I- INTRODUc,AO

A industria de alimentos encontra-se atualmente no Brasil em processo de crescimento. Uma prova disso e a quantidade e variedade de produtos disponiveis

no mercado que ha bem pouco tempo nao existiam. Este crescimento esta bastante
relacionado ao aparecimento de novas opgoes para o processador de alimentos, que pode encontrar ingredientes variados para as suas form ulagoes e com condigoes de satisfazer as suas necessidades. Tais ingredientes puderam se tornar disponiveis devido aos avangos nas tecnologias empregadas na sua produgao. Dessa forma, fontes de materia-prima que eram anteriormente ignoradas, puderam tornar ingredientes de alto valor funcional. Um exemplo claro disso e a produgao concentrados de proteinas do soro de leite que se de

tern cads vez mais encontrado

aplicagoes nas industrias de alimentos. Isso porque, alem de possuir um excelente valor do ponto de vista nutricional, esta proteina ainda apresenta a caracteristica de ser soluvel em uma ampla faixa de pH e pode desempenhar importantes propriedades funcionais nos alimentos em que for empregada. Dentre estas, as mais importantes sao a gelatinizagao e formagao e estabilizagao de interfaces (espuma e emulsao). Para a obtengao de tais concentrados, Arias metodologias podem ser empregadas, sendo a principal e mais utilizada a concentragoo atraves ultrafiltragao e diafiltragao do soro de leite clarificado. Este processo rende um concentrado de proteinas do soro (CPS) com um grau de desnaturagao baixo, quando bem controlado, principalmente quanto as temperaturas utilizadas. Porem, da

muitas vezes a proteina no seu estado nativo nao a capaz de cumprir uma
determinada performance desejada em um produto e uma modificagao na sua estrutura se faz necessaria. Essa m odificagao pode se dar atraves de tres estrategias principais, que sao a modificagao quimica, fisica e enzimatica nao foi bem aceita pelos processadores devido aos altos custos, use de agentes quim icos, alem da falta de aceitagao pelos consum idores e pelas agencias reguladoras. A utilizagao de tratamentos fisicos, como o termico, geralmente resulta (Panyam & Kilara, 1996). A modificagao quimica de proteinas altera a sua digestibilidade e

na agregagao e insolubilizagao dessas proteinas. Como boa parte das propriedades funcionais requer boa solubilidade, este pode nao ser tambem um metodo muito adequado. A modificagao enzimatica a um processo que tem se mostrado util para a modificagao de proteinas, sendo a hidrolise a mais utilizada. Inicialmente a hidrolise de proteinas do soro teve como objetivo a solubilizagao de concentrados obtidos por metodos onde ocorria uma extensiva desnaturagao da molecula, com consequente insolubilizagao do produto, como e o caso da precipitagao termica (Jost & Monti, 1977; Monti & Jost, 1978). Entao comegou-se a observar que as propriedades do material hidrolisado sofriam alteragoes tambem de acordo com a protease utilizada, com o grau de hidrolise e com diversos outros fatores envolvidos. A partir dal, varios estudos tern sido feitos com o objetivo de manipular as propriedades funcionais de proteinas do soro atraves da hidrolise. Destes estudos, pode-se concluir que este processo, quando utilizado com concentrados de proteinas do soro, resulta em um material com propriedades de gelatinizagao alteradas, solubilidade aumentada,e meihora nas propriedades de emulsificagao e formagao de espuma e decrescimo na estabilidade da espuma e da emulsao. Porem, a hidrolise controlada pode meihorar desempenho de algumas propriedades funcionais e simultaneamente ser prejudicial a outras. Dependendo da propriedade funcional requerida, as proteinas podem ser enzimaticamente modificadas para produzir o ingrediente adequado (Panyam & Kilara, 1996). E importante ressaltar que o soro de leite atualmente e descartado indiscriminadamente nos efluentes das industrias produtoras de queijos, causando um problema ambiental grande devido ao seu alto potencial poluidor. Isto nao ocorreria se este material tivesse a sua utilizagao disseminada. Neste trbalho, o objetivo foi de fazer uma comparagao entre as propriedades funcionais de proteinas soro hidrolisadas por tripsina e pepsina e proteinas do soro nao hidrolisadas. As propriedades funcionais estudadas foram: espuma (overrun e estabilidade), gelatinizagao (concentragao minima formadora de gel), solubilidade e estabilidade do o

termica.

II- REVISAO BIBLIOGRAFICA 11.1- O Concentrado de Proteinas do Soro 0 soro de leite e a solugao aquosa remanescente da remogao dos globulos de gordura, membranas dos globulos de gordura e micelas de caseina do leite 1993). No processo de fabricagao de queijos e caseinatos sao obtidas grandes quantidades de soro, o qual muitas vezes a descartado pela industria. Quando isso acontece, ha a necessidade de tratamento deste material como residuo, o que resulta em um gasto da industria com sistemas mais eficientes de tratamento, ja que o soro a um agente de grande potencial poluidor para o meio ambiente. A produgao anual de solidos a partir do soro nos EUA a estimada em 1,25 milhoes de toneladas, que contem 16000 toneladas de proteina. Em torno de 40% deste material e dispensado como residuo (Morr, 1984). E bom se ter em mente que no minimo, metade dos solidos do leite permanecem no soro de queijo feito com leite integral e muito mais da metade aparece no soro resultante da fabricagao de queijos com leite desnatado e caseina (Horton, 1993). Com o aparecimento de novas tecnologias que tornem possiveis a utilizagao racional da proteina e dos outros solidos, um aproveitamento pode ser feito com ganho na qualidade dos produtos nos quais os com ponentes do soro forem incorporados. A utilizagao do soro atraves do fracionamento e concentragao dos seus componentes (lactose e proteinas principalmente), possui a vantagem de eliminar a necessidade de tratamento deste material como residuo pela industria e surgem novos produtos, como os concentrados de proteinas do soro (CPS) ou isolados de proteinas do soro (IPS). Estes concentrados podem desempenhar em um alimento algumas propriedades funcionais importantes, como emulsificagao, formagao de espuma, gelatinizagao e retengao de agua. Estas propriedades funcionais dependem grandemente das propriedades fisico-qu[micas, como pode ser observado na TABELA 1. (Morr,

TABELA I l
opriedad" quimicas e fi lii ratai o e solvataa .ao

QU i ilc

tf TS
:. higroscopicidade viscosidade

Pirapriedad func ona s

I:igaao e retenco de agua

pelo valor

do CPSJIPS

gelatinizao a coagulaqAo induzida rsbo e dissocla

;Abertura molecular e desnaturaoo dlspersibiiidade do CPS/ PS solubi idade soldbiiidade viscosidade .; elati:niza o e coagulaco induzid pelo valor ormacio de espuma

emulsiflcagao

ifusao

gelat.iniza o e coagular o induzida

pelo valor

farmacao de espuma
emulsificac o AtMdade de adsoroo e interfacial emulstfica, o

ormacao de espuma
gelatiniza o e coagular jnduzida peloealor

nteraro proteina-proteiria e:agreegar o

solubilidade turbidez pen fl ;jnterac6es carboidrato-proteins o de ligantes

relacionada'ac o; a erxtrusao

texturizaOo em plicacoes na

Mai lard, esi:t3recimeritonao enzimatico igaOo de compostos que fornecem off-flavor

moo de escurecimento, ligaco de

pigmentos

reac o deMlaillard

oi~rI X 393
A variabilidade nas propriedades funcionais de concentrados de proteinas do soro (CPS), como pode ser observado nas TABELAS 2 e 3, ocorre porque a materia-prima utilizada para a sua produgao varia grandemente quanto a

composigao, pH e concentragao de sais e tambem porque varios metodos de concentragao das proteinas sao empregados, entre outros.

TABELA 2

Somas de al men

eIa ao, tempo e co

nd irs de t, cgntagem de c iulas somaticas ' enzimas do lute

tempo tie estocagem, tetnperstur8s sanit rios,el' ncia da t attfioa o ryas residuals

sto agem,conteucty de umidooo.

uimiGastf stcas

Para uma melhor utilizagao do soro (atraves da produgao de concentrados de proteinas), a necessario que a variabilidade nas propriedades funcionais do produto seja grandemente diminuida. A funcionalidade variavel destes concentrados esta bastante relacionada a diferengas na hidrofobicidade da proteina, devido a modificagoes na estrutura da molecula proteica durante o processamento. pelo tratamento termico recebido nos varios estagios de fabricagao. Todavia, as propriedades funcionais das proteinas nao sao determinadas apenas pela hidrofobicidade superficial. Por exemplo, a a-lactalbumina no estado nativo mostra boas propriedades de formagao de espuma e emulsificagao, embora tenha baixa hidrofobicidade superficial. Portanto, fatores estruturais outros que a hidrofobicidade superficial podem ainda ser considerados para o estabelecimento das relagaes entre estrutura e propriedades funcionais das proteinas. Dentre estes, a flexibilidade molecula proteica apresenta grande relevancia. A hidrofobicidade superficial ser considerada como um fator estatico e a flexibilidade, um fator dinamico nas propriedades de superficie das proteinas (emulsificagao e formagao de espuma). Uma vez que proteinas flexiveis apresentam alta hidrofobicidade devido a desnaturagao na interface, a hidrofobicidade superficial se torna o fator mais importante em ultima instancia para que sejam apresentadas boas propriedades de formagao de espuma e de emulsificagao. A hidrofobicidade parece causar uma conformagao instavel da molecula, o que aumenta a sua flexibilidade devido a regioes hidrofobicas na superficie. As propriedades de formagao de espuma parecem correlacionar melhor com a flexibilidade das proteinas que as propriedades emulsificagao (Kato et al., 1985). de da pode Mangino et a/.(1987, 1988) demonstraram que a hidrofobicidade da proteina pode ser afetada

11.1.1- Composigao do Soro A TABELA 4 apresenta a composigao do soro de leite bovino (acido e doce), compilada par Morr (1993) a partir de dados de Bassette & Acosta. E importante notar a alta concentragao de lactose, a grande quantidade de agua e os baixos valores de proteina e lipideos residuais.

0 soro ainda contem concentragoes

significantes de minerals inorganicos, como ions cfilcio, magnesio, citrato, e fosfato

derivados das micelas de caseina. destes minerals que o soro doce. 0 soro acido possui maiores concentragoes

pH

Cinzas Lactose

.coordura
t dio !Potassio

proteina

Acjcto tatico

tSsfo o

11.1.2- Processos de Producao dos Concentrados de Proteinas do Soro

0 concentrado de proteinas do soro pode ser obtido atraves de diversos metodos, como a formagao de complexos de proteina com metafosfato, evaporagao, filtracao em gel sephadex , ultrafiltragao, ultra/diafiltragao, ultrafiltragao/osmose reversa e cromatografia de troca ionica entre outros. A utilizagao de metodos envolvendo a precipitarao e formagao de complexos resultava em produto concentrado nao facilmente adaptavel para a comercializacao devido a contaminacao residual com reagentes. Alguns processos foram desenvolvidos para solucionar este problema, mas estes eram inviaveis economicamente (Schimidt et

al., 1984). Os processos de filtragao em gel sephadex nao sao aplicaveis

industrialmente, sendo utilizados principalmente em laborat6rios. Os processos envolvendo evaporagao, embora sejam economicos, nao sao adequados para o processamento das proteinas do soro devido a intensa desnaturagao proteica, resultando em concentrados de baixo valor funcional. A ultrafiltragao apenas, resultava em CPS contendo de 35 a 50% de proteina e com propriedades funcionais de grande variabilidade, devido as diferengas de composigdo dos soros utilizados

principalmente quanto a pH e concentragoo de sais e lipideos residuals e as altas concentragoes de solidos nao protaicos (lactose) no CPS. Entretanto, aperfeigoamentos nos metodos envolvendo a ultrafiltragao tornaram possiveis a obtengao de concentrados com propriedades melhoradas, devido a eliminagao de com postos com a lactose, m o inerals e outros com ponentes de baixo peso molecular, e ainda com conteudo de proteinas mais alto. Entre estas inovagoes, a que se mostrou mais eficiente foi a que envolvia ultra e diafiltragao juntas. Nesse metodo, o soro a clarificado a 50C, ultra/diafiltrado e entao seco por "spray-drying" 175-200C na entrada e 80-90C na salda. Este produto tera desnaturagao minima se as temperaturas forem cuidadosamente controladas e com conteudo de proteina de 75% ou mais (Kinsella & Whitehead, 1989). Existe ainda, para a produgao de isolados de proteinas do soro (IPS), o processo de adsorgao por troca ionica juntamente com uma subsequente ultrafiltragao e spray-drying. resultante possui 90% ou mais de proteina (Morr, metodo nao possui aplicabilidade comercial em grande escala. 0 concentrado de proteinas do soro (CPS) nao tem padrao de composigao definido nos Estados Unidos, mas segundo o regulamento do USDA, qualquer produto comercializado como CPS deve conter no minimo 25% de proteina. Porem estes produtos geralmente contem no minimo 34% para atingir o conteudo de proteina minimo encontrado no leite desnatado em po. 0 produto 1993). Porem a utilizagao deste a

11.1.3- Proteinas Componentes do Soro de Leite 0 soro de leite possui 20% do material proteico presente no leite. Nesta fragao sao encontrados diferentes tipos de proteinas. Estas podem ser fracionadas em dois grupos principais pela saturagao do soro acido com (NH4)2SO4 a 50%: uma fragao insoluvel de lactoglobulina (aproximadamente 10% do nitrog&enio proteico do soro) uma fragao soluvel de lactalbumina, sendo que a major parte dos componentes desta ultima nao sao albuminas verdadeiras. A fragao lactalbumina engloba a alactoglobulina, a a-lactalbumina, soro albumina do sangue (BSA) e varias proteinas em menor quantidade como a lactotransferrina, a serotransferrina e a
02-

microglobulina. Dentre as globulinas estao as imunoglobulinas (IgG, IgA, IgM e IgE). leite contem ainda aproximadamente 30 enzimas originarias principalmente do sangue e membranas secretoras das celulas. Algumas destas tam importancia

tecnologica em produtos lacteos, como as lipases e proteinases. A xantina oxidase,

exemplo, e o principal componente da membrana do globulo de gordura do leite 1989). Algumas proteinas menores e peptIdeos que se encontram no soro fragmentos de R-caseina que sao termo estaveis e soluveis em pH (peptideos derivados das caseinas), residuos de coagulante das caseinas (renina), fragmento altamente acidico glicomacropeptideo (GMP) da x-caseina, peptideos endogenos na fragao de nitroganio nao proteico do leite e membranas dos globulos gordura que sao complexadas com fosfolipideos e pequenos globulos de gordura (Morr, 1993). As propriedades fisico-quimicas das quatro principals proteinas do soro sao dadas na TABELA 5. 4,6

por (Fox, sao: o de

Scentracao no soro (gll) f Concentragaono soro (%) - em base.

Peso molecular (Kdattons) Hidrofobicidade media (cal/residuo) Total de residuos de aminoficidosf i Residuos apolares/mol Residuos de cisteinatmol

?onto'isoeietnco

:Residuos de acids glutami

Residuos de dissutftdeos/moo Residuos sufffdril/mol Residuos defisin.a/mot Residuos de iclda asp rticolma Foote: Eigei, W N , Sutler, Whitney, R Mr t. > t984

11.1.3.1- 0-lactoglobulina A R-lactoglobulina e a proteina que esta em major concentragao no soro de leite e existe como um dimero em solugoes com pH acima do ponto isoeletrico de levemente expandido, e entre o pH 3,5 e 5,2 o dimero polimeriza em um octamero 9

5,2.

Abaixo do pH 3,5 e acima de pH 7,5, o dimero se dissocia em um monomero

(Morr, 1993). Contem quatro grupos triptofano por dimero; doffs dos quais estao

"protegidos" e outros dois expostos ou os quatro estao parcialmente "protegidos".

Sabe-se que o dimero desta proteina se dissocia em monomero na regiao de pH 69, a medida em que a temperatura a aumentada de 20 para 45C. Os processos de complexagao ocorrem em temperaturas acima de oxidagao de grupos SH e grupos dissulfidicos 65C com envolvimento de (Reddy et a/., 1988). A R-

lactoglobulina contem duas pontes dissulfidicas e um grupo tiol livre por monomero. Este grupo tiol a capaz de interagir para formar novas pontes dissulfidicas, sendo que a reagao se torna bastante favoravel em pH acim de 6,8 devido a um a a mudanga conformacional da molecula. Em particular durante tratamentos termicos, isso resulta em formagao de pontes dissulfidicas intra e inter moleculares entre moleculas de a-lactoglobulina ou com outras proteinas que possuam o grupo tiol Iivre, que podem afetar a sua solubilidade e funcionalidade. As pontes S-S intramoleculares mantem a integridade estrutural e aumentam a estabilidade da proteina (Reddy et al, 1988). A a-lactoglobulina possui temperatura de em

desnaturagao de 78C, sendo que algumas regioes da molecula sao abertas apenas temperatura de 140C (de Wit & Klarenbeek, 1984).

11.1.3.2- a-Iactalbumina A a-Iactalbumina representa quantitativamente a segunda proteina mais importante do soro. Ela foi considerada por muito tempo como sendo a proteina m term ais oestavel presente no soro de leite. Porem foi observado que a alactalbumina tambem a susceptivel a desnaturagao termica. 0 que ocorria era um alto grau de renaturagao desta proteina durante o resfriamento (Dybing & Smith, 1991). A a-Iactalbumina nao demonstra o comportamento de reversibilidade da desnaturagao no CPS devido a interagoes com R-lactoglobulina e albumina do soro bovina (de Wit & Klarenbeek, 1984). Possui quatro pontes dissulfidicas e nenhum grupo tiol livre (Kinsella & Whitehead, 1989).

10

11.1.3.3- Albumina do Soro Bovino A albumina do soro bovino e a major proteina do soro em tamanho. Contem 17 residuos sulfidril e um grupo tiol livre por molecula. Este grupo tiol, assim como o da lactoglobulina, pode participar de interagoes intra ou inter-moleculares. A BSA possui temperature de desnaturagao de 64C (Fox, 1989). (3-

11.1.3.4- Imunoglobulinas No soro de leite estao presentes quatro classes de imunoglobulinas: IgG, IgE, IgM, IgA. Das imunoglobulinas presentes no leite da vaca, 80% sao IgG (Morr, 1993). Estas proteinas exibem uma temperatura de desnaturagao, que a mais alta que a da a-lactalbum e da O-lactoglobulina., m na presenga de outras ina as proteinas do soro elas se tornam extremamente termolabeis, o que pode ser devido interagoes dissulfjdicas entre BSA e 3-lactoglobulina (de Wit, 1989). a

11.1.3.5- Fragmentos de

3-Caseina.

Estes fragmentos eram classificados anteriormente como proteose-peptonas sendo identificados por eletroforese em gel como componentes 5,8-slow e 8-fast. Hoje sao classificados como fragmentos 1P, 4P e 5P. Estes fragm entos de proteinas contem baixas concentragoes de residuos de aminoacidos sulfurados e aromaticos e nao sao precipitados por aquecimento do leite a 95C por 20 minutos subsequente ajuste do pH para 4,6 com acido. Embora muitos destes fragmentos 0-caseina estejam presente no leite, muito provavelmente uma quantidade adicional a formada pela agao da renina na produgao de queijo (Morr,1993). A quantidade presente no soro pode ter um efeito no comportamento funcional das demais proteinas do soro, e mais pesquisa a necessaria para monitorar essas e de

quantidades e tipos presentes e os seus efeitos sobre fungoes especificas,

principalmente em panificagao. A fragao de proteose peptonas 8-fast a unica devido a sua alts carga em pH 6,6 e ao seu baixo peso molecular (3474 D). Jd a fragao 5-

11

slow a uma tipica molecula do tipo sabao, com uma cabega polar e uma cauda apolar, aberta em consequencia do alto teor de prolina presente na molecula. Isto pode ser grandemente responsavel pelas boas propriedades de formagao de espuma dessa fragao do soro (de Wit, 1989).

11.2- Modificagfio Enzimatica das Proteinas do Soro

As propriedades funcionais das proteinas do soro podem ser modificadas com objetivo de se obter uma determinada performance nao atingida pela proteina no estado nativo. As tres principals estrategias que tem sido usadas sao modificagao quimica, tratamento termico e modificagao enzimatica. A modificagao quimica envolve acetilagao ou succinilagao das proteinas com anidridos acidos, fosforilagao, lipofilizagao (metodos onde se incorpora grupos hidrofobicos a molecula, como esterificagao, amidagao e alquilagao redutiva) glicosilagao, tiolagao e uniao covalente de aminoacidos. A maioria das modalidades de modificagoes quimicas

o seu

tern como objetivo uma mudanga no balango de cargas da proteina pela substituigao
dos grupos s-amino, que por sua vez, influenciam a sua solubilidade. A modificagao quimica das proteinas altera a sua digestibilidade, e nao foi bem aceita pelos processadores de alim entos devido aos elevados custos, use de substancias quimicas, necessidade de controlar a reagao, tanto quanto para ganhar aceitabilidade entre os consumidores e 1996). A hidrolise enzimatica de concentrados de proteinas do soro a um assunto bem explorado em todo o mundo. Segundo Chobert et al. (1988), dos muitos usos potenciais atuais das enzimas para modificagao das proteinas e meihora das

agendas reguladoras (Panyam & Kilara,

propriedades funcionais e nutricionais

(fosforilagao, glicosilagao, hidroxilagao e

metilagao, hidrolise e ressintese das ligagoes peptidicas), a hidrolise e a mais amplamente utilizada. Inicialmente o seu use com soro de leite tinha como objetivo,

12

aumentar a solubilidade de concentrados obtidos por metodos onde ocorria extensiva desnaturagao da proteina solubilidade do produto final (precipitagao termica) e consequente baixa (Monti & Jost, 1978). Entao comegou-se a observar que do

as propriedades do material hidrolisado variavam devido a especificidade da enzima, ao grau de hidr6lise, as concentragoes de proteina e enzima e condigoes meio onde ocorria a reagao. Dessa forma, variando estes parametros, podem ser obtidos hidrolisados com propriedades diversas. Uma outra aplicagao para a hidrolise enzimatica de proteinas do soro reside tentativa de redugao da alergenicidade de alimentos infantis onde este produto sido incorporado. Segundo Asselin et al. (1989), as reagoes alergicas a leite vaca sao favorecidas pela rapida absorgao de produtos lacteos nao digeridos completamente. As proteinas que possuem estrutura globular compacta, Como a 0lactoglobulina, podem se tornar alergenos ja que na tenha de

tern a sua digestao dificultada por

(Reddy et al., 1988).

falta de acesso da enzima aos sitios especificos de clivagem

Somado a isso, a digestao ainda a mais complicada em bebes devido a baixa acidez gastrica e a baixa atividade da fungao ex6crina do pancreas. Devido a este fato, comegou-se a utilizar a hidr6lise enzimatica das proteinas do soro de leite com objetivo de diminuir a alergenicidade de alimentos infantis. Essa redugao depende grandemente da especificidade da enzima para o rompimento das ligagoes peptidicas envolvidas nos sitios alergenicos. Segundo Asselin et al. (1989), uma redugao satisfat6ria da alergenicidade foi conseguida ap6s o tratamento da proteina com pepsina e a-quimotripsina, sucessivamente. Por outro lado, a alergenicidade das f6rmulas nao foi reduzida suficientemente ap6s o tratamento com tripsina. Embora o valor nutricional das proteinas do soro seja um aspecto importante para a sua utilizagao, nao s6 ele deve ser levado em consideragao. Realmente a hidr6lise enzimatica aumenta o valor nutricional da proteina por tornar os sitios de clivagem disponiveis a agao das enzimas do trato digestivo; podem a reconhecido tambem que as pessoas escolhem o alimento nao apenas pelo seu valor nutricional, mas tambem pelas suas caracteristicas fisicas e gustativas (Adler-Nissen, 1986). Logo, as propriedades funcionais das proteinas se tornam de relevante importancia o

13

para as caracteristicas finals dos alimentos. A hidrolise enzimatica afeta significativamente as propriedades da proteina original. Os peptideos formados na reagao podem apresentar meihora ou piora nas caracteristicas de funcionalidade, dependendo do grau de hidrolise da proteina, da especificidade da enzima e das condigoes do meio (Mutilangi et al., 1996). Os fatores que afetam a hidrolise enzim atica de proteinas incluem : especificidade da enzima, extensao de desnaturagao da proteina, concentragoes de substrato e enzima, pH, forga ibnica, temperatura e presenga ou ausencia de substancias inibidoras (Panyam & Kilara, 1996).

11.2.1- Principals Mecanismos de Hidrblise Enzimfitica de Proteinas Globulares

Linderstrom-Lang (1952) propos que a hidrolise inicial de uma proteina globular nativa poderia ser descrita por dois tipos extremos de reagoes : "um por um" ou "ziper". Um por Um: molecula proteica intacta

U11 lento

molecula proteica desnaturada

4 rapido

peptideos grandes

11 rapido

peptideos pequenos "Ziper": molecula proteica intacta

U11 rapido (ex.: aquecimento)

molecula proteica desnaturada peptideos grandes

4 rapido 4 lento

peptideos pequenos

No caso da reagao "um por um", nao existem quantidades apreciaveis de

produtos intermediarios no sistema, ja que o passo de desnaturagao inicial da

14

molecula a lento, sendo um peptideo liberado por vez. Porem, se o ataque inicial ocorre em uma taxa muito major que a subsequente degradagao para peptIdeos, parece que toda a proteina nativa se apresenta desnaturada e aberta na fase mais inicial da hidrolise.

0 grande numero de ligagoes peptidicas expostas leva a

formagao de uma ampla variedade de peptideos na reagao subsequente, que com a progressao da hidrolise sao novamente atacados. Este ultimo tipo de reagao foi denominado por Linderstrom-Lang de "ziper" (Adler-Nissen, 1976), e e a forma mais comum de agao das proteases nas proteinas do soro (Panyam & Kilara, 1996).

A hidrolise enzimatica de proteinas a acompanhada por tres efeitos distintos: -um decrescimo no peso molecular -um aumento no numero de grupos ionizaveis -a exposigao de grupos hidrofobicos anteriormente protegidos A hidrolise controlada pode melhorar algumas propriedades funcionais e simultaneamente ser prejudicial a outras. Dependendo da propriedade funcional requerida, as proteinas podem ser modificadas enzimaticamente para produzir o ingrediente certo (Panyam & Kilara, 1996). Os peptideos produzidos por proteolise

tern tamanhos moleculares menores e

m enos estrutura secundaria que as proteinas intactas, e pode-se esperar um aumento na solubilidade proximo ao ponto isoeletrico, decrescimo na viscosidade, e

mudangas significantes nas propriedades espumantes, gelificantes e emulsificantes,

quando comparados com a proteina original (Chobert et al., 1988).

11.2.2- Hidr6lise das Proteinas do Soro A hidrolise do concentrado de proteinas do soro (CPS), a uma reagao onde uma determinada enzima ira agir em um substrato que a composto por diferentes proteinas, dentre as quais, as principais sao a R-lactoglobulina, a a-lactalbumina, a albumina do soro bovina e as imunoglobulinas.

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Para que a hidrolise enzimatica das proteinas do soro proceda de maneira adequada, muitas vezes a necessario que, dependendo da especificidade da enzim a m a, olecula sofra um abertura da sua estrutura com a pacta Adler-Nissen (ex: Rlactoglobulina), para tornar disponiveis os sitios especificos de clivagem. Segundo (1986), existe normalmente em uma solugao de uma dada proteina, uma pequena porcentagem flutuante de moleculas no estado desnaturado. Porem, o numero de moleculas que estao neste estado, com os sitios de clivagem disponiveis para a quebra enzimatica a insuficiente para uma taxa de reagao satisfatoria. Por isso, seriam indicados pre-tratamentos termicos das proteinas do soro antes da hidrolise com o objetivo de provocar uma abertura das estruturas secundarias e terciarias das m oleculas, tornando disponiveis assim os sitios de clivagem especificos das enzimas e aumentando a taxa de reagao. Kilara & Sharkasi
(1986) sugeriram que a desnaturagao de proteinas do soro a um processo em duas etapas iniciado pelo rom ento da estrutura secundaria e terciaria levando a desnaturagao pim e culm inando com a agregagao e coagulagao. As m udangas lactoglobulina sao reversiveis abaixo de 70C, mas acima irreversivel e ocorre polimerizagao por meio de conformacionais na (3desta temperatura a desnaturagao a

pontes dissulfidicas intermoleculares (de

Wit &

Klarenbeek,

1984). A outra proteina

principal do soro, a a-Iactalbumina, a facilmente renaturada sob 0

susceptivel a desnaturagao termica, mas resfriamento, e portanto, parece termoestavel.

decrescimo na hidrofobicidade superficial durante a desnaturagao termica mostra uma relagao curvilinear com a capacidade espumante mas nao foi correlacionada com a estabilidade da espuma (Kato et al., 1983) (Mutilangi et al.,
1996).

A ordem decrescente de sensibilidade termica das fragoes de proteinas do imunoglobulinas, BSA, R-lactoglobulina e a-lactalbumina. 0 padrao de

soro e:

desnaturagao termica das principals fragoes de proteinas do soro, 0-lactoglobulina e a-Iactalbumina, em soro de queijo se assemeiha aquele do leite desnatado (Hillier & Lyster,

1979).

16

Uma hidr6lise extensiva a normalmente usada para produgao de hidrolisados hipoalergenicos, com peptideos nao maiores que 5000 Da e com a grande maioria (90%) menores que 500Da, enquanto para hidrolisados usados como suplementos proteina uma hidr6lise menos pronunciada pode ser mais vantajosa. Isso porque, que sejam obtidas melhoras nas propriedades funcionais dos hidrolisados com as das proteinas nativas, a necessario que o tamanho medio dos peptideos menor que 5000 Da (Panyam & Kilara, 1996 ; Chobert et al., 1988). Os hidrolisados de proteinas contem peptideos de baixo peso molecular e proteinas nao hidrolisadas. A filtragao em membranas pode ser utilizada para fracionar o hidrolisado em um permeado de baixo peso molecular e um retentado de alto peso m olecular; as propriedades funcionais das duas fragoes pode ser completamente diferente. No caso das proteinas do soro, os permeados parecem melhores propriedades de formagao de espuma e interfaciais que os retentados. Porem este passo adicional no processamento pode nao ser interessante do ponto vista economico (Panyam & Kilara, 1996). A tripsina a uma endopeptidase muito especifica, hidrolisando as ligagoes peptidicas envolvendo os grupos carboxil da lisina e da arginina isoleucina (Fersht, 1977 ;Reddy et al., 1988). As proteases hidrolisam ligagoes peptidicas especIficas promovendo a redugao do peso molecular, possiveis mudangas conformacionais, e aumento no numero de grupos ionizaveis. Todavia, a hidrofobicidade de proteinas globulares pode aumentar com a exposigao de residuos de aminoacidos apolares no processo. Estes efeitos de prote6lise podem resultar em m udangas drasticas no comportamento funcional da proteina. Propriedades especificas dos hidrolisados sao dependentes do grau de hidr6lise, que por sua vez a influenciado pela atividade especifica da protease, carater fisico-quimico do substrato proteico e condigoes de (Gauthier et al., e 1993). A pepsina possui especificidade por triptofano, tirosina, fenilalanina, leucina de ter de para relagao nao seja

reagao.

17

11.2.2.1- 3-Iactoglobulina Kella & Kinsella (1988) sugeriram que a estabilidade da R-Iactoglobulina em

meio acido pode ser resultante do aumento de pontes de hidrogenio entre dois grupos carboxilicos ou entre um grupo amida e um carboxil. Logo, a resistencia da 3-Iactoglobulina nativa 'a digestao por pepsins pode refletir a sua conformagao estavel em pH 2,0. A pepsina possui especificidade por triptofano, tirosina, (Fersht, 1977). A resistencia da R-Iactoglobulina fenilalanina, leucina e isoleucina enzima (Reddy et al., 1988). A R-Iactoglobulina contem 4 grupos S-S por dimero de peso molecular 36000 (Mc Kenzie, 1971). Como as pontes S-S intramoleculares mantem a integridade estrutural e aumentam a estabilidade das proteinas (Cantor & Schimmel, 1980), a

nativa a digestao por pepsins indica que estes grupos nao estao acessiveis a

redugao dessas ligagoes desestabiliza a conformagao da

3-Iactoglobulina. A S-

carboximetilagao da P-lactoglobulina na presenga de (i-mercaptoetanol aumenta a susceptibilidade da proteina a digestao por pepsina, tripsina e a-quimiotripsina (Reddy et al, 1988). A 0-Iactoglobulina a bastante resistente a proteblise por pepsina em pH 2,0. 0 aquecimento a 50, 60, e 70C nao altera a sua resistencia a digestao por pepsina. 0 aquecimento a 80C aumenta a hidrolise em alguma da

extensao, enquanto aquecimento a 90C resulta em um rapido aumento da hidrolise R-Iactoglobulina (Reddy et al., 1988). A (3-Iactoglobulina tratada com calor realiza extensivas mudangas

conformacionais em pH 8,0, resultando na exposigao de grupos hidrofobicos ao

solvente, o que permite o acesso da enzima a poucas ligagoes peptidicas

estrategicas. Estas clivagens podem entao induzir mudangas conformacionais posteriores permitindo eventualmente a clivagem em muitos pontos (Mihalyi, 1978).

A 3-Iactoglobulina a rapidamente hidrolisada por subtilisina e proteinase K e

mais lentamente por a-quimotripsina, tripsina e pancreatina na presenga de Cat

18

(Schimidt & Poll,

1991). Embora as Iigagoes peptidicas susceptiveis sejam 8 minutos a 1993). 82C foi aparentemente

numerosas, o grau de abertura apos limitada (Schimidt & Markwijk,

insuficiente para torna-Ias todas acessiveis a pepsina e ocorre apenas uma hidrolise

11.2.2.1- a-lactalbumina A a-lactalbumina foi rapidamente hidrolisada por pepsina e papaina lentamente por pancreatina e elastase. E apenas levemente hidrolisada pela tripsina, bromelina e quimosina. Na presenga de Ca+2, a hidrolise por tripsina e pancreatina foi ainda menor (Schimidt & Poll, 1991). Em pH 1993). 2,5, a pepsina digere apenas a-Iactalbumina, enquanto a R(Schimidt & Poll, 1991) (Schimidt & Markwijk, (Schimidt

& Markwijk, 1993), a-quimotripsina, subtilisina, proteinase K e pronase e mais

lactoglobulina nao a hidrolisada

A pepsina rompe Iigagoes peptidicas que envolvem aminoacidos com grandes

cadeias laterais hidrofobicas , como fenilalanina e leucina. Calculos da estrutura tridimensional da a-Iactalbumina feitos por Warme et al. (1974) demonstram que uma

grande area hidrofobica esta presente na superficie da molecula de a-Iactalbumina

n tiv , d q a P e a a a ul h
31

se expoe na solugao. Entao, esta area da molecula de a-

lactalbumina a susceptivel a proteolise por pepsina. Porem, foi demonstrado por Miranda et at (1989) que a a-Iactalbumina realiza uma mudanga conformacional em pH <4 para um estado desnaturado da molecula. Logo, a rapida hidrolise desta

proteina por pepsina nao depende necessariamente

hidrofobica particular na superficie da molecula proteica nativa Markwijk, 1993).

de alguma estrutura
(Schimidt &

19

11.2.2.3- Albumina do Soro Bovino BSA

A analise eletroforetica de concentrados de soro hidrolisados por tripsina mostrou a presenga do monomero da albumina do soro (BSA). A surpreendente resistencia da BSA a quebra enzimatica e o resultado da nao disponibilidade dos sitios sensiveis 'a enzima devido a estrutura primaria fortemente reforgada por pontes dissulfidicas. Esta resistencia nao a especifica para tripsina, m e as caracteristica da resposta da BSA a outras proteases tambem (Jost et al., 1987), com excegao a a-quimotripsina, que consegue facilmente hidrolisar esta proteina (Kato et al., 1985).

11.2.3- Enzimas

As duas enzimas utilizadas neste estudo sao a tripsina e a pepsina. Estas duas enzimas participam do processo de digestao normal dos alimentos, e varios pesquisadores as

tern utilizado com o objetivo de modificar as propriedades

funcionais de proteinas do soro de leite. 11.2.3.1- Tripsina

A tripsina a uma serina-protease, que possivelmente evoluiu a partir de uma esterase, com poucas modificagoes quanto ao mecanismo quimico da reagao catalisada. Este grupo de enzimas a extremamente sensivel a inibigao por di isopropil fluorfosfato (DFP). Este inibidor reage com o residuo de serina da enzima, mas nao reage com residuos de serina livres ou presentes em peptideos. Isso leva conclusao que este unico residuo de serina presente na molecula da enzima esta relacionado a atividade especifica desta (Dixon & Webb, 1979). a

A tripsina hidrolisa ligagOes, e nao especificamente ligagoes peptidicas, envolvendo os grupos carboxil de aminoacidos bfisicos como arginina e lisina.

20

Amidas sao quebradas mais rapidamente que peptideos e osteres ainda mais rapido (Dixon & Webb, 1979). 11.2.3.2- Pepsina

A especificidade exata desta enzim a incerta. Sabe-se que a pepsina a hidrolisa apenas Iigagoes peptidicas, nao agindo em amidas e asteres. Ligagoes envolvendo aminoacidos aromaticos , especialmente se estes forem aminoacidos dicarboxilicos sao um excelente sitio de agao pars esta enzima 1979). (Dixon & Webb,

A pepsina possui um pH otimo entre valores de 2 e 3. Dois grupos carboxil

(Asp 32 e Asp 215) sao cataliticamente importantes, sendo que o residuo Asp 32 esta ionizado e o Asp 215 nao ionizado na forma ativa da enzima. Suspeita-se ainda que um residuo de tirosina possa ainda estar envolvido de alguma forma na atividade (Dixon & Webb, 1979).

11.3- Propriedades Funcionais das Proteinas do Soro de Leite

Pour El (1981) definiu a funcionalidade como "qualquer propriedade funcional de um alimento ou ingrediente de um alimento, exceto as suas propriedades nutricionais, que afetam a sua utilizagao" (Harper, 1991 ; Dybing & Smith, 1991).

A funcionalidade proteica em um alimento esta relacionada a uma serie de propriedades fisico-quimicas interdependentes que influenciam a estrutura fisica, aparencia, textura, retengao de flavor do alimento e estabilidade fisica de emulsoes espum as. As propriedades funcionais das proteinas de um alim ento sao manifestagoes das suas propriedades fisico-quimicas relacionadas as suas propriedades reologicas e de superficie. A Iigagao de agua, dispersibilidade, solubilidade, viscosidade e gelatinizagao sao manifestagoes das suas propriedades reologicas, que sao afetadas grandem ente pelo tam anho e form das a macromoleculas e dos complexos macromoleculares, alem das suas interagoes e

21

inter-moleculares. Em contraste, as propriedades de superficie ativa das proteinas sao influenciadas m pelas proporgoes e sequencias dos seus residuos de ais aminoacidos hidrofbbicos e hidrofilicos e pela flexibilidade da cadeia TABELA 6. (Morr, 1993).Uma sintese dos diversos fatores que influenciam a funcionalidade a dada na

11.3.1- Solubilidade

A solubilidade em uma ampla faixa de concentragao de proteina, pH, temperatura, atividade de agua e condigoes ionicas a uma das propriedades mais importantes das proteinas do soro nativas em alimentos Os tratamentos termicos utilizados no processamento do CPS e IPS podem resultar em muitas vezes em pequena desnaturagao proteica induzida pelo calor, agregagao Ca+2-proteina, e interagao com lipideos polares, que tendem a reduzir a solubilidade das proteinas do soro (Mort, 1993). Estas proteinas nativas permanecem soluveis no seu pl que esta entre 4 e 5. Todavia a desnaturagao induzida pelo calor as torna insoluveis nesta faixa de pH. Logo, a solubilidade do CPS em pH 4,6 a util para estimar a

desnaturagao proteica (Morr, 1993). 0 estado inicial do CPS e IPS seco a um solido
heterogeneo, amorfo e as concentragoes relativas de fragoes de proteina insoluvel e soluvel estao relacionadas as condigoes de processamento, como tratamento 22

termico e de secagem utilizados. Outros fatores envolvidos na determinagao da solubilidade proteica sao pH, composigao ionica e temperatura do solvente; metodos e tempo de dispersao; forga centrifuga e tempo usado para sedimentar a fragao insoluvel (Morr, 1993). Devido a isso, a solubilidade do CPS a um indicador seguro da sua funcionalidade. A solubilidade das proteinas depende do fato de as interagoes proteina solvente terem uma energia livre mais baixa que a soma das interagoes proteina proteina e solvente-proteina varias propriedades fisico-quimicas endogenas, que incluem peso molecular, estrutura secundaria e terciaria, hidrofobicidade, hidrofilicidade, carga eletrostatica, etc., alem fatores exogenos, como pH, temperatura e composigao ionica, que ainda estao relacionados com a manifestagao das propriedades fisico-quimicas das proteinas no alimento. Muitas das aplicagoes em sistemas de alimentos que usam ingredientes de proteina do soro requerem boa solubilidade. A expressao das propriedades funcionais requer solubilidade das proteinas ou dos peptideos (Mutilangi et al., 1996). Apesar de render um produto de baixa solubilidade, a precipitagao tarmica e de (Harper, 1991). Por isso, ela depende de

de
e

interesse para a recuperagao da proteina do soro, porque a de simples execugao

tem como resultado um produto com alto conteudo de proteina e com pouca contaminagao de sais e lactose (Monti & Jost, 1978). Dentro de certos limites de pH, Monti & Jost (1978) conseguiram solubilizagao completa pela agao da tripsina em concentrado de proteinas do soro obtidos por precipitagao tarmica. Essa solubilizagao ocorreu mesmo com uma limitada extensao de hidrolise (Monti & Jost, 1978). A solubilidade aumentada dos hidrolisados a provavelmente devido ao seu tamanho molecular reduzido e ao aumento correspondente no numero de grupos

carboxil e amino ionizaveis. No caso da panificagao pode nem ser necessaria a

solubilizagao das proteinas obtidas pela precipitagao tarmica, uma vez que para esta finalidade um alto grau de solubilidade nao se faz necessario.

23

A solubilidade dos hidrolisados de tripsina, avaliada no trabalho de

Mutilangi et

al.

(1996) foi major que a de outros hidrolisados em todos os niveis de hidrolise. A tripsina hidrolisa sitios hidrofilicos (residuos de lisina ou arginina) na proteina para formar peptideos hidrofilicos. Enzimas como a a-quimotripsina, que hidrolizam sitios hidrofobicos, produzem fragmentos mais hidrofobicos e menos soluvejs al., 1996). A medida da solubilidade do nitrogenio em uma faixa de pH de 3,0 a 7,0, no trabalho de Monti & Jost (1978), mostrou que o hidrolisado produzido com tripsjna foi completamente soluvel em pH neutro e teve mais que 90% de nitrogenio soluvel em pH 6,0. A curvy de solubilidade mostrou um minimo pronunciado (65%) em pH e em pH 3,0, a solubilidade foi novamente prbxima a 100% (Monti & Jost,
1978).

(Mutilangi et

4,5

11.3.2- Fonmagao de Espuma A propriedade de form agao de espum a definida com a criagao e a o de bolhas de gas em um liquido. Assim como na emulsificagao, e de espumas com proteinas, uma rapida difusao da reduzir a tensao superficial, seguida por encapsulamento das bolhas de formagao de um fjlme estabilizagao essencial para a formagao

proteina para a interface ar-agua para

abertura parcial da proteina. Isso ira resultar em um

ar e na associagao das moleculas proteicas levando a

coesivo intermolecular com um certo grau de elasticidade

(de Wit,

1989). Logo, as propriedades moleculares requeridas para a formagao de espuma sao: solubilidade (permitindo rapida difusao para a interface), caracteristicas anfipaticas para interagoes jnterfaciais melhoradas; flexjbilidade para facilitar a abertura da molecula na interface, segmentos interativos para permitir interagoes secundarias nas fases gasosa e aquosa da interface e disposigao de grupos carregados e polares para previnir a coalescencia das bolhas e para permitir a hidratagao (Panyam & Kilara, 1996). A espuma a importante em muitos alimentos, como

coberturas, cremes batidos, merengue, sufle, mousse, sorvete,etc. (Mulvihill & Fox,
1983). Os agentes emulsificantes

tern uma agao meihorada quando utilizados em

(Mangino, 1984). 24

interfaces entre ar e agua que entre oleo e agua

A capacidade espumante (que a medida pelo volume de espuma formado, e usualmente a expressa como %"overrun") e estabilidade da espuma (que se refere tempo decorrido para o colapsamento da espuma) sao as duas caracteristicas comuns das espumas (Nakai & Li-Chan, 1989). As proteinas do soro possuem menos atividade de superficie que as casejnas devido a sua estrutura globular. Em bora a sua solubilidade seja boa, a sua capacidade para estabilizar interfaces a pobre, e isto lim o seu use com its o ingrediente em alimentos (Gauthier et al., 1993). Porem, proteinas que sao soluveis no seu ponto isoeletrico usualmente exibem excelentes propriedades espumantes, aparentemente devido ao fato de o balango de cargas facilitar interagoes extensivas proteina/proteina levando ao fortalecimento do filme, englobando e estabilizando mais ar na espuma (Kinsella & Phillips, 1989). Devido a sua natureza anfipatica, as moleculas de proteina sao tensoativas. A mudanga de condigoes que acompanha a adsorgao na interface pode ser suficiente para causar desnaturagao. Quando uma proteina a adsorvida na interface agua/ar, uma forma alternativa de dobramento da molecula para minimizar a energia Iivre grupos hidrofobicos se torna possjvel; logo, alem do dobramento para o interior aquosa, as cadeias laterais apolares podem se localizar na fase de ar. Isto a formagao de filmes adsorvidos contendo cadeias de aminoacidos que contato com a superficie e caudas de residuos que penetram na "bulkphase". Este fenomeno a melhor observado e desempenhado por moleculas com conformagao molecular pouco organizada ("random coil"), o que nao e o caso das proteinas do soro, que possuem uma estrutura altamente organizada e de forma globular. Por isso a necessario que a sua estrutura terciaria seja modificada para permitir uma major flexibilidade para desnaturagao na interface, o que tera como consequencia uma melhor capacidade espumante. Tem sido demonstrado para polipeptideos, que a a-helice a estavel na interface ar/agua, logo dos da fase pode levar estao em ao mais

a provavel para

proteinas que tais elementos de estrutura ordenada no estado nativo sejam

25

preservados no estado desnaturado da superficie, ou seja, apos o rearranjo da molecula na superficie (Phillips, 1981). Em baixas concentragoes de proteina, a taxa de adsorgao na interface e controlada pela difusao; mas em alta concentragao de proteina isto nao ocorre e existe uma barreira de energia de ativagao para a adsorgao. Sob estas ultimas condigoes, a capacidade das moleculas proteicas para criar espago em um filme existente, penetrar neste e rearranjar-se na interface a primordial (Phillips, 1981).

Em espum continuas em agua, a floculagao e a coalescencia sao as dependentes da natureza das camadas adsorvidas de proteina estabilizada. No estado floculado, filmes finos de agua separam as boihas de ar. As condigoes para equilibrio em tais filmes a que a pressao de disjungao seja igual e oposta a pressao hidrostatica. Na condigao de equilibrio, a dada a seguinte equagao:
7CV+iE+7tS+nH=O

onde:
7rV

atragao de Van der Walls

7tE repulsao eletrostatica its repulsao esterica

7tH

- pressao hidrostatica

(Phillips, 1981) A atragao de van der Walls(7rv) entre as duas faces do filme a negativa, porque assim como a pressao hidrostatica (7tH), ela age afinando-o. A repulsao eletrostatica (7tE) entre as duas superficies carregadas se opoe ao afinamento do filme, assim como o faz a chamada repulsao esterica (its). E considerado que esta ultim possua um efeito de curta duragao, que surge dos efeitos estericos a associados com a aproximagao intima das camadas adsorvidas; a hidratagao dessas camadas se torna critica em tal fenomeno. Filmes transitorios ocorrem

quando a repulsao eletrostatica e a repulsao esterica nao sao grandes o suficiente para compensar as forgas atrativas, e a atragao de van der Walls na equagao se torna dominante. Nesta situagao, o filme drena continuamente ate uma espessura

26

critics ser atingida, na qual o ponto de ruptura pode aparecer pelo crescimento de ondas nas duas superficies do filme (Phillips, 1981).

Existem tres possiveis maneiras pelas quais as propriedades reologicas das camadas de proteina adsorvidas podem contribuir para a estabilidade geral da espuma: (1)A taxa de drenagem de agua da fina lamela aquosa a reduzida quando os filmes

adsorvidos sao viscosos e incompressiveis.

(2)A ruptura da lamela por nucleagao envolve o rompimento das forgas coesivas dentro de duas camadas superficiais, e a energia de ativagao a uma fungao do modulo dilatacional dinamico, que mede a variagao na pressao dos filmes. (3)As celulas de ar sao estaveis contra desproporcionagao quando o modulo dilatacional a major que a tensao interfacial. Parece que a forga das camadas tipo gel adsorvidas,e crucial na determinagao da estabilidade da Liao & Mangino espuma(Phillips,
1981).

(1987) mostraram que a propriedade de formagao de espuma

de concentrados de protelnas do soro correlaciona-se significativamente com o conteudo de R-lactoglobulina e com a extensao da desnaturagao da proteina. Ambos, pH e temperatura podem causar alteragoes na conformagao e estrutura das protelnas do soro, especialmente da R-lactoglobulina Whitehead, 1989). Um nivel de hidrolise lim itado parece ser desejavel para m elhorar as propriedades de formagao de espuma, mas a estabilidade da espuma decresce grandemente como um resultado de tal hidrolise. Isso a provavelmente devido a um aumento do conteudo de polipeptideos inicialmente, o que permite que mais ar seja incorporado. Todavia, os polipeptideos nao possuem a forge requerida para formar uma espuma estavel. 0 decrescimo na estabilidade da espuma manjfesta-se nos 30 minutos inicjais de reagao. Hidrolise posterior provavelmente resultara em polipeptideos com perda da habilidade de estabilizar as celulas de ar da espuma. A (Morr, 1993; Kinsella &

hidrolise limitada pode ser vantajosa para a utilizagao das protelnas do soro com o objetivo de formagao de espuma, uma vez que o volume especifico p8de ser
aumentado em 25% na espuma obtida com o material hidrolisado. 0 decrescimo da 27

estabilidade, resultante da hidrolise limitada pode ser compensado pela adigao de estabilizadores, como CMC (Kuehler & Stine, 1974). As propriedades de formagao de espuma de produtos de proteinas do soro industrials sao afetadas por varios fatores, sendo os m relevantes, a ais concentragao e estado das proteinas do soro, pH, ambiente ionico, tratamentos termicos anteriores e presenga de lipideos. A medida que a concentragao de proteinas do soro aumenta, a espuma se torna mais densa, com bolhas de ar mais uniformes de uma textura fina. Geralmente o "overrun" aumenta com a concentragao de proteina ate um valor maximo, apos o qual ele decresce. Para espumas de CPS, este maximo esta entre 8 e 12% (m/v). As proteinas do soro desnaturadas (agregadas) perdem a habilidade de difundir rapidamente para a interface e de se reorientar para a formagao de um fiime viscoso. Porem este fato pode retardar a drenagem de agua, aumentando assim a estabilidade da espuma. Isso ira afetar positivamente o balango entre formagao e ruptura da espuma 1989). 0 pH da dispersao afeta as propriedades de form agao de espum das a proteinas do soro significativamente. 0 "overrun" e estabilidade da espum a as na maximos sao observados em pH entre 4 e 5. Este fato pode ser explicado pela atragao eletrostatica maxima das proteinas proximo ao ponto isoeletrico. Desde que proteinas nao coagulem, esta interagao induz a formagao de um fiime proteico interface ar/agua, o que aumenta a viscosidade superficial Segundo Liao & Mangino (de Wit, 1989). (1987), a hidrofobicidade da molecula proteica e a (de Wit,

concentragao de grupos sulfidril foram os fatores mais importantes relacionados ao "overrun" em um produto utilizado como cobertura, feito com CPS de soro acido. Essas observagoes sao validas para soro doce tambem concentrado de proteina reconstituido. (Harper, 1991). Um fator im portante para a boa estabilidade da espum e o tratam a ento term do ico 0 volume especifico e a estabilidade aumentam diretamente com a temperatura de aquecimento da solugao de proteina que formara a espuma (Kuehler & Stine, 1974).

28

0 efeito do ambiente ionico nas propriedades de formagao de espuma das

proteinas do soro a complexo. Um "overrun" maximo a conseguido com forga ionica de

0,05 (Nakai & Li-Chan, 1989). Porem, segundo Kinsella (1981), os diferentes (Phillips et ali., ions podem ter efeitos variados nas propriedades de formagao de espuma atraves dos seus efeitos na estrutura da agua e na conformagao proteica 1991). Os fosfolipideos e acidos graxos insaturados causam ruptura da lamela da espuma como resultado da sua alta atividade de superficie e do efeito de redugao espessura do filme proteico (efeito de Gibbs-Marangoni). associagao a importante para eliminar o seu efeito prejudicial a maioria dos lipideos polares podem ser ligados fortemente as proteinas e (de Wit, 1989). da esta Hailing (1981) relatou que

Os peptideos produzidos pela hidrolise de proteinas do soro sao menores e possuem menos estrutura secundaria que as proteinas, sendo esperados comportamentos diferentes nas interfaces agua-oleo e agua-ar (Gauthier et al., 1993). No caso de formagao de espuma, a proteolise limitada por tripsina, produz peptideos com propriedades melhoradas. Areas hidrofbbicas intactas e de grande peso molecular nos peptideos estao presumivelmente associadas com a melhora da funcionalidade dos hidrolisados (Gauthier et al., 1993). Quando as proteases hidrolisam ligagoes peptidicas especificas para promover a redugao do peso molecular, ocorrem possiveis mudangas conformacionais, e aumento da hidrofilicidade devido aos novos grupos carboxil e amino dos aminoacidos expostos como consequencia. Todavia, a hidrofobicidade de proteinas globulares pode aumentar com a exposigao de residuos de aminoacidos apolares com a hidrolise. Estes efeitos de proteolise podem resultar em m udangas drasticas no comportamento funcional da proteina. Propriedades especificas dos hidrolisados sao dependentes do grau de hidrolise, que por sua vez a influenciado pela atividade especifica da protease, carater fisico-quimico do substrato proteico e condigoes de reagao.

29

A estabilidade da espuma formada com clara de ovo a major que a formada por proteinas do soro de leite. Isso porque a glicoproteina presente na clara adsorve e retem agua na lamela, resultando em aumento da viscosidade superficial, aumentando a estabilidade da espuma.Quando os menores peptideos produzidos pela hidrolise sao separados por ultrafiltragao, a capacidade de formar espuma ("foam capacity") do permeado sao comparaveis as da clara de ovo (Muitlangi et al., 1996). Estes mesmos autores sugeriram que os peptideos de alto peso molecular exercem um efeito inibitorio nas caracteristicas espumantes dos peptideos de baixo peso molecular por interagao hidrofobica ou por efeito esterico na interface. A separagao de peptideos de baixo peso molecular por ultrafiltragao afetou as propriedades funcionais dos retentados ou permeados. Os retentados tiveram alta solubilidade e meihores propriedades emulsificantes, mas nao formaram espuma; enquanto os permeados tiveram boas propriedades de formagao de espuma, mas nao formaram emulsoes. 0 controle do tamanho dos peptideos a essencial, se (Chobert et al., 1988),com niveis de da mudangas nas propriedades funcionais sao desejadas. Este controle pode ser feito pelo use de proteases altamente especificas hidrolise baixos. Nao estao ainda claras que propriedades moleculares sao criticas para a capacidade de formagao da espuma e quais sao criticas para a estabilidade espuma (Panyam & Kilara, 1996; Mutilangi et al., 1996). Segundo Phillips et al. (1994), a formagao de filme proteico em espuma e a

influenciada pela capacidade da proteina em diminuir a tensao superficial, enquanto estabilidade da espuma depende da natureza do filme e reflete a extensao da interagao proteina-proteina na matriz. A estabilidade da espuma a aumentada pelos dominios proteicos flexiveis, os quais aumentam a viscosidade da fase aquosa, concentragao de proteina e espessura do filme. A natureza dos peptideos gerados e suas interagoes no filme proteico na interface sao responsaveis por diferengas estabilidade da espuma (Mutilangi et al., 1996). Os fatores estruturais que governam as propriedades de formagao de espuma sao a flexibilidade da proteina, ou instabilidade e interagao proteina-proteina na

as na

interface ar-agua. 0 aquecimento a seco das proteinas do soro pode causar

30

desnaturagao parcial, na qual a flexibilidade ou instabilidade a aumentada e a interagao proteina-proteina a meihorada para formar uma espuma com filme reforgado (Ibrahim et al., 1993). 0 conceito classico de Bigelow de hidrofobicidade proteina assume valores para aminoacidos individuais baseados na energia requerida para a transferencia um ambiente aquoso para um nao-aquoso. Em proteinas globulares, todavia, devido a sua estrutura secundaria e terciaria, alguns dos residuos hidrofobicos nao sao expostos na superficie. A hidrofobicidade de uma proteina pode ser menor que soma das hidrofobicidades dos seus residuos de aminoacidos constituintes, e e descrito como a sua hidrofobicidade superficial ou efetiva. A alta hidrofobicidade acompanhada por alts viscosidade e dispersibilidade moderada foram associadas com btimas propriedades espumantes (Panyam & Kilara, 1996). a de

A hidrofobicidade superficial pode mudar como resultado de tratamento termico tanto quanto como resultado de hidrolise. As interagoes facilitadas por grupos hidrofobicos superficiais podem levar a redugao na hidrofobicidade efetiva. Mudangas na hidrofobicidade superficial como resultado da proteolise influenciam propriedades funcionais, especialmente as propriedades interfaciais dos hidrolisados. A este respeito, as diferengas no numero total de grupos hidrofobicos gerados ou expostos por hidrolise varia com a enzima e grau de hidrolise causando variagoes na hidrofobicidade superficial. lnteragoes hidrofobicos entre peptideos, associadao expontanea envolvendo pontes de hidrogenio, interagoes ionicas e ligagoes dissulfeto ainda afetam a hidrofobicidade superficial No trabalho realizado por Mutilangi et al. (Mutilangi et al., 1996). as

(1996), com o aquecimento de IPS

para a produgao do IPS term desnaturado, foi observada um redugao na o a hidrofobicidade superficial. Este decrescimo pode ser explicado pelo fato que a desnaturagao termica e subsequente agregagao das moleculas desnaturadas e mediada por reagoes hidrofobicas e ligagoes dissulfeto (Hill et al., 1982). Aumento (Mutilangi et al., 1996). A da interagao hidrofobica pode levar ao decrescimo da hidrofobicidade superficial devido a redugao dos residuos hidrofobicos expostos

31

ausencia de uma relagao linear entre hidrofobicidade superficial e grau de hidrolise, em hidrolisados obtidos pela agao da tripsina, conforme foi observado por al. (1996), a influenciada pelo numero e natureza dos peptideos gerados. Um balango de residuos hidrofilicos e hidrofbbicos a essencial para boas Mutilangi et

propriedades interfaciais. Dois peptideos obtidos por hidrolise com tripsina da

lactoglobulina (correspondente aos residuos de aminoacidos exibiram propriedades interfaciais meihoradas, conforme havia sido presumido. Do estudo de uma fragao peptidica produzida a partir de proteinas do soro pela com binagao de um tratam ento term e proteolise lim ico itada, seguida de ultrafiltragao, peso molecular superior a 5000Da e areas hidrofobicas intactas foram essenciais para boas propriedades emulsificantes Ney (1971) apud Nakai & Li-Chan (Panyam & Kilara, 1996).

0-

21-40 e 41-60)

(1989) propos que peptideos com sabor

amargo tern uma hidrofobicidade maior que 1400 Kcal por residuo, nao importando

a
o

sequencia de aminoacidos dos peptideos, e que proteinas com uma alta

hidrofobicidade tern tendencia em produzir peptideos amargos na hidrolise. Embora sabor amargo seja geralmente relacionado a hidrofobicidade dos aminoacidos nos peptideos, este efeito depende da extensao de exposigao das cadeias laterals hidrofobicas ao solvente para permitir o contato com os receptores bucais para sabor (Nakai & Li-Chan, 1989). Adler-Nissen (1976) sugeriu que a extensao da o cadeia polipeptidica a inversamente proporcional ao grau de hidrolise, o que este e principal determinante de sabor e funcionalidade dos hidrolisados.

11.3.3- GelatinizaCao
As proteinas do soro presentes em solugoes de CPS possuem a importante

propriedade de formar gels estaveis sob aquecimento a 70-90C. 0 processo de

gelatinizagao a dividido em duas etapas:

(1) desnaturagao inicial da molecula proteica

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(2) formagao de um agregado tri-dimensional (Harper, 1991)

As reagoes iniciais que ocorrem no processo de gelatinizagao envolvem

enfraquecimento e quebra de pontes dissulfidicas e de hidrogenio para romper a estrutura conformacional nativa da proteina e dispersar os agregados de proteinas. segundas reagoes envolvem polimerizagao das moleculas de proteinas dissociadas e desnaturadas para produzir uma estrutura proteina tri-dimensional capaz de imobilizar fisicamente a major parte do solvente atraves de formagao de ligagoes intermoleculares dissulfidicas, hidrofobicas e ionicas (Morr, 1993). 0 As

processo de gelatinizagao a favorecido se o passo de desnaturadao proteica

preceder o passo de polimerizagao. Esta sequencia de eventos perm que ite moleculas de proteinas nao abertas possam se orientar e formar uma estrutura bem ordenada que favorega a gelatinizagao em vez da coagulagao. 0 processo de gelatinizagao a completado pelo resfriamento e estocagem para que as proteinas continuem a polimerizar e interagir com agua adicional via ponte de hidrogenio (Morr, 1993). As reagoes de gelatinizagao requerem um balango proprio entre forgas de repulsao e atragao entre as moleculas de proteina e a agua e entre as moleculas de proteinas (Morr, 1993).

Uma concentragao minima de proteina a necessaria para a gelatinizagao, e o aumento nessas concentragoes acima deste valor minimo, diminui o tempo requerido para formar o gel (Gupta & Reuter, 1992). Baixas concentragoes de proteina favorecem as interagoes intramoleculares, que faiham em formar a estrutura do gel. A determinagao da concentragao de proteina minima requerida para formar o gel a baseada no teste da "concentragao minima formadora de gel" (least concentration endpoint). 0 teste a feito, geralmente, a partir do aquecimento uma serie de concentragoes de proteinas a 80C por 30 minutos. A menor concentragao de proteina que conseguir formar gel a tida como a "concentragao minima formadora de gel" (Morr, 1993). de

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A gelatinizagao dos produtos a base de proteinas do soro a de particular importancia em produtos

cameos reestruturados, pudins e bolos. As proteinas do

soro tem lido promovidas como possiveis substituintes para as proteinas do ovo nas aplicagoes para gelatinizagao, incluindo bolos e produtos carneos. Todavia a variabilidade na composigao e nas propriedades das preparagoes de proteina do soro prejudicam a sua utilizagao (Harper, 1991).

A hidrolise a presumivelmente prejudicial as propriedades de gelatinizagao das proteinas. 0 aum ento no num de cargas expostas resulta em repulsao ero aumentada entre os peptideos, diminuindo a sua habilidade em formar gel. A hidrolise por tripsina de proteinas do soro com grau de hidrolise entre 2,3% e 6,7% previniu a gelatinizagao em pH 3,0 e pH 7,0, porem a utilizagao de outras proteases pode causar uma melhora nesta propriedade. Isto sugere que a possivel usar hidrolisados obtidos a partir da hidrolise com tripsina em altas concentragoes em bebidas acidas sem ter como consequencia a gelatinizagao 1996). A hidrolise possui uma variedade de efeitos nas propriedades de gelatinizagao das proteinas e pode tanto inibir quanto promover o processo. De qualquer forma, ambos efeitos podem ser vantajosos para o processamento de alimentos Kilara, 1996). (Panyam & (Panyam & Kilara,

11.4-Estabilidade Tarmica As proteinas do soro de leite possuem estrutura altamente organizada e estabilizada por pontes dissulfidicas principalmente. Devido a este fate, a sua

resistencia a tratamentos termicos a baixa e temperaturas maiores que 70C estao

associadas com desnaturagao e agregagao das moleculas. Segundo trabalho realizado por Hidalgo & Gamper (1977), a estabilidade termica dos concentrados de proteinas do soro pode ser aumentada com o use da hidrolise por tripsina & Gamper, 1977). (Hidalgo

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A hidrolise por tripsina aum entou a estabilidade term ica do CPS consideravelmente. Por exemplo, mais que permaneceu soluvel apos aquecimento a 80% da proteina hidrolisada 134C por 5 minutos. As perdas na (ate 10%). As solucoes de

solubilidade sob tratamentos termicos brandos foram pequenas. 0 CPS hidrolisado por tripsina foi soluvel ainda em altas concentracoes tiveram uma aparencia leitosa e foram livres de "off-flavors" e sabor amargo. Alem tudo, o produto manteve as boas propriedades emulsificantes do CPS. 0 CPS hidrolisado por tripsina foi composto de aproximadamente 70% (extrato seco) de peptideos ultrafiltraveis e um grupo de relativo alto peso molecular. A quantidade de aminoecidos Iivres foi pequena (Hidalgo & Gamper, 1977).

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