpentaclosanosililado.
kCts 400
Cl O OH Cl Cl Cl
100% 75% 50% 25% 0% 250 300 350 400 m/z 415

m/z=413+415+417

300

Cl

200

268

380

100

0 26.0 26.5 27.0 27.5 28.0 28.5 minutos

Junto con estos tres compuestos, aparecen tambin dos clorofenoles procedentes de la rupturadelenlaceterenlaestructuradeltriclosn.Eldiclorofenolpresentaelmismotiempode retencinqueel 2,4diclorofenol, mientras que el triclorofenol obtenido no se corresponde con el descrito en la bibliografa. Para identificar el triclorofenol y confirmar que el diclorofenol correspondealismerosustituidoenlasposiciones2,4,seinyectaronpatrones,enacetatodeetilo, delosdistintosismerosdediclorofenolesytriclorofenoles,derivatizadosconMTBSTFAyBSTFA,as como extractos de estas pruebas de cloracin sililados con ambos derivatizantes. Los tiempos de retencinobtenidossemuestranenlasiguientetabla(tablaIII.13).

149

Determinacinyreactividadenagua

Tabla III.13. Tiempos de retencin de los dicloro y triclorofenoles tertbutildimetilsililados y trimetilsililados.

Clorofenol 3,5diclorofenol 2,5diclorofenol 3,4diclorofenol 2,6diclorofenol 2,4diclorofenol 2,3diclorofenol 2,3,4triclorofenol 2,3,5triclorofenol 2,3,6triclorofenol 2,4,5triclorofenol 2,4,6triclorofenol Diclorofenoldetectado Triclorofenoldetectado trtertbutildimetilsililado(min) 15.38 15.52 16.08 15.79 15.83 16.18 18.22 17.40 17.80 17.48 17.41 15.83 17.41 trtrimetilsililado(min) 12.45 12.41 13.42 12.43 12.63 13.02 15.28 14.49 14.67 14.57 14.22 12.63 14.22

ComosepuedeobservarenlatablaIII.13,lautilizacindeMTBSTFAcomoderivatizanteno permiti resolver varios ismeros a lnea base. Experimentos adicionales, usando BSTFA, posibilitaronlaidentificacindeldicloroytriclorofenolprocedentesdeladegradacindeltriclosn. Paraelcasodetriclorofenol,elusodeMTBSTFAindica3posiblescandidatos:el2,3,5;2,4,5y2,4,6 TCF. La utilizacin del BSTFA permiti resolver mejor estos compuestos, y confirmar que la seal para el compuesto trimetilsililado a 14.2 minutos presente en el extracto de los experimentos de halogenacin,correspondeconel2,4,6triclorofenol.Losderivadostertbutildimetilsililadosdel2,4 DCF y 2,6DCF presentaron el mismo tiempo de retencin. La derivatizacin del extracto y de los patronesconBSTFAconfirmqueelpicoqueemergea12.6minutoscorrespondeconel2,4DCF. Lapresenciadel2,4,6triclorofenolenelmediodereaccin,envezdel2,3,4triclorofenol, indicaqueestecompuestoprovienedelacloracindel2,4diclorofenol,procesocinticamentemuy favorable.El2,4diclorofenolseformaporlarupturadelenlaceterenlaestructuradeltriclosn. Adems de estos cinco productos, se detect tambin la presencia de otras especies halogenadasentrelostiemposderetencindel2,4,6triclorofenolyeltriclosn.Estasespeciesson minoritarias,yaparecenaconcentracionesdecloroelevadas,cuandonoseaadaelagentereductor (tiosulfatosdico)paraeliminarelexcesodeoxidante.Experimentosadicionalesutilizandoelcido ascrbico (vitamina C) como agente reductor, tampoco mostraron la presencia de estos subproductos. En la siguiente figura (fig. III.18) se muestran los cromatogramas de esas especies, 150

HalogenacinTriclosn

obtenidosparauntiempodereaccinde1horaydistintasconcentracionesdecloro(entre0y1.6 mg/L), as como los espectros de masas correspondientes. Para estas pruebas no se detuvo la reaccinconunreductor,sinoqueunaveztranscurridoeltiempoestablecido,seajustelpHa2.5e inmediatamente, las muestras se concentraron mediante SPE. De acuerdo con los espectros de masas obtenidos se identificaron como derivados tertbutildimetilsililados de dihidroxifenoles (resorcinoles) sustituidos con uno, dos o tres tomos de cloro. Estos se forman por la ruptura del enlaceterdelTCSolosclosanostetraypentaclorados,permaneciendolosdosgruposhidroxiloen el mismo anillo aromtico. El pico base en los espectros corresponde a la prdida del grupo tert butilodeunodelosdoshidroxilossililados.Elrestodefragmentacionesprocedendelaprdidade cloro (35 unidades), tertbutilo (57 unidades), cloro y tertbutilo (92 unidades) cloro y tert butildimetilsilil(150unidades). Figura III.18. Cromatogramas, espectros de masas y estructuras propuestas para los productos minoritariosdecloracindeltriclosn,adistintasconcentracionesdeclorolibre.
kCts 10.0 100% 75% 50% 7.5 Cl 25% 0% 5.0 0mg/LClorolibre 0.04mg/LClorolibre 0.08mg/LClorolibre 0.2mg/LClorolibre 0.4mg/LClorolibre 0.8mg/LClorolibre 1.6mg/LClorolibre [M57]+ 315

OTBDMS OTBDMS

[M5735]+ [M5757]+ 258 280 [M57150]+ 165 150 200 250 300

[M]+ 372 350 400 m/z

2.5

0.0 19.9 20.0 20.1 20.2 minutos

151

Determinacinyreactividadenagua
kCts OTBDMS 40 Cl2 30 OTBDMS 100% 75% 0mg/LClorolibre 0.04mg/LClorolibre 0.08mg/LClorolibre 0.2mg/LClorolibre 0.4mg/LClorolibre 0.8mg/LClorolibre 1.6mg/LClorolibre 50% 25% 0% 150 [M5735]+ [M5792]+ 314 [M57150]+ 257 199 293 200 250 300 350 [M57]+ 349

[M]+ 406 400 m/z

20

10

0 21.25 21.30 21.35 21.40 21.45 21.50 minutos

kCts 4 OTBDMS OTBDMS 3 Cl3 100% 75% 50% 25% 2 0mg/LClorolibre 0.04mg/LClorolibre 0.08mg/LClorolibre 0.2mg/LClorolibre 0.4mg/LClorolibre 0.8mg/LClorolibre 1.6mg/LClorolibre 0% [M5792]+ 291 [M57150]+ 233 150 200 250 300 350 400 450 m/z [M57]+ 385

0 22.80 22.85 22.90 22.95 23.00 23.05 23.10 minutos

152

HalogenacinTriclosn

Enlabibliografanoexistenreferenciasdescribiendolaformacindeestosresorcinolesen presenciadeclorolibre,sibienesciertoqueFerrerycolaboradores[FerrerI;2004]detectaronel clorofenoldihidroxiladocomounintermedioinestableenlafotodegradacindeltriclosn. Adems de los compuestos sealados, en algunas pruebas realizadas con elevadas concentraciones de cloro y tiempos de reaccin largos, se encontr a19.5 minutosun compuesto cuyoespectrocorrespondeconuntetraclorofenol.Debidoaquelasealresultserpocointensay puesto que slo apareci tras un tiempo de reaccin elevado, no se consider en el estudio de evolucin de los subproductos de cloracin del TCS, al igual que los resorcinoles. En la siguiente figura(figuraIII.19),semuestraelpicocorrespondientealtetraclorofenolascomosuespectrode masas. Figura III.19. Cromatogramas para el tetraclorofenol (producto minoritario) a distintos tiempos de reaccin,enaguaapH7.3con0.4mg/Ldeclorolibrey10ng/mLdetriclosn.
kCts 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 19.00 19.25 19.50 19.75 20.00 minutos Ominutos 2minutos 6minutos 10minutos 1hora 2horas 3horas
60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 200 289

223 254 250 300

323 350 m/z

3.5.5.Evolucintemporaldelosproductosmayoritarios Unavezidentificadosloscompuestosdehalogenacindeltriclosn,formadosenpresencia de cloro libre, se investig su evolucin temporal para poner de manifiesto la estabilidad de los mismos.Parallevaracaboesteestudio,seprepararonunaseriedemuestrasdeaguaultrapuracon distintas concentraciones de cloro libre (0.4 y 1.4 mg/L), a pH 7.3, y con una cantidad inicial de triclosnde50ng/mL.Losresultadosobtenidosparadistintostiemposdereaccinseobservanen lasfigurasIII.20.AyIII.20.B,endondeserepresentalasealrelativaalreadepicodeltriclosnpara tiempo0minutos.

153

Determinacinyreactividadenagua

Figura III.20.A. Evolucin temporal de los cloroderivados del TCS con 0.4 mg/L de cloro libre. ConcentracininicialdeTCS50ng/mL.
2,4DCF 0.6 Respuestanormalizada 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Tiempo(min) 2,4,6TCF TetraI TetraII Penta

Figura III.20.B. Evolucin temporal de los cloroderivados del TCS con 1.4 mg/L de cloro libre. ConcentracininicialdeTCS50ng/mL.
2,4DCF 0.6 Respuestanormalizada 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 50 100 Tiempo(min) 150 200 2,4,6TCF TetraI TetraII Penta

Como se puede comprobar en las figuras anteriores, a tiempos relativamente cortos los fenoxifenoles tetraclorados fueron los subproductos predominantes. La respuesta del Tetra II fue mayorfrentealTetraI,demodoquesepresumequeelTetraIIcorrespondeconelderivado4,5 dicloro2(2,4diclorofenoxi)fenol, puesto que la posicin para al hidroxilo presenta menor impedimento estrico frente a la posicin orto. En un momento dado, la seal del Pentaclosano aumenta exponencialmenteen detrimento de la seal de los Tetraclosanos hastaque desciende a

154

HalogenacinTriclosn

favor de los clorofenoles. Como productos finales, el 2,4diclorofenol y el 2,4,6triclorofenol, se mantuvieronanivelesprcticamenteconstantesdentrodelintervalodetiempoconsiderado. Experimentos adicionales, realizados con el 2,4DCF para observar su comportamiento en presencia de cloro, as como estimar su tiempo de vida media con 1.44 mg/L de cloro libre y 50 ng/mLde2,4DCF(t1/27.8minutos)mostraronlaconversinntegradel2,4DCFen2,4,6TCFen1 hora. A partir de ese momento la concentracin de 2,4,6TCF comenz a decaer hasta la mitad, mantenindoseprcticamenteconstanteapartirdelas2horas,figuraIII.21. FiguraIII.21.Evolucintemporaldel2,4DCFa2,4,6TCFcon1.44mg/Ldeclorolibre.Concentracin inicialde2,4DCF50ng/mL.
1.2 Respuestanormalizada 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 20 40 60 80 100 Tiempo(min) 120 140 160 180 200 2,4DCF 2,4,6TCF

ElrendimientomolardelaconversindelTCSen2,4DCFy2,4,6TCFseestudiatrespHs diferentesusando0.4mg/Ldeclorolibre,yunaconcentracininicialdetriclosnde50ng/mL,para tiemposdereaccinde5y15minutos.LosporcentajesdeconversinsemuestranenlatablaIII.14. Tabla III.14. Rendimientos molares (%) de conversin del triclosn en los clorofenoles relacionados para0.4mg/Ldeclorolibre(N=3).ConcentracininicialdeTCS50ng/mL.
Compuesto 2,4DCF 2,4,6TCF 5min 2.80.2 0.300.05 pH6.3 15min 7.10.6 0.590.05 5min 4.40.5 0.90.1 pH7.3 15min 8.80.8 2.50.4 5min 1.00.2 0.220.04 pH8.3 15min 5.00.7 1.80.3

155

Determinacinyreactividadenagua

El mecanismo de degradacin de triclosn y su conversin final en 2,4DCF y 2,4,6TCF se muestraenlasiguientefigura,figuraIII.22.Cabedestacarquetantoel2,4DCFcomoel2,4,6TCFson considerados por la EPA como candidatos a la lista de disruptores endocrinos y posibles carcingenos[http://www.epa.gov]. FiguraIII.22.Mecanismodedegradacindeltriclosnenaguascloradas.
Cl O Cl Cl O Cl TCS Cl Cl Cl 2,4,6TCF Cl OH Cl Cl Cl Cl Cl OH Cl Cl 2,3,4TCF OH Tetraclosanos Cl OH O OH Cl Cl Cl Cl Cl OH Pentaclosano Cl O OH Cl Cl

2,4DCF

3.5.6.Estudiosdecloracinenaguadegrifo

Lareactividaddeltriclosnenaguaultrapura,conuncontenidoconocidodeclorolibre,fue confirmadarealizandoexperimentossimilaresenaguadegrifo.Lamuestraserecogienunabotella mbary,previamentealarealizacindelosexperimentos,sedeterminlaconcentracindecloro libre con un fotmetro tal como se ha indicado en la seccin 3.1.4. La concentracin obtenida de clorolibreenlamuestrafuede0.430.3mg/L.Setomaronvariasalcuotasde250mL,lascuales fuerondistribuidasenbotellasmbarde300mL.SetamponaronapH7.3yseadicionunpatrnde triclosnenmetanolparatenerunaconcentracinenaguade50ng/mL.Trasuntiempodereaccin debidamentecontrolado,seaadielagentereductoreliminandoaselexcesodecloroenelmedio, y se concentr la muestra mediante la metodologa de SPE desarrollada. En estas condiciones, el tiempodevidamediadeltriclosnfuede1.9minutos,datoanlogoalobtenidoparaaguaultrapura conconcentracindeclorosimilar(t1/22.2minpara0.4mg/Ldeclorolibre).EnlafiguraIII.23,se muestraelperfildeformacindeloscompuestosderivadosdeltriclosnenaguadegrifo. 156

HalogenacinTriclosn

FiguraIII.23.Perfildeformacindeloscompuestoscloradosenaguadegrifoconteniendo0.43mg/L declorolibre.ConcentracininicialdeTCS50ng/mL.
2,4DCF 0.35 0.3 Respuestanormalizada 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 2 4 6 8 10 Tiempo(min) 12 14 16 18 20 2,4,6TCF TetraI TetraII Penta

Laevolucintemporaldeloscompuestossiguiunperfilanlogoalmostradoenlafigura III.20.A, pudiendo extrapolar los resultados obtenidos con agua ultrapura a agua de grifo. De este modo,seponedemanifiestoqueeltriclosnpuedesufrirprocesosdecloracinenaguadegrifo,lo que se traduce en la potencial exposicin por va drmica a sus productos de reaccin y, por supuesto,enladescargadestosalmedioacuticoatravsdelasaguasresiduales. 3.5.7.Presenciadecompuestoshalogenadosenmuestrasreales Dadoqueeltriclosnreaccionarpidamenteenaguascloradas,seevalulapresenciade los productos de cloracin en muestras de agua residual debido al uso de PPCPs, conteniendo triclosnensuformulacin,ysucontactodirectoconaguadegrifoclorada.Enlasmuestrasdeagua residual, se detectaron 2,4diclorofenol y 2,4,6triclorofenol. Con respecto a la presencia de los closanospoliclorados,susnivelessonmuybajosaunqueenalgunasmuestras,conunaltocontenido de triclosn, se encontraron trazas de los mismos. En la figura III.24, se puede observar la seal cromatogrfica de estos derivados halogenados del triclosn en una muestra de agua residual sin tratar,conunaconcentracinmedidadetriclosnde14ng/mL. 157

Determinacinyreactividadenagua

Figura III.24. Cromatogamas de GCMS mostrando la presencia de triclosn, tetra I, tetra II y pentaclosanoenunamuestradeaguaresidualsintratarconaltocontenidoentriclosn.
MCts 1.5 100% 75% 1.0 50% 25% 0% 0.5 150 200 250 300 350 400 m/z 310 200 347

TCS

0.0 kCts

Tetraclosanos IyII
100% 75% 50% 234 381

10.0 7.5 5.0 2.5 0.0 kCts 6 5 4 3 2 1 0 23 24 25 100% 75% 50% 25% 0% 150 200 250 300 350 270

25% 0% 150 200 250 300 350 400 m/z

415

Pentaclosano

381 400 m/z

26

27

minutos

158

HalogenacinParabenes

3.6.Halogenacindeparabenes

3.6.1.Pruebaspreliminares

Al igual que el triclosn, los parabenes son compuestos fenlicos susceptibles de sufrir sustituciones electrfilas aromticas en la posicin orto al grupo hidroxilo. Para verificar este comportamiento,serealizaronunaseriedepruebasenaguaultrapura,tamponadaapH7.3,con adicindeclorolibreanivelde0.4mg/L.Traslaadicindelospatronesenmetanoldemetilparaben y propilparaben, las muestras se dejaron reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos, tras los cuales el exceso de cloro libre fue eliminado con tiosulfato sdico. Las muestras fueron concentradas, mediante la metodologa de SPE desarrollada para el anlisis de parabenes en muestrasacuosasy,trasladerivatizacindelosextractos,seinyect1LenelsistemaGCMSen full scan.En los cromatogramas obtenidos se observunaclara disminucin en la seal de ambos parabenes(tablaIII.15),loqueindicqueestostambinreaccionanenmediosclorados.Enbasea estosprimerosresultados,sellevacaboelestudiosistemticodelosparmetrosqueafectanala halogenacin los parabenes ms comunes en PPCPs (MeP, EtP, PrP y BuP) cuando entran en contactoconaguaconteniendoclorolibre. TablaIII.15.SealdeMePyPrPtras30minutosdereaccin.Concentracindeclorolibre0.4mg/Ly 40ng/mLparacadaanalito,aliniciodelareaccin.
Sealrelativaatiempo0minutos MeP PrP 11% 13%

3.6.2.DegradacinadistintospHsyconcentracionesdeclorolibreenaguaultrapura

El pH del medio y la concentracin de cloro fueron dos de los factores estudiados previamente a la evaluacin de la cintica de reaccin. Del mismo modo que para el triclosn, se consideraronpHscomprendidosentre6y9unidades,ascomoconcentracionesdeclorolibreentre 0 y 2.4 mg/L. Se realizaron una serie de experimentos usando muestras de 100 mL de agua, tamponadas a los pHs anteriores, con una concentracin inicial de 40 ng/mL para uno slo de los analitosconsiderados(MeP,EtP,PrPyBuP).Trasuntiempodereaccinde10minutos,seaadieron 10mgdetiosulfatosdicoparaeliminarelexcesodeclorolibrepresenteenelmedio.Lasmuestras 159

Determinacinyreactividadenagua

se ajustaron a pH cido y se concentraron con la metodologa desarrollada para la extraccin de estos compuestos en muestras acuosas mediante SPE, descrita en este captulo. Los resultados obtenidos para los cuatro compuestos fueron idnticos. En la figura III.25, se muestra el comportamientoparaelMePyelPrP. Figura III.25. Perfil de degradacin de MeP y PrP para concentraciones de cloro y pHs variables. Tiempodereaccin10minutos,concentracininicialdeanalito40ng/mL.
pH6.8 pH7.3 pH8 pH8.6 pH6.3

1.2 Sealnormalizada(MeP)
Sealnormalizada(PrP)

1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0

1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 0.08 0.2 0.4 0.8 1.6 2.4 mg/Lclorolibre

0.08

0.2

0.4

0.8

1.6

2.4

mg/Lclorolibre

Enambasfiguras,seobservaunaclaradisminucindelasealdeloscompuestoscuandola concentracin de cloro libre sobrepasa 0.4 mg/L. Este comportamiento fue ms acusado a pHs comprendidosentre7.3y8.0,puestoqueelcidohipoclorosotodavaestpresenteenelmedio, mientrasqueelequilibriofenolfenolatodelosparabenes(pKa8.28.3)comienzaadesplazarsehacia laformabsica. 3.6.3.Cinticasdehalogenacinenaguaultrapurayaguadegrifo Lacinticadedegradacindelosparabenesenaguaultrapurafueestudiadaconsiderando dos concentraciones de cloro libre diferentes: 0.4 y 1.6 mg/L (5.63 y 22.53 M como hipoclorito, respectivamente). Para la realizacin de estos experimentos, alcuotas de 250 mL de agua tamponadaapH7.3fueronfortificadasindividualmenteconcadacompuestoaunaconcentracin de 910 ng/mL (4570 nM). Tras un tiempo dado, se detuvo la reaccin y se concentraron las

160

HalogenacinParabenes

muestras. Los extractos obtenidos, una vez derivatizados, fueron inyectados en el sistema GCMS. Dado que la concentracin de cloro presente en el medio se mantuvo en exceso, la velocidad de reaccin fue funcin nicamente de la concentracin de cada paraben. La representacin del logaritmo neperiano de la concentracin de analito frente al tiempo de reaccin transcurrido, proporcion las siguientes representaciones, figura III.26. De nuevo la desaparicin de los analitos obedeceaunacinticadeorden1. FiguraIII.26.CinticasdedegradacinparaEtPyBuPcon0.4y1.6mg/Ldeclorolibre.Concentracin inicialdeanalito10ng/mL.
EtP,0.4mg/Lcl orol i bre 4.5 4 3.5 3 2.5 2 0 10 20 30 Ti empo(mi n) y=0.0266x+3.9453 R =0.9961
Ln[BuP]
2

BuP,0.4mg/Lcl orol i bre 4.5 4 3.5 3 2.5 0 20 40 60 Ti empo(mi n) y=0.0251x+3.9806 R =0.991

2

Ln[EtP]

40

50

60

EtP,1.6mg/Ldeclorolibre 5 Ln[EtP] 4 3 2 1 0 5 10 15 20 25 Tiempo(min) y=0.1307x+4.1597

BuP,1.6mg/Lclorolibre 5 Ln[BuP] 4 3 2 1 0 5 10 15 20 25 Tiempo(min) y=0.1384x+3.8854 R =0.9914

2

R =0.9968

Losestudiosdevelocidaddereaccintambinserealizaronutilizandoaguadegrifocondos concentraciones de cloro libre diferentes. Las muestras empleadas en estos estudios contenan originalmente0.46y0.2mg/Ldeclorolibre.Laprimeraseutiliztalcomoseobtuvo,paracomparar conlostiemposdevidamediaparaaguaultrapuracon0.4mg/Ldecloro,mientrasquelasegunda fuefortificadaconladisolucindehipocloritosdicoparaobtenerunaconcentracinfinaldecloro librede1.6mg/L.TraselajustedelpHdelmedioa7.3ylaadicindelcorrespondientecompuesto

161

Determinacinyreactividadenagua

(910 ng/mL en agua) se dejaron reaccionar los mismos tiempos seleccionados para los experimentosconaguaultrapura.Losresultadosobtenidosmostraronqueparaelaguadegrifo,la cintica de reaccin sigue el mismo comportamiento que para agua ultrapura, obteniendo los tiemposdevidamediaqueserecogenenlatablaIII.16. TablaIII.16.Tiemposdevidamedia(minutos)delosparabenespara0.4y1.6mg/Ldeclorolibre. Concentracininicialdeanalito10ng/L.
t1/2(min) AguaUltrapura Clorolibre (mg/L) MeP EtP PrP BuP 0.4 33.8 26.1 30.9 27.6 1.6 4.6 5.3 4.2 5.0 Aguadegrifo 0.46 31.5 31.5 30.3 29.9 1.6 4.7 4.7 4.6 4.4

Talcomosepuedecomprobar,lostiemposdevidamediaparaaguaultrapuraconadicin de hipoclorito y agua de grifo clorada fueron muy similares. Teniendo en cuenta que los experimentossellevaronacaboendistintosdas,ysincontrolexactodelatemperaturadelagua(15 2C),lasdiferenciasentrelosvaloresencontradosparaambasmuestrassonmnimas. 3.6.4.Identificacindelosproductosdetransformacin:Parabenescloradosybromados. Lahalogenacindelosparabenesenaguadegrifodilugaralaformacindecincotiposde derivadoshalogenados.Losespectrosdemasasparalosdosproductosmayoritarios,presentesenel medio,tienenunperfilisotpicotpicodecompuestosmonocloradosydiclorados.Lospicosbaseen susespectrosaparecena34y68unidadesdem/zporencimadeloscorrespondientesalparabende partida,porloquesededucequeprocedendelasustitucinelectrfilaaromticadeuntomode hidrgenoporuntomodecloroenlaposiciones ortoalhidroxilo,puestoquelaposicin paraest bloqueadaconelgruposter,figuraIII.27. 162

HalogenacinParabenes

FiguraIII.27.Cromatogramasyespectrosdemasasparaloscompuestosmonocloradosydiclorados procedentesdelosparabenesestudiados.
kCts 150 125 100 75 50 25 0 kCts 150 100 50 0 kCts 150 100 50 0 kCts 150 100% 75% 50% 25% 0% 285 100% 75% 50% 25% 0% 271 100% 75% 50% 25% 0% 257 100% 75% 50% 25% 0% 243

TBDMSO
119 100 163 150 200 250 m/z

Cl

OMe

O O O O O

149

TBDMSO Cl
OEt
200 250

100

150

m/z

O O O O O

TBDMSO
149 100 150 200 250 m/z

Cl

OPr

O O O O O

100 50 0 17.0

TBDMSO Cl
OBu

149 100 150 200 250 m/z

17.5

18.0

18.5

19.0

19.5

20.0 minutos

163

Determinacinyreactividadenagua

kCts 150 100 50 0 kCts 200 150 100 50 0 kCts 200 150 100 50 0 kCts 250 200 150 100 50 0 18.5 19.0 19.5 20.0 20.5 21.0 minutos 100% 75% 50% 25% 0% 305 100% 75% 50% 25% 0% 277

Cl
O

183 100 150

218 200 250 m/z

TBDMSO Cl
OMe

Cl
O

TBDMSO Cl
OEt

100% 75% 50% 25% 0%

291

183 147 150 200 250 300 m/z

Cl
O

TBDMSO
147 150 183 200 250 300

Cl
m/z

OPr

Cl
O

TBDMSO Cl
OBu

100% 75% 50% 25% 0% 150

319

183 200 250 300 m/z

La existencia de patrones comerciales de 3clorometilparaben (3ClMeP) y 3 cloroetilparaben (3ClEtP) permiti confirmar la identidad de estos dos subproductos en los experimentosdecloracinrealizados.Paraello,seprepararondisolucionesindividualesenmetanol de estos dos compuestos de 2000 mg/L y, por dilucin con acetato de etilo, dos patrones de concentraciones0.7y2mg/L.Alcuotas(500L)estospatronesmsdiluidosfueronderivatizados enlascondicionesutilizadasparalosparabeneseinyectadosenelsistemaGCMS.Elcromatograma obtenidoparacadaunodelospatrones,muestraunpicocuyotiempoderetencinyespectrode masascoincidenconloscorrespondientessubproductosdecloracinidentificadosparaelMePyel EtP,figuraIII.28.

164

HalogenacinParabenes

FiguraIII.28.Patrones(lneadiscontinua)de3ClMeP(0.7mg/L)y3ClEtP(2mg/L)solapadosconlos subproductos monoclorados del MeP y EtP, detectados en las pruebas de halogenacin (lnea continua).
kCts 100 75 50 25 0 16.75 17.00 17.25 17.50 17.75 minutos

3ClMeP

kCts 800 700 600 500 400 300 200 100 0 17.6 17.7 17.8 17.9

3ClEtP

18.0

18.1

18.2 minutos

Los tiempos de vida media para estos compuestos fueron estudiados en las mismas condiciones de pH y concentraciones de cloro libre utilizadas para los parabenes. De nuevo, la desaparicin de amboscompuestos obedeci aunacintica de pseudoprimer orden. Los tiempos devidamediaevaluadosenaguaultrapurasemuestranenlatablaIII.17. Tabla III.17. Cinticas de cloracin para3ClMeP y 3ClEtP junto con sus tiempos de vida mediaen aguaultrapura.Concentracininicialdeanalito10ng/mL.
3ClMeP 3ClEtP Clorolibre 0.4mg/L 1.6mg/L 0.4mg/L 1.6mg/L R2 0.9927 0.9984 0.9907 0.9935 t1/2(min) 31.2 6.6 31.9 8.1

Como se puede comprobar los tiempos de vida media fueron similares a los de los compuestosdepartida(tablaIII.16)paralasdosconcentracionesdeclorolibreensayadas.Adems, seconfirmlaformacindelosderivadosdicloradosapartirdel3ClMePy3ClEtP. Los experimentos realizados con agua de grifo y parabenes revelaron la formacin de los derivados clorados descritos anteriormente, as como tres productos adicionales para cada analito de partida. En base a sus espectros de masas se identificaron como compuestos bromados. La formacindeestosnuevosproductospodradebersealaexistenciadetrazasdebromuroenelagua de grifo, el cual es oxidado a bromo en presencia de hipoclorito, reaccionando finalmente con el anilloaromticodeloscompuestosfenlicosmedianteunasustitucinelectrfilaaromtica [Inaba

165

Determinacinyreactividadenagua

K;2006].EnlafiguraIII.29sepuedeobservarloscromatogramas,conlosrespectivosespectrosde masas,paraloscompuestosbromadosascomosusestructuras. Figura III.29. Cromatogramas de los derivados bromados de los parabenes encontrados en experimentos realizados con agua de grifo, con sus respectivos espectros de masas y estructuras propuestas.
kCts 15.0 12.5 10.0 7.5 5.0 2.5 0.0 kCts 15 100% 75% 50% 25% 0% 303 100% 75% 50% 25% 0% 289

TBDMSO Br
150 200 250 300 m/z

OMe

10

TBDMSO Br
OEt

149 150 200 250

313 300 m/z

0 kCts 100% 75% 50% 25% 0% 317

O O O O O

15 10 5 0 kCts 15

TBDMSO
149 150 200 273 250 300 m/z

Br

OPr

TBDMSO Br
OBu

10

100% 75% 50% 25% 0%

331

149 150 200

273 250 300 350 m/z

0 18.0 18.5 19.0 19.5 20.0 20.5 minutos

166

HalogenacinParabenes

kCts 25 20 15 10 5 0 kCts 30 100% 75% 50% 25% 0% 323

Cl
O O O O O

TBDMSO
147 150 183 200 264 250 300 349 350 m/z

Br

OMe

Cl
O

20

TBDMSO Br
OEt

100% 75% 50% 25% 0%

337

148 184 150 200

227 250 300

349 350 m/z

10

0 kCts 30 20 100% 75% 50% 25% 0% 351

Cl
O O O O O
147 184 100 150 200 250 313 300 350 m/z

TBDMSO Br
OPr

10

0 kCts 30 25 20 15 10 5 0 19.5 20.0 20.5 21.0 21.5 22.0 minutos 365

Cl
O

TBDMSO Br
OBu

100% 75% 50% 25% 0% 100 150 200 250 300

350 m/z

167

Determinacinyreactividadenagua

kCts 1.25 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 kCts 1.5 100% 75% 50% 25% 0% 313 381 351 227 252 281 200 250 300 337 350 400 m/z 25% 20% 15% 10% 188 5% 0% 200 253 329 250 300 350 389 400 m/z 367

Br
O O O O O

TBDMSO Br
OMe

Br
O

TBDMSO Br
OEt

1.0

0.5

0.0 kCts 1.25 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 kCts 1.5 100% 75% 50% 25% 0% 395

Br
O O O O O

TBDMSO
231 200 250 285 300 327 341 350 377 400 m/z

Br

OPr

Br
O O O O O

TBDMSO
1.0

Br
0.5

OBu

341 409 100% 75% 50% 25% 149 207 0% 150 200 250 300 350 400 450

0.0 20.0 20.5 21.0 21.5 22.0 22.5 minutos

Paraverificarestahiptesis,sellevaronacabounaseriedeexperimentosconaguadegrifo conuncontenidodeclorolibrede0.53mg/L.UnaveztamponadaapH7.3,lamuestrafuedividida en dos alcuotas de 250 mL, adicionando a una de ellas 1 ng/mL de bromuro, como bromuro potsico.Aambasalcuotasselesaadiunpatrnconteniendoloscuatroparabenes,demodoque laconcentracindeestosenaguafuesede10ng/mL,ysedejreaccionardurante20minutos.Los

168

HalogenacinParabenes

resultadosobtenidosmostraronunadisminucinsignificativadelasealdeloscompuestosclorados a favor de los bromados en la muestra fortificada con bromuro potsico, lo que sugiri una competencia entre ambos dentro de la reaccin de sustitucin electrfila aromtica. En la figura III.30,seobservalainfluenciadelaadicinde1ng/mLdebromuroenlaformacindelosderivados halogenadosparaelEtPyelBuP. Figura III.30. Influencia de la adicin de 1 ng/mL de bromuro en la formacin de los derivados halogenadosdelEtPydelBuP.Aguadegrifo(0.53mg/Lclorolibre)apH7.3,tiempodereaccinde 20minutos.
Aguadegrifo 3,5BrEtP ClBrEtP 3,5ClEtP 3BrEtP 3ClEtP EtP 0.E+00 1.E+05 2.E+05 3.E+05 4.E+05 5.E+05 6.E+05 readepico Aguadegrifo+1ng/mLdebromuro

Aguadegrifo 3,5BrBuP ClBrBuP 3,5ClBuP 3BrBuP 3ClBuP BuP 0.E+00

Aguadegrifo+1ng/mLdebromuro

2.E+05

4.E+05 readepico

6.E+05

8.E+05

Para confirmar la mayor tendencia del bromo que el cloro para dar lugar a reacciones de sustitucinconlosparabenes,serealizaronestudiosconaguaultrapuraconunaconcentracinfija de cloro libre (0.4 mg/L) y niveles crecientes de bromuro (1, 10 y 65 ng/mL) como sal potsica. El tiempodereaccinylaconcentracininicialdecadaparabensemantuvieronen20minutosy10 ng/mL,respectivamente.Losresultados,tablaIII.18,pusierondemanifiestoquelaadicindebromo alanillofenlicoesmuchomsfavorablefrentealadecloro,loqueconcuerdaconlaspredicciones deRichardson [RichardsonSD;2003].As,cuandolaconcentracininicialdebromuroes40veces inferior a la de cloro libre (10 ng/mL frente a 400 ng/mL, respectivamente) predominan los productosdetranformacinbromadosfrentealosclorados. Comoconsecuenciadeestecomportamiento,lasespeciesbromadasseesperancomosub productosmayoritariosdereaccinentrelosparabenesyaguadegrifocloradaenaquellasregiones dondelascaptacionespresentannivelesdebromuroelevados,comosonzonascosterasoreascon depsitossalinos,loscualespuedencontenerhasta1mg/Ldebromuro[vonGuntenU;2003][Inaba K;2006].Cabeindicarque,deformagenrica,loscompuestosbromadospresentanmayortoxicidad frente a los clorados [Hansch C; 1972], aunque no hay datos especficos sobre la toxicidad de los derivadoshalogenadosdelosparabenes.

169

Determinacinyreactividadenagua

Tabla III.18. Relacin entre las reas de pico para los derivados halogenados de los parabenes en aguaultrapuracon0.4mg/Ldeclorolibreydistintoscontenidosdebromuro.
Compuesto MeP EtP PrP BuP Relacinreas 3ClMeP/3BrMeP 3,5DClMeP/3,5DBrMeP 3ClEtP/3BrEtP 3,5DClEtP/3,5DBrEtP 3ClPrP/3BrPrP 3,5DClPrP/3,5DPrMeP 3ClBuP/3BrBuP 3,5DClBuP/3,5DBrBuP Concentracininicialdebromuro(ng/mL) 1 2.19 9.67 2.51 10.32 2.43 12.72 2.71 10.53 10 0.13 0.02 0.16 0.02 0.12 0.02 0.15 0.02 65 <105
4 2.3x10

<105
5 <10

<105
4 1.7x10

<105
5 <10

3.6.5.Evolucintemporaldelosderivadoscloradosdelosparabenes

La estabilidad de los compuestos estudiados, tanto los de partida como los derivados halogenados,fueestudiadaparavariasconcentracionesdeclorolibre(0.4,0.8,1.6y5mg/L).Enla figura III.31 se muestra la estabilidad del EtP para esas concentraciones de cloro y tiempos de reaccinrelativamentebajos. FiguraIII.31.EstabilidadtemporaldelEtPenaguaultrapuracondistintasconcentracionesdecloro libre.ConcentracininicialdeEtP10ng/mL.
1.2 Sealrelativa 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 10 20 30 Tiempo(min) 40 50 60 0.4mg/L 0.8mg/L 1.6mg/L 5mg/L

Comosepuedeobservarenlafigura,aconcentracioneselevadasdeclorolibreenelmedio dereaccin,eldecaimientodelasealdelcompuestodepartidaesmsrpido,talcomoyahaba sidodescritoenlaseccin3.6.2.Laevolucintemporaldeloscompuestoshalogenadosseestudia concentracioneselevadasdeclorolibre(5mg/L)yatiemposcomprendidosentre0y180minutos. EnlafiguraIII.32,sepuedeobservarestaevolucinparalosderivadoscloradosdeletilparabenen agua a pH 7.3. La especie predominante a tiempos de reaccin largos es el 3,5DClEtP, lo que demuestra su escasa labilidad frente a sucesivas cloraciones o rupturas del anillo aromtico a 170

HalogenacinParabenes

diferencia de lo que ocurra en el caso del triclosn. El resto de parabenes present un comportamientoanlogo. FiguraIII.32.EvolucintemporaldelosderivadoscloradosdelEtPenaguaultrapuraapH7.3,con5 mg/Ldeclorolibrey10ng/mLdeEtPiniciales.
2.5 Sealrelativa 2 1.5 1 0.5 0 0 50 100 Tiempo(min) 150 200 EtP 3ClEtP 3,5DClEtP

Enbasealainformacinexpuestaanteriormentelarutadehalogenacindelosparabenes resultaextraordinariamentesencilla,figuraIII.33. FiguraIII.33.Rutadelahalogenacindelosparabenesenmuestrasdeaguaconclorolibreytrazas debromuro.

O C HO Cl O O C HO OR HO Cl OR Cl O C OR

HO Cl Br

3ClPB

3,5ClPB
OR

3Br5ClPB
O

PB

O C HO Br OR Br

OR

HO Br

3BrPB

3,5BrPB

171

Determinacinyreactividadenagua

3.6.6.Formacindederivadoshalogenadosdelosparabenesenaguadegrifoencontacto conproductosdecuidadopersonal Desdeunpuntodevistaecotoxicolgicoesrelevanteconocersilasreaccionesdecloracin y bromacin descritas anteriormente pueden tener lugar cuando productos de cuidado personal, quecontienenensuformulacinparabenes,seponenencontactoconaguadegrifoclorada.Enesta situacin,elclorodisponiblepuedeserconsumidoporotrosaditivosincluidosenlaformulacinde losPPCPs,demodoquelosparabenespermaneceraninalterados.Parallevaracaboestosestudios, seempleungeldebao(tablaIII.19),compradoenelsupermercado.Entodoslosexperimentosse utilizaron250mLdeagua,yaseaaguaultrapura,degrifoodepiscina,alacualseleadicioneste geldebaodemodoquelaconcentracinfinaldeloscompuestosfuelaindicadaenlatablaIII.19. TablaIII.19.Concentracionesdelosparabenesenelgeldebaocomercialyenlasmuestrasdeagua.
Gel(mg/kg) Agua(ng/mL) MeP 2240 22.4 EtP 446 4.5 PrP 272 2.7 BuP 617 6.2

Enunprimerensayo,seaadielgeldebaoaunaguadepiscinacon0.58mg/Ldecloro libre.Bajoestascondiciones,seobtuvieronlostiemposdevidamediaparalosparabenespresentes en el producto cosmtico que se indican en la tabla III.20, adems se identificaron los mismos derivados halogenados encontrados en los experimentos realizados con patrones de estos compuestos. Tabla III.20. Tiempos de vida media (minutos) obtenidos al mezclar un gel de bao con agua de piscinaconteniendo0.58mg/Ldeclorolibre.
t1/2(min) MeP 18.0 EtP 10.7 PrP 11.4 BuP 10.6

Paraestemismogel,seestudilacinticadedegradacinenaguadegrifo(0.83mg/Lde clorolibre)termostatizadaa15y38C.Lostiemposdevidamediaobtenidasseresumenenlatabla III.21.

172

HalogenacinParabenes

Tabla III.21. Comparativa de tiempos de vida media (minutos) a 15C y 38C para los parabenes presentesenungeldebaoencontactoconaguadegrifoconteniendo0.83mg/Ldeclorolibre.
Temperatura(C) 15C 38C t1/2(min) MeP 11.6 7.8 EtP 9.8 5.8 PrP 9.3 5.4 BuP 8.6 4.9

A 38C, el tiempo de vida media disminuy prcticamente 1.5 veces con respecto a las pruebas realizadas a 15C. Por otra parte, tal como se pone de manifiesto en la figura III.34, se apreciunincrementodelasrespuestasmedidasparalassustanciasbromadasfrentealascloradas cuandolatemperaturadelaguaaumentade15Ca38C.Entodocaso,estoscompuestosfueron minoritariosconrespectoalosderivadosclorados. FiguraIII.34.ComparacindelaevolucintemporaldelosderivadosbromadosdelMePa15Cy38 C.Datosparaaguadegrifo(0.83mg/Lclorolibre)yungeldebao.
3BrMeP 15C 200000 readepico 150000 100000 50000 0 0 10 20 Tiempo(min) 30
readepico

38C

ClBrMeP 500000 400000 300000 200000 100000 0 0 10 20 Tiempo(min) 30 15C 38C

3,5BrMeP 15C 38C

30000 readepico 25000 20000 15000 10000 5000 0 0

10 20 Tiempo(min)

30

173

Determinacinyreactividadenagua

Porltimo,seevalulainfluenciadelbromuroenlaformacindederivadoshalogenados de los parabenes al mezclar agua de grifo con un colutorio bucal (concentracin de MeP de 1225 mg/LydePrPde489mg/L).Sellevaronacabodosensayosaadiendo25Ldeunadilucin1:10 del colutorio sobre 250 mL de agua de grifo conteniendo 0.77 mg/L de cloro libre. A una de las muestrasseleaaditambin1ng/mLdebromurocomoKBr.Eltiempodereaccinconsiderado conambosensayosfuede10minutos. Al igual que sucedi con las muestras de agua ultrapura, la formacin de los compuestos bromadossehizomssignificativaalaadirlasal(KBr)almedioacuoso,figuraIII.35. Figura III.35. Influencia de la adicin de 1 ng/mL de bromuro en la formacin de los derivados halogenadosparaelMePyelPrPapartirdeuncolutoriobucal.Aguadegrifo(0.77mg/Ldecloro libre)apH7.3,tiempodereaccinde10minutos.
0ng/mLbromuro 3,5BrMeP ClBrMeP 3BrMeP 3,5ClMeP 3ClMeP MeP 0.E+00 5.E+04 1.E+05 2.E+05 2.E+05 3.E+05 3.E+05 reasdepico 1ng/mLbromuro

0ng/mLbromuro 3,5BrPrP ClBrPrP 3BrPrP 3,5ClPrP 3ClPrP PrP 0.E+00 2.E+04 4.E+04

1ng/mLbromuro

6.E+04

8.E+04

1.E+05

reasdepico

3.6.7.Presenciadeparabeneshalogenadosenmuestrasreales

Losderivadosdihalogenadosprocedentesdelosparabenespresentanunagranestabilidad enmedioacuoso(figuraIII.32).Adems,losestudiosrealizadossobrelareactividaddeproductosde cuidado personal, que contiene en su formulacin los parabenes, en agua de grifo y de piscina, pusieron de manifiesto que el comportamiento descrito para analitos puros puede producirse diariamente en cualquier hogar, implicando una continua introduccin de estos compuestos en el aguaresidual.Seanalizaronvariasmuestrasdeaguaresidual,sintratar,enlascualessedeterminla concentracin del paraben de partida as como la relacin existente entre ste y los compuestos halogenadosdetectadosenlasmuestras.LosresultadosobtenidosparaMePyPrPsemuestranenla tablaIII.22.

174

HalogenacinParabenes

Tabla III.22. Concentraciones de MeP y PrP y relaciones de reas de pico medidas para los compuestoshalogenadosdetectadosenaguaresidual(500mLmuestra).
Cod Concentracin(g/L)SD MeP nd 0.060.01 0.490.05 nd 1.880.12 PrP 0.980.09 10.840.64 12.960.65 0.940.08 0.670.06 3ClMeP/MeP nd 14.0 nd nd 4.8 Relacinreadepico(%) 3,5DClMeP/MeP nd 520.7 323.0 nd 4.2 3ClPrP/PrP nd 4.9 nd nd 3.8 3,5DClPrP/PrP 18.4 6.6 15.9 32.0 3.4

1 2 3 4 5

nd:pordebajodelosLOQ

Tal como se observa en la tabla anterior, dos de las muestras (cdigos 2 y 3) presentan respuestaspara3,5DClMePmuysuperioresalasdelMeP,mientrasqueenlasmuestrasnmero2y 5sedetecttambinel3ClMeP.ParaelPrPtambinseencontraronlasformasmonoydicloradas. Para el BuP y EtP, compuestos utilizados minoritariamente en las formulaciones de PPCPs, no se detectaronloscorrespondientesderivadoshalogenados.EnlafiguraIII.36,sepuedenobservarlos cromatogramas,consusrespectivosespectrosdemasas,paralosderivadoshalogenadospresentes enlamuestra2. Figura III.36. Cromatogramas correspondientes a una muestra de agua residual (cdigo 2, tabla III.22)paralosderivadoscloradosdelMePyPrP.
kCts 200 3ClMeP 80% 60% 40% 20% 0% 243 kCts 500 137 163 400 125 150 175 200 225 250 m/z 300 200 50 100 0 16.8 MCts 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 17.5 18.0 18.5 19.0 19.5 minutos 3,5DClMeP 100% 75% 50% 25% 0% 150 200 16.9 17.0 17.1 17.2 17.3 17.4 17.5 minutos 277 0 18.25 MCts 1.75 1.50 303 250 1.25 3,5DClPrP 100% 75% 50% 25% 0% 18.50 18.75 19.00 19.25 minutos 305 3ClPrP 271 100% 75% 283 50% 243 25% 129 149 163 193 0% 125 150 175 200 225 250 275 m/z

150

100

300 m/z 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 19.5 20.0

183

323 279

175 200 225 250 275 300 325 m/z

20.5

21.0 minutos

175

Determinacinyreactividadenagua

La presencia de estos compuestos halogenados en agua residual puede justificarse nicamente debido a lacloracinde parabenes,puesto queno hay ningn producto comercial de usocotidianoqueloscontengaensuformulacin,demodoquesuidentificacinenaguaresidual sirve para poner de manifiesto la evidencia de las reacciones de transformacin descritas. Otra evidenciadelaformacindeestossubproductoshalogenados,fuelapresenciadel3,5DClPrPenun agua de piscina con un contenido en cloro libre de 0.78 mg/L y un pH de 7.3. El cromatograma correspondientesemuestraenlafiguraIII.37. FiguraIII.37.Cromatogramacorrespondienteaunamuestradeaguadepiscinaprocesadamediante SPE(500mLdemuestra).
kCts 25 20 15 10 5 0 19.50 19.75 20.00 20.25 minutos

m/z=305+307

100% 75% 50% 25% 0%

Espectrodel 3,5DClPrP

305

183

175 200 225 250 275 300 325 350 m/z

176

Determinacindetriclosn,compuestosrelacionadosyparabenesenmuestrasacuosas

IV. APLICACIN DE LAS METODOLOGAS DESARROLLADAS A LA DETERMINACIN DE TRICLOSN,COMPUESTOSRELACIONADOSYPARABENESENAGUASRESIDUALESYSUPERFICIALES 4.1.Triclosnycompuestosrelacionados Las metodologas de extraccin y microextraccin en fase slida, desarrolladas para la determinacindetriclosn,metiltriclosnyclorofenoles,fueronaplicadasavariasmuestrasdeagua residual. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla IV.1, indicando el tipo de muestra, el mododemuestreoylatcnicadeconcentracinempleada.Todaslasmuestrasseprocesaronpor triplicado, utilizando como tcnica de determinacin GCMS. Los especmenes de agua residual fuerontomadosendistintospuntosdelareddealcantarillado,ascomoenlaentrada(influente)y salida(efluente)deunaplantadepuradoradeaguasresidualesurbanas,equipadacontratamientos primario y secundario (lodos activos). Las muestras compuestas corresponden a muestreos realizadosduranteunperodode12horas,tomandounaalcuotadeaguacada60minutos.Puesto que en el apartado anterior se ha demostrado que el triclorofenol relacionado con ladegradacin deltriclosneselismero2,4,6ynoel2,3,4TCF,comosepensabainicialmente,lasmetodologas de SPME y SPE, validadas para el ltimo compuesto, se aplicaron a la determinacin de ambas especiesenmuchasdelasmuestrasprocesadas.Losnivelesmedidosparatriclosnfueronanlogos a los encontrados por varios autores en Estados Unidos, Europa y Asia (tabla I.2 del captulo I), aunque inferiores a los publicados por Agera y colaboradores para muestras tomadas en Espaa [AgeraA;2003]. TablaIV.1.ConcentracionescuantificadasdeTCS,2,4DCFy2,4,6TCFenmuestrasdeagua.
Cdigo muestra 1 1 2 2 3 4 5 6 7 Tipodeaguaymodode muestreo Efluentecompuesta Efluentecompuesta Influentepuntual Influentepuntual Sintratarcompuesta Sintratarpuntual Influentecompuesta Efluentecompuesta Sintratarcompuesta Tcnicaextraccin SPME(PA) SPE SPME(PA) SPME(PDMSDVB) SPME(PA) SPME(PDMSDVB) SPME(PA) SPME(PA) SPME(PA) Concentracin(ng/L) 2,4DCF 18318 16317 14411 15117 945 842250 nd nd 1609 2,4,6TCF na na na na na 25437 na na na TCS 72943 69035 24218 22940 19031 2000440 43352 20922 38226

177

Determinacinyreactividadenagua Cdigo muestra 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36

na:noanalizado

Tipodeaguaymodode muestreo Sintratarcompuesta Influentecompuesta Efluentecompuesta Sintratarcompuesta Sintratarcompuesta Influentecompuesta Efluentecompuesta Sintratarcompuesta Sintratarcompuesta Influentecompuesta Efluentecompuesta Sintratarcompuesta Influentecompuesta Efluentecompuesta Sintratarcompuesta Influentecompuesta Efluentecompuesta Ropuntual Influentepuntual Efluentepuntual Sintratarpuntual Sintratarcompuesta Sintratarcompuesta Sintratarcompuesta Sintratarcompuesta Influentepuntual Efluentepuntual Efluentepuntual Efluentepuntual

Tcnicaextraccin SPME(PA) SPME(PA) SPME(PA) SPE SPE SPE SPE SPE SPE SPE SPE SPE SPE SPE SPE SPE SPE SPE SPE SPE SPME(PA) SPME(PA) SPME(PA) SPME(PA) SPME(PA) SPME(PA) SPME(PA) SPME(PA) SPME(PDMSDVB)

Concentracin(ng/L) 2,4DCF 2222277 545 34827 951 130613 2721 nd 1008 81328 2895 4531 16412 522 nd 21910 984 436 nd nd nd 17113 353 122375 6333 128232 586 542 295 8914 2,4,6TCF 37516 na na na na 323 7810 na 39012 22314 1194 10620 442 254 1103 224 686 nd 432 373 na na 860116 99080 2476 na na na na TCS 139441760 966164 32140 20910 127117 25016 4315 54836 3450103 33312 1022 26813 2431 5210 41411 1023 788 8010 80624 72876 709 12112 4148423 13605538 175501176 2998 26526 18621 16515

nd:pordebajodelosLOQ

178

Determinacindetriclosn,compuestosrelacionadosyparabenesenmuestrasacuosas

Enlasmuestrasprocesadasnosedetectnuncani2,3,4TCFniMTCS.Sinembargo,elTCS estuvo presente en el 100 % de las mismas. Con respecto al 2,4diclorofenol, se cuantific en la prcticamayoradelasmuestras,conunporcentajedepositivosdelordendel80%.El2,4,6TCFfue encontradoenel95%delamuestrasenlasquefueanalizado.Enalgunasmuestras,sedetect,a tiemposderetencininferioresaldel2,4diclorofenol,otropicoconunespectrodemasasidntico. Paraverificarlaidentidaddelospicosasignadosa2,4DCFy2,4,6TCF,enlasmuestrasdeagua,as comoidentificareldiclorofenolpresenteenalgunasdeellas,seinyectaronpatronesindividualesde diferentes dicloro y triclorofenoles sililados empleando MTBSTFA y BSTFA. Los extractos de las muestrastambinsederivatizaronconambosreactivos,figuraIV.1. FiguraIV.1.Cromatogramassuperpuestosparapatronesyextractosdeunamuestrareal(cdigo17, tablaIV.1)derivatizadosconMTBSTFAyBSTFA. m/z=219+221
MCts 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 16.00 16.25 16.50 16.75 17.00 17.25 minutos Muestra MTBSTFA 2,5DCF 2,4DCF

m/z=253+255
kCts 500 400 300 200 100 0 18.25 18.50 18.75 19.00 19.25 19.50 19.75 minutos Muestra 2,3,4TCF 2,4,6TCF MTBSTFA

m/z=253+255
kCts 350 300 250 200 150 100 50 0 14.0 14.5 15.0 15.5 minutos Muestra 2,3,4TCF BSTFA 2,4,6TCF

179

Determinacinyreactividadenagua

Comoseindicanteriormente,el2,4,6TCFpresentaelmismotiempoderetencinqueel 2,4,5TCFyel2,3,5TCFcomoderivadostertbutildimetilsililados(tablaIII.13),aunquelas3especies sepuedenresolvercuandoseutilizaelBSTFA,loquehapermitidocomprobarqueeltriclorofenol identificado de forma sistemtica en las muestras analizadas es el 2,4,6TCF. Adems, ambos derivatizantes dan lugar a picos perfectamente resueltos para los ismeros 2,3,4 y 2,4,6TCF de manera que no existe riesgo de realizar asignaciones errneas entre ambas especies (fig. IV.1). El diclorofenolqueapareceenalgunosdelosextractos,atiemposderetencininferioresal2,4DCF,se identificcomoel2,5DCF.Enprincipio,noexisteningunarelacinentreestecompuestoyelTCS. Las mayores concentraciones de 2,4DCF y 2,4,6TCF se detectaron en aquellas muestras quepresentaronniveleselevadosdetriclosn(4,8,12,16,30,31y32)loqueratificalahiptesisde que estos compuestos procedan, al menos en parte, de la cloracin del TCS, cuando PPCPs conteniendo este bactericida entran encontactocon elagua clorada.La muestra nmero 25 es la nicacorrespondienteaaguaderoenlatablaIV.1.Hasidotomadaunos5Kmdespusdelpunto dedescargadelasaguasresidualesprocedentesdelaestacindepuradora.Esemismodasehan obtenido tambin las muestras nmero 26 y 27, correspondientes al influente y el efluente de la planta.ElniveldeTCSenelrorepresentadelordendeun10%desuconcentracinenelefluente delaestacindepuradora. Usando los datos para los pares de muestras compuestas de agua residual, tomadas a la entradaysalidadelaplantadepuradora(56,910,1314,1718,2021y2324),seestimaronlos porcentajesdeeliminacindelTCS,2,4DCFy2,4,6TCF,enloreferentealasfraccionespresentesen disolucin,tablaIV.2.Cabedestacarqueestosparesdemuestrasfuerontomadosconunadiferencia de 12 horas, equivalentes al tiempo de residencia del agua en la planta. Los porcentajes de eliminacinpromediooscilanentreel45yel68%,sinembargoparaTCSy2,4DCFseobservaron variacionesmuyimportantesenlaeficaciadelaplantadepuradora. TablaIV.2.Porcentajedeeliminacindetriclosn,2,4DCFy2,4,6TCFparalasmuestrastomadasa laentradayalasalidadeladepuradoradeaguaresidual.
Cdigomuestra 56 910 1314 1718 2,4DCF 0% 0% 100% 84% 2,4,6TCF na na nc 47% TCS 52% 67% 83% 69%

180

Determinacindetriclosn,compuestosrelacionadosyparabenesenmuestrasacuosas Cdigomuestra 2021 2324 Eliminacinmedia 2,4DCF 100% 56% 6862

2,4,6TCF 43% nc 456

TCS 79% 24% 6235

na:noanalizado nc:porcentajesnegativosnoconsideradosparaelclculo

Con objeto de verificar la exactitud de las metodologas de SPE y SPME con muestras contaminadas de forma real, la muestra nmero 1 fue procesada con ambas tcnicas (N=3) y los resultados obtenidos, para los dos compuestos que se encuentran por encima de los LOQs del mtodo,comparadosestadsticamenteutilizandolostestsFdeFisherytdeStudent,tablaIV.3.La conclusin a la que se lleg es que no existen diferencias estadsticamente significativas entre las concentraciones obtenidas con ambas metodologas, tabla IV.4. De forma anloga, la muestra nmero 2 se concentr mediante SPME, empleando fibras de PA y PDMSDVB. De nuevo, las concentracionesencontradaspara2,4DCFyTCS,empleandoambasfibras,fueronequivalentespara unniveldeconfianzadel95%. TablaIV.3.ExpresionesparaeltestFyeltesttdeStudent.
Test F Frmula
s F = 1 s1>s2 2 s2
2

tdeStudent (varianzascomparables estadsticamente,testF)

t= s

x1 x 2 n 2 + n1 n1n2

(n 1)s + (n 1)s =
1 2 1 2

2 2

n1 + n2 2

Tabla IV.4. Valores deF y t de Student tabuladosy calculados para ambos mtodos de extraccin, muestra1.
2,4DCF TCS Fexperimental 1.10 1.50 Ftabulada 39 39 texperimental 1.36 1.21 ttabulada 2.78 2.78 Conclusin Resultadoscomparables (95%confianza) Resultadoscomparables (95%confianza)

181

Determinacinyreactividadenagua

TablaIV.5.ValoresdeFytdeStudenttabuladosycalculadosparaambasfibrasdeSPME,muestra2.
2,4DCF TCS Fexperimental 2.38 4.90 Ftabulada 39 39 texperimental 0.59 0.51 ttabulada 2.78 2.78 Conclusin Resultadoscomparables (95%confianza) Resultadoscomparables (95%confianza)

4.2.Parabenes La presencia de parabenes se investig en muestras de agua de ro y agua residual. En el primer caso se realizaron muestreos puntuales en la zona de Pontevedra, Lugo y Santiago de Compostela (Ver Anexo, pgina 187188, para la localizacin de las muestras). Todas las muestras fueronprocesadasportriplicado,utilizandolatcnicadeextraccinenfaseslida.Enalgunoscasos seincrementelvolumendemuestraconcentradohasta2L,enlugarde1L,yelextractofinalse concentraunvolumende0.5mLconobjetodereducirloslmitesdecuantificacinpresentadosen la tabla III.11en un factorde 8 veces. Adems se realizaron blancosde muestreoyde extraccin, paradetectarposiblesproblemasdecontaminacinambientalodelmaterial. Losvaloresencontradospara10muestrasdeaguasepresentanenlatablaIV.6.MePyPrP estuvieronpresentesentodaslasmuestras,mientrasqueelBzPnosedetectenningunadeellas. Las muestras codificadas como 1, 2, 3 y 4 fueron tomadas en los alrededores de Santiago de Compostela.LasdosprimerascorrespondenalroSar,tomadasprevia(muestra1)yposteriormente (muestra2)alpuntodevertidodelefluentedelaplantadepuradoradeaguaresidual.Lamuestra3 correspondeaunafluentedelSar.Comopodemoscomprobar,lasmuestras1y3presentanniveles bajosdelosparabenes,mientrasqueenlamuestra2,seobservunnivelsuperiordePrP(100ng/L). Las muestras codificadas como 6 y 7 son de un ro de Pontevedra (Lrez) y dos de sus afluentes (cdigos5y8).TodasellaspresentaronnivelessimilaresdeMePyPrP. Lasmuestrasnmero9y10correspondenaroscuyocaucetranscurrepordosciudades, unadelascuales(Vigo,cdigo9)presentaunagranindustrializacinascomounelevadonmero dehabitantes(400000habitantes),mientrasquelaotraprocededeunapequeaciudadinteriorde lazonadeLugo(cdigo10). 182

Determinacindetriclosn,compuestosrelacionadosyparabenesenmuestrasacuosas

TablaIV.6.Concentracindeparabenesenmuestrasdeaguadero(ng/L).N=3rplicas.
Cdigo muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Localizacin Lat:425210.54N Lon:83443.12O Lat:425136.06N Lon:83715.11O Lat:42537.12N Lon:83420.31O Lat:42505.90N Lon:8358.11O Lat:422657.14N Lon:83840.32O Lat:42263.16N Lon:8389.04O Lat:42276.89N Lon:83718.33O Lat:42258.71N Lon:83811.84O Lat:42131.25N Lon:84232.64O Lat:423622.95N Lon:74636.14O Muestreo 18/01/06 18/01/06 18/01/06 27/02/06 27/02/06 28/02/06 28/02/06 27/02/06 28/02/06 01/02/06 Concentracin(ng/L) MeP 273 263 5.40.8 171 7.30.3 131 152 181 131 121 EtP 5.40.1 7.10.4 3.30.1 nd nd nd nd nd nd nd PrP 292 1022 142 142 8.30.7 151 213 201 343 183 BuP 191 nd 201 nd nd nd nd 1.40.1 nd nd BzP nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd

nd:pordebajodelosLOQ

Las muestras de agua residual, salvo indicacin contraria, han sido integradas durante un periodo de 12 horas y se procesaron utilizando tanto SPE como SPME. En el primer caso, la cuantificacinserealizmediantecalibracinexternayenelsegundohaciendoadicionesalagua.La figuraIV.3muestraloscromatogramasparaunblancodeSPME,unamuestradeaguaresidualyla misma matriz fortificadacon los analitos de inters. Losdatos de concentracin para las muestras medidas se recogen en la tabla IV.7. Las muestras codificadas como 1, 2, 3, 4, 9, 12 y 16, corresponden a distintos puntos de la red de alcantarillado en la ciudad de Santiago. Al igual que ocurraenelaguadero,MePyPrPfueronlasespeciespresentesamayorconcentracin,mientras quenosehadetectadoelBzPenningunadeellas.

183

Determinacinyreactividadenagua

Figura IV.2. Cromatogramas de GCMS/MS para un blanco del proceso (rojo), una muestra de influente(verde,cdigo7,tablaIV.7)ylamismamuestrafortificadaa0.5ng/mL(naranja).
kCts 10.0 7.5 5.0 2.5 0.5 0.0 14.75 15.25 PrP BuP 3.0 m/z151+195 30 20 10 0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 17.0 17.5 18.0 18.5 19.0 minutos 0.0 21.5 22.0 22.5 minutos m/z163+241 15.75 16.25 minutos kCts 3.5 0.0 16.00 16.50 17.00 minutos BzP m/z177 MeP kCts 12.5 10.0 7.5 5.0 2.5 EtP m/z151+177+195

kCts 40

TablaIV.7.Cuantificacindeparabenesenmuestrasdeaguaresidualmediantelasmetodologasde SPEySPME.Concentracinenng/L(N=3).
Cod. 1 2 3 4 Tipodeaguaymodode muestreo Sintratar Sintratar Sintratar Sintratar Tcnicade concentracin SPME SPME SPME SPME Concentracin(ng/L) MeP 2400190 658 733 1480170 EtP nd 566 nd 101 PrP 980100 81070 18030 1220110 BuP nd nd nd 191

184

Determinacindetriclosn,compuestosrelacionadosyparabenesenmuestrasacuosas

Cod. 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Tipodeaguaymodode muestreo Influente Efluente Influente Efluente Sintratar Influente Efluente Sintratar Influente Efluente Influente Sintratar
1

Tcnicade concentracin SPME SPME SPME SPME SPE SPE SPE SPE SPE SPE SPE SPE

Concentracin(ng/L) MeP 2920200 nd 43040 nd 651 532 181 172686 2000105 81 1667 2401110 EtP 21010 nd 524 nd 561 91 11 1593 2421 nd 1164 nd PrP 810140 nd 23020 nd 80723 161 71 129460 71512 141 43122 97835 BuP 8615 nd 201 nd nd nd nd 203 742 21 401 nd

ndpordebajodelosLOQ Muestraspuntuales

LafiguraIV.3representalasconcentracionesparalasparejasdemuestras56,78,1011y 1314, correspondientes a muestreos realizados en diferentes fechas en la entrada y salida de la estacindepuradora,conunadiferenciade12horasparatenerencuentaeltiempoderesidencia delaguaenlaplanta. FiguraIV.3.Nivelesdeparabenesenlaentradaysalidadelaestacindepuradoradeaguaresidual.
Influente 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 5,6 7,8 10,11 13,14 5,6 7,8 10,11 13,14 Efluente

Influente 300 250 200 ng/L 150 100 50 0 10,11 13,14

Efluente

ng/L

10,11

MeP

PrP

EtP

BuP

13,14

5,6

7,8

5,6

7,8

185

Determinacinyreactividadenagua

Enconjunto,losparabenessoneliminadosdemaneraprcticamentecuantitativaduranteel tratamientodelaguaresidual,ysusnivelesenefluentesondelmismoorden,oinclusoinferioresa losencontradosenlasmuestrasdeaguaderoprocesadas.

186

Anexo

Anexo:Puntosdemuestreoparaladeterminacindeparabenesenrosgallegos(tablaIV.6)

187

Anexo

188

CAPTULOIV

MAEaplicadaalaextraccindeTCSyclorofenolesenlodoysedimento

I. DETERMINACIN DE TRICLOSN Y CLOROFENOLES EN MUESTRAS DE SEDIMENTO Y LODOMEDIANTEEXTRACCINASISTIDAPORMICROONDAS 1.1.Introduccin EnelcaptuloIIIdeestaTesisDoctoralsehapuestodemanifiestolapresenciadetriclosny dos clorofenoles relacionados en aguas residuales. Dado que el triclosn tiene un carcter medianamente lipoflico (Log Kow 4.8), una parte del mismo puede permanecer asociado a los residuos slidos (lodos) generados en las estaciones depuradoras de aguas residuales. En estas plantassegenerandistintostiposdelodossegneltipodetratamientoaplicado.Eneldenominado tratamientoprimario,seeliminalamateriaensuspensinpresenteenelaguamedianteunaseriede operaciones de tipo fsico. Incluye la eliminacin de gruesos, el desarenado, el desengrasado y la decantacin,dandolugarallododenominadoprimario.Eneltratamientosecundariosellevaacabo el ataque a la fraccin disuelta en agua, recurriendo a bacterias que se alimentan de la materia orgnica en disolucin. Tras un nuevo proceso de decantacin, se separa el lodo biolgico o secundario. En algunas plantas depuradoras, se realiza adems un tratamiento fsicoqumico (tratamientoterciario)paramejoraralgunasdelascaractersticasdelefluentefinal. Los lodos generados en la planta depuradora procedentes del tratamiento primario y secundario, normalmente son reutilizados como fertilizantes, despus de su tratamiento con agentes qumicos (por ejemplo, cal viva o carbonato clcico) para eliminar bacterias y otros microorganismos. Este uso, hace posible que los contaminantes qumicos retenidos en la matriz slida,pasendirectamentealsuelo[XuJ;2008].Portanto,esimportanteconocerquecompuestos permanecenenellodoascomosuconcentracin. Ladeterminacindecompuestosorgnicosenmatricesslidas,yprincipalmenteenlodos, presenta un grado de dificultad considerable. La complejidad de la matriz y la fuerte interaccin existente entre los sitios activos del lodo y las molculas de los analitos, hacen que las recuperacionesobtenidasseangeneralmentebajasysometidasaunagranvariabilidad.Porlotanto, es necesario la utilizacin de tcnicas de extraccin exhaustivas como Soxhlet [Bester K; 2003], extraccincondisolventespresurizados[SingerH;2002][ChuS;2007][AgeraA;2003],extraccin con fluidos supercrticos [Mc Avoy DC; 2002] o extraccin asistida por microondas [Morales S; 2005]. Por otro lado, debido a la gran capacidad de extraccin de estas tcnicas, no slo recuperamosloscompuestosdeinters,sinoque,unaparteimportantedelcontenidoorgnicode estasmuestraspasaadisolucinporloqueseobtienenextractosmuycomplejosquenopuedenser analizadosdirectamenteyprecisandeunaetapadepurificacin.EnlatablaI.1seresumenvarios mtodosdesarrolladosparaladeterminacindetriclosnenmuestrasdelodoysedimentos.Cabe destacarqueenningunadelasreferenciassehacemencinalaextraccinsimultneadetriclosny 191

Lodosdedepuradoraysedimentos

los clorofenoles derivados de la halogenacin de este bactericida: 2,4diclorofenol y 2,4,6 triclorofenol. Tabla I.1. Resumen de mtodos para la determinacin de Triclosn en muestras de lodos y sedimentos.
Analitosy matriz
TCSyotros PPCPsen sedimentos marinos TCSybifenilol en sedimentos marinos TCSenlodos de depuradora TCSyMTCS en sedimentosy lodosde depuradora

Procedimiento
Soxhletasistidopormicroondas:1gde liofilizadoy100mLdeDCMdurante75min. EvaporarasequedadyreconstituirconAcOEt. PLE:10gdeliofilizado+2ghidromatrixenceldas de22mL.DCM,100C,1500psi,1ciclode5 min.Evaporara5mLypurificacincon1gde slica,eluyendoconacetonaymetanol. Concentrarasequedadyreconstituirconfase mvil. Soxhlet:10gdeliofilizadoconAcOEt6h. Limpiezaconslicaypurificacinmediante cromatografadepermeacinengel. PLE:1gliofilizadoDCM,100C,1500psi,3ciclos de5min.Purificacincon2gdeslicayelucin con2mLdeDCM,evaporandoasequedad. Derivatizarcondiazometano.Eliminacinde disolvente,reconstitucinconAcOEt. PLE:0.10.2gdeliofilizado,dispersadocon3g dehidromatrix,DCM,60C,1500psi,3ciclosde 5min.PurificarconOasisHLB500mg,lavando conhexano,DCMyagua,eluircon MeOH:Acetona(1:1).Concentrarasequedady reconstituirconMeOH. Sonicacin:20mgdelodosecoa50Ccon5mL deMeOHy3mLaguadurante30min.Dilucin con100mLaguaultrapuraySPEconC18. Elucincon8mLDCM:Hexano(4:1).Concentrar asequedadyderivatizarconBSTFAypiridinaa 65C/20min. Extraccinconfluidossupercrticos:0.5gde liofilizado+0.5gdeslica,40C,5500psi,200 Ldecidofrmicoenesttico15minyCO2a1 mL/minendinmico45min.TrampadeC18y extraccindelamismaconhexanoa1020C, concentracina0.5mLyderivatizarconBSTFA.

Deteccin

LOD (ng/g)
0.5

RSD (%)
10

Rec.(%)

Ref.

GCMS

96

(1)

GCMS LCMS/MS

3.5

100

(2)

GCMS

27

94

(3)

GCMS/MS

1.5

95

(4)

TCSyTCCen lodos

LCMS/MS

1.5

98

(5)

TCS, nonilfenoly derivados, bisfenolAen lodos TCS,MTCS, Tetrasy Pentaclosano enlodos

GCMS

150

15

85

(6)(7)

GCMS

21

7984

(8)

192

MAEaplicadaalaextraccindeTCSyclorofenolesenlodoysedimento

Analitosymatriz
TCS,AINEs,PPCPs ensuelos TCSyPPCPsen lodosde depuradora TCSyPPCPsen lodosde depuradora TCSyfrmacosen lodosysuelos enriquecidoscon lodos

Procedimiento
MAE:3gsuelosecoa115C,15mina800Wcon2:1 deDCM:MeOH.Dividiren2elextracto, derivatizandounodeellosconBSTFA,ypurificar ambosconslica,eluyendocondistintosdisolventes. PLE:0.5gliofilizado+materialinerteenceldasde33 mL.ExtraccinconAcOEta130C,2ciclosde45min. Evaporara1mL,ydiluir1:9contolueno. Extraccinlquidoslido:0.5gliofilizadocon30mL deNaOH1M,agitandoa700rpm30min. Centrifugara3000rpm10min.AjustedepHa2. Aadir20mLtolueno,agitara700rpm/30min.LLE paraobtencindelafaseorgnica,yderivatizacin conagentesililante. PLE:2.7gsuelo1glodoliofilizado+arenaen celdasde33mL.ExtraccinconMeOH:agua(1:1)a 60C/1500psicon2ciclosestticosde5min. ConcentracinseguidadeSPEOasisHLB200mg.

Deteccin

LOD (ng/g)

RSD (%)
10

Rec. (%)
90

Ref.

GCMS

(9)

GCMS

31

70 130

(10)

GCMS

31

70 130

(10)

LCMS/MS

20

3.0 4.6

100

(11)

(1)MoralesMuozS,2005;(2)AgeraA,2003;(3)BesterK,2003;(4)SingerH,2002;(5)ChuS,2007;(6)GatidouG,2007;(7) StasinakisAS,2008;(8)McAvoyDC,2002;(9)RiceSL,2007;(10)LigonAP,2008;(11)BarronL,2008.

1.2.Experimentosprevios Paralaextraccindetriclosn,2,4diclorofenoly2,4,6triclorofenoldelodosdedepuradora y sedimentos, se seleccion la extraccin asistida por microondas (MAE) puesto que presenta un gran poder extractante, derivado de la aplicacin de la energa de microondas sobre una muestra impregnada con un disolvente que presenta un momento dipolar distinto de cero. Los extractos obtenidos, generalmente fueron complejos, de modo que, al igual que ocurre con los mtodos descritos en la tabla I.1, es necesario establecer una estrategia de purificacin para eliminar potencialesinterferencias. 1.2.1. Viabilidad de la extraccin de TCS, 2,4DCF y 2,4,6TCF de muestras de lodos medianteMAE Previamentealaoptimizacindelascondicionesdeextraccin,sellevaronacabounaserie depruebasinicialesparaponerdemanifiestolapresenciadeloscompuestosdeintersenlamatriz estudiada,ascomoelgradodecomplejidaddelosextractosobtenidos.

193

Lodosdedepuradoraysedimentos

Las muestras de lodo sin adicin, previamente liofilizadas, fueron extradas con tres disolventesdistintos:acetatodeetilo,acetonaymetanol,enbasealabibliografaexistenteparala determinacin de triclosn y otros frmacos en esta matriz [Bester K; 2003][Ternes TA; 2005]. La extraccin (0.5 g de muestra liofilizada) se realiz con 30 mL de disolvente a 110C durante 20 minutos, con una potencia del magnetrn de 500 W. Una vez enfriados, los extractos fueron centrifugados y el sobrenadante fue recogido en un vial, realizando un cambio de disolvente a acetato de etilo. En todos los casos, los extractos presentaron un color muy intenso, con lo cual previamente a la inyeccin de los mismos en el sistema cromatogrfico (GCMS), seprocedi a su purificacin con 500 mg de slica, eluyendo los analitos con acetato de etilo en las condiciones descritasenelcaptuloanteriorparamuestrasdeagua.EnlafiguraI.1semuestrauncromatograma de GCMS correspondiente a la extraccin con acetona. Independientemente del disolvente de extraccin,elperfildecorrienteinicatotal(TIC)presentunagrancomplejidaddebidoalelevado nmero de impurezas coextradas, lo que repercute en que el tiempo de vida til de la columna disminuya. Figura I.1. Cromatograma de corriente inica total para un extracto de lodo. MAE a 110C con acetona.
MCts 1.50 TCS 1.25 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 minutos

AdemsdelagrancomplejidaddeloscromatogramasdeGCMS,enelespectrodemasas deltriclosnseapreciaunaseala327unidadesdem/zpertenecienteaunainterferenciaqueco eluyeconelanalitoyquedificultasuidentificacin,sobretodoparamuestrasconnivelesbajosdel compuesto.EnlafiguraI.2seobservalaintensidaddelainterferenciafrentealasealdeTCS,as comoelespectrodemasasparaelpicodeltriclosnenlamuestrasinadicin.

194

MAEaplicadaalaextraccindeTCSyclorofenolesenlodoysedimento

FiguraI.2.Cromatogramacorrespondienteaunamuestradelodoprimarioreconstruidoam/z327 (impureza,lineacontinua)y345+347(TCS,lneadiscontinua).
327 MCts 7 6 5 4 3 2 1 0 22.75 23.00 23.25 23.50 23.75 minutos 75% 50% 25% 0% 150 200 250 300 350 m/z 131 313 347

En base a estos datos preliminares, se decidi desarrollar una estrategia de purificacin exhaustivadelosextractosobtenidospormicroondas,ademsdeoptimizarladeteccinenmodo MS/MS para aumentar la sensibilidad y la selectividad en la determinacin de los compuestos de inters.Porotrolado,estosexperimentospusierondemanifiestolaexistenciadeconcentraciones significativasdeTCSenellodo. 1.2.2.Identificacincromatogrfica(GCMS/MS) LaidentificacindelospicoscromatogrficoscorrespondientesaTCS,2,4DCFy2,4,6TCF sellevacaboconsiderandosustiemposderetencin,ascomolosespectrosdeMSyMS/MS.Las condiciones de deteccin en modo MS fueron descritas en la seccin III del captulo anterior. La optimizacindelascondicionesdeMS/MSparael2,4diclorofenol,2,4,6triclorofenolytriclosnse realiz con ayuda de la herramienta de desarrollo automatizado de mtodos (AMD). Los iones precursoresseleccionadosfueronlosfragmentoscorrespondientesalaprdidadelgrupotertbutilo dem/z[M57]+parael2,4DCFy[M+257]+parael2,4,6TCFyelTCS.Laeleccindelinprecursor [M+257]+ para compuestos triclorados, da lugar a dos iones producto para cada transicin que implicaunaprdidadecloro.Laventanadeaislamientosefijen3unidadesdem/z,yseutilizla fragmentacin en modo resonante. En el caso de los clorofenoles, los espectros obtenidos mostraronlaprdidade36y72unidadesdemasa,correspondientesalaeliminacindeunoodos molculasdeHClenlaestructuradelosanalitos.Paraeltriclosn,lafragmentacinresultserun pocomscompleja,puestoqueademsdeperderuntomodeCl(transicin347a310),suenlace terserompe,dandolugaraunfragmentode200unidadesdem/z. En la figura I.3 se presentan los espectros de MS/MS obtenidos para 2,4DCF, 2,4,6TCF y TCScomocompuestostertbutildimetilsililados.

195

Lodosdedepuradoraysedimentos

FiguraI.3.EspectrosdeMS/MSpara2,4DCF,2,4,6TCFyTCS.
100% 75% 50% 25% 0% 125 125 147 150 175 201 219 200 225 m/z

2,4DCF

183

100% 75% 50% 25% 0%

2,4,6TCF

217

159 125 150

183 175 200

235 255 225 250 m/z

100% 75% 50% 25% 0% 175 185

200

TCS
310 219 200 225 250 275 300 325 345 350

m/z

Las condiciones instrumentales de medida en GCMS/MS para TCS y dos clorofenoles se resumenenlatablaI.2. TablaI.2.CondicionesinstrumentalesdemedidaenGCMS/MS.
Tr (min)1 15.67 In precursor (m/z) 219 Nivelde almacenamiento (m/z) 96 Amplitudde excitacin(V) 0.53 Ionesproducto (m/z)2 183 147 217 235 183 200 310 219 Intensidades relativas(%) 100 10 100 34 15 100 50 10

2,4DCF

2,4,6TCF

17.26

255

110

1.10

TCS
1 2

23.04

347

140

1.50

ColumnaHP5MS. Losionessubrayadosseutilizanparacuantificacin.

Lasiguientefigura,correspondienteaunextractodeunlodobiolgicosinadicin,ponede manifiestoladisminucindelacomplejidaddelperfilcromatogrficocuandoseutilizaMS/MScomo tcnicadedeteccinfrenteaMS,figuraI.4.

196

MAEaplicadaalaextraccindeTCSyclorofenolesenlodoysedimento

FiguraI.4.Cromatogramas(TIC)deMSyMS/MScorrespondientesaunextractodeunamuestrade lodobiolgico.
MCts 6 5 4 3 2 1 0 kCts 500 400 300 200 100 0 15 16 17 18 19 20 21 22 minutos 23 2,4DCF 2,4,6TCF

MS

MS/MS
TCS

1.3.Estrategiadepurificacindelosextractos Tal como hemos descrito en las pruebas preliminares, los extractos de microondas correspondientes a muestras de lodo fueron muy complejos, conteniendo gran cantidad de interferencias. Aunque el uso de la deteccin en modo MS/MS oculta su presencia en los cromatogramas, es evidente que a medio plazo provocarn la contaminacin irreversible de la columna capilar. Para reducir estos problemas, se desarroll una estrategia de purificacin de los extractosmselaborada,evitandosiemprerecurriralacromatografadepermeacinengel[Bester K;2003]. Dado que los compuestos objeto de estudio, tienen caractersticas cidas (pKa comprendidos entre 6.6 y 8.1) pueden ser separados de especies de naturaleza bsica y neutra utilizando extraccin lquidolquido. ApHs bsicos,cabeesperar que en un procesode extraccin lquidolquidotenganmayorafinidadporelmedioacuosoqueporlafaseorgnica.Paraevaluarla viabilidaddeestaestrategiadepurificacin,seinvestigladistribucindeestoscompuestosentre unafaseorgnicayotraacuosaapHbsico.Paraestaspruebas,seprepararonalcuotasde100mL de agua ultrapura con adicin de los analitos a nivel de 50 ng/mL, ajustando el pH con hidrxido sdicoavaloresde11.5y13unidades.Estasmuestrasfueronextradascondosalcuotasde15mL

197

Lodosdedepuradoraysedimentos

de hexano o acetato de etilo. La fase orgnica se concentr a 2 mL, y una alcuota de 500 L fue derivatizada con MTBSTFA. La fase acuosa, se acidific a pH 2.5 y se extrajo mediante SPE con la metodologadescritaenelcaptuloII,seccin2.1.1.Traslaelucindeloscartuchos,yderivatizacin delosextractosenacetatodeetilo,seinyectaronlosextractosobtenidos(1L)paraambasfases enGCMS.Lassealesparacadaanalitoenlafaseacuosaylafaseorgnicasecompararonconlos obtenidos para una referencia (muestra de agua no sometida al proceso de LLE) concentrada por SPE.LatablaI.3muestralosresultadosobtenidosparatriclosn,elmslipoflicodelostresanalitos consideradosy,portanto,elqueapriorivaapresentarmayoresdificultadesparapermanecerde formacuantitativaenlafaseacuosaapHbsicoduranteelprocesodeLLE. TablaI.3.Porcentajes(%)detriclosnenlasfasesorgnica(FO)yacuosa(FA)considerandodospH diferentes (11.5 y 13) y dos disolventes distintos (acetato de etilo y hexano). Valores normalizados respectoaunamuestradeaguanosometidaaLLE.
Disolvente Acetatodeetilo Hexano FO 92.5 41.5 pH11.5 FA 0.5 59.1 FO 1.4 pH13 FA 92.6

DeacuerdoconlosresultadosmostradosenlatablaI.3,usandohexanocomofaseorgnica yaguaajustadaapH13,eltriclosnpermaneceprcticamenteenelmedioacuosoandespusde lasetapasdeLLEconestedisolvente. LadistribucindeloscompuestosentrelaFAylaFOdehexanoapH13,fuereevaluadaen presenciade30mLdemetanoloacetona,omezcladeambosdisolventesal50%.Losresultados obtenidos,tablaI.4,muestranquenohubodiferenciasenladistribucindelosanalitosentrelafase acuosaylaorgnica.Adems,lareferencia,realizadasinadicindedisolventesysinllevaracabola LLE,pusodemanifiestoquelapresenciadeesevolumendedisolventenoafectalarecuperacin delaetapadeSPE. TablaI.4.Porcentajes(%)delosanalitosenlaFOyFAconteniendometanoloacetona,conrespecto alareferencia.
Disolvente presenteenlaFA Acetona Metanol Act:MeOH(1:1) 2,4DCF FO 0.04 0 0 FA 96.1 97.5 92.5 2,4,6TCF FO 0.02 0 0 FA 96.0 97.5 99.9 FO 0.48 0.92 0.49 TCS FA 94.0 97.1 112.4

198

MAEaplicadaalaextraccindeTCSyclorofenolesenlodoysedimento

Enbaseaestosresultados,sellevacabolaextraccindeunamuestradelodocon20mL demetanola110Cdurante20minutos.Trascentrifugarelextractoydiluirlocon100mLdeNaOH 0.2MapH13,seextrajodosvecescon15mLdenhexano,aadiendoclorurosdico(0.5g)para facilitar la separacin de ambas fases. La fase orgnica present una gran complejidad, probablementedebidoalapresenciadegrasasyotrasespeciesdecarcterapolarybsico.Lafase acuosa, en cambio, present una apariencia menos compleja (prcticamente incolora) despus de estaetapadeLLE.EstafaseacuosafueajustadaapH2.5,concentradamedianteSPEypurificadacon 500mgdeslicaneutra(protocolodescritoenelcaptuloII,seccin2.1.1).Enesteltimopaso,la slicaretieneaquellasinterferencias,denaturalezamspolarquelosanalitos,quenohayanpodido sereliminadasenlasanterioresetapasdeLLESPE.Elextractofinalpresentunamenorcoloracin, yporlotantocomplejidad,frenteaaquelenelqueseomitilaetapadeLLEypurificacinconslica neutra,figuraI.5. FiguraI.5.CromatogramasdeGCMS(TIC)deunlododedepuradoracon(lneacontinua)ysinetapa delimpiezamedianteLLE(lneadiscontinua).
MCts TCS SinLLE 7.5 ConLLE

5.0

2.5

0.0 15 16 17 18 19 20 21 22 23 min

En la figura I.6 se resume el protocolo de purificacin para los extractos de MAE procedentesdelodosdedepuradora.

199

Lodosdedepuradoraysedimentos

FiguraI.6.Esquemadepurificacinparaextractosdelodos.
ExtractoMAE Centrifugar5000rpm/5min Mezclarcon100mL NaOH 0.2M(pH13) LLE2X15mL hexano

FA AjustarapH2.5 SPE:OasisHLB60mg (2mL AcOEt)

FO

Residuo

Purificacin:SepPak500mg (5mL AcOEt)

Concentrara2mL yderivatizar 0.5mL con50L MTBSTFAaT Amb.5min

1.4.Optimizacindelascondicionesdeextraccinasistidapormicroondas La optimizacin de los factores que afectan al proceso de extraccin asistida por microondas se realiz mediante diseo de experimentos. La temperatura, el tipo y volumen de disolvente, la agitacin y la adicin de modificadores son factores que pueden influir significativamenteenelrendimientodelprocesodeextraccin. 1.4.1.Temperatura,disolvente,volumendedisolventeyagitacin Los efectos del tipo de disolvente y su volumen, la temperatura y la agitacin fueron estudiadosmedianteundiseofactorialfraccionaldescreeningdeltipo241.Paralarealizacinde los 8 experimentos implicados en estediseo, seprepar una muestramezclando lodo primario y biolgico (previamente liofilizados) en proporcin 8:2 (p/p). Estudios previos mostraron que la cantidadnativadetriclosnenlamuestraeraconsiderable,encambio,losclorofenolespresentaron 200

MAEaplicadaalaextraccindeTCSyclorofenolesenlodoysedimento

nivelesmuchomsbajos,porloquelamatrizfuefortificadacon2,4DCFy2,4,6TCF.Paraello,se prepar una suspensin mezclando el slido con un patrn de 2 g/mL de ambos clorofenoles en acetona.Traslaevaporacindeldisolvente,lamuestrasealmacendurante5dasatemperatura ambiente,parafavorecerlainteraccinentrelosanalitosylamatriz. Paralarealizacindecadaexperimentodeldiseo,sepesaron0.5gdelodoyseextrajeron enlascondicionesindicadas(tablaI.5),durante20minutos,aplicandounapotenciade500W.Una vezobtenidoslosextractos,secentrifugaron,yelsobrenadantesediluya30mLconeldisolvente correspondiente, para posteriormente proceder a la etapa de limpieza, concentracin y derivatizacin, figura I.6. Los extractos, una vez derivatizados fueron analizados mediante GC MS/MS.Lascondicionesdeextraccin,ascomolosresultadosobtenidos(readepico)paracada compuesto,semuestranenlatablaI.5. Tabla I.5. Condiciones de extraccin y respuestas (reas de pico) obtenidas en el diseo factorial fraccionaltipo241.
Exp.N 1 2 3 4 5 6 7 8 Agitacin S No No S S No No S T(C) 130 130 130 130 90 90 90 90 Disolvente Acetona Metanol Acetona Metanol Metanol Metanol Acetona Acetona Vol.(mL) 15 15 30 30 15 30 15 30 2,4DCF 37421 69878 36347 66412 61843 63386 39997 41794 2,4,6TCF 66061 101959 58759 87226 87689 85721 75163 55060 TCS 66334 59088 101671 41164 64864 68419 64774 101807

Una vez introducidos estos resultados en el programa estadstico (Statgraphics 5.1), se calcularonlosvaloresdelosefectosprincipalesasociadosacadafactorestudiado(tablaI.6). TablaI.6.Efectosprincipalesasociadosacadafactorparaeldiseofactorialfraccionaldescritoenla tablaI.5.
Factor Disolvente Volumen(mL) Temperatura(C) Agitacin Nivelbajo Acetona 15 90 No Nivelalto Metanol 30 130 S 2,4DCF 528 16 50 43 2,4,6TCF 164 40 60 27 TCS 1164 285 192 36

201

Lodosdedepuradoraysedimentos

Acontinuacin,seoptporeliminaraquelfactorquepresentabaunefectomenorqueel resto,obtenindoseassuficientesgradosdelibertadparacalcularlasignificacinestadsticadelos efectosrestantes(tablaI.7). Tabla I.7. Efectos principales normalizados asociados a cada factor tras eliminar aquellos factores menossignificativos.
Factor Disolvente Volumen(mL) Temperatura(C) Agitacin
a

Nivelbajo Acetona 15 90 No

Nivelalto Metanol 30 130 S

2,4DCF 32.4a 3.1 2.6

2,4,6TCF 6.0 1.5 2.2

TCS 32.3a 7.9 5.3

Factorestadsticamentesignificativoaunniveldeconfianzade95%

El tipo de disolvente es el factor que ejerce una mayor influencia en la eficacia de extraccin. Para el TCS y el 2,4,6TCF, la acetona permiti obtener respuestas significativamente mejores(principalmenteenelcasodelTCS)queelmetanol,mientrasqueparaelmspolardelos tres analitos, el 2,4DCF, la utilizacin de metanol fue ms favorable. Con respecto al volumen, el triclosn requiere volmenes elevados de disolvente a diferencia de los clorofenoles, aunque su comportamientonoquedaclaro.Latemperaturadeextraccinjugunpapelimportanteaunqueno significativo en la recuperacin de los compuestos, ejerciendo una influencia positiva en el rendimientodelaextraccin.Porltimo,laagitacinnopresentunpapelimportanteparaninguno de ellos. En base a estos resultados, se fij la temperatura en 130C, mientras que se opt por prescindirdelaagitacindelamuestradentrodelosvasosdelextractordemicroondas. 1.4.2. Optimizacin del volumen de extractante, proporcin metanol:acetona y modificadororgnico Con el primer diseo de experimentos no se obtuvieron conclusiones claras sobre la influenciadeciertosfactoresenlaeficaciadeextraccin.Enunsegundodiseo,seestudiaroncon ms detalle, el efecto del volumen de extractante y la composicin del mismo (mezclas metanol:acetona), junto con un tercer factor, el cido frmico, utilizado como modificador del disolvente de extraccin. La adicin del cido frmico hace que el pH del medio sea cido, favoreciendolaextraccindeloscompuestoscongruposcidos,comolosclorofenolesyeltriclosn, sobretodoenaquelloslodosquehansidoestabilizadosconcarbonatoclcico. Losfactoresvolumendedisolvente(1530mL),porcentajedemetanolenacetona(2575%) yvolumendecidofrmico(0300L)fueronestudiadosmedianteundiseofactoriala2niveles

202

MAEaplicadaalaextraccindeTCSyclorofenolesenlodoysedimento

con un punto central. La muestra empleada para la realizacin del diseo fue la misma que en el casoanterior.Losresultadosobtenidos(reasdepico)semuestranacontinuacin,tablaI.8. TablaI.8.Condicionesexperimentalesyresultadosobtenidosenelsegundodiseoexperimental.
Exp.N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Volumen(mL) 22.5 15 30 15 15 30 30 30 15 %metanolen acetona 50 75 75 25 25 75 25 25 75 Ac.frmico (L) 150 0 0 300 0 300 0 300 300 2,4DCF 46570 40444 37057 42770 43960 44293 37874 34702 46265 2,4,6TCF 64963 47689 53742 57122 54972 62250 63901 71845 52802 TCS 40929 35256 50249 60909 42991 61198 73214 75032 33562

EnlacartaParetoobtenida,figuraI.7,sepuedeobservarqueelvolumendedisolventeyel porcentaje de metanol son estadsticamente significativos para TCS y 2,4,6TCF. Para ambos compuestos, un incremento en el volumen de extractante y una disminucin de su polaridad (reduccindelporcentajedemetanol)conllevanunamejoraenlaeficaciadeextraccin.Enelcaso del2,4DCFningnfactorfueestadsticamentesignificativo. FiguraI.7.CartaParetoobtenidaparael2,4DCF,2,4,6TCFyTCS.
Volumen %MeOH Ac.Frmico

TCS 2,4,6TCF 2,4DCF 4 3 2 1 0 1 2 3 4 5

Efectosestandarizados

203

Lodosdedepuradoraysedimentos

El cido frmico, aunque no alcanz el nivel de significacin estadstica (95 % confianza) paraningunodelosanalitos,afectpositivamentealaextraccin.Elmayorefectoseobservparael compuestoquepresentaunmenorpKa,el2,4,6triclorofenol,justificandolaadicindelmodificador paralaobtencindemejoresrecuperacionesdeloscompuestospresentesenlamatrizslida. Lassuperficiesderespuestaestimadascidofrmicofrenteaporcentajedemetanolparael triclosnyel2,4DCF,conunvolumende30mLdedisolvente,sepresentanenlafiguraI.8.Enellas seobservaclaramenteuncomportamientoopuestoenfuncindelapolaridaddelamezcla.El2,4 DCFesmspolarqueel2,4,6TCFyelTCS,extrayndosemsfcilmenteconporcentajeselevados demetanol,mientrasqueTCSprefieremezclasdeextraccinconunmayorcontenidoenacetona. Se opt por una solucin de compromiso seleccionando una mezcla 1:1 de metanol:acetona para realizarlaextraccin. FiguraI.8.Superficiesderespuestaestimadasparael2,4DCFyTCS,considerandounvolumende30 mLdedisolvente.
2,4DCF Volumen30mL

(X1000) 45 43 41 39 37 35 25
reasdepico reas2,4DCF

35

45 55 MeOH (%)

65

75

100

200

300 c.Frmico (L)

TCS
Volumen30mL

(X1000) 82 77 72 67 62 57 52
reasdepico reasTCS

25

35

45 55 MeOH (%)

65

75

100

200

300

c.Frmico (L)

204

MAEaplicadaalaextraccindeTCSyclorofenolesenlodoysedimento

En base a los resultados obtenidos con ambos diseos, las condiciones de extraccin seleccionadashansidolasquesemuestranenlatablaI.9. Tabla I.9. Condiciones de extraccin (MAE) para TCS, 2,4DCF y 2,4,6TCF en muestras de lodo de depuradoraysedimento.
Potencia(W) Masamuestra(g) Temperatura(C) Tiempo(min) 500 0.51 130 20 Volumen(mL) 30 Disolvente Metanol:acetona(1:1)con300L cidofrmico

1.5.Caracterizacindelmtodoanaltico 1.5.1.Caracterizacindelmtododedeterminacin(GCMS/MS):linealidad,repetibilidad yLOQs LacaracterizacindelmtododeGCMS/MS,comotcnicadedeteccin,fuellevadaacabo utilizando patrones mezcla de los tres compuestos preparados en acetato de etilo a distintas concentraciones. Los patrones se derivatizaron en las mismas condiciones descritas para los extractosdemuestrasacuosasobtenidasmedianteSPE(500Ldeextractoy20LdeMTBSTFAa temperaturaambientedurante5minutos). Elrangolinealseevaludesde1hasta1500ng/mL,inyectandolosanalitosa6nivelesde distinta concentracin en triplicado, y la repetibilidad de inyeccin fue estudiada realizando cinco inyeccionesconsecutivasdedospatronesde5y250ng/mL(tablaI.10). TablaI.10.Linealidad,precisinyLOQsdelmtododedeterminacin,GCMS/MS.
Linealidad(R2) Repetibilidad (%RSD,n=5) 5ng/mL 250ng/mL 2,4DCF 0.998 4.2 4.1 0.2 2,4,6TCF 0.996 4.4 3.6 0.2 TCS 0.999 8.3 5.3 0.2

LOQ(ng/mL)

Los coeficientes de determinacin obtenidos oscilaron entre 0.996 y 0.999. En todos los casos,loscoeficientesdevariacinfueroninferioresal8%.Porltimo,loslmitesdecuantificacin 205

Lodosdedepuradoraysedimentos

instrumentales,hansidode0.2ng/mL(figuraI.9),10vecesinferioresalosobtenidoscondeteccin porGCMS(tablaIII.6,captuloIII). FiguraI.9.Patrnde1ng/mLconlascorrespondientesrelacionesS/Npara2,4DCF,2,4,6TCFyTCS.

Cts 200 150 100 50 0 15.4 15.6 15.8
Cts 125 100 75 50 25 0 22.50 22.75 23.00 23.25 23.50 23.75 minutos

m/z183 2,4DCF

S/N:185 S:185 N:1

Cts 150 100 50

m/z217 2,4,6TCF

S/N:165 S:165 N:1

16.0

minutos

16.75 17.00 17.25 17.50 17.75 minutos

S/N:129 S:129 N:1 m/z310+200 TCS

1.5.2.Exactitud,precisinylmitesdecuantificacindelmtodoanaltico La exactitud, precisin y lmites de cuantificacin del mtodo analtico propuesto fueron evaluadosconcuatromatrices:lodoprimario,lodosecundario,lodotratadoconcarbonatoclcico (lodo estabilizado) y sedimento de ro. Todas estas muestras fueron liofilizadas previamente y caracterizadas en cuanto a su contenido de carbono. En general, los lodos presentaron niveles de carbono orgnico (TOC) delorden de3638 %, mientrasque en sedimentos de ro se encontraron prximosal1%. Paraevaluarlaexactituddelmtododepreparacindemuestra,sepreparunasuspensin de cada muestra con un patrn de concentracin conocida de los analitos en acetona, realizando una mezcla 1:1 (1 mL de patrn por cada gramo de muestra) entre ambos. La mezcla se dej evaporar,teniendoespecialcuidadodenocalentarniexponeralaluz.Unavezseca,secerryse dej envejecer a temperatura ambiente durante varios das. Las concentraciones adicionadas dependierondelamatrizestudiada.Paralasmuestrasdelodolaadicindelosclorofenolesfuede 300ng/g,mientrasqueparaeltriclosnfuede5g/g,dadoqueestoscompuestosseencontraron enellodoaniveleselevados.Paraelcasodelossedimentos,laconcentracinadicionadafuede300 206

MAEaplicadaalaextraccindeTCSyclorofenolesenlodoysedimento

ng/g. Con objeto de evaluar la exactitud del mtodo a concentraciones inferiores, se prepararon otrasmuestrasconnivelesdeadicindelordende40ng/gparalosclorofenolesy900ng/gparael triclosn en lodo estabilizado qumicamente, y de 10 ng/g en una muestra de sedimento de ro conteniendoslotrazasdetriclosn. Paracadaunadelasmatricesconsideradasseprocesaronfraccionesconysinadicindelos analitos.Lasrecuperacionessecalcularoncomoloscocientesentreladiferenciadeconcentraciones parafraccionesconadicinysinadicin,ylaconcentracinaadidaacadamuestra,tablaI.11.Enel casodelsedimento,eltamaodemuestraconsideradofuede1genlugarde0.5gparamejorarlos LOQsenestamatriz.Esprecisodestacartambinquelosextractosdelodoestabilizado,obtenidos sinaadircidofrmicoalamezcladeextraccin,nopresentaronsealesparaningunodelostres analitosconsiderados. TablaI.11.Recuperacionesobtenidas(%)paramuestrasdelodoysedimentoconadicin(N=4).
Muestra Sedimentoro Sedimentoro Lodoprimario Lodosecundario Lodoestabilizado Lodoestabilizado
a b

%TOC 0.8 0.8 38 36 11 11

Nivelaadido (ng/g) 10 300 a 300 a 300 a 300 b 40

RecuperacionesRSD(%) 2,4DCF 81.85.7 79.18.2 79.18.2 78.38.1 106.67.5 82.99.2 2,4,6TCF 96.04.9 92.08.9 98.93.2 87.65.1 88.35.0 97.413.0 TCS 98.78.5 99.76.5 81.76.5 94.06.5 82.211.5 97.310.5

5g/gparaTCS 0.9g/gparaTCS

Talcomosepuedecomprobar,engenerallasrecuperacionesobtenidasfueronsuperiores al80%,condesviacionesestndarpordebajodel13%. Ademsdeutilizarmuestrasconadicinparaevaluarlaexactituddelmtododesarrollado, secompararonlosresultadosobtenidosparamuestrassinadicinprocesadasusandoSoxhlet,para unamuestradelodoprimarioyotradelodobiolgico.LaextraccinSoxhletsellevacabodurante 24horascon100mLdeunamezclademetanol:acetona(1:1).Elextractoobtenidofueconcentrado a 30 mL, y se procedi a la limpieza mediante LLE con hexano, posterior concentracin de la fase acuosa, y purificacin del extracto final. Los resultados obtenidos fueron similares con ambas metodologas,figuraI.10. 207

Lodosdedepuradoraysedimentos

FiguraI.10.ComparacindeSoxhletconMAEparaladeterminacindeTCS,2,4DCFy2,4,6TCFen lodoprimarioybiolgico.
Lodoprimario 3500 3000 2500 ng/g 2000 1500 1000 500 0 2,4DCF MAE 2,4,6TCF Soxhlet TCS
150 100 50 0 2,4DCF 2,4,6TCF

6000 5000 4000 ng/g 3000 2000 1000 0 2,4DCF

400 300 200 100 0

Lodobiolgico

2,4DCF

2,4,6TCF

2,4,6TCF MAE Soxhlet

TCS

LoslmitesdecuantificacindelmtodopropuestocondeteccinmedianteGCMS/MS,se calcularonteniendoencuentalosLOQsinstrumentales,lamasademuestra(1gparasedimento,0.5 gparalodo)yelvolumendelextractofinal(2mL).Losblancosdeprocesonomostraronproblemas decontaminacin.EnbaseaestainformacinseestimaronunosLOQsde0.8ng/gy0.4ng/gpara lodoysedimento,respectivamente.EnlafiguraI.11semuestrauncromatogramadeunamuestraa nivelesprximosaloslmitesdecuantificacin. FiguraI.11.CromatogramasyespectrosdeMS/MSparaunamuestradesedimentoconadicinde loscompuestosestudiadosanivelde10ng/g.

kCts 1.50 1.00 0.50 0.00 14.5 kCts 1.25 0.75 0.25 kCts
100% 100% 75% 50% 25% 0% 125 125 147 150 175 201 217 200 225m/z 183

2,4DCF

15.0

15.5
100% 75% 50% 25% 0%

16.0
217

16.5

min

2,4,6TCF

159 150

183 175 200

235 225 249 267 250 m/z

16.0
200 75% 50% 25% 185 0% 219 200 225 250

16.5

17.0

17.5

18.0

18.5

min

1.5 1.0 0.5 0.0

310 303 275 300 332 325 m/z

TCS

22.0

22.5

23.0

23.5

24.0

min

208

MAEaplicadaalaextraccindeTCSyclorofenolesenlodoysedimento

La utilizacin de GCMS/MS no solamente permite aumentar la selectividad, sino que tambinpermiteobtenerLOQsdiezvecesmsbajosqueGCMS,dadoaqueaslaelinprecursoren la trampa para proceder a su posterior fragmentacin. Esto permiti, en el caso del triclosn, discriminarlasealdelanalito(345+347)delainterferenciadem/z327(figuraI.2).Engeneral,los lmitessonmejoresquelosencontradosenlabibliografa.Porotraparte,unadelaslimitacionesde esta metodologa con respecto a otras descritas en la bibliografa, ha sido la imposibilidad de recuperar el metiltriclosn, puesto que este se pierde en la etapa de LLE con nhexano [Singer H; 2002][McAvoyDC;2002]. 1.6.Aplicacinalanlisisdemuestrasreales Lametodologadesarrolladaseaplicalanlisisdevariasmuestrasdelodo,desedimentos de ro y marino. En todos los casos, las muestras fueron liofilizadas y homogeneizadas, almacenndolasposteriormenteatemperaturaambientepreviamenteasuanlisis. Seprocesaron 0.5 g de muestra para lodo y 1 g para sedimento, realizando en todos los casos la extraccin por triplicado.LasconcentracionesobtenidassemuestranenlatablaI.12. Tabla I.12. Concentraciones de los analitos (ng/g) en sedimentos de ro, marino y lodos de depuradora.
Cdigo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Tipomuestra Sedimentoro Sedimentoro Sedimentoro Sedimentomarino Lodoprimario Lodobiolgico Lodoestabilizado Lodo Lodo ConcentracinSD(ng/g) 2,4DCF nd nd nd nd 79.98.5 31633 77.98.5 74.41.0 55.23.3 2,4,6TCF nd nd nd nd 19.40.3 38.19.2 15.82.4 7.51.0 14.50.5 TCS 4.40.8 nd 35.71.1 nd 254350 5400125 1508196 1474240 41838

nd:pordebajodelosLOQ

Dentro de las muestras analizadas se detect triclosn en la mayora de las mismas, a concentraciones superiores a 1 g/g para cuatro de los cinco lodos estudiados. En el caso de los clorofenoles,lasconcentracionesestuvieronpordebajodelosLOQsdelmtodoenlossedimentos, mientrasqueenloslodoslasconcentracionesfueronentre10y100vecesinferioresalasmedidas para triclosn. Los resultados son comparables a los descritos en la bibliografa, y la distribucin 209

Lodosdedepuradoraysedimentos

existenteenellodopuedeexplicarseenbasealaspropiedadesdeloscompuestos,puestoqueapH 7,losclorofenolespresentanunasolubilidadentre3.2y3.9g/L,mientrasqueeltriclosntieneuna solubilidad de 0.005 g/L. Adems, ste ltimo presenta niveles en agua superiores a los dos clorofenoles(tablaIV.1,captuloIII). En el caso de los lodos de depuradora, las muestras codificadas como 5, 6 y 7 se correspondena muestraspuntualestomadas en la misma plantade tratamientodeagua residual. Las mayoresconcentraciones de loscompuestos estudiados correspondieron a la muestra de lodo biolgico,seguidodelprimario.Ellodoestabilizado,elcualprocededeunamezcladelodoprimario ybiolgicotratadoconcarbonatoclcico,esutilizadoenlaagriculturacomofertilizante.Losniveles deloscompuestosestudiados,aunqueinferioresquelosdetectadosenloslodosdepartida,sonlo suficientemente considerables (sobre todo en el caso del triclosn) como para representar una contribucin importante a su introduccin en el medio ambiente, de modo que es necesario el controldeestosresiduosslidosutilizadosparausosagrcolas.Porotrolado,laincineracindeestos lodos debe considerarse tambin con suma precaucin ya que el triclosn podra derivar en la formacindedibenzodioxinas[KanetoshiA;1987]. Envistaalosdatospresentadosenlatablaanterior,resultaevidentequelosbalancesde eliminacin de triclosn, realizados nica y exclusivamente en base a determinaciones en las corrientesdeentradaysalida(influenteyefluente,respectivamente)delasestacionesdepuradoras, resultanerrneos,yaqueunafraccinimportantedeestecompuestoesadsorbidaenloslodos.

210

CAPTULOV

TCSyParabenesenmuestrasdepolvo

I.DETERMINACINCONJUNTADETRICLOSNYPARABENESENMUESTRASDEPOLVO 1.1.Introduccin El estudio de la presencia de compuestos orgnicos en atmsferas interiores ha experimentadounaugeimportantedurantelosltimosaos.Estemedioconstituyeunafuentede exposicin del ser humano (vas respiratorias y drmicas) a un nmero creciente de compuestos qumicosusadosenmaterialesdeconstruccin,muebles,electrodomsticosyequiposelectrnicos, ascomoenaerosolesyproductosdecuidadopersonal.Enelcasodeltriclosnylosparabenes,la informacinrelativaasupresenciaenatmsferasinterioresesprcticamenteinexistente.Sloseha encontrado una referencia en la que, junto con otros compuestos orgnicos, se estudiaron los nivelesdeMeP,EtPyBuPenmuestrasdeaireypolvotomadasenatmsferasinteriores[RudelRA; 2003]. En este trabajo, el aire se pas a travs de un polmero XAD2, que posteriormente fue extradocondiclorometano(150mL).Lasmuestrasdepolvoseobtuvierondebolsasdeaspiradora, analizandolafraccinconuntamaodepartculainferiora150m.Paralaextraccindediversos compuestosfenlicos,entreelloslosparabenes,serealizunataquecidodelasmuestrasdepolvo conunamezcla1:1decidosulfrico:agua,traslocualseprocedialaextraccinslidolquidoen triplicadocondiclorometano.Tantolosextractosdeairecomolosdepolvo,seconcentrarona1mL ysederivatizaronconBSTFAa60C,durante60minutosparaseranalizadosmedianteGCMS.Los nivelesdeparabenesencontradosfueroninferioresa21ng/m3 paraairey8g/gparapolvo.Enel caso del triclosn, no se ha encontrado ninguna referencia relacionada con su determinacin en atmsferasinteriores. Dentro de las actividades realizadas en esta Tesis Doctoral se ha considerado relevante evaluar los niveles de TCS y parabenes (MeP, EtP, PrP y BuP) en atmsferas interiores usando muestrasdepolvo,procedentesdeaspiradoresdomsticos,comomatrizpararealizarelestudio.El trabajo realizado se ha centrado en el desarrollo de dos metodologas de preparacin de muestra diferentes (combinando las etapas de extraccin y purificacin) para a continuacin proceder a la sililacin de los analitos y su posterior determinacin mediante GCMS/MS, en las condiciones optimizadasenloscaptulospreviosparamuestrasdeaguasylodos. Lastcnicasdepreparacindemuestraconsideradashansidolaextraccinpresurizadacon disolventes(PLE)yladispersindelamatrizenfaseslida(MSPD).Laprimerapresentaunelevado grado de automatizacin permitiendo procesar, sin necesidad de un usuario dedicado, un nmero considerabledemuestras.DentrodelasaplicacionesdePLEparalaextraccindenuestrosanalitos, slosehanencontradoreferenciascentradasenladeterminacindetriclosnenmuestrasdelodo de depuradora y sedimento (tabla I.1). Por su parte, MSPD es una tcnica que no requiere la adquisicin de instrumentacin especfica y, adems, precisa volmenes de disolventes 213

Atmsferasinteriores

relativamente bajos. Aunque su eficacia como tcnica de preparacin para alimentos y muestras biolgicas ha sido evaluada de forma extensa [Barker SA; 2007] sus aplicaciones a otras matrices slidas,porejemplosuelosymuestrasdepolvo,sonmuchomslimitadas[GarcaLpezM;2008]. TablaI.1.ResumendelasaplicacionesdePLEparalaextraccindeTCS.
Analitosymatriz Procedimiento
PLE:5gdepescado+hidromatrixenceldade22mL. Ciclohexano:DCM(1:1)aTAmb,1500psi,3ciclosde 13 9min.Adicionar C12PCB30,yhacerGPC.Purificar con800mgdeslicaactivadacon5%deagua, eluyendocon10mLdeHexano:AcOEt(10:1). Concentrara50200L. PLE:10gdeliofilizado+2ghidromatrix,enceldade 22mL.DCM,100C,1500psi,1ciclode5min. Evaporara5mLypurificacincon1gdeslica, eluyendoconacetonaymetanol.Llevarasequedady reconstituirconfasemvil. PLE:1gliofilizado.DCM,100C,1500psi,3ciclosde 5min.Purificacincon2gdeslicayelucincon2 mLdeDCM,evaporandoasequedad.Derivatizarcon diazometano.Eliminacindedisolvente,reconstituir conAcOEt. PLE:0.10.2gdeliofilizado,dispersarcon3gde hidromatrix,DCMa60Cy1500psi,3ciclosde5 min.PurificarconOasisHLB500mg,lavandocon hexano,DCMyagua,eluirconMeOH:Acetona(1:1). ConcentrarasequedadyreconstituirconMeOH. PLE:0.5gliofilizado+materialinerteenceldasde33 mL.ExtraccinconAcOEta130C,2ciclosde45min. Evaporara1mL,ydiluir1:9contolueno. PLE:2.7gsuelo1glodoliofilizado+arenaen celdasde33mL.ExtraccinconMeOH:agua(1:1)a 60C/1500psicon2ciclosestticosde5min. ConcentraryhacerSPEOasisHLB200mg.

Deteccin

LOD (ng/g)

RSD (%)

Rec. (%)
76 108

Ref.

TCSyMTCSen pescado

GCMS

(1)

TCSybifenilolen sedimentos marinos TCSyMTCSen sedimentosy lodosde depuradora TCSyTCCen lodos TCSyPPCPsen lodosde depuradora TCSyfrmacosen lodosysuelos enriquecidoscon lodos

GCMS LCMS/MS

3.5

100

(2)

GCMS/MS

1.5

95

(3)

LCMS/MS

1.5

98

(4)

GCMS

31

70 130

(5)

LCMS/MS

20

3.0 4.6

100

(6)

(1)BalmerME,2004;(2)AgeraA,2003;(3)SingerH,2002;(4)ChuS,2007;(5)LigonAP,2008;(6)BarronL,2008.

PLE presenta la ventaja de poder controlar la selectividad de la extraccin rellenando la celdacondistintosadsorbentesenvezdematerialesinertes[CanosaP;2007A].Ladisposicindel adsorbente puede tener mltiples propsitos. Colocado en la parte inferior de la celda, inmediatamentedespusdelamuestra,tienelafinalidadderetenerlasinterferenciascoextradaso destruirlas [Bjrklund E; 2006]. A modo de ejemplo, la utilizacin de adsorbentes de fase normal qumicamente modificados, como la slice cida en combinacin con disolventes apolares como hexano,permiteobtenerextractoslibresdegrasasenelanlisisdealimentos.

214

TCSyParabenesenmuestrasdepolvo

Homogeneizarlamuestra,previamenteasuempaquetamientoenlaceldadelequipo,con unadsorbenteenfasenormaloreversatambinpermitemejorarlaselectividaddelaextraccin[de laCalA;2003][GmezArizaJL;2002]. Con respectoa la tcnica de dispersin de la matriz en fase slida (MSPD) sus principales virtudessonlasencillez,rapidez,selectividadybajocoste.Laadecuadacombinacindeadsorbentes y disolventes permite obtener extractos libres de impurezas. Su aplicacin en matrices medioambientales no es la ms habitual, aunque los resultados hasta ahora obtenidos son tan buenoscomolosproporcionadosporPLEoMAE[GarcaLpezM;2008]. 1.2.Condicionesexperimentalesdemedida Como se ha comentado en el apartado anterior, GCMS/MS ha sido la tcnica de determinacin utilizada para cuantificar los niveles de triclosn y parabenes en muestras de polvo trassusililacin.Lascondicionesdetrabajoempleadasserecopilanenlasiguientetabla(tablaI.2). Tabla I.2. Parmetros de determinacin para triclosn, metilparaben, etilparaben, propilparaben y butilparaben.
MeP EtP PrP BuP TCS
1

Tr (min)1 17.05 17.83 18.91 19.91 23.13

Tr (min)2 17.38 18.15 19.20 20.24 23.38

2

Inprecursor (m/z) 209 223 237 251 347

Nivelde almacenamiento(m/z) 92 98 104 110 140

3

Amplitudde excitacin(V) 0.5 0.5 0.5 0.5 1.5

Ionesproducto (m/z)3 195,177,149 195,177,163,151 195,163,151 195,151 200,310,219

ColumnaHP5MS

ColumnaCPSil8LowBleed

Ionesutilizadosparalacuantificacin

Adems, en algunas ocasiones se ha utilizado GCMS como tcnica de deteccin, principalmentepararegistrarelperfildecorrienteinicatotalqueproducenlosextractosobtenidos, evaluandoassucomplejidadbajodiferentescondicionesdeextraccin.

215

Atmsferasinteriores

1.3.Extraccincondisolventespresurizados La matriz empleada para evaluar la presencia de triclosn y parabenes en atmsferas interiores correspondi al contenido de las bolsas de aspiradores domsticos. Con objeto de incrementarlahomogeneidaddelamatriz,elcontenidodelasbolsasfuetamizadoylafraccinpor debajodelas60mempleadaenesteestudio. Paraoptimizarlosfactoresqueafectanalaeficaciadelosprocesosdeextraccinycleanup sehautilizadounpooldedosmatrices(1:1)concontenidosdecarbonoorgnicode24.7y25.6%. UnavezverificadalaexistenciadenivelesconsiderablesdeTCS,MePyPrPenlamuestracompuesta, se procediasu fortificacin conEtPy BuP, a nivel de300ng/g. Paraello se aadi1 mL deuna disolucin patrn de EtP y BuP de 300 ng/mL en acetona por cada gramo de polvo. Tras la evaporacin del disolvente, la muestra se dej envejecer durante varios das a temperatura ambiente. 1.3.1.Estrategiadepurificacin La eficacia dela purificacinonline (en la celda de extraccin) de los extractos de PLE se evalu considerando cuatro adsobentes diferentes, tres en fase normal (Florisil 60100 mesh, almina150meshyslica230400mesh),previamenteactivadosa130Cdurante24horas,yunode fasereversa(C1870230mesh).Entodosloscasos,0.5gdemuestrasehomogeneizaroncon1gde sulfato sdico anhidro y 2.5 g del adsorbente considerado en un mortero de vidrio. Una vez se obtuvounamezclahomognea,seintrodujoenlaceldadelextractordePLE,conteniendo,deabajo aarriba,dosfiltrosdecelulosa,1gdesulfatosdicoanhidroy1.5gdelmismoadsorbenteutilizado enladispersin.Laceldaserellenconsulfatosdicoysecompact,colocandounfiltrodecelulosa enlapartesuperior.Cabedestacarque,paraelcasodelaalmina,debidoasumayordensidad,la masautilizadafueeldoblequeparalosotrosadsorbentes. Las condiciones de trabajo en estas etapas iniciales fueron seleccionadas teniendo en cuenta aplicaciones de PLE al anlisis de sedimentos. La extraccin se llev a cabo con acetato de etilo, a 130C considerando un ciclo de 10 minutos a 2000 psi (13.8 MPa). El volumen de lavado (flush) y el tiempo de purga con nitrgeno de la celda fueron de 100 % y de 60 segundos, respectivamente.Unavezobtenidoslosextractos,seconcentrarona5mL,yunaalcuotade500L se derivatiz con 40L deMTBSTFA a 70C durante60 minutos. El perfil de corriente inica total (TIC)obtenidoconcadaadsorbentesemuestraenlasiguientefigura(figuraI.1). 216

PLEaplicadaalaextraccindeTCSyParabenesenmuestrasdepolvo

FiguraI.1.CromatogramasdeGCMS(TIC)obtenidosparafraccionesdeunamismamuestradepolvo enfuncindeltipodeadsorbente.
MCts 10.0 A:Arena B:C18 C:Slica D:Almina E:Florisil

7.5

5.0

2.5 B 0.0 15.0 17.5 20.0 22.5 E D C

25.0 minutos

Comoseobservaenlafiguraanterior,laslicayelC18proporcionaroncromatogramasmuy complejos,similaresalosobtenidosconarena.ParaFlorisilyalminaseobservunmenornmero deinterferenciascoextradas,indicandoqueestasfueronretenidasenmayorextensinporestos adsorbentes. Al inyectar estos extractos en GCMS/MS, se obtuvieron respuestas ligeramente superiorescuandoseusaFlorisilcomodispersantedelamuestraycoadsorbenteenelfondodela celda, tabla I.3. En base a estos resultados, se seleccion el Florisil como agente dispersante para experimentosposteriores. TablaI.3.reasdepicoenlosextractosdePLE.
Florisil Almina MeP 5126 2953 EtP 2238 1711 PrP 2357 1743 BuP 4764 4590 TCS 6441 4938

Paraincrementarlaselectividaddelmtodo,seplantelaposibilidadderealizarunaetapa delavado,previaalprocesodeextraccin,conobjetodeeliminarcompuestosapolaresnoretenidos por el Florisil y que contribuyen a incrementar la complejidad del extracto. Esta estrategia fue descritaporPapagiannopoulos[PapagiannopoulosM;2002]enladeterminacindepolifenolesen plantasyalimentos,realizandounlavadodelaceldadeextraccinconpentanoa60C,seguidadela extraccindelosanalitosconacetonaencondicionesmsenrgicas. Para este estudio, se seleccionaron dos disolventes de caractersticas apolares: hexano y

217

Atmsferasinteriores

diclorometano. La etapa de lavado se realiz en condiciones suaves de temperatura, presin y tiempo(40C,1ciclode1minutodeextraccinestticaa500psi),conunvolumendeflushde50% y un tiempo de purga de 1 minuto. Cada muestra fue extrada con cuatro ciclos consecutivos de lavado en las condiciones fijadas, recogiendo las fracciones en distintos viales colectores. A continuacin,seextrajoconacetatodeetiloparaponerdemanifiestolapresenciadelosparabenes en la matriz. Todos los extractos (fracciones de lavado y extracto en acetato de etilo) fueron evaporadosasequedadbajocorrientedenitrgenoyreconstituidoscon2mLdeacetatodeetilo, procediendoasuderivatizacineinyeccinenGCMS/MS,figuraI.2. Figura I.2. Distribucin de los analitos entre las fracciones de lavado (Fr 1Fr 4) y el extracto en acetatodeetilo(Fr5).
120% 100% Searelativa 80% 60% 40% 20% 0% Fr1 Fr2 Fr3 Hexano Fr4 Fr5 Fr1 Fr2 Fr3 DCM Fr4 Fr5 MeP EtP PrP BuP TCS

Lautilizacindenhexanonoprovocprdidasdelosanalitosenlasfraccionesdelavado, recuperndose en la ltima fraccin de acetato de etilo. Por su parte, el uso de diclorometano ocasion la aparicin de seal de los compuestos en las fracciones sucesivas de lavado, principalmente del TCS. Este comportamiento es coherente con la bibliografa existente para la extraccin de triclosn en matrices slidas mediante PLE, ya que algunos autores utilizan diclorometanocomodisolventedeelucin[AgeraA;2003].Enbaseaestosresultados,elhexano se seleccion como disolvente de limpieza de la celda de PLE, previamente a la extraccin de los compuestosdeinters. Para la optimizacin de las condiciones de limpieza con hexano, en lo referente a temperatura (40120 C), tiempo (110 minutos) y nmero de ciclos (15), se utiliz un diseo factorialadosnivelesconunpuntocentral.Traslaetapadelavado,deacuerdoconlascondiciones descritas en cada uno de los experimentos del diseo, las celdas fueron extradas con acetato de etiloenlascondicionespropuestas(1ciclode10minutosa130Cy2000psi,flushde100%ypurga de 1 minuto). Estos extractos (acetato de etilo), una vez concentrados y derivatizados, fueron inyectadosenelsistemaGCMS/MS.Elobjetivodeesteestudiofueseleccionarlascondicionesde lavado ms enrgicas que no impliquen prdidas de los analitos. La carta Pareto con los efectos 218

PLEaplicadaalaextraccindeTCSyParabenesenmuestrasdepolvo

principalesestandarizadossemuestraenlafiguraI.3. FiguraI.3.CartaParetoparaeldiseodelavadoconhexano.
Tiempo(min) Temperatura(C) Ciclos TCS BuP PrP EtP MeP 5 4 3 2 1 0 1

Efectoestandarizado

Comosepuedecomprobar,latemperaturahasidolavariablemsrelevante.Elvalordesu efecto estandarizado es superior a la lnea que describe el nivel de significacin, con un 95 % de confianza,paratodoslosanalitos.Puestoquesuinfluenciaesnegativa,aaltastemperaturasparte de los compuestos son coeludos con las interferencias apolares en el hexano. Experimentos adicionales realizados a 80C y 120C, en los valores intermedios para el nmero de ciclos y el tiempodeextraccin,pusierondemanifiestolapresenciadetriclosn,aunquenodelosparabenes, enlafraccindelavado,inclusomanteniendolaceldaa80C,figuraI.4. Figura I.4. Fracciones de hexano eludas a 80C y 120C en 3 ciclos de 6 minutos. Seal correspondientealTCS.
kCts 6 5 4 3 2 1 0 Cts 70 50 30 10 23.00 23.25 23.50 23.75 minutos

120C

100% 75% 50% 25% 0%

200 310 170 150 200 250 312 300 350 400 m/z

80C
100% 75% 50% 25% 0%

200 329 310 328 300 350 400 m/z

164 150 200

267 250

219

Atmsferasinteriores

Enbaseaestosresultados,latemperaturadelaceldaenlaetapadelavadosemantuvoa 40C para evitar posibles prdidas de TCS. El tiempo y el nmero de ciclos, correspondientes a la etapadelavado,sefijaronen4minutosy1ciclo,respectivamente,yaqueelusodetiemposms largos o un nmero mayor de ciclos, aunque no provoc prdidas de los analitos, tampoco contribuyareducirelniveldeinterferencias. La comparacin de los cromatogramas de GCMS (TIC) obtenidos para los extractos de muestras de polvo con y sin limpieza previa de la celda con hexano, mostraron una mejora considerableenelperfildelcromatogramaobtenido,talcomosepuedeapreciarenlafiguraI.5. FiguraI.5.CromatogramasdeGCMSparaunamuestradepolvo(extractoenacetatodeetilo)cony sinetapadelavado.
MCts 3.0

Sinetapadelavado

2.5

2.0

Lavadopreviocon hexano

1.5

1.0

0.5

0.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 minutos

1.3.2.Optimizacindelascondicionesdeextraccin Unavezverificadalaposibilidaddeintegrarunaetapadelimpiezaonline,consistenteenla utilizacindeunadsorbenteenfasenormal(Florisil)enlaceldadeextraccinylaintroduccinde una etapa de lavado previa a la elucin de los analitos, se procedi a la optimizacin de las condicionesdeextraccin. 1.3.2.1.Disolventedeextraccin El primer factor estudiado fue el tipo de disolvente empleado para la extraccin de los compuestos.Enfuncindesuscaractersticasfsicoqumicas,seseleccionarontresdisolventescon polaridad creciente que adems fuesen compatibles con la etapa posterior de sililacin:

220

PLEaplicadaalaextraccindeTCSyParabenesenmuestrasdepolvo

diclorometano,acetatodeetiloyacetonitrilo.Paralarealizacindelosexperimentos,lasceldasse rellenaron siguiendo el protocolo descrito anteriormente. Tras una primera etapa de lavado con hexanoa40C,seextrajeroncondiclorometano,acetatodeetilooacetonitrilo,empleandounsolo cicloa130Cy2000psidurante10minutos.Losextractos,concentradosasequedadpararealizarel cambiodedisolvente,fueronreconstituidoscon2mLdeacetatodeetilo,derivatizandounaalcuota de500Lcon40LdeMTBSTFAduranteunahoraa70C.Losresultadosobtenidossemuestranen lafiguraI.6. Figura I.6. Eficacia de extraccin para diclorometano, acetato de etilo y acetonitrilo (N=3). Respuestasnormalizadasfrenteaacetatodeetilo.
DCM
180% 160% 140% 120% 100% 80% 60% 40% 20% 0% MeP EtP PrP BuP TCS

AcOEt

ACN

Como se observa en la figura I.6, el diclorometano fue el disolvente que present menor afinidadporloscompuestos.Paraacetatodeetiloyacetonitrilo,laeficaciadeextraccinesfuncin de las caractersticas de los analitos. Los ms polares, MeP, EtP y PrP (Log Kow 1.9, 2.4 y 2.9, respectivamente) mostraron una mayor afinidad por el acetonitrilo (ms polar que el acetato de etilo),mientrasqueelBuPyTCS(LogKow3.5y4.8)seextrajeronenmayorextensinconacetatode etilo. Dado que el acetato de etilo es ms fcil de concentrar mediante evaporacin que el acetonitrilo,seseleccionfinalmentecomodisolventedeextraccin. 1.3.2.2.Temperatura,tiempoymasadecoadsorbente Una vez establecido el disolvente de elucin, los valores correspondientes a temperatura, tiempo de extraccin, as como masa de Florisil situado en la parte inferior en la celda como adsorbenteparalaretencindeinterferenciaspolares,hansidooptimizadossimultneamentecon un diseo experimental central compuesto (CCD) tipo 23 con 6 puntos estrella situados a una distancia axial de =1.68. El nmero de puntos centrales fue de nueve para tener un diseo

Respuestanormalizada

221

Atmsferasinteriores

ortogonal y rotable. Los valores extremos para los factores temperatura, tiempo y masa de co adsorbenteexploradoseneldiseofueron70180C,119minutosy02g,respectivamente. EntodoslosexperimentoslamasatotaldeFlorisilenlaceldadeextraccin,considerandola cantidaddedispersantemslacantidadusadacomocoadsorbente,semantuvoen4g.Lapresin detrabajosefijen2000psi(13.8MPa),suficienteparamantenereldisolventeenestadolquido dentrodelacelda,mientrasqueelnmerodeciclos,elvolumendeflushylapurgadenitrgenose fijaronen1,100%y60segundos,respectivamente. Una vez realizadas las 23 extracciones, en las condiciones descritas en la tabla I.4, se analizaronlosextractosmedianteGCMS/MS,obteniendolossiguientesresultados. Tabla I.4. Condiciones de extraccin y resultados (reas de pico) obtenidos para el diseo experimentalcentralcompuesto.
Exp Temp(C) Tiempo(min) Coadsorbente(g) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 92 125 158 125 70 125 125 125 92 125 125 92 92 158 180 125 125 158 125 125 15.3 10 4.7 1 10 10 10 10 15.3 19 10 4.7 4.7 4.7 10 10 10 15.3 10 10 1.6 2 0.4 1 1 1 1 1 0.4 1 1 0.4 1.6 1.6 1 1 1 1.6 1 1 MeP EtP PrP BuP TCS 135929 44689 73782 33193 164254 129934 38969 70240 33717 137929 176215 52679 77508 33810 90158

164910 54029 88373 39284 152992 113152 39899 70569 37291 205416 159437 47251 78291 38697 162794 185439 59740 83262 40810 135083 192999 58385 84221 32803 139148 167593 53735 85501 40040 153719 156991 46300 70614 33317 165208 183301 51979 82352 35751 198693 153562 49683 75254 31909 174008 157553 52723 85592 38393 206420 164083 45740 65334 29771 112129 160886 43501 59774 23372 69899

173145 49024 78073 32584 177100 195747 60773 88360 36530 160151 198822 53355 71459 30289 112555 207497 64448 89157 39469 195846 191656 57142 78794 34479 160582

222

PLEaplicadaalaextraccindeTCSyParabenesenmuestrasdepolvo Exp Temp(C) Tiempo(min) Coadsorbente(g) 21 22 23 158 125 125 15.3 10 10 0.4 0 1 MeP EtP PrP BuP TCS 78863 96820

207336 56411 83128 34314 149781 42424 67458 30554

149015 47545 80104 36700 143942

Una vez tratados los datos anteriores con el programa estadstico Statgraphics Centurin XV.I, se obtuvieron los efectos principales, los trminos cuadrticos y las interacciones entre dos factoresquesemuestranenlatablaI.5. Tabla I.5. Valores normalizados para los efectos principales, los trminos cuadrticos y las interaccionesdeordendoscorrespondientesaldiseotipoCCD.
A:Temperatura(C) B:Tiempo(min) C:Coadsorbente(g) AA AB AC BB BC CC
a

MeP 2.92a 0.66 1.10 2.02 1.39 0.19 0.38 0.52 1.83

EtP 0.62 0.19 0.91 1.91 0.92 0.15 0.11 0.39 2.14

PrP 1.68 0.78 0.90

a 2.97

BuP 3.23a 0.45 0.26 2.33a 0.11 0.77 0.28 1.40 1.53

TCS 7.29a 0.69

a 2.30

1.84 0.97 0.31 0.32 0.09

a 3.29

0.88 1.17 0.21 1.13 2.14

Factoresestadsticamentesignificativosaunniveldeconfianzade95%.

La variable tiempo no afect en gran medida a la eficacia del proceso de extraccin. La temperatura jug un papel ms importante, siendo estadsticamente significativa para el MeP, el BuPyTCS.Paralosdosltimos,elrendimientodelaextraccindisminuyatemperaturaselevadas, mientras que para el MeP se observ el efecto contrario. Por otra parte, el trmino cuadrtico asociado con la temperatura tambin result significativo para PrP y BuP, lo que sugiere que la variacin en la eficacia de extraccin no sigue un modelo lineal dentro del dominio experimental considerado para esta variable. Dado que la viscosidad de los lquidos disminuye al aumentar la temperatura, cabe esperar que la solubilidad de los analitos en el disolvente de extraccin, y por tantolaeficaciadesta,aumenteconlatemperatura,sinembargo,paraalgunoscompuestosseha descritouncomportamientoopuesto,coincidenteconelobservadoenestetrabajoparaBuPyTCS [Petrovic M; 2002][ConchaGraa E; 2004][Rodil R; 2006]. Prdidas por evaporacin de los compuestoscuandoelextractocalienteestransferidodesdelaceldadeextraccinalvialcolector y/odegradacintrmicadelosanalitosenlaceldadePLEpodranexplicarlareduccinenlaeficacia 223

Atmsferasinteriores

deextraccinalaumentarlatemperaturadelacelda.Enestecasoconcreto,paraelBuPyparael TCS,lasprdidasporevaporacinnopuedenjustificarestadisminucin,puestoquesonlosmenos voltiles de los cinco compuestos estudiados. Con respecto a la masa de coadsorbente, slo fue estadsticamente significativa para el triclosn, al igual que el trmino cuadrtico asociado a la misma.Porltimo,lasinteraccionesentrefactoresnoalcanzaronelniveldesignificacinestadstica (95%deconfianza)paraningunodelosanalitosconsiderados. Puesto que las condiciones ptimas de extraccin (sobre todo en lo referente a la temperaturadelacelda)fuerondiferentesparaMePfrentealoscompuestosmsapolares(BuPy TCS) se utiliz una funcin de deseabilidad global para estimar las mejores condiciones de trabajo paraelconjuntodeloscincoanalitosconsiderados.Enprimerlugar,lasrespuestasobtenidaspara cadaanalitoenlosdiferentesexperimentosimplicadoseneldiseotipoCCD,hansidonormalizadas entre 0 y 1. A continuacin, la funcin de deseabilidad global se ha definido en base a su media geomtrica. La representacin de esta funcin frente a la temperatura y masa de coadsorbente, considerandoeltiempodeextraccinenelvalorcentraldeldiseo(10minutos),semuestraenla figuraI.7. Figura I.7. Representacin de la funcin de deseabilidad global temperaturacantidad de co adsorbenteparauntiempodeextraccinde10minutos.
Tiempo10min

0.8 Valornormalizado 0.6 0.4 0.2 0 70 90 110 130 150 170 190 1 2 0
g) te( ben or ads Co

Temperatura(C)

Como se puede observar, el mximo corresponde a una temperatura de 103C y una cantidaddecoadsorbentede1g.Paraelvalorptimodetemperatura,eltiempodeextraccinque proporcionmejoresresultadoscorrespondia1minuto,figuraI.8. 224

PLEaplicadaalaextraccindeTCSyParabenesenmuestrasdepolvo

FiguraI.8.Funcindedeseabilidadglobaltiempomasadecoadsorbenteparaunatemperaturade 103C.
Temperatura103C

1 Valornormalizado

0.5 2 0 1 6 11 16 21 0
C

1
rbe dso o a

) (g nte

Tiempo(min)

En consecuencia, las condiciones finales de extraccin seleccionadas fueron 103C, 1 minutodetiempodeextraccin,1gdeFlorisilcomocoadsorbenteenlaceldadeextraccin,y,por lotanto,3gdelmismomaterialdispersante. 1.3.2.3.Ciclosdeextraccin El nmero de ciclos de extraccin por muestra, definido como el nmero de etapas de extraccinestticaqueseaplicasobreunamismaceldaconunaporcinfrescadedisolvente,fueel ltimoparmetroaoptimizar. Paraevaluarelefectodeestefactor,seextrajeronunaseriedemuestrasconsiderandoun nmero creciente de ciclos (de 1 a 5), en las condiciones ptimas estimadas anteriormente. Tras cada ciclo de extraccin, la celda fue lavada con un volumen de acetato de etilo equivalente al volumen total de flush (100 % del volumen de la celda) dividido entre el nmero de ciclos. Los extractosobtenidos,usandounnmerocrecientedeciclos,seetiquetaroncomofraccin1.Despus del ltimo ciclo de extraccin las celdas fueron purgadas y despresurizadas. A continuacin, se volvieronaextraeraplicandounnicociclode1minuto,recogiendoelextractoenunsegundovial etiquetadocomofraccin2.Ambasfraccionesfueronconcentradasa2mLy,unavezderivatizadas, analizadasmedianteGCMS/MS.EnlafiguraI.9,serepresentalasrespuestasrelativas(readepico para la segunda fraccin frente a la suma de las respuestas para ambas) para cada compuesto en funcindelnmerodeciclosimplicadosenlaprimeraextraccin.

225

Atmsferasinteriores

FiguraI.9.Respuestarelativaobtenidaenlareextraccindelasmuestrasfrentealnmerodeciclos consideradosenlaprimeraextraccin,103C,13.8MPay1minuto(N=2).
Sealrelativaparala2extraccin (%) 12% 10% 8% 6% 4% 2% 0% 1 2 3 4 Ndeciclosenlaprimeraextraccin 5 MeP EtP PrP BuP TCS

Cuandoseaplicaron3msciclos,lasealrelativaparalassegundasfraccionesfueinferior al5%deltotalparatodosloscompuestos.Adems,noseobservunareduccinmuysignificativa enlarespuestaobtenidaparalasegundafraccin,considerandounnmeromayordeciclosenla primera,portanto,sunmeroselimitatres. 1.3.3.Optimizacindelascondicionesdederivatizacin Las condiciones de derivatizacin utilizadas hasta ahora fueron las consideradas para la sililacindelosextractosdeaguaresidual.Dadalamayorcomplejidaddelosextractosdepolvose consideroportunoreoptimizarlascondicionesdederivatizacin. Paralarealizacindeesteestudio,seempleunamezcladeextractosobtenidosmediante PLEparafraccionesdeunamuestradepolvoconadicindeEtPyBuPanivelde300ng/g.Alcuotas de0.5mLdelpooldeextractossederivatizaronendiferentescondicionesdetemperatura,volumen deMTBSTFAytiempo.DenuevoseutilizundiseoexperimentalfactorialdeltipoCCD,ortogonaly rotable,paraestudiareldominioexperimentaldetrabajodeformaexhaustiva,tablaI.6.Elanlisis delasrespuestasobtenidascondujoalosefectosprincipalesquesemuestranenlatablaI.6. 226

PLEaplicadaalaextraccindeTCSyParabenesenmuestrasdepolvo

TablaI.6.Dominioexperimentalyefectosprincipalesestandarizadosparavolumendederivatizante, tiempoytemperaturaparaeldiseotipoCCD.
Factores A:Vol.(L) B:Tiempo(min) C:Temp.(C) Dominioexperimental 1.68 20 4 20 1 36 13 30 0 60 33 45 +1 84 50 60 +1.68 100 62 70 MeP 0.92 0.77 0.99 Efectosestandarizados EtP 0.39 0.94 1.37 PrP 0.31 1.64 0.77 BuP 0.72 0.73 0.97 TCS 1.15 0.21 0.24

Ningunodelosfactoresresultserestadsticamentesignificativoaunniveldeconfianzade 95%.Detodosmodos,laeleccindelascondicionesdetrabajosehizoenbasealafuncinglobal dedeseabilidadobtenidaparaloscincocompuestos,figuraI.10.Considerandounvolumenmnimo dederivatizante(20L),lasuperficiederespuestaparalafuncindedeseabilidadglobalpermiti visualizar los valores ptimos de temperatura y tiempo. Las condiciones de derivatizacin seleccionadasfueron20LdeMTBSTFA,65Cy5minutos. Figura I.10. Superficie de respuesta para la funcin de deseabilidad global correspondiente a la derivatizacindeextractosdepolvo.
VolumendeMTBSTFA20L

1 Valornormalizado

0.5 70

0 4.4 24.4 Tiempo(min) 44.4 64.4 20 30

40

Tem

C) ra( atu per

50

60

1.3.4.Caracterizacindelmtodoanaltico

Una vez fijadas las condiciones de preparacin de muestra (figura I.11), se procedi a la caracterizacin analtica del mtodo desarrollado, usando GCMS/MS como tcnica de determinacin.

227

Atmsferasinteriores

Figura I.11. Condiciones ptimas de extraccin (PLE) y derivatizacin para la determinacin de parabenesytriclosnenmuestrasdepolvo.
PreparacindelaceldadeASE(11mL):
0.5gde muestra dispersadacon 3gdeFlorisil y 1gNa2SO4 1gFlorisil Filtro decelulosa Rellenar conNa2SO4 1gofNa2SO4 Dosfiltros decelulosa

Limpieza: nhexanoa40C y500psi (3.4MPa),1ciclo de4min,50%flush y1 min depurga

Extraccin: acetatode etiloa103C y2000psi (13.8MPa),3ciclosde1 min,100%flush y1min depurga

Residuo

Concentrara2mL

Derivatizar 0.5mL con20L de MTBSTFAa65C durante5min

1.3.4.1.Caracterizacindelmtododedeterminacin(GCMS/MS):linealidad,repetibilidad yLOQs El rango de respuesta lineal del equipo (GCMS/MS) fue evaluado con una serie de 10 patrones,preparadosenacetatodeetilo,enunintervalodeconcentracionescomprendidoentre2 ng/mLy1.5g/mL. Para el clculo de los lmites de cuantificacin del sistema cromatogrfico se inyectaron patrones de concentraciones comprendidas entre 0.1 y 1 ng/mL, obteniendo las relaciones seal ruido de los picos correspondientes a cada analito. A concentraciones prximas a los LOQs e intermedias en el rango de calibrado, se estim la variabilidad de la respuesta del equipo. Los resultadosreferentesalosparmetrosquecaracterizanelsistemaGCMS/MSutilizado,semuestran enlatablaI.7.

228

PLEaplicadaalaextraccindeTCSyParabenesenmuestrasdepolvo

TablaI.7.Linealidad,repetibilidadyLOQsdelequipoGCMS/MSempleadoenesteestudio.Columna CPSil8LowBleed.
Linealidad R2 8ng/mL 500ng/mL MeP 0.998 9.9 6.5 0.4 EtP 0.994 6.8 4.8 0.5 PrP 0.996 4.0 3.4 0.6 BuP 0.996 4.1 4.3 0.6 TCS 0.997 3.8 3.5 0.3

Repetibilidad (%RSD,n=5)

LOQ(ng/mL)a
a

ColumnaCPSil8LowBleed

1.3.4.2.Exactitud,precisinylmitesdecuantificacindelmtodoanaltico La precisin intrada (repetibilidad) e interda (reproducibilidad) del procedimiento propuestofueestudiadaconunamuestradepolvo,sinadicin,enlaquesedetectlapresenciade todos los analitos. Para el estudio de repetibilidad se llev a cabo la extraccin de la muestra por cuadruplicado dentro de un mismo da, mientras que para evaluar la reproducibilidad, la misma muestra fue extrada por triplicado cuatro das consecutivos. Los resultados, expresados como coeficientesdevariacin,mostraronvaloresinferioresal8%y11%respectivamente,tablaI.8. Tabla I.8. Repetibilidad (N=4), reproducibilidad (N=12), recuperacin (N=4) y LOQs del mtodo analticopropuesto.
Analito MeP EtP PrP BuP TCS Repetibilidad (%RSD,n=4) 5.0 5.8 4.7 8.4 6.6 Reproducibilidad (%RSD,n=12) 6.1 10.6 9.7 10.3 8.6 RecuperacinSD Muestra1 (TOC18%) 985 856 867 934 925 Muestra2 (TOC20%) 948 886 8410 7613 9310 LOQ (ng/g) 1.6 2.2 2.9 3.6 1.2

La exactitud del mtodo propuesto fue evaluada con dos muestras de polvo, una procedente de un edificio pblico (TOC 18 %) y otro de una vivienda particular (TOC 20 %). Cada muestrafuedivididaendosfracciones.Unadeellasfueenriquecidacon500ng/gdelosanalitos.La 229

Atmsferasinteriores

recuperacinsecalculcomoladiferenciadevaloresobtenidosparalasfraccionesconadicinysin adicin, dividida por la concentracin aadida, tabla I.8. En general, las recuperaciones obtenidas paraambasmuestraspresentaronvaloressuperioresal85%,convariacionesinferioresal13%,por loquesepuedeafirmarqueelmtodopermiteextraerlosanalitoscuantitativamente. Porltimo,loslmitesdecuantificacindelmtodoanalticoseestimaronconsiderandolos blancos del proceso, as como los lmites de cuantificacin proporcionados por el equipo de GC MS/MS.Teniendoencuentaquenosehadetectadolapresenciadeloscompuestosenlosblancosy lacantidaddemuestradepartidafuede0.5g,losLOQsfueroninferioresa4ng/g.EnlafiguraI.12 semuestrauncromatogramareferentealamuestranmero1(tablaI.8)conysinadicin,ascomo elblancodelproceso. Figura I.12. Cromatogramas (m/z 177+151+195+200+310) de GCMS/MS para la muestra 1 (tabla I.8)con(naranaja)ysinadicin(verde),ascomounblancodeproceso(azul).
kCts 70 60 50 TCS 40 30 20 10 0 17 18 19 20 21 22 23 minutos EtP PrP BuP MeP

230

MSPDaplicadaalaextraccindeTCSyParabenesenmuestrasdepolvo

1.4.Extraccinmediantedispersindelamatrizenfaseslida AdicionalmenteaPLE,seevaluaronlasposibilidadesqueofreceladispersindelamatrizen faseslida(MSPD)paralaextraccinconjuntadeparabenes(MeP,EtP,PrPyBuP)yTCSenmuestras de polvo. Esta tcnica presenta un bajo coste, una gran sencillez y una considerable selectividad derivadadelaposibilidaddeintegrar,aligualqueenelcasodePLE,etapasdepurificacinenlnea con el proceso de extraccin, adems de emplear condiciones mucho ms suaves (temperatura ambienteypresinatmosfrica)quePLE.Enestecaptulosedescribelaoptimizacinsistemticadel procesodeMSPD,conelobjetodemaximizarlaselectividadyeficaciadelapreparacindemuestra. ComotcnicadedeterminacinsehausadodenuevoGCMS/MSy,enalgunoscasos,GCMS. 1.4.1.Optimizacindelascondicionesdeextraccin LosfactoresqueafectanalaeficaciadeextraccinenMSPDfueronoptimizadosmediante el empleo de diseos experimentales factoriales, as como usando estudios univariantes para determinados factores. La eleccin de C18 como agente dispersante fue un parmetro fijado de antemano,yaqueeseladsorbenteempleadoenlamayoradelasaplicacionesdeMSPD[BarkerSA; 2007]. 1.4.1.1.Eleccindelcoadsorbente Como primer paso en la optimizacin de las condiciones de extraccin se estudi la influencia de diferentes coadsorbentes en el perfil cromatogrfico obtenido en GCMS para extractosdemuestrasdepolvo.LosmaterialesestudiadosfueronelFlorisil(60100mesh),almina (150mesh),C18(70230mesh)yslica(230400mesh).Losadsorbentesenfasenormalseactivaron a 130C durante 48horas, eliminando as las molculasde agua que pueden estar retenidas en la superficiedesuspartculas.Entodosloscasosseemplearon2gdecoadsorbentesituadosbajo0.5 gdemuestra(polvotamizadoa60myfortificadoconlosanalitosanivelde100ng/g)previamente dispersadaenunmorteroconsulfatosdicoanhidroy2gdeC18,figuraI.13. FiguraI.13.DisposicindelamuestraenelcartuchodeMSPD.
0.5gdemuestra dispersada con2g deC18y0.5gde Na2SO4 2gdecoadsorbente

Fritasde polietileno

231

Atmsferasinteriores

Laelucindelosanalitosserealizcon20mLdeacetatodeetilo.Unavezconcentradoa1 mL,sefiltrparaevitarlapresenciadepartculasenelextractofinal.Unaalcuotadelfiltrado(500 L)fuederivatizadaconMTBSTFAeinyectadaenGCMS. Figura I.14. reas de pico y perfiles cromatogrficos para extractos de una muestra de polvo en funcindelcoadsorbente(N=3).
Florisil
3.E+05

C18

Almina
MCts

Slica

2.E+05

30 25

2.E+05 reas

20 15 10

1.E+05

5.E+04

5
0.E+00 MeP EtP PrP BuP TCS

0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5min

Como se puede comprobar, figura I.14, la seal de los compuestos es prcticamente idntica en todos los experimentos con excepcin de MeP y TCS, utilizando la almina como co adsorbente. Los cromatogramas de GCMS presentan menor complejidad para Florisil y almina, frente al C18 y slica, por lo que finalmente se continu trabajando slo con los dos primeros materialescomocoadsorbentes. 1.4.1.2.Disolventedeelucin La eficacia de extraccin se evalu considerando cuatro disolventes con polaridades crecientes (hexano, diclorometano, acetato de etilo y acetonitrilo) usando Florisil y almina como coadsorbentes.Aligualqueenelapartadoanterior,lamuestrafuedispersadapreviamentecon2g de C18. El volumen de disolvente se fij en 20 mL. Con objeto de evitar cambios aparentes en la eficacia del proceso de preparacin de muestra, derivados de variaciones en el rendimiento de la

232

MSPDaplicadaalaextraccindeTCSyParabenesenmuestrasdepolvo

sililacin para extractos en diferentes disolventes, todos los extractos fueron concentrados a sequedadyreconstituidoscon1mLdeacetatodeetilopreviamentealaadicindelagentesililante. Los resultados obtenidos, como reas de pico, se muestran en la figura I.15 para cada disolventeycoadsorbente. FiguraI.15.reasdepicoenfuncindelcoadsorbenteyeldisolventedeelucinutilizadoenMSPD (N=3).
Hexano 450000 400000 350000 300000 250000 200000 150000 100000 50000 0 MeP EtP PrP Florisil BuP TCS MeP EtP PrP Almina BuP TCS DCM Acetatodeetilo Acetonitrilo

Engeneral,losresultadosrepresentadosenlafiguraI.15siguenlamismatendenciaquelos observados para PLE. Por un lado, hexano y diclorometano no fueron capaces de recuperar los analitos.Porotro,enacuerdoconlainformacinpresentadaenlatablaI.3ylafiguraI.14,laalmina resultmsretentivaqueelFlorisil,porloqueseprefirielprimermaterialcomocoadsorbenteen elcartuchodeMSPD.AunqueparaFlorisilseobtuvieronmayoresrespuestasusandoacetonitriloque conacetatodeetilo,laeleccindeldisolventedeelucinsereservparaetapasposteriores. Nihexanonidiclorometanopermitieronrecuperarlosanalitosdelamatriz,sinembargolos cromatogramas obtenidos presentaronuna gran complejidad, especialmente para los extractos en diclorometano. Por ello, se consider la posibilidad de realizar un lavado previo del cartucho con diclorometano, para a continuacin proceder a la elucin de los compuestos usando acetonitrilo. Planteadaestaestrategia,sepreparuncartuchodeMSPDdispersando0.5gdemuestracon0.5g de sulfato sdico anhidro y 2 g de C18, con 2 g de Florisil como coadsorbente. En una primera fraccin,serecogieron10mLdediclorometanoyacontinuacin,traselsecadodelcartuchoavaco, se recuperaron los analitos con 10 mL de acetonitrilo. Una segunda muestra fue procesada en condicionesidnticasperosinconsiderarlaetapadelavado.Loscromatogramasdecorrienteinica total(TIC),inclusousandoadquisicinenmodoMS/MS,mostraronclaramentelosbeneficiosdela etapadelavado,figurasI.16yI.17.

reasdepico

233

Atmsferasinteriores

Figura I.16. Cromatogramas de GCMS (TIC) para las fracciones de diclorometano y acetonitrilo obtenidasdeunamuestradepolvo.
kCts 800 700 600 500 400 300 200 100 0

Diclorometano

Acetonitrilo

Figura I.17. Cromatogramas de GCMS/MS (TIC) para un patrn en acetonitrilo (A), un extracto de MSPDenacetonitrilosinlimpiezaprevia(B)yunextractodeMSPDenacetonitriloconlavadoprevio delcartuchousandodiclorometano(C).
kCts 150 EtP 100 50 0 17 kCts 800 700 600 500 400 MeP 300 200 100 0 17 18 19 20 21 kCts 300 22 23 MeP PrP EtP BuP 17 18 19 20 21 22 23 minutos minutos PrP BuP TCS MeP

17.5

20.0

22.5

25.0

minutos

B
BuP EtP PrP

250 200 150 TCS 100 50 0

TCS

18

19

20

21

22

23 minutos

1.4.1.3.Optimizacindelamasadedispersante,disolventedeelucinyvolumen La cantidad de dispersante (C18), el tipo de eluyente (acetato de etilo o acetonitrilo) y 234

MSPDaplicadaalaextraccindeTCSyParabenesenmuestrasdepolvo

volumen del mismo fueron optimizados mediante un diseo factorial mixto tipo 3 x 22 con dos puntoscentrales,tablaI.9. TablaI.9.Dominioexperimentaldeldiseofactorial3x22.
Factor Volumeneluyente(mL) MasaC18(g) Eluyente Bajo 5 0.5 Acetatodeetilo Medio 15 Alto 25 2 Acetonitrilo

Los14experimentosdeldiseofueronllevadosacaboconunamezcla1:1dedosmuestras de polvo procedentes de dos viviendas diferentes. Sus contenidos de carbono orgnico fueron de 24.7%y25.6%,respectivamente.DadoquelasconcentracionesnativasdeEtPyBuPenlamuestra compuesta eran muy bajas, sta se fortific con ambos compuestos a nivel de 300 ng/g. A continuacinsedejenvejeceratemperaturaambienteunperiodode10dasantesdeprocedera suextraccin. Los cartuchos de MSPD se prepararon usando 2 g de Florisil como coadsorbente, dispersando0.5gdelpoolanteriorcon0.5gdesulfatosdicoanhidroylacantidaddeC18descrita encadaexperimento.Trasellavadodeloscartuchoscon10mLdediclorometano,seeluyeroncon el volumen indicado de acetonitrilo o acetato de etilo. Todos los extractos, incluidos los de diclorometano,fueronconcentradosasequedadyreconstituidoscon1mLdeacetatodeetilo.Una vezderivatizados,fueroninyectados,juntoconuncalibradoparasucuantificacin,enelsistemaGC MS/MS. En ninguna de las fracciones de diclorometano, se detect la presencia de los analitos, confirmandoquenoexistenprdidasenlaetapadelavado.Lamatrizdeexperimentos,juntoconlas concentracionesobtenidasparacadaensayo,sepresentaenlatablaI.10. Tabla I.10. Experimentos realizados en el diseo de MSPD (3 x 22) y respuestas (concentracin en ng/g)obtenidasparacadacompuesto.
Exp. 1 2 3 4 5 6 7 8 Vol.(mL) 15 25 15 15 15 15 5 25 C18(g) 1.25 0.5 0.5 2 0.5 2 0.5 2 Eluyente AcN AcN AcOEt AcOEt AcN AcN AcN AcOEt MeP 545.9 504.0 470.8 465.1 629.2 691.5 372.9 395.8 EtP 320.1 288.7 150.6 87.3 392.1 408.1 191.1 105.6 PrP 660.5 613.4 431.1 469.5 748.8 782.4 527.3 388.6 BuP 476.4 387.1 258.0 248.3 525.3 552.4 396.4 226.8 TCS 852.6 867.5 398.7 700.5 992.3 1012.4 1048.1 476.6

235

Atmsferasinteriores Exp. 9 10 11 12 13 14 Vol.(mL) 15 5 5 25 25 5 C18(g) 1.25 2 2 2 0.5 0.5 Eluyente AcOEt AcN AcOEt AcN AcOEt AcOEt MeP 485.4 721.0 25.0 572.2 429.6 473.5 EtP 288.6 458.8 9.1 361.6 127.8 88.9 PrP 471.9 979.8 16.3 796.5 451.6 477.9 BuP 224.9 744.5 8.6 564.4 311.3 252.8 TCS 306.6 928.9 12.2 1108.5 714.6 713.2

UsandoelprogramaestadsticoStatgraphics5.1,seobtuvieronlosefectosestandarizados de cada variable, as como las interacciones entre factores. La carta Pareto para los efectos principales,juntoconelniveldesignificacinaun95%deconfianza(lneavertical),semuestranen lafiguraI.18. FiguraI.18.CartaParetoconlosefectosprincipalesasociadosalosfactoresdeldiseoexperimental.
Volumen TCS BuP PrP EtP MeP 2 0 2 4 6 8 Eluyente Cantidaddispersante

Como se observa en la grfica anterior, el disolvente de elucin fue el nico factor estadsticamente significativo (95 % de confianza). De nuevo se confirm que el acetonitrilo proporcionaba mejores rendimientos que el acetato de etilo. La cantidad de dispersante prcticamente no afect a la eficacia de extraccin, seleccionando finalmente el valor medio del dominioexperimentalparaestavariable,1.25gdeC18. El volumen de eluyente tampoco fue un factor significativo, por lo que, a priori, se podr mantener en el nivel bajo del diseo (5 mL); sin embargo, su valor ptimo se estableci en un estudioposterior,conjuntamenteconlamasadecoadsorbente. 1.4.1.4.Masadecoadsorbenteyvolmenesdedisolventesdelavadoyelucin La masa de Florisil (coadsorbente en la columna de MSPD), as como los volmenes de diclorometanoyacetonitrilofueronestudiadosconjuntamentecomoltimopasoenlaoptimizacin 236

Efectosestandarizados

MSPDaplicadaalaextraccindeTCSyParabenesenmuestrasdepolvo

delascondicionesdeextraccin.Sellevaronacabodosseriesdeexperimentosusando1y2gde Florisil como coadsorbente. En la primera se evalu el volumen mximo de disolvente de lavado, pasando atravs de los cartuchos deMSPD tres fracciones consecutivas de diclorometano(10 mL cadauna)yunaltimade15mLdeacetonitrilo.Enlasegundaserie,seestudielvolumenmnimo deacetonitriloparaeluircuantitativamentelosanalitos.Serecogiunanicafraccinde10mLde diclorometano, y tras el secado de los cartuchos, cuatro fracciones consecutivas de 5 mL de acetonitrilo.Todaslasfraccionesfueronconcentradasasequedadyreconstituidasconacetatode etilo para su posterior anlisis mediante GCMS/MS. Los resultados obtenidos se muestran en la figura I.19, donde se representa seal relativa para cada fraccin frente a la suma de seales de todaslasfraccionesrecogidas. FiguraI.19.Distribucindelosanalitosentrelasfraccionesdediclorometano(A)yacetonitrilo(B), usando1y2gdeFlorisilcomocoadsorbente.Datosparaextraccionesenduplicado.

A
Respuestanormalizada 100% 80% 60% 40% 20% 0% MeP EtP PrP BuP TCS MeP EtP PrP BuP TCS Fr1,10ml DCM Fr2,10ml DCM Fr3,10ml DCM Fr4,15ml ACN

1gFl ori s i l

2gFl ori s i l

Respuestanormalizada

100% 80% 60% 40% 20% 0% MeP EtP PrP BuP TCS MeP EtP PrP BuP TCS

Fr1,10mLDCM Fr2,5ml ACN Fr3,5ml ACN Fr4,5ml ACN Fr5,5ml ACN

1gFl ori s i l

2gFl ori s i l

Elvolumendediclorometanonecesarioparaeluirlasinterferencias,sinquehayaprdidas de los compuestos estudiados, ha sido dependiente del analito y de la masa de coadsorbente. El triclosn, el ms lipoflico de los compuestos estudiados, aparece en la primera fraccin de diclorometanocuandoseutiliz1gdecoadsorbente,mientrasque,usando2gdeFlorisil,fueron 237

Atmsferasinteriores

necesarias dos fracciones de 10 mL de diclorometano para detectar prdidas de este compuesto (figura I.19 A). Para los parabenes, el perfil de elucin fue ms lento que para el triclosn, aprecindose la seal de estos compuestos en la segunda y tercera fraccin de 10 mL de diclorometanopara1gdeFlorisil,mientrasquenohuboprdidassignificativasenlasfraccionesde lavadocuandolacantidaddecoadsorbentefuede2g(figuraI.19A). Conrespectoaldisolventedeelucin,tantoconsiderando1como2gdeFlorisil,fueposible recuperarel95%detodoslosanalitosconunanicafraccinde5mLdeacetonitrilo(figuraI.19B), aunque finalmente se seleccionaron 10 mL para asegurar la recuperacin cuantitativa de los compuestos. En base a estos datos la cantidad de coadsorbente (Florisil) se mantuvo en 2 g, mientras quelosvolmenesdediclorometanoyacetonitrilosefijaronen10mL. 1.4.2.Optimizacindelascondicionesdederivatizacinenacetonitrilo Elacetonitriloresultundisolventeadecuadoparalaextraccindelosanalitosdemuestras depolvo.Paraevitarlaetapadecambiodedisolvente,enelprocesodetratamientodemuestra,se optimizladerivatizacindeloscompuestosenacetonitrilo.Lainfluenciadelatemperatura(2045 70C),elvolumendeagentederivatizante(20100L)yeltiempodederivatizacin(560minutos) fueronestudiadosutilizandoundiseofactorialmixto3x22,condospuntoscentrales.Parallevara cabolosexperimentos,seutilizunpooldeextractosenacetonitrilo,correspondientesamuestras de polvo procesadas mediante MSPD. Los valores estandarizados para los efectos principales correspondientesalasvariablesanterioressemuestranenlatablaI.11,ascomoaquellosfactores quesonestadsticamentesignificativosal95%deconfianza. TablaI.11.Dominioexperimentalyvaloresestandarizadosdelosefectosprincipalesparaeldiseode derivatizacinenacetonitrilo.
Factor Temperatura(C) Tiempo(min) Volumen(L)
a

Dominioexperimental Bajo 20 5 20 Medio 45 Alto 70 60 100 MeP 0.52 0.35 a 2.05 EtP

Efectosprincipales PrP 0.05 0.68 1.54 BuP 0.77 0.90 3.29a TCS 0.24 1.72 7.91a 0.83 1.31 1.03

Factoresestadsticamentesignificativosaunniveldeconfianzade95%

Sloelvolumendederivatizanteresultserunavariableestadsticamentesignificativapara tres de los compuestos estudiados (MeP, BuP y TCS). El signo positivo indica que son necesarios volmeneselevadosdeMTBSTFAparatenerbuenosrendimientosenlaetapadederivatizacin.Las

238

MSPDaplicadaalaextraccindeTCSyParabenesenmuestrasdepolvo

otras dos variables afectaron en menor medida al proceso de derivatizacin y sus efectos no alcanzaron el lmite de significacin estadstica. Sin embargo, el trmino cuadrtico asociado a la temperaturafuerelativamenteimportante,principalmenteenelcasodelMeP.Elgrficodeefectos principales para este analito, figura I.20, revel una importante curvatura en su respuesta con un mximoa45C. FiguraI.20.GrficodeefectosprincipalesparaelMeP.
(X1000) 98 reasMeP 97 96 95 94 93 20.0 60.0 20.0 100.0 70.0 5.0 Temperatura(C) Tiempo(min) Volumen(L) EfectosprincipalesparaelMeP

Enbaseaestosresultados,laderivatizacinsellevacaboa45Ccon100LdeMTBSTFA durante5minutos.Enestascondiciones,seevalulaestabilidadtemporaldeloscompuestoster butildimetilsililados en acetonitrilo, para lo cual se derivatiz un extracto de muestra de polvo, obtenidomedianteMSPDyseinyectendistintosdas,utilizandoelPCB30comopatrninternode inyeccin.Losresultadosobtenidos(sealesrelativasalpatrninterno),serepresentanenlafigura I.21. FiguraI.21.Estabilidadtemporaldelosanalitossililadosenelextractodeunamuestradepolvo.
Da1 1.2 SealrelativaPCB30 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 MeP EtP(reasX2) PrP(reasX2) BuP(reasX2) TCS Da2 Da3 Da6 Da7 Da9

Comosemuestraenlafiguraanterior,loscompuestosderivatizadosenacetonitrilofueron estables,almenosdurante9das,loquepermitesureinyeccinencasonecesario. 239

Atmsferasinteriores

1.4.3.Caracterizacindelmtodoanaltico El mtodo propuesto para la extraccin de parabenes y triclosn en muestras de polvo englobunapreparacindelamuestrasencillabasadaenladispersindelamatrizenfaseslida, con una etapa previa de lavado para eliminar especies poco polares y posterior extraccin de los analitoscon10mLdeacetonitrilo(figuraI.22).Esteextractofueconcentradoa1mLyunafraccin del mismo (0.5 mL) sililado en las condiciones descritas en el apartado anterior. La figura I.22 muestraunesquemadelmtodopropuesto. FiguraI.22.EsquemadeextraccinderivatizacinenMSPD.
0.5gdemuestra dispersada con1.25 gdeC18y0.5gde Na2SO4 2gdeFlorisil

Fritasde polietileno

Lavado: 10mL DCM Residuos

Extraccin: 10mL ACN

Concentrara1mL yfiltrar confiltrosde0.22m

Derivatizar 0.5mL con0.1mL MTBSTFAa45C durante5min

Una vez optimizada la preparacin de las muestras empleando MSPD se procedi a la caracterizacinanalticadelmtododesarrollado. 1.4.3.1.Caracterizacindelmtododedeterminacin(GCMS/MS):linealidad,repetibilidad yLOQs ParaevaluarelrangoderespuestalinealdelsistemaGCMS/MSseprepararonpatronescon concentraciones comprendidas entre 2 y 1500 ng/mL, inyectndolos por triplicado. La representacindelasreasdepicofrenteaconcentracinproporcionrectasconcoeficientesde determinacin (R2) comprendidos entre 0.996 y 0.999. La repetibilidad de inyeccin se evalu

240

MSPDaplicadaalaextraccindeTCSyParabenesenmuestrasdepolvo

mediante inyecciones consecutivas de un patrn de 5 ng/mL. Los coeficientes de variacin para todos los compuestos fueron inferiores al 9 %. Por ltimo, los lmites de cuantificacin del equipo fueron estimados con la inyeccinde patrones de concentraciones en un rango de 0.5 y 5 ng/mL, obteniendo valores inferiores a 1 ng/mL para la mayora de los compuestos. En la tabla I.12 se resumenestosresultados. TablaI.12.Caractersticasdelsistemademedida(GCMS/MS)parapatronessililadosenacetonitrilo. ColumnaHP5MS.
Linealidad (R2) Repetibillidad(% RSD,n=6) LOQ a (ng/mL)
HP5MS
a

MeP 0.999 7.5 0.5

EtP 0.998 3.9 1.3

PrP 0.996 8.5 0.3

BuP 0.996 2.1 0.3

TCS 0.999 6.3 0.7

Enconjunto,estosdatossonequivalentesalospresentadosenlatablaI.7paralosmismos compuestos, empleando tambin GCMS/MS como tcnica de determinacin, a pesar de que se utilizaron dos columnas y dos sistemas de GCMS/MS fsicamente diferentes, el disolvente y las condicionesdederivatizacinfuerondistintos. 1.4.3.2.Exactitud,precisinylmitesdecuantificacindelmtodo Laprecisindelmtodoanalticoseevaluconsiderandolasdesviacionesestndarrelativas correspondientesalaextraccindeunamuestradepolvoenunmismoda(repetibilidad)yendas consecutivos (reproducibilidad). Los resultados obtenidos mostraron coeficientes de variacin, en condicionesderepetibilidadyreproducibilidad,inferioresal13%. Los lmites de cuantificacin del mtodo fueron estimados considerando el factor de concentracinobtenido(0.5gdemuestra,1mLdeextractofinal)ylosLOQsdelsistemaGCMS/MS. Los valores obtenidos oscilaron entre 0.6 y 2.6 ng/g (tabla I.13). De nuevo no se observaron problemasdecontaminacinenlosblancosdelproceso. Paraelestudiodeexactitudsellevaronacabodosseriesdeexperimentos.Enlaprimera,se utilizaron muestras discretas de polvo, con bajos contenidos de los analitos, fortificadas con una concentracin conocida de los compuestos estudiados. Las recuperaciones fueron calculadas

241

Atmsferasinteriores

dividiendoladiferenciadeconcentracionesparamuestrasconysinadicin,entreelvaloraadido. Losresultadosobtenidos,expresadoscomoporcentaje,oscilanentre84%paraelBuPy114%para elMeP.Loscoeficientesdevariacinasociadosfueroninferioresal10%,tablaI.13. TablaI.13.Repetibilidad,reproducibilidad,LOQsyrecuperacionesparalametodologadesarrollada.

Analito MeP EtP PrP BuP TCS
a

Repetibilidad(% RSD,n=4)a 4.7 4.5 3.4 5.3 6.0

Reproducibilidad(% RSD,n=12)a 8.6 4.4 2.8 4.4 13.0

RecuperacinSD LOQ(ng/g) 1.3 2.6 0.6 0.7 1.5 50ng/gPBs 300ng/gTCS 1149 8710 937 844 1086 300ng/gPBs 700ng/gTCS 1023 905 985 844 1025

ParaestosestudioslamuestradepolvofuefortificadaconEtPyBuPanivelde300ng/g

En la segunda serie de experimentos, se compararon los resultados obtenidos para la extraccindefraccionesdeunamismamuestradepolvo,sinadicindeloscompuestos,conMSPD frente a Soxhlet, como mtodo de referencia, y la metodologa de PLE desarrollada en la primera partedeestecaptulo.LaextraccinSoxhletserealizcon75mLdeacetonitrilodurante12horas. Los resultados obtenidos para PLE y Soxhlet, expresados como recuperaciones frente a la concentracin obtenida usando MSPD, se presentan en la tabla I.14. MSPD proporcion valores anlogos a PLE y Soxhlet, siendo la primera tcnica ms sencilla y menos costosa, adems de requerirunmenorconsumodedisolventes. TablaI.14.Recuperacionesrelativas(%)proporcionadasporSoxhletyPLEfrentealmtododeMSPD desarrollado.
Soxhlet PLE MeP 994 1243 EtP 1116 1161 PrP 8911 1034 BuP 1004 1042 TCS 11316 9512

242

DeterminacindeTCSyParabenesenmuestrasdepolvo

1.5.Anlisisdemuestrasreales Empleando las dos metodologas desarrolladas en este captulo se analizaron varias muestrasdepolvoprocedentesdeedificiospblicos(2,3y11)yviviendasparticulares(restantes). LosresultadosobtenidossemuestranenlatablaI.15,juntoconelcontenidodecarbonoorgnico (TOC)dealgunasdeellas. Tabla I.15. Niveles de parabenes y triclosn en muestras de polvo (fraccin inferior a 60 m) procedentesdeviviendasparticularesyedificiospblicos(N=3).
Cdigo TOC(%) Extraccin 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 18 14 19 27 33 30 20 23 34 22 18 20 23 24 25 PLE PLE PLE PLE PLE PLE PLE PLE PLE PLE MSPD MSPD MSPD MSPD MSPD MSPD MSPD MSPD MSPD MSPD Mximo Mnimo Media MeP 40941 11210 24212 49330 13355 164022 13817 87812 1092127 32826 19041 44289 6821 78378 60858 4708 57717 8910 19428 97322 1640 68 553 ConcentracinSD(ng/g) EtP PrP BuP 432 21614 342 173 365 161 5536 2108 434 1083 1765 1341 34616 83675 21328 30413 8349 2456 122 121 nd 52519 72428 17816 1629 76275 7410 463 23520 1063 225 22031 294 6713 39675 518 51 41 11 37012 52926 18811 846 46622 991 232 42915 351 1236 54038 21111 28732 16220 286 484 24827 153 568 105234 1013 553 1052 245 5 4 1 160 404 95 TCS 25150 258 1228223 2444426 66025 110031 56918 1724241 1253107 903 29913 28445 6011 2179175 85336 46523 95774 2399 58468 4449 2444 25 812

nd:pordebajoLOQ

243

Atmsferasinteriores

Entodaslasmuestrasanalizadas,aparecenlosparabenesyeltriclosnconexcepcindela muestra nmero 7, en la cual no se ha podido cuantificar el BuP. Los niveles promedio de los compuestosenlasmuestrasdepolvodecrecenenelordenTCS>MeP>PrP>EtP>BuP,demodoquesu concentracin, al menos en el caso de los parabenes, guarda cierta relacin con los porcentajes relativos de estos compuestos en los productos de cuidado personal. Las muestras 2, 3 y 11 corresponden a edificios pblicos. Las concentraciones de los compuestos estudiados en estas muestrassoninferioresquelosexistentesenviviendasparticulares.LapresenciadeTCSyparabenes en polvo puede estar asociada a derrames de productos cosmticos que los contienen en su formulacin,clulasepitelialesy,enelcasodeltriclosn,difusindesdetextilesyotrassuperficies tratadasconestebactericida.Enalgunasmuestras,elTCSqueseencuentraanivelesprximosalos medidosenloslodos(tablaI.12,captuloIV)ypodrajustificarlapresenciadeestecompuestoen fluidosbiolgicosdehumanosquehandeclaradonousarPPCPsconteniendoTCS[AllmyrM;2006].

244

CAPTULOVI

MSPDaplicadaalaextraccindeTCSyMTCSenpescadoyalimentos

I. DETERMINACIN DE TRICLOSN Y METILTRICLOSN EN MUESTRAS DE MATERIAL BIOLGICO 1.1.Introduccin 1.1.1.Antecedentesbibliogrficos Elusocontinuodetriclosn(TCS)enproductosdecuidadopersonalyotrosmaterialesde usocotidianoprovocasudescargaenelmedioacutico.Lasaguasresidualesascomoloslodosde depuradora, tal como hemos visto en los captulos III y IV, son los principales vectores de introduccindeestecompuestoenelmedioambiente.Eltriclosn,unavezhaalcanzadoelmedio acutico,puedesertransformadoporlosorganismosdandolugaralproductodebiometilacindel mismo,elmetiltriclosn(MTCS)[BalmerME;2004],elcualadiferenciadelTCSnoessusceptiblede eliminarseatravsdeprocesosdefotodegradacin[AranamiK;2007][MezcuaM;2004][Lindstrom A;2002]. TantoTCScomoMTCSpresentanunaelevadalipofilidad(logKow4.8y5.4respectivamente) loquehaceposiblesuacumulacinenmatricesdenaturalezaorgnica.Dehecho,laconcentracin deamboscompuestosenlosslidos(lodosysedimentos)esmuysuperiorqueenelagua[BesterK; 2003]. En algas, se han detectado factores de bioacumulacin de hasta 1000 veces [Coogan MA; 2007].Tambinsehanencontradoamboscompuestosenmsculo[BalmerME;2004y2005],bilis [AdolfssonErici M; 2002][Houtman CJ; 2004] y plasma de pescado [Valters K; 2005][Alaee M; 2003],demodoqueelriesgodeentradadeambasespeciesenlacadenatrficaesconsiderable.La rapidez con la que se produce la bioacumulacin de TCS y MTCS se ha puesto de manifiesto en experimentosconcaracolesdeaguadulce,expuestosdurantedossemanasaaguadeunlagocon concentracionesmediasdeTCSyMTCSde100ng/Ly41ng/L,respectivamente.Laconcentracinde TCSenestosorganismosaumentdiezveces,mientrasqueelfactordebioacumulacinfuede50 vecesparaelMTCS[CooganMA;2008]. Porotrolado,laincorporacindelTCScomoagentebactericidaenpolmerosyproductos de cuidado personal (por ejemplo, pasta de dientes, jabones,) se ha convertido en una de los principalesvasdeexposicinhumanaaestecompuesto.LaformulacinconocidacomoMicroban es aadida a diferentes superficies tales como tableros de corte, films protectores, utensilios y encimeras de cocina e incluso suelos en industrias dedicadas al procesado de alimentos [http://www.silestone.com][http://www.microban.com], para proporcionarle propiedades antibacterianas.Dadoquelosalimentosestnencontactoconestassuperficies,esfactiblequese produzca la migracin del aditivo (TCS) a los alimentos, principalmente a aquellos con altos contenidosenmateriagrasa[MoretroT;2006][SnchesSilvaA;2005][ChungD;2003]. 247

Materialbiolgico

EnestecaptulodelaTesisDoctoralsedescribelaoptimizacinunprocedimientoparala extraccindeTCSyMTCSenpescadoyenalimentosgrasos,aplicableasudeterminacinenpeces, yvlidatambinparaestudiarlaposiblemigracindelTCSdesdelassuperficiestratadasconeste bactericidaalosalimentosencontactoconlasmismas. Con respecto a las metodologas descritas en la bibliografa para el anlisis de TCS en muestrasbiolgicas,todasellaspresentanunaelevadacomplejidaddebidoaladificultadinherente de la matriz. La presencia de macromolculas y grasas en las muestras hace necesario aplicar tcnicas de purificacin, que no siempre estn al alcance de todos los laboratorios o que simplementesonpocosostenibles.Denuevo,lacromatografadepermeacinengel(GPC)hasido utilizada por diferentes autores para purificar extractos con contenidos en grasas relativamente elevados [Valters K; 2005][Balmer ME; 2004]. Otras tcnicas menos complejas, se basan en la mineralizacin (oxidacin) de las grasas con cido sulfrico adicionado directamente al extracto [AdolfssonEriciM;2002],oimpregnadosobrepartculasdeslica[ValtersK;2005].Enningunade estasaplicaciones,laetapadecleanupsehanintegradoenelprocesodeextraccindandolugara mtodoscomplejos,largosyportanto,propensosaerrores,tablaI.1. Tabla I.1. Metodologas de preparacin de muestra para la determinacin de triclosn y metiltriclosnenmatricesbiolgicasyalimentos.
Analitosy matriz
MTCSyfiltros solaresen grasade pescado MTCSyfiltros solaresen msculode pescado PBDEsy derivados, TCSyMTCS enplasmade pescado

Procedimiento
LLEde1025gdegrasacon100mLdeaguaultrapura,2 mLdeoxalatopotsicoal35%,100mLetanol,50mL dietiltery70mLdepentano.RecogerFOyrealizarGPC (BiobeadsSX8),eluirconciclohexano:AcOEt1:1,a5 mL/min.Evaporara1mL,limpiezacon5gdeslica. Mezclar20gdemsculodepescadoconNa2SO4.Extraer conDCM:Hexano(1:1).PurificarusandoGPC(BiobeadsS X3),eluirconDCM:ciclohexano(35:65),a3mL/min. Evaporara1mL,limpiezacon5gdeslica. Desnaturalizar4gdeplasmacon1mLHCl6My3mL isopropanol.LLE3x3mLdeMTBE:Hexano(1:1).Recoger FOyaadirNaOH50%enMeOH.SeparacindeFA(TCSy OHBDEs)yFO(BDEs,MeOBDEyMTCS).AcidificarFAy reextraeramedioorgnico.SecarconNa2SO4y derivatizarcondiazometanoypurificarcon8gdeFlorisil. LaFOsepurificacon5gdeslicaconteniendo22%de H2SO4,eluyendo50mLdeDCM:Hexano(1:1).Concentrar ambasfraccionesa0.1mL.

Deteccin

LOD (ng/g)

RSD (%)

Rec. (%)

Ref.

GCMS

(1)

GCMS

(2)

GCMS

>85

(3)

248

MSPDaplicadaalaextraccindeTCSyMTCSenpescadoyalimentos

Analitosymatriz

Procedimiento
Mezclar25gdemuestracon100gdeNa2SO4y150 13 mLdeDCM:hexano(1:1).Aadir C12PCB77como surrogado.Trasvasaracolumnadevidrio,eluircon 200mLdemezcla.Concentrarparadeterminar residuolipdicoyrealizarGPC(Phenomenex EnviroSepABCGuard).Eluirlosanalitoscon DCM:Hexano(35:65)a3mL/min. PLEde5gdemuestramezcladocon10gde hidromatrix.Ciclohexano:DCM(1:1)aTAmb.y1500 13 psien3ciclosde9min.Adicinde C12PCB77yGPC (PhenomenexEnviroSepABCGuard)utilizando DCM:Hexano(35:65)a3mL/min.Purificarlos extractoscon0.8gdeslica(5%deagua). Desnaturalizar4gdeplasmacon1mLHCl6Ny3mL isopropanol.LLEcon3X3mLdeMTBE:Hexano(1:1). RecogerFOypurificarconFlorisil.LaFAsebasifica conKOH1MenMeOH50%yseextraecon MTBE:Hexano(1:1)traslaacidificacin.RecogerFO, secarconNa2SO4yderivatizarcondiazometano. PurificarconslicaH2SO422%. Tratar1gdebilisconglucoronidasaysulfatasa. RealizarlaLLEcon2X2mLdeDCM.Purificarpor GPC. Hidrolizar0.2gdebiliscon20Ldeglucuronidasa en1mLdetampnaceticoapH5.Incubar2horasy aadir2mLdeaguayrealizarLLEcon2X3mLde Hexano:MTBE(2:1).EvaporarlasFOasequedady reconstituirconAcOEt. LLEde10mLdelechecon10mLdecidofrmicoy2 X2mLdehexano.ConcentrarasequedadlaFO. Reconstituircon2mLdehexanoyrealizarLLEcon2 mLdeKOH0.5Men50%EtOHy2X3mLdehexano. Aadir1mLdeHCl1MyLLEcon2X3mLde Hexano:MTBE(9:1).EvaporarlaFOasequedad, redisolveren2mLhexanoyaadirH2SO4.Evaporarla FOyderivatizarconanhdridoactico. Mezclar2gdealgascon35gdeNa2SO4,aadir patronesinternosmarcadosisotpicamente,y realizarextraccinSoxhletdurante6horascon100 mLdeDCM.Evaporara5mLyeliminarlpidos medianteGPC,concentrandoa0.11mL.

Deteccin

LOD (ng/g)

RSD (%)

Rec. (%)

Ref.

MTCSenmsculo depescado

GCMS

76 108

(4)

MTCSenmsculo depescado

GCMS

76 108

(4)

TCSyMTCSen plasmadepescado

GCMS GCECD

(5)

TCSyotros contaminantes estrognicosen bilisdepescado TCSenbilisde pescado

GCMS

(6)

GCMS

(7)

TCSenleche materna

GCMS

(7)

TCS,MTCSyTCC enalgas

LCMSy GCMS

510

11.2

80 107

(8)

249

Materialbiolgico

Analitosy matriz

Procedimiento
13

Deteccin

LOD (ng/g)

RSD (%)

Rec. (%)

Ref.

Hidrolizar35gdemuestra,conteniendo C12TCScomo surrogado,conH2SO49Ma60Cdurante30min.Enfriar yLLEcon6y4mLdehexano:acetona(9:1).Aadir2mL TCSen GCECD KOH0.5MenEtOH50%.AcidificarFAcon1mLHCl2M, 0.009 plasmay GC 95 (9)(10) yextraercon4y2mLdehexano:acetona(9:1).Tratarla 0.018 FOcon4mLdeH2SO413.7Myreextraercon2mLde lechehumana NCI/MS hexano:acetona(9:1).Combinarlasfasesorgnicas, concentraryconvertirenderivados pentafluorbencilados. Zumodenaranja:LLEde10gcon3x10mLdehexano, agitar10minutos.CombinarFOyconcentrara sequedad.Redisolveren10mLdeACN90%. Pollo:Mezclar10g+10mLhexano+2mLACN,agitar TCSen LCUV 83 10minutos.LLEcon2X10mLhexano.Combinary alimentos 25 (11) LCMS 112 concentrarasequedad.ReconstituirconACN90%. varios Queso:LLEde10gcon3X10mLdehexanodurante10 minutos.ConcentrarFOasequedadyaadiralresiduo graso2x10mLdeACN.EvaporarelACNyreconstituir con10mLdeACN90%. Hidrolizarconenzimas0.1mLdeorinaenunmedio TCS, tamponadoenacetatoamnico,incubandotodala clorofenolesy LCMS/MS 6 (12) nochea37C.Diluircon0.8mLdecidofrmicoy centrifugar.RealizarlaSPEconcartuchosdeC18, otrosenorina eluyendoconMeOH:H2O(1:1). (1)BuserHR,2006;(2)BalmerME,2005;(3)ValtersK,2005;(4)BalmerME,2004;(5)AlaeeM,2003;(6)HoutmanCJ,2004; (7)AdolfssonEriciM,2002;(8)CooganMA,2007;(9)AllmyrM,2006A;(10)AllmyrM,2006B;(11)SanchesSilvaA,2005; (12)YeX,2005.

Ennuestrotrabajoseeligiladispersindelamatrizenfaseslida(MSPD)comotcnicade extraccin,incorporandoenlaparteinferiordeloscartuchosdiferentesadsorbentesconobjetode purificarlosextractosprimarios.Deestemodo,seintegrlaextraccinylaetapadecleanupenel mismopaso,siguiendounaestrategiasimilaralaaplicadaamuestrasdepolvo.Losobjetivosbsicos delmtododesarrolladofueron:maximizarlosnivelesdeTCSyMTCSenlosextractosyminimizarel residuolipdicodelosmismos. 1.1.2.Determinacindecontenidograsodelasmuestras.MtodoBligh&Dyer La determinacin del contenido graso de las muestras consideradas en este estudio: msculo de salmn (Salmo salar) y de trucha (Oncorhynchuss mykys), fiambres y quesos, se ha realizado con el denominado mtodo de Bligh & Dyer [Jensen S; 2003][Smedes F; 1996]. En un embudodedecantacin,seintrodujeron2.5gdemuestrajuntocon10mLdemetanoly5mLde cloroformo. Despus de agitar el embudo durante varios minutos, se aadieron otros 5 mL de 250

MSPDaplicadaalaextraccindeTCSyMTCSenpescadoyalimentos

cloroformo y se volvi a agitar otros 2 minutos. Pasado este tiempo, se aadieron 10 mL de agua ultrapura agitando de nuevo la mezcla. Tras la separacin de ambas fases, se recogi la fase orgnicasituadaenlaparteinferiordelembudo.Lafaseacuosasevolviaextraerconunamezcla demetanol:cloroformo(1:9),recogiendonuevamentelafaseorgnicaymezclndolaconlaanterior. El extracto orgnico combinado se concentr a un volumen de, aproximadamente, 0.5 mL y se trasvas a un vial previamente pesado, concentrndolo a sequedad hasta peso constante. La variacinenlamasadelvial correspondealcontenidoengrasadelamuestra.Losporcentajesde grasacorrespondientesatruchaysalmnfrescosyliofilizadossemuestranenlatablaI.2. TablaI.2.Contenidograsodelasmuestrasdepescadoutilizadasparaoptimizarlametodologade extraccindetriclosnymetiltriclosn.
Salmnfresco 17.9% Truchafresca 6.2% Salmnliofilizado 58.8% Truchaliofilizada 31.0%

1.1.3.Condicionesinstrumentalesdemedida La determinacin de TCS y MTCS en matrices biolgicas exige una alta sensibilidad y selectividadenlaetapademedida.Denuevo,seseleccionlacromatografadegasesacopladaala espectrometrademasasentndemcomotcnicadedeteccinycuantificacindeloscompuestos. LascondicionesinstrumentalesdemedidaseresumenenlatablaI.3. Tabla I.3. Condiciones de GCMS/MS para la determinacin de triclosn y metiltriclosn en los extractosdemuestrasbiolgicasyalimentarias.
Compuesto MTCS TCS
1

Tr(min)1 21.18 23.29

Inprecursor (m/z) 304 347

Ionesproducto (m/z) 232,252,254 200,310

Amplitudde excitacin(V) 1.50 1.50

Nivelde almacenamiento (m/z) 130 140

HP5MS

LosespectrosdeMS/MS,correspondientesaTCSyMTCS,semuestranenlafiguraI.1.La fragmentacindeltriclosn,talcomosehadescritoenelcaptuloIV,consisteenlaprdidadeun tomo de Cly la ruptura del enlace ter. Para el metiltriclosn se observa la prdidade CH3Cly 2 tomos de Cl, dando lugar a los fragmentos 252+254 y 232+234 con la relacin isotpica correspondienteaespeciesconteniendo1y2tomosdecloro. 251

Materialbiolgico

FiguraI.1.EspectrosdeMS/MSparaelMTCSyelTCS.
100% 232 [M2Cl]+ 75% 252 [MCH3 Cl]+ Cl O Cl 50% Cl OCH3

100%

200 [MC4H9Cl2C6H3]+ Cl O Cl OSi(CH3)2C4H9

75% Cl

50% 310
267

[MC4H9Cl]+ 25%
M+ 304

25%

185

219

347 [MC4H9]+

0% 200 225 250 275 300 m/z

0% 200 250 300 350 m/z

252

MSPDconretencindelpidosaplicadaalaextraccindeTCSyMTCS

1.2.MSPDconretencindelpidos Las muestras de pescado liofilizado tienen un alto contenido de grasa, especialmente el salmn, que puede interferir en la determinacin de los analitos, usando columnas capilares para cromatografadegases.Enlosestudiospreliminares,seevaluelporcentajedegrasa(comopeso del residuo despus de evaporar a sequedad) existente en los extractos de muestras de salmn liofilizado. La tcnica de preparacin de muestra usada fue la MSPD considerando acetonitrilo y acetato de etilo como disolventes de elucin. Los materiales evaluados como dispersante y co adsorbentesfueronC18(70230mesh),Florisil(60100mesh),almina(150mesh)yslica(230400 mesh),secadoslostresltimosa130Cdurante24horas.Mediogramodemuestrafuemezclado con1gdesulfatosdicoanhidroparaeliminarposiblesrestosdeaguaquepudiesenquedarenla matriz. Acontinuacin, sedispers con2g del adsorbente seleccionado, en un mortero de vidrio, hasta obtener un polvo fino y uniforme. En el cuerpo de polipropileno de la jeringa de MSPD, se depositaron2gdelcoadsorbentey,acontinuacin,lamuestradispersada.Seeluyeron15mLde acetonitrilo o acetato de etilo. La tabla I.4 muestra los resultados obtenidos expresados como cocienteentreelpesodelresiduoseco(obtenidoalevaporarlosextractosasequedad)ylamasade muestra(0.5g),multiplicadopor100. TablaI.4.Porcentajedelpidosenlosextractosdesalmn(0.5gdemuestraliofilizada)considerando distintascombinacionesdeadsorbentesydisolventesdeelucinenelprocesodeMSPD.
Dispersante(2g) C18 C18 C18 C18 Florisil Almina Slica Coadsorbente(2g) C18 Florisil Almina Slica C18 C18 C18 Eluyente Acetonitrilo 0.96% 2.80% 2.90% 3.05% 0.29% 0.42% 0.97% Acetatodeetilo 37.60% 34.29% 32.30% 35.10% 32.90% 44.11%

Comoseobservaenlatablaanterior,lautilizacindeacetatodeetilocondujoaextractos con contenidos en grasa mucho ms elevados que el acetonitrilo. Para este disolvente, la combinacindeunadsorbenteenfasenormalcomoagentedispersanteyC18comocoadsorbente proporcion mejores resultados frente a la situacin inversa. Este comportamiento ya haba sido descritoporPensadoycolaboradores[PensadoL;2005]enladeterminacindePAHsenmsculode salmnyrodaballo.Detodosmodos,enlamejordelassituaciones(FlorisilcomodispersanteyC18 comocoadsorbente),lacantidaddegrasaenextracto(equivalentea1.5mg)siguesiendounvalor 253

Materialbiolgico

elevadoquepuedemermarengranmedidalavidatildelacolumna,ascomocrearproblemasen elanlisiscromatogrfico.Enexperimentosposterioresconsalmnliofilizado,seaumentlamasa de C18 usado como coadsorbente para intentar reducir los niveles de lpidos en los extractos. Tambinseutilizaroncoadsorbentesdelimpiezamixtos,esdecir,combinacionesdeC18conFlorisil. Losresultadosobtenidos,semuestranenlasiguientetabla(tablaI.5). Tabla I.5. Residuo graso en los extractos de salmn liofilizado usando Florisil como agente dispersanteyC18C18Florisilcomocoadsorbenteendistintascantidades.
Dispersante Florisil(2g) Florisil(2g) Florisil(2g) Coadsorbente C18(3g) C18(1g)+Florisil(2g) C18(2g)+Florisil(2g) %residuo 0.37 0.37 0.32

Dado que el porcentaje de grasa en el extracto se mantuvo prcticamente invariable, se continu trabajando con 2 g de Florisil como dispersante y la misma masa de C18 como co adsorbente. En estas condiciones, se evalu el volumen de acetonitrilo necesario para eluir los analitos de los cartuchos de MSPD. Para ello, se utilizaron dos tipos de muestra con distinto contenidograso:salmnytrucha.Enamboscasos,0.5gdemuestrafuerondispersadoscon1gde sulfatosdicoanhidroy2gdeFlorisilenunmorteropara,acontinuacin,transferirlosacartuchos deMSPDconteniendocomocoadsorbente2gdeC18.Decadacartuchoserecogieronfracciones consecutivasde5mL,concentrndolasa2mLyderivatizandounaalcuotade0.5mLcon100Lde MTBSTFA en las condiciones descritas para las muestras de polvo. Los resultados obtenidos se muestranenlafiguraI.2. FiguraI.2.Extraccinconacetonitrilo(fraccionesde5mL)deTCSyMTCSenmuestrasdetruchay salmnliofilizado.
MTCS 120% 100% 80% 60% 40% 20% 0% Fr1 Fr2 Fr3 Fr4 Fr1 Fr2 Fr3 Fr4 TCS

Sealrelativa

Salmn

Trucha

254

MSPDconretencindelpidosaplicadaalaextraccindeTCSyMTCS

Como se puede apreciar en la figura anterior, el metiltriclosn se recuper con 5 mL de disolvente, mientras que la distribucin del triclosn en las fracciones sucesivas de acetonitrilo dependi de la matriz considerada, seleccionando finalmente 15 mL de este disolvente. En estas condiciones, se evalu la recuperacin obtenida para una muestra de salmn con adicin de los analitosanivelde300ng/g.Elextracto,unavezconcentradoa5mL,fuederivatizadocon100Lde MTBSTFApreviamenteasuinyeccinenGCMS.Lasrecuperacionesobtenidas,paran=3,fueronde 97.011%y99.113%paraMTCSyTCS,respectivamente. La figura I.3 muestra el cromatograma de GCMS (TIC) correspondiente a uno de los extractos.Lospicosmsintensosqueaparecenenelmismofueronidentificadosporcomparacin con la librera NIST, como derivados tertbutildimetilsililados de cidos grasos saturados e insaturados. FiguraI.3.CromatogramadeGCMS(TIC)paraunamuestradesalmnconadicindeTCSyMTCSa nivel de 300 ng/g. Los picos nombrados como C8 a C18 corresponden a los derivados sililados de cidosgrasosconelnmerodecarbonosindicado.
(x103Cts) 800 700 600 500 400 300
3.0 6 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 21.1 21.3 21.5 minutos

TCS
m/z345+347

TIC

MTCS
m/z302+304

C16 C14 C16

C18

5 4 3 2 1 0 23.0 23.2 23.4 23.6 minutos

C12 C11 C8 C9 C10 C13

C15 C17

200 100 0 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 minutos

Debidoalapresenciadenivelessignificativosdecidosgrasosenlosextractos,seplante la posibilidad de llevar a cabo una etapa de purificacin offline de los mismos con cartuchos comerciales(500mg)dediferentesadsorbentesenfasenormal(Florisil,slica,almina),ascomode aminasprimariassecundarias(PSA),materialrecomendadoparalaeliminacindecidosgrasosen extractosdeaceitesyaceitunas[GarcaReyesJF;2007].Parallevaracaboesteestudioseprepar 255

Materialbiolgico

un pool de extractos de muestras de salmn. Alcuotas de 0.5 mL se depositaron en cartuchos comerciales, conteniendo 0.5 g de los adsorbentes anteriores, eluyendo 5 mL de acetonitrilo, que posteriormente fueron concentrados a sequedad para determinar el residuo graso. Los resultados obtenidosmostraronquelalimpiezaoffline,noproporcionunamejorasustancialenelcontenido enlpidosdelosextractosfinalesyaque,enelcasodemuestrasdesalmnliofilizado,estostodava contienendelordende0.8mgdelpidos,tablaI.6. TablaI.6.Porcentajedelpidoseliminadosenlaetapaadicionaldelimpiezaoffline.
%eliminacin Slica 54.9 Florisil 60.7 Almina 41.2 PSA 38.9

256

MSPDconeliminacindelpidosaplicadaalaextraccindeTCSyMTCS

1.3.MSPDconeliminacindelpidos Una alternativa a las estrategias de purificacin descritas anteriormente es el uso de materialesenfasenormalimpregnadosconuncido.Enconcreto,lautilizacindeslicaimpregnada conun44%decidosulfrico,hapermitidoobtenerextractoscompletamentelibresdelpidosenla determinacin de PCBs y PBDEs en muestras biolgicas [Carro AM; 2005][Martnez A; 2005]. Los mayoresproblemasderivadosdelempleodeestetipodecoadsorbentessonladestruccindelos analitosolaretencindelosmismosenlacapadecarbnquesegeneraaloxidarloscidosgrasos [PensadoL;2005][WellsDE;1994].Enelcasodeltriclosnyelmetiltriclosnslosehaencontrado una referencia en la cual se utiliza la slica impregnada con cido sulfrico, al 22 % (p/p), para purificarlosextractosobtenidosmediantelaextraccinlquidolquidodeplasmadepescado[Alaee M;2003]. Enuna primera aproximacin a la optimizacinde estasegunda estrategia, se realiz una MSPD de una muestra de salmn liofilizado en las siguientes condiciones: 0.5 g de muestra se homogeneizaron con 2 g de sulfato sdico anhidro y 1.5 g de slica (activada a 130C durante 24 horas) en un mortero de vidrio. En el cartucho de MSPD se depositaron previamente 3 g de slica impregnadaconun10%(p/p)deH2SO4.stasepreparmezclandoslicaactivada(130Cdurante 24horas)conelcorrespondientevolumendecidosulfricoconcentrado.Unavezhomogeneizada, seintrodujodenuevoenunaestufaa110Cdurante12horas,almacenndolaposteriormenteenun desecador. El cartucho de MSPD fue eluido con 15 mL de diclorometano, concentrndolo posteriormenteasequedad.Elresiduofueaproximadamente56vecesinferioralobtenidoconla metodologadescritaenelapartadoanterior(0.050.06%delamasadelamuestra).Porotraparte, se confirm que el triclosn y el metiltriclosn son capaces de resistir el proceso oxidativo, obteniendo seales del mismo orden de magnitud que las correspondientes al patrn de adicin utilizadoparafortificarlamuestra.ElcromatogramadeGCMS,paraunamuestradesalmn(figura I.4),mostrunacomplejidadinferioralpresentadoenlafiguraI.3,endondeloscidosgrasoseran coextradosjuntoconnuestrosanalitos.Enbaseaestosresultados,seprocedialaoptimizacinde las condiciones de extraccin usando MSPD con oxidacin qumica del residuo graso sobre slica cida. 257

Materialbiolgico

Figura I.4. Cromatograma de GCMS (TIC) para un extracto en diclorometano utilizando como co adsorbenteslicacida(10%deH2SO4p/p).Salmnliofilizadoconteniendo300ng/gdeTCSyMTCS.
kCts 100

75 TCS 50 MTCS 25

0 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 minutos

1.3.1.Porcentajedecidosulfricoenelcoadsorbente El primer parmetro optimizado fue la concentracin de cido sulfrico (5, 10, 20 % p/p) necesariaparaoxidarporcompletoloslpidospresentesenlamatriz,sinafectaralaestabilidadde los compuestos estudiados. Para la realizacin de este estudio, muestras de 0.5 g de salmn liofilizado,conadicinde300ng/gdeMTCSyTCS,fuerondispersadasenunmorterodevidriocon2 gdesulfatosdicoanhidroy1.5gdeslicaactivada.EnlaparteinferiordelcartuchodeMSPDse depositaron 3 g de slica cida con porcentajes variables de cido sulfrico. Dado que el diclorometano fue capaz de extraer el TCS y el MTCS, se utiliz como disolvente de elucin, recogiendovolmenesde15mLyconcentrndolosposteriormentea1mL.Unaalcuotade0.5mL seempleparaladeterminacinderesiduoslido,mientrasquelaotraporcinfueevaporadaa sequedad y reconstituida con 0.5 mL de acetato de etilo, para ser derivatizada e inyectada en el cromatgrafo de gases. La respuesta obtenida para ambos compuestos se mantuvo constante independientemente de la cantidad de cido sulfrico aadida a la slica, figura I.5. Estos datos sugierenqueloscompuestos,ademsdeserestablesencondicionesaltamenteoxidantes,noson retenidosenlacapadecarbnqueseformadebidoalaoxidacindeloslpidos,comosedescribi para los PAHs [Pensado L; 2005]. Con respecto al residuo lipdico presente en el extracto final, se apreci una ligera disminucin cuando se aument la concentracin de cido de 5 % a 10 %, sin embargo, entre 10 % y 20 % los resultados fueron idnticos, por lo que se decidi emplear slica impregnadaconun10%decidosulfricoenexperimentosposteriores.

258

MSPDconeliminacindelpidosaplicadaalaextraccindeTCSyMTCS

FiguraI.5.InfluenciadelaconcentracindecidosulfricoenlasrespuestasobtenidasparaMTCSy TCS.Datosparasalmnliofilizado(N=3rplicas).
MTCS 60000 readepico 40000 20000 0 5% 10% 20% TCS Residuolipdico Residuolipdico 0.15% 0.10% 0.05% 0.00%

ConcentracindeH2SO4(%p/p)

1.3.2.Tipoyvolumendeextractante Seevalulaeficaciadeextraccinusandodisolventesconpolaridadescrecientes:hexano, cloroformoydiclorometano.Disolventesdemayorpolaridad,comoelacetatodeetilo,elmetanolo acetonitrilo, no fueron considerados puesto que proporcionan extractos cidos al romper las interaccionesexistentes entre la slicay el cido sulfrico. Elperfil deelucin de TCS yMTCS para cada uno de los disolventes anteriores, fue estudiado con tres matrices que presentan distintos contenidosdemateriagrasa(m.g.):salmnliofilizado(59%dem.g.),truchaliofilizada(31%m.g.)y queso(40%m.g.),todasellosconadicindeMTCSyTCSanivelde300ng/g. Para cada muestra y disolvente, se eluyeron fracciones consecutivas de 5 mL, las cuales fueron evaporadas a sequedad y reconstituidas posteriormente con 1 mL de acetato de etilo. Despusdesuderivatizacin,seinyectaronenGCMS/MS,obteniendolosresultadosmostradosen lafiguraI.6. ElhexanonofuecapazdeextraernielTCSnielMTCSdelcartuchodeMSPD,adiferencia deldiclorometanoydelcloroformo.Paralastresmatricesconsideradas,elMTCSfuerecuperadocon una nica fraccin de 5 mL de diclorometano o cloroformo. El comportamiento del TCS fue ms complejo,puestoquesuperfildeelucindependiclaramentedeltipodedisolventeydelamatriz. Elcloroformopresentmenorpoderextractantequeeldiclorometano,sobretodoparalamuestra de trucha. Este comportamiento se explica en base a la diferencia de polaridades entre ambos compuestos(MTCSyTCS)yelcoeficientedeparticinoctanolaguadelosdisolventesutilizados.El analitomslipoflico(MTCS)serecupercon5mLdeambosdisolventes.ElTCS,ligeramentems polar,presentunamayorafinidadporeldiclorometano(logKow1.19)queporelcloroformo(log Kow1.76). 259

Materialbiolgico

Figura I.6. Distribucin de TCS y MTCS en fracciones consecutivas de diclorometano, cloroformo y hexano(5mLcadauna)paramuestrasdesalmn,truchayqueso(N=3).
120 Sealrelativa(%) 100 80 60 40 20 0 F.1 F.2 F.3 F.1 F.2 F.3 F.1 F.2 F.3 F.1 F.2 F.3 F.1 F.2 F.3 F.1 F.2 F.3 MTCS Hexano TCS MTCS TCS MTCS TCS Salmn Trucha Queso

Diclorometano

Cloroformo

Finalmente,seseleccionaron10mLdediclorometanoparalaextraccinconjuntadelMTCS ydelTCSdematricesbiolgicas. 1.3.3.EstabilidaddeTCSyMTCSenlasmuestrasconadicin Unaspectoimportantealahoradellevaracaboeldesarrollodeunametodologaanaltica es evaluar la estabilidad de los compuestos en la matriz, dado que la disminucin en la respuesta analticapodraconfundirseconposiblesprdidasenlaetapadelimpiezaencondicionesoxidativas. Adems, es necesario asegurar que no tiene lugar la metilacin parcial del TCS, durante el almacenamientodelasmuestras. Para investigar este aspecto, se fortificaron muestras de trucha liofilizada, a nivel de 300 ng/g,usandounadisolucinpatrndelosanalitosenacetona.Sedejevaporarlaacetona(12horas en campana) y se evaluaron las recuperaciones obtenidas en funcin de las condiciones de almacenamientodescritasenlatablaI.7. Como se puede comprobar en los resultados obtenidos, no hay diferencias significativas paralosexperimentos1,2y3,sibienesciertoque,larecuperacinparaelMTCSfuemayorque paraelTCS.Paraevaluarsiesposiblequeseproduzcabiometilacindeltriclosndurantelaetapa dealmacenamiento,serepitieronlosexperimentos2y3fortificandolasmuestrassloconTCS.Los resultadosobtenidos,muestras4y5,reflejaronquenohayconversindeTCSenMTCS,ademslas recuperacionesestuvieronprximasal100%enambosexperimentos.

260

MSPDconeliminacindelpidosaplicadaalaextraccindeTCSyMTCS

TablaI.7.Recuperacionesparamuestrasdetrucha,fortificadasanivelde300ng/g,enfuncindelas condicionesdealmacenamiento(N=3).
Experimento 1 2 3 4 5
a

Condicionesdealmacenamiento (tiempo,temperatura) Noalmacenadaa 7das,20C 7das,4C b 7das,20C b 7das,4C

b

%RecuperacinSD MTCS 107.87.3 94.88.6 106.85.5 n.d. n.d. TCS 80.07.4 92.112.9 97.97.6 101.13.3 108.72.6

Extradaalas12horasdepracticarlaadicin

Sloseaaditriclosn

Por lo tanto, se puede concluir que no existen problemas de degradacin, ni de interconversinentreTCSyMTCS,enmuestrasdepescadoalmacenadasa4C,durante7das. 1.4.Caracterizacindelmtodoanaltico Una vez optimizadas las condiciones de extraccin de las muestras de material biolgico mediante MSPD con eliminacin de lpidos, figura I.7, se procedi a la caracterizacin del mtodo analticopropuesto. FiguraI.7.EsquemadelprocesodeextraccindeTCSyMTCSenmuestrasdematerialbiolgico.
0.5gdemuestra dispersada con1.5g deslica y1gde Na2SO4 3gdeslica 10% (p/p)H2SO4

Fritasde polietileno

10mL DCM

Concentrarasequedad, redisolvercon1mL de AcOEt yfiltrar(0.22m) Derivatizar 0.5mL con 0.05mL MTBSTFAaT ambientedurante5 minutos

261

Materialbiolgico

1.4.1.Caracterizacindelmtododedeterminacin(GCMS/MS):linealidad,repetibilidad yLOQs LalinealidadenlarespuestadelsistemaGCMS/MSfueevaluadainyectandopatronesde triclosn y metiltriclosn preparados en acetato de etilo en concentraciones crecientes desde 2 ng/mLhasta2g/mL.Larespuestasemantuvolinealenelrangoestudiado,obteniendocoeficientes de determinacin de 0.998 y 0.999 para el MTCS y TCS respectivamente, con una repetibilidad de inyeccin inferior al 4 %. Los lmites de cuantificacin, estimados para una relacinseal/ruido de 10,fueronde0.5ng/mLparaelTCSy1ng/mLparaelMTCS. TablaI.8.Linealidad,repetibilidadyLOQsdeGCMS/MSparapatronesdeMTCSyTCS.
MTCS TCS Linealidad(R2) Rep.25ng/mL(%RSD,n=4) LOQ(ng/mL) 0.998 0.999 3.4 3.0 1 0.5

1.4.2.Exactitud,precisinylmitesdecuantificacindelmtodoanaltico La eficacia de la metodologa de extraccin propuesta se evalu usando muestras con distintoscontenidosgrasos.Lasmatricesempleadasfueronsalmn(59%m.g.)ytrucha(31%m.g.) liofilizadosydosalimentosfrescos,quesoenlonchas(40%m.g.)yjamncocido(3%m.g.).Cada muestra fue dividida en tres porciones. Dos de ellas fueron enriquecidas con los analitos a dos concentraciones diferentes: 10 y 50 ng/g. La tercera se us como blanco. Las muestras, con y sin adicin, fueron almacenadas a 4C durante una semana. Pasado este tiempo, fueron procesadas mediantelametodologadesarrollada,aligualquelosblancosdeproceso.Losresultadosobtenidos mostraronqueningunadelasmuestrassinadicinpresentabasealdelosanalitos,aexcepcindel jamncocido.EnlafiguraI.8seobservanloscromatogramasparalamuestradejamnconadicin (10ng/g),lamuestrasinadicinyunblancodeproceso.Entodocaso,losnivelesdeMTCSyTCSen lamuestrasinadicinfueroninferioresalosLOQsdelmtodo. Las recuperaciones obtenidas para las diferentes matrices estudiadas se presentan en la tablaI.9,juntoconlosrespectivoscoeficientesdevariacindelprocesoanaltico.Talcomosepuede comprobar, las recuperaciones oscilaron entre 77 y 120 %, con unos coeficientes de variacin inferioresal12%.

262

MSPDconeliminacindelpidosaplicadaalaextraccindeTCSyMTCS

FiguraI.8.CromatogramasdeGCMS/MSparajamncocidoconadicinde10ng/gdeTCSyMTCS (C),muestrasinadicin(B)yblancodeproceso(A).
(x103 Cts)

(x103 Cts)
1.25

MTCS 1.0 m/z232+252+254

2.5 TCS 2.0 m/z200+310

0.75

1.5

0.5

1.0

0.25

C B 0.0 21.00 21.50 A 22.00 minutos

0.5 C B 0.0 22.5 23.0 A 23.5 minutos

Lavariabilidadinterdaseestudiconunamuestradesalmnliofilizadoconadicinde25 ng/g para ambos analitos, realizando las extracciones en 4 das consecutivos. Los resultados obtenidosmostraronreproducibilidadesde4.2%y7.2%paraMTCSyTCS,tablaI.9. Los LOQs para la metodologa desarrollada fueron de 1 y 2 ng/g para MTCS y TCS. Estos valores son del mismo orden que los estimados por Balmer y colaboradores utilizando masas de muestrade525g[BalmerME;2004]. TablaI.9.Recuperaciones(n=4),reproducibilidad(n=12)yLOQs(ng/g)delmtodopropuesto.
ng/g Salmn (59%m.g.) 10 50 %RecuperacinSD Trucha (31%m.g.) 10 50 Queso (40%m.g.) 10 50 Jamn (3%m.g.) 10 859 50 928 Repr.(% RSD,n=12) 25 4.2 7.2 LOQ (ng/g) 2 1

MTCS 1203 1098 11112 9511 10312 1107 TCS 1129 987 1079 794 959

1139 7711 856

263

Materialbiolgico

Encomparacinconotrasmetodologasexistentesenlabibliografaparaladeterminacin detriclosnenmatricesbiolgicasyalimentos,elmtodopropuestoessuperiorenrelacinalcoste delprocedimientoylasrecuperacionesobtenidas.Porejemplo,Allmyrycolaboradores[AllmyrM; 2006AyB]precisarondetriclosnmarcadoisotpicamenteparacompensarprdidasdehastaun 50 % en la extraccin de TCS en muestras biolgicas. Por otra parte, las recuperaciones y la repetibilidadobtenidassonsimilaresalasdescritasporSanchesSilva[SanchesSilva;2005]parala determinacindetriclosnenzumo,pechugadepolloyqueso,aunqueloslmitesdecuantificacin desumtodoson40vecessuperioresalpresentadoenestamemoria. 1.5.Aplicacindelametodologadesarrollada Lametodologadescritaseaplicalanlisisdeseismuestrasliofilizadasdetruchaarcoiris (Oncorhynchusmykiss),caballa(Scomberomoruscavalla)ymejilln(Mytilusedulis)procedentesde pequeosrosdelazonadeLugoyestuariosdelaRadePontevedrayVigo,estosltimosprximos aunazonaindustrializada.Ningunadelasmuestrasdepescadonidemoluscoanalizadaspresent nivelesdeTCSyMTCSporencimadelosLOQsdelmtodo. Porotraparte,lapresenciadetrazasdetriclosnenalgunasdelasmuestrasdealimentos en lonchas (figura I.8), sugieren su posible contaminacin al entrar en contacto directo con superficiesoutensiliosqueestuviesentratadosconestebactericida(cuchillos,tablerosdecorte,) odeunmodoindirecto,debidoalusodeesponjasobayetas,conteniendotriclosn,paralimpieza de mostradores, tablas de corte y otras superficies en contacto con los alimentos. En los ltimos aos, los productos polimricos antimicrobianos han tenido un gran auge, existiendo un amplio abanico de utensilios utilizados en la vida diaria que incorporan, dispersados en su estructura, sustancias con propiedades antimicrobianas como el triclosn. Por ejemplo, el TCS es uno de los posibles bactericidas que incorpora una conocida patente (Silestone) de encimeras de cocina y bao. As pues, se evalu la posibilidad de que se produzca la migracin del triclosn desde materialesslidoshastalosalimentosenuntiempodecontactorelativamentecorto.Pararealizar un estudio preliminar de esta posibilidad, lonchas de dos alimentos (queso y jamn cocido), con distintocontenidograso,sepusieronencontactoconuntablerodecortequecontieneTCScomo agente bactericida (nivel estimado 245 24 g/g). Cada cierto tiempo, se tom una porcin de la muestradealimentoparadeterminarelcontenidodetriclosn.Losresultadosmostraronqueexiste migracin apreciable del compuesto desde las superficies tratadas con este bactericida a los alimentos,figuraI.9.

264

MSPDconeliminacindelpidosaplicadaalaextraccindeTCSyMTCS

FiguraI.9.Migracindetriclosndesdeunasuperficietratadaconelbactericidaadosalimentoscon contenidosgrasosde43%(queso)y2.5%(jamn).
Queso43%m.g. 800 [TCS]ng/g 600 400 200 0 0 2 4 6 8 10 12 Tiempodecontacto(horas) Jamn2.5%m.g.

Comosepuedeobservarenlagrfica,lavelocidaddemigracindeltriclosnalosalimentos dependedelacantidaddemateriagrasaqueestospresentan.Elqueso,conunacantidaddegrasa muy superior a la del jamn cocido, acumul concentraciones de triclosn mayores. Este comportamiento ya haba sido descrito por Chung y colaboradores [Chung D; 2003] al estudiar la cintica de migracin del triclosn desde un copolmero de estirenoacrilato. En su estudio, simularon distintas condiciones experimentales, poniendo el polmero en contacto con diferentes disolventes.Usandoheptano,elcualrepresentabaalimentosconaltocontenidograso,lamigracin deltriclosntenalugardeformamsrpidaqueempleandounadisolucinmetanol:agua,lacual imitabalosalimentosconaltocontenidoacuoso.Ensuestudio,trasuntiempodecontactode20 horas,el65%deltriclosnpresenteenelpolmeromigrabaalheptano. En nuestro experimento, como se puede observar en la figura I.9, la migracin ha sido relativamente rpida puesto que para tiempos inferiores a 5 minutos, las concentraciones de triclosnenlosalimentosfueronde4050ng/g,equivalentesaun0.02%delvalorexistenteenla superficie slida. Estos valores aumentaron con el tiempo hasta alcanzar niveles del orden de 700 ng/g, tras 7 horas de contacto, en el caso de la matriz ms grasa. Evidentemente estas concentraciones(<1g/g)todavaresultanmuyinferioresaloscontenidosdeTCSenproductosde cuidado personal (entre 0.10.3 % en pasta de dientes) por lo que su contribucin a la exposicin humanaaestebactericidaesbaja.

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CONCLUSIONES

Conclusiones

CONCLUSIONES En esta seccin se presentan las conclusiones ms relevantes derivadas de los diferentes resultados obtenidos en este estudio, relativas a la determinacin y distribucin de triclosn y parabenesenvariasmatricesmedioambientales: DETERMINACIN,DISTRIBUCINYREACTIVIDADENMEDIOACUOSO I.AplicacindeSPMEaladeterminacindetriclosnyparabenesenagua LacombinacindelaSPMEconunaetapadesililacinonfiberpermitealcanzarlmitesde cuantificacin(LOQs)aniveldelosbajosng/LenladeterminacindeTCSysusderivados,ascomo parabenesenmuestrasdeaguasuperficialyresidualusandoGCMSyGCMS/MScomotcnicasde medida.Laetapadederivatizacinonfiberrequieretanslodiezminutos,pudiendoserllevadaa cabo a temperatura ambiente. Cabe destacar que las condiciones de sililacin ptimas fueron comunesparaambosgruposdecompuestos. Enrelacinalaetapadeconcentracin,lasmayoreseficaciasdeextraccinseobtuvieron utilizando fibras de PA y PDMSDVB para el TCS y sus derivados, y PA para el caso de parabenes. Aparte del tipo de fibra, la nica variable que afect de manera diferente al rendimiento de la extraccin para ambas familias de compuestos fue la fuerza inica del medio. En base a estos resultados esfactibledeterminar parabenes, TCSy sus derivados (clorofenoles y metiltriclosn) en muestras de agua de forma conjunta, usando PA como recubrimiento de la fibra de SPME. Considerandounvolumendemuestradetanslo10mL,yuntiempodepreparacinde40minutos, se pueden alcanzar LOQs suficientemente bajos para la determinacin de estos bactericidas en muestras reales de agua superficial y residual, con un rango de respuesta lineal de 3 rdenes de magnitud y un rendimiento de extraccin escasamente dependiente del tipo de matriz. La mayor limitacin del mtodo de SPME es la presencia de niveles moderados de MeP en los blancos de extraccin. II.ConcentracinmedianteSPE ElusodecartuchosOASISHLB,60mg,permiticoncentrarvolmenesdeaguadehasta2 LenladeterminacindeTCSyparabenes.Despusdesuretencinsobreeladsorbente,losanalitos puedenrecuperarseconslo2mLdeacetatodeetiloyacontinuacinprocederasuderivatizacin (sililacin) sin la necesidad de realizar un cambio de disolvente. En general, los LOQs obtenidos usando SPE como tcnica de concentracin se situaron en el mismo rango de valores que los 269

correspondientesaSPME,ademsnosehanencontradoproblemasdecontaminacinparaninguno deloscompuestosestudiados.LaslimitacionesmsimportantesdelmtododeSPEsonlanecesidad de mayores volmenes de muestra y la introduccin de una etapa adicional de purificacin en el caso de aguas residuales. De nuevo, sera factible la determinacin conjunta de TCS y parabenes, usandolascondicionesdederivatizacinalgomsenrgicasquenecesitanlossegundos. III.Reactividadconclorolibre TantoTCScomoparabenespresentanunareactividadconsiderableencontactoconagua,a pH neutro, conteniendo niveles de cloro libre inferiores a 1 g/mL. Para los segundos se ha demostradoquelareaccintienelugartambinentreaguacloradayproductosdecuidadopersonal queincluyenparabenesensuformulacin. TCSyparabenesreaccionanconunexcesodeclorodeacuerdoconunapseudocinticade primer orden,sin embargo el primero presenta una vidamedia muchoms cortay adems de la formacindederivados halogenados, resultadode reacciones de sustitucin electrfila, da lugar a otros compuestos de reconocida toxicidad: 2,4diclorofenol y 2,4,6triclorofenol. Por su parte, los derivados halogenados de los parabenes presentan una mayor estabilidad a concentraciones elevadasdecloroy,portanto,unamenortendenciaaevolucionaratrihalometanos. El uso de sistemas GCMS, tipo trampa de iones, es recomendable para identificar los derivados formados en los procesos de halogenacin, sobre todo si no existe informacin previa relativaasusestructuras. IV.Distribucinenmedioacutico ElTCSylosparabenesalquilados(MeP,EtP,PrPyBuP)fuerondetectadosenprcticamente todas las muestras de agua residual no tratada procesadas, alcanzado en algunos casos concentracionessuperioresa1ng/mLparaMeP,PrPyTCS.Sinembargo,nosedetectlapresencia deBzP,nideMTCSenningunadeellas,tampocoseencontr2,3,4TCF,consideradoaliniciodeeste trabajocomounproductodetransformacindelTCS.AdiferenciadelTCS,losparabenesseeliminan de forma prcticamente cuantitativa durante la depuracin de aguas residuales urbanas. Su presenciaenaguasuperficial,porejemploenlosros,esunclaroindicativodevertidosdirectosde aguasnotratadas.TCS,2,4DCFy2,4,6TCFfuerondetectadosenvariasmuestrasdeaguaresidual tratadaaconcentracionesdehasta0.20.3ng/mL,portantocabeesperarsupresenciaenrosque recibenlasdescargasdedepuradorasequipadascontratamientosdelodosactivos. 270

Conclusiones

DETERMINACINDETCS,2,4DCFY2,4,6TCFENLODOYSEDIMENTO El lodo de depuradora constituy la ms compleja de las matrices consideradas en este estudio, requiriendo el desarrollo de una estrategia de limpieza intensiva, a la vez que obliga a la utilizacin de GC acoplada a espectrometra de masas en tndem (MS/MS) como tcnica de determinacin. En relacin al procedimiento de extraccin asistida por microondas (MAE) optimizado,eltipodedisolventeysuvolumenhansidolosfactoresmssignificativosdesdeelpunto devistadelaeficaciadeextraccin. El mtodo desarrollado mostr recuperaciones aceptables, comparables con Soxhlet, desviaciones estndar relativas inferiores al 13 %, y lmites de cuantificacin, 0.8 ng/g, adecuados para el anlisis de lodos y sedimentos. Si embargo, implica una excesiva manipulacin de las muestrasynoesaplicablealadeterminacindeMTCS. El anlisis de muestras de lodos revel la presencia de concentraciones elevadas de TCS (niveldelg/g)enestamatriz,ascomodelosdosclorofenolesaconcentracionesdelosaltosng/g. Considerando las vas de transformacin medioambiental del TCS, este dato debe tenerse muy en cuenta a la hora de decidir el destino final de este residuo (incineracin, utilizacin como abono, etc.).Adems,conocerlosnivelesdeTCSretenidosenloslodosesimprescindiblepararealizarlos balancesdeeliminacindeestebactericidaenestacionesdepuradorasdeaguaresidual. DETERMINACINYDISTRIBUCINDETCSYPARABENESENMUESTRASDEPOLVO Sehandesarrolladodosmtodos,aplicandolastcnicasdePLEyMSPD,paralaextraccin deparabenesyTCSenmuestrasdepolvo.Enamboscasos,lasetapasdelimpiezasehanintegrado enelprocesoextraccin,minimizandolamanipulacindelosextractos.Laestrategiadecleanupha sidocomnenambosmtodos,losinterferentesconmenorpolaridadquelosanalitosseeliminan enunaprimeraetapadelavadodelcartuchodeMSPDolasceldasde PLE,mientrasqueaquellos quepresentanunapolaridadmselevadapermanecenretenidosenunacapadeFlorisil,situadaen elfondodelcartuchoolacelda.EnelcasodePLE,debidoasugranpoderextractivo,losdisolventes empleadostantoparalaetapadecleanupcomodeextraccinsonmenospolaresqueparaMSPD, considerada sta ltima como una tcnica suave de extraccin. Con respecto a la etapa de derivatizacin, se ha demostrado la posibilidad de realizar la sililacin conjunta de los analitos estudiadosendosdisolventesdiferentes(acetonitriloyacetatodeetilo)utilizandocondicionespoco enrgicas. Usando GCMS/MS como tcnica de determinacin, se obtuvieron LOQs inferiores a 4 ng/g para todos los analitos considerando ambos protocolos de preparacin de muestra. Las recuperacionesobtenidasparamuestrasconadicinfuerontambinsimilaresysloenelcasode

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MeP, el ms polar de los compuestos considerados, PLE result ligeramente superior a MSPD en trminosdeeficaciadeextraccin. Desdeunpuntodevistaoperativo,elmtododePLErequiereunamenorintervencindel operadoryesposibleprocesarvariasmuestrasdeformasecuencial.Porsuparte,MSPDresultams barataalnorequeririnstrumentacindedicadaynopresentariesgodecontaminacincruzadaentre muestras,puestoquelaextraccinserealizaencartuchosdepolipropilenodesechables. La aplicacin de ambas metodologas (PLE y MSPD) al anlisis de muestras de polvo, procedentesdeviviendasparticularesyedificiospblicos,pusodemanifiestolapresenciadeestos compuestosenconcentracionesdelordendelapartepormilln(g/g),similaresalosnivelesdeTCS enlodos,loqueindicaunacontinuaexposicinaTCSyparabenesporvadrmicayrespiratoriaen atmsferasinteriores. DETERMINACINDETCSYMTCSENMATERIALBIOLGICO Elprocedimientodedispersindelamatrizenfaseslida(MSPD)desarrolladoenestatesis constituye la primera aplicacin que integra las etapas de extraccin y purificacin para la determinacin de TCS y MTCS en muestras de material biolgico. Para este tipo de matriz, la eliminacindelpidosrepresentlamayordificultadeneldesarrollodelametodologapropuesta. De las dos estrategias inicialmente consideradas: (1) retencin de lpidos en el cartucho de MSPD combinando acetonitrilo con Florisil y C18 como eluyente, dispersante y coadsorbente, respectivamente y (2) oxidacin de lpidos sobre slica impregnada con cido sulfrico; la segunda resultmsefectiva,permitiendoobtenerrecuperacionescuantitativascon10mLdediclorometano yextractoslibresdegrasa,compatiblesconelusodeGCcomotcnicadedeterminacin. Aunque en muestras de pescado no se ha detectado la presencia ni de TCS ni MTCS, la capacidaddeTCSparamigrardesdesuperficiesslidashaciaalimentosdebeserconsideradadesde el punto de vista de las aplicaciones permitidas de este bactericida. Ms preocupante an es la estabilidad de ambas especies (TCS y MTCS) en presencia de cido sulfrico, comportamiento anlogo al de otros contaminantes con una reconocida persistencia medioambiental como son los PBDEs,conlosquecompartenunaciertasemejanzaensusestructurasqumicas.

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BIBLIOGRAFA

Bibliografa

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 ACRNIMOS

Acrnimos

ACRNIMOS 2,3,4TCF2,3,4triclorofenol 2,4,6TCF2,4,6triclorofenol 2,4DCF2,4diclorofenol ACNAcetonitrilo AcOEtAcetatodeetilo AMDDesarrolloautomatizadodemtodos ANOVAAnlisisdevarianza APCIIonizacinqumicaapresinatmosfrica ASEExtraccinaceleradacondisolventes BSTFABis(trimetilsilil)trifluoroacetamida BuPButilparaben BzPBencilparaben CARPDMSCarboxenPolidimetilsiloxano CCDDiseoCentralCompuesto CEComunidadEuropea CWDVBCarbowaxDivinilbenceno DCMDiclorometano DVBCARPDMSDivinilbencenoCarboxenPolidimetilsiloxano EIImpactoelectrnico EPAAgenciadeProteccinMedioambiental ESIElectrospray EtPEtilparaben GCCromatografadegases GPCCromatografadepermeacinengel LCCromatografadelquidos LODLmitededeteccin LOQLmitedecuantificacin LLEExtraccinlquidolquido MAEExtraccinasistidapormicroondas MeOHMetanol MePMetilparaben MSEspectrometrademasas MS/MSEspectrometrademasasentndem 289

Acrnimos

MSPDDispersindelamatrizenfaseslida MTBSTFAN(tertbutildimetilsilil)Nmetiltrifluoroacetamida MTCSMetiltriclosn NISTInstitutoNacionaldeEstndaresyTecnologa PAHHidrocarburopolicclicoaromtico PBParaben PBDEBifenilterpolibromado PCBBifenilopoliclorado PDMSPolidimetilsiloxano PDMSDVBPolidimetilsiloxanoDivinilbenceno PLEExtraccinpresurizadacondisolventes POPsContaminantesorgnicospersistentes PPCPsProductosfarmacuticosydecuidadopersonal PrPPropilparaben RDRealDecreto RSDDesviacinestndarrelativa SDDesviacinestndar SIMRegistroselectivodeiones SPEExtraccinenfaseslida SPMEMicroextraccinenfaseslida SSIIonizacinconsprayinico TCCTriclocarban TCSTriclosn trTiempoderetencin USUltrasonidos

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