Cours de biotechnologies

Hamid MAZOUZ
Laboratoire de Biotechnologies Végétales
&
Biologie Moléculaire

Unité de Mycologie Appliquée

Introduction aux Biotechnologies
Les organismes génétiquement modifiés

Les techniques de diagnostic par utilisation de

sondes nucléiques

Les techniques de diagnostic par PCR

La RT-PCR et la PCR quantitative

La production de protéines recombinantes

La synthèse d’hormones par les cellules procaryotiques

Clonage d’organe et thérapie génique

Introduction aux Biotechnologies
 1) Définition de la Biotechnologie

La biotechnologie a été définie comme

<<l'application des principes scientifiques et de

l'ingénierie à la transformation de matériaux par

des agents biologiques pour produire des biens et

services>>.
Ensemble des sciences et des techniques qui

s’appliquent aux ressources du vivant (tissus,

cellules, protéines…), en les considérant comme

objet d’études, produits ou modèles, afin de

concevoir des connaissances, des produits ou des

services (santé humaine ou animale,

agroalimentaire, chimie, environnement)

La biotechnologie, ou « technologie de bioconversion »

comme son nom l'indique, résulte d'un mariage entre la

science des êtres vivants – la biologie – et un

ensemble de techniques nouvelles issues d'autres

disciplines telles que la microbiologie, la biochimie, la

chimie, la biophysique, la génétique, la biologie

moléculaire, l'informatique…
Par abus de langage, on restreint souvent la

Biotechnologie au domaine du génie génétique et aux

technologies issues de la transgénèse, permettant en

particulier d'intervenir sur le patrimoine génétique des

espèces pour le décrypter ou le modifier

La Biotechnologie est pratiquée depuis fort
longtemps, mais a connu un essor dernièrement
avec le développement de la biologie moléculaire.

2/ Biotechnologies traditionnelles
Fermentations alimentaires :
Fabrication des vins;
des pains;
des yaourts;
et des fromages.
3/ Biotechnologies actuelles

Manipulations génétiques.

Décryptage du génome.

Modification des génotypes par le transfert des

gènes d’un individu à l’autre (transgénèse) : Génie

Génétique. On obtient des organismes

génétiquement modifiés (OGM).

 Les organismes génétiquement
modifiés

Un organisme génétiquement modifié (OGM) est un

organisme vivant transgénique. C’est un organisme
dont le patrimoine génétique a été modifié par
l'Homme.
L’introduction d’un gène dans le patrimoine génétique d’une
plante s’effectue essentiellement selon deux méthodes :
transfert de l’A.D.N à l’aide de bactéries : on utilise ces
bactéries du sol qui transfèrent naturellement une partie de leur
ADN dans les cellules de certaines plantes et provoquent ainsi
la modification de cellules ; on remplace dans ces bactéries les
gènes responsables de la maladie par les gènes que l’on veut
transférer.
transfert direct : l’A.D.N est transféré à l’aide de microbilles
qui sont projetées sur des cellules avec un canon à particules.
Le transfert d'un gène à l’aide de bactérie se fait en six étapes :

L'extraction de l'ADN source

L'extraction d'un plasmide bactérien

La digestion par un enzyme de restriction

Le mélange et la ligation des bouts d'ADN et de plasmides

La transformation d'une bactérie à l'aide des plasmides

recombinés

La sélection et le criblage des clones

 1/ Extraction de l’ADN
La première étape consiste à extraire l'ADN contenu dans des
cellules ou des tissus. L'extraction d'ADN peut se faire selon
différentes méthodes qui comprennent généralement les
étapes suivantes :
• Lyse des cellules (on brise les membranes afin de libérer le
contenu cellulaire)
• Élimination des membranes, organites et protéines
• Élimination des autres acides nucléiques à l'aide
d'ARNases
• Concentration de l'ADN
 2/ Extraction de plasmides

Un plasmide est une molécule d'ADN circulaire distincte du

chromosome qui est capable de réplication autonome.
Certains plasmides contiennent des gènes (ex. gènes de
résistance aux antibiotiques) que les bactéries peuvent
échanger par conjugaison.
Les bactéries peuvent également acquérir de nouveaux
plasmides par la transformation.
Dans cette exemple, le plasmide contient un gène
de résistance à l'antibiotique ampicilline (ampr)
et un gène permettant à la bactérie d'hydrolyser
le lactose (lacZ). Le site de restriction de l'enzyme
ECOR1 est situé dans le gène lacZ.
L'extraction d'ADN plasmidique se fait généralement par la technique de
la lyse alcaline. Elle permet d'isoler spécifiquement l'ADN plasmidique
en éliminant l'ADN du chromosome bactérien. Elle se fait généralement de
la façon suivante :
• Lyse des cellules à l'aide d'un détergent à pH 13.
• L'ADN est dénaturé (les deux brins se séparent) à ce pH élevé.
• La neutralisation rapide fait en sorte que l'ADN tente de se rapparier.
• L'ADN chromosomique étant très long n'arrive pas à se rapparier
complètement et forme des enchevêtrements insolubles.
• L'ADN plasmidique plus court arrive à se reformer et demeure en
solution.
• Séparation des composants cellulaires par centrifugation.
• Les membranes, les protéines et l'ADN chromosomique vont
précipiter.
• Les plasmides demeureront dans le surnageant.
• Les ARN sont éliminés par des ribonucléases.
• L'ADN plasmidique est concentré par précipitation à l'alcool ou à l'aide
d'une colonne chromatographique échangeuse d'ions.
3/ Digestion des ADN par des enzymes de restriction
Une fois l'ADN chromosomique et plasmidique isolés, on doit

les couper à l'aide d'enzymes de restriction. Ceci permettra

de couper l'ADN chromosomique en plusieurs morceaux

plus ou moins longs. Le plasmide ne sera coupé qu'à un

endroit (site de restriction) ce qui aura pour effet d’inactiver le

gène qui le contient.

Les enzymes de restriction sont principalement d’origine

bactérienne, capables de couper l’ADN double brin (et ce

quelque soit son origine) à des endroits spécifiques

(séquences nucléotidiques) appelés sites de restriction

généralement de 4 à 6 paires de bases.

 Produite par une souche d’Escherichia
coli qui porte le gène cloné AluI de
Arthrobacter luteus

Produite par Haemophilus aegypticus

Produite par Bacillus amyloliquefaciens

Produit par Haemophilus influenzae

Produit par Escherichia coli

Les sites de restriction sont généralement des palindromes,

c'est-à-dire des textes qui peuvent se lire dans les deux sens.
Les deux premières enzymes entrainent une coupure franche
c'est-à-dire au même niveau sur les deux brins ; ce sont les
bords ou les bouts francs : la coupure a lieu au milieu du site de
restriction. Il ne peut pas y avoir de liaison spontanée entre les
fragments qui ont résulté de cette coupure.
Seule une T4 ligase peut rétablir la ligation des deux brins
G¶$'1UpVXOWDQWGHODcoupure.

ADN avant la coupure ADN1 ADN2

5’CCCĻGGG 3¶ 5’CCC 3’ 5’ GGG 3’
3’GGGĻCCC 5¶ 3’GGG 5’ 3’ CCC 5’
Les trois dernières enzymes provoquent une coupure décalée

sur les deux brins. On parlera alors d’extrémités cohésives. Les

bouts des deux ADN obtenus ne sont plus francs ; ce sont des

bouts collants ou bouts cohésifs.

Les coupures sont décalées l’une par rapport à l’autre sur les

deux brins. Les parties simples brins peuvent s’apparier, d’où la

possibilité de lier des fragments d’ADN d’origine différentes :

c’est le phénomène de la recombinaison génétique.

Dans l'exemple suivant, on utilise EcoRI provenant de E coli.
 4/ La ligation

La ligation consiste à relier des molécules d'ADN à l'aide

de l'enzyme ADN ligase qui forme des liaisons
phosphodiester entre les nucléotides. La ligation reforme
une molécule d'ADN bicaténaire.
Plasmide reconstitué Plasmide recombiné ADN étranger circulaire
5/ La transformation d'une bactérie à l'aide des
plasmides recombinés
 6/ Création d’une variété OGM : cas des végétaux

Après identification, isolation, intégration et multiplication

du gène d'intérêt, on doit ensuite l’introduire dans la plante
d'intérêt commercial.

On utilise souvent une bactérie du sol nommée

Agrobacterium qui transfert les gènes dans le génome de
certaines cellules de la plante : transformation biologique.
On peut aussi transférer le gène d’intérêt par méthode
directe : transfert directe.
- Le transfert direct fait intervenir :

• soit une projection d'ADN dans les cellules de la plante par

l'utilisation d'un canon à particules qui projette dans les

cellules des microparticules enrobées d'ADN (biolistique),

• soit l'introduction d'ADN dans des protoplastes, par action

d'un agent chimique (PolyEthylène glycole = PEG) ou d'un

champ électrique (électroporation).

Régénérer et évaluer les plantes transformées :

• régénération in vitro des cellules transformées;

• analyse des plantes régénérées pour confirmer

l'insertion du gène d’intérêt dans leur génome. Des

analyses moléculaires sont conduites dans ce sens.

Des études sur l'expression du gène ont lieu à plusieurs

stades, ce qui permet de caractériser le niveau

d'expression et le comportement de la plante exprimant

le nouveau caractère.
Incorporer dans une variété commerciale :

Les plantes transformées obtenues sont soumises à des

croisements contrôlés pour étudier les modalités de
transmission du nouveau caractère à la descendance.
La transformation et la régénération étant des opérations
délicates, le génotype de la plante choisie est celui facilitant
ces étapes. C'est pourquoi les plantes retenues sont ensuite
soumises à une succession de rétrocroisements afin
d'introduire le gène dans le matériel élite et d'obtenir de
nouvelles variétés commerciales exprimant ce caractère.
Les sondes nucléiques
Une sonde nucléique est une molécule d’acide nucléique,
antiparallèle et complémentaire d’une séquence spécifique
d’un génome, capable de reconnaitre par hybridation et de
marquer cette séquence pour permettre son identification ou
son isolement.

Le mécanisme fondamental de la technique de diagnostic

par sondes nucléiques est la liaison (hybridation) de l’ADN,
issus d’un échantillon suspecté de contenir un agent
pathogène (l’«inconnu»), avec de l’ADN hautement
caractérisé dérivé au préalable d’un agent pathogène
intéressant (l’ADN « connu »).
 1/ Hybridation moléculaire
L’hybridation moléculaire = réassociation de deux brins
complémentaires d’acides nucléiques, mélange d’ADN et
d’ARN ou d’ADN exclusivement.

• En élevant la température jusqu’à la Tm, on disjoint 50 %

environ des liaisons hydrogène qui unissent les brins de
DNA, ce qui dénature partiellement la double hélice.
• Lorsque la température atteint 95°C, toutes les liaisons
hydrogène sont rompues et la dénaturation du DNA est
complète : DNA simple brin.
• En refroidissant brutalement (glace) les structures secondaires

ne se reforment pas et le DNA reste dénaturé.

• Si on refroidit doucement, la double hélice se reforme

progressivement. Un oligonucléotide (sonde) ajouté à ce moment

peut s’hybrider avec un fragment complémentaire du DNA, dès

que la température descend en-dessous de la Tm.

 HYBRIDATION MOLECULAIRE

sb

db

température
Tm
Simple brin

glace
ADN ADN
double brin simple brin

refroidissement progressif
Dénaturation REAPPARIEMENT
- chauffage > Tm
- agent dénaturant HYBRIDATION
Principe de l’hybridation
 Les GLIIpUHQWVW\SHVG¶K\EULGDWLRQ
L’hybridation peut avoir lieu

1 - en solution

2 - sur support solide :

immobilisation sur membrane (nitrocellulose,
nylon), sur verre
3 – hybridation in situ
colonies bactériennes
chromosomes
coupe de tissus...
Objectif : détecter la présence d'un acide
nucléique d'une séquence donnée par
O¶XWLOLVDWLRQ G¶XQ fragment G¶$'1 complémentaire
= sonde
 1-1/ Hybridation en phase liquide

Segments complémentaires dans une solution contenant un

tampon et de la formamide.

L’agitation thermique assure la liaison entre les fragments

complémentaires.

Les hybrides formés sont quantifiés par spectrophotométrie

ou par mesure de la radioactivité.

 1-2/ Hybridation sur support solide
La séquence complémentaire cible est immobilisée sur un support
solide. Cette méthode facilite la séparation des fractions hybridées de
celles non hybridées. Cependant, la vitesse d’hybridation est
nettement inférieure à celle de la phase liquide (jusqu’à 10 fois).
Cette hybridation s’effectue avec plusieurs types de supports qui
permettent d’immobiliser les brins d’acides nucléiques :
• La nitrocellulose
• Les membranes synthétiques (à base de nylon)
Hybridation sur support
 1-3/ Hybridation in situ (HIS)

C’est une technique qui permet, par l’utilisation de sondes, de mettre en

évidence et de repérer, dans des cellules ou des tissus, des séquences d'acides

nucléiques connues. Elle est très proche, dans son principe, du Southern et du

Northern Blot et repose, comme eux, sur l'hybridation d'une sonde d'acide nucléique

(ADN ou ARN) marquée avec une séquence complémentaire d'acides nucléiques

que l'on cherche à identifier et à localiser.

La seule différence est que les Southern et Northern Blot se font sur des broyats

de tissus, alors que l'HIS s'effectue sur une coupe histologique de tissu.

Permet la localisation des gènes sur des chromosomes en métaphase;

la recherche de bactéries qui ont intégré un plasmide ou un phage recombinant

 2/ Les sondes moléculaires et leur préparation

Morceaux d’ADN ou d’ARN utilisés sous forme de monobrins pour

sélectionner par complémentarité des bases, un fragment d’acide
nucléique inconnu et présentant un intérêt.

2-1/ Types de sondes

Les sondes génomiques. Copies simples brins d’un gène, obtenues
à partir du génome tout entier. Elles peuvent renfermer tout ou une
partie d’un gène. Donc on peut y retrouver des introns (portion non
codante), des portions de séquences régulatrices.
• Les sondes d’ADNc. Copies monobrins d’ARNm obtenues par
transcription inverse. A la différence des sondes génomiques, elles
ne renferment pas des introns.
• Les oligonucléotides. Séquences d’une vingtaine de nucléotides
synthétisés artificiellement à partir du moment où la séquence d’une
partie d’ADN est connue ou lorsqu’on a pu purifier la protéine
spécifiée par le gène recherché. Dans ce cas, on procède à la
reconstitution du gène à l’aide du code génétique et on en établit les
oligonucléotides.
• L’insert. Morceau représentatif d’un gène. Il est obtenu après
digestion d’une portion de gène par une enzyme de restriction. Il
peut être intégré dans un ADN à reproduction rapide et autonome
appelé vecteur, pour y être multiplié.
Il permet d’identifier un gène correspondant dans un pool de
morceaux d’ADN.
• Les sondes à ARN. Elles sont obtenues en insérant un gène
d’intérêt dans un plasmide renfermant au moins un promoteur actif
capable de le transcrire. Le transcrit permet ultérieurement par
complémentarité de bases de repérer le gène correspondant dans
un mélange de fragments d’ADN.
 2-2/ Marquage des sondes
Pour visualiser l'hybridation de la sonde il faut être capable de la
repérer en y fixant une molécule repérable. On distingue le marquage
dit « chaud » utilisant des isotopes radioactifs, et les marquages
« froids » qui utilisent des molécules aux propriétés fluorescentes,
luminescentes.

2-2-1/ Marquage par la polynucléotide kinase

Un Phosphore radioactif (marquage au 32P ou 33P) est transféré en
5' à la place du P normal (que l'on retire à l'aide d'une phosphatase)
à l'aide d'une kinase. La révélation se fera alors par
autoradiographie.
 2-2-2/ Marquage par la terminale transférase
Cette enzyme ajoute à l’extrémité 3’OH de l’ADN une queue poly
C en présence de dCTP (desoxycytidine-triphosphate) radioactif
(marqué au α32 P).

2-2-3/ Marquage par nick translation

Cette technique repose sur le principe d’une synthèse semi-
conservative de l’ADN.
Elle utilise 2 enzymes :
* DNase I pour générer quelques coupures simples brin dans le
fragment d'intérêt.
* DNA polymérase I pour dégrader l'ADN dans sens 5'-3' au
niveau de ces coupures et repolymériser en présence d'un nucléotide
chaud.
Marquage par Nick Translation

La DNAse génère quelques cassures aléatoires

simple brin

Au niveau des cassures la DNA polymérase I détruit

l’ADN par son activité exonucléasique (5’-3’)….

… et le synthétise par son activité polymérase en

Présence de nucléotides dont un est marqué
 2-2-4/ Marquage par amorçage au hasard (Random priming)
Dans cette technique de marquage, les deux brins d’ADN de la
sonde sont préalablement séparés par chauffage suivi d’un
refroidissement brutal. Puis, on ajoute un mélange d’oligonucléotides
(hexanucléotides) de synthèse correspondant à toutes les combinaisons
mathématiquement possibles (soit 46 = 4096 nucléotides).
Ces oligonucléotides vont s’hybrider avec la sonde pour une partie
d’entre eux.
Les oligonucléotides fixés vont servir d’amorces au fragment de
Klenow de l’ADN polymérase I qui va reconstituer l’intégrité des
deux fragments en présence de désoxynucléosides triphosphates
marqués au 32P.
Des ADN polymérases par exemple dérivée du phage T7 sont
actuellement les plus utilisées.
2-2-5/ Marquages froids : fluorescence ; colorimétrie;
chimioluminescence

Fluorescence

Colorimétrie :

Colorants : biotine, digoxygénine, fluoresceine

Chimioluminescence

La chimioluminescence se produit au cours d'une réaction chimique

lorsque l'excès d'énergie est libéré sous forme de lumière.

3/ Exemple d’utilisation de sondes nucléiques pour le diagnostic :
cas de la drépanocytose (anémie falciforme).

L’électrophorèse de l’ADN du gène HBB, qui code pour la chaîne ß des

globines est révélée par deux sondes : l’une spécifique de la séquence
normale, l’autre de celle de la protéine mutée.
L’ADN d’un sujet est révélé par la seule sonde normale s’il possède
deux gènes HBB normaux (homozygote normal), par la seule sonde de la
protéine mutée s’il possède deux gènes HBB responsables de la mutation
(homozygote muté) et par les deux sondes s’il possède un gène normal et
un gène de la protéine mutée (hétérozygote).
Les sujets homozygotes mutés sont atteints d’anémie falciforme et
sujets à des crises graves. Les sujets hétérozygotes sont porteurs du
« trait drépanocytaire », ils n’ont que peu de troubles mais ils transmettent
le gène à leurs descendants.
Réaction de Polymérisation en

Chaine (PCR)
 Un peu d’histoire…

1953 : Découverte de la structure en double hélice de l’ADN par James Dewey

Watson, (prix Nobel de physiologie ou médecine en 1962).
1956 : Découverte de l’ADN polymérase ADN dépendante (ADN pol I) par Arthur
Kornberg (prix Nobel de physiologie ou médecine en 1959).
1970 : Co-découverte indépendante de l’ADN polymérase ARN dépendante par
Temin HM et Baltimore D (prix Nobel de physiologie ou médecine en 1975).
1986 : Première publication publique sur la PCR par Kary Mullis (prix Nobel de
chimie en 1993).
1988 : Première PCR réalisé avec une ADN polymérase thermostable, provenant
de Thermus aquaticus, par Saiki RK.
1991 : Première détection du produit de PCR par sonde (sonde d’hydrolyse) par
Holland PM.
1992 : Invention de la PCR en temps réel par Higuchi R.
La PCR (polymerase chain reaction) permet d’amplifier spécifiquement
une région de DNA double brin de quelques centaines de paires de bases.
Ce DNA doit d’abord être séparé en simples brins (dénaturation à 95°C).
 1/ Réalisation pratique

- Microtube
- ADN à amplifier ou matrice : 50ng à 500ng
- les 2 amorces
- dNTP
-Taq Polymérase
- tampon avec Mg++

Volume final : 20 l à 100 l

- Appareil : Thermocycler
On ajoute au DNA de départ une large quantité d’amorces
(oligonucléotides synthétiques complémentaires des deux extrémités de la
région à amplifier) qui vont s’hybrider à 50-60°C environ avec la séquence
complémentaire sur chacun des brins de DNA, et les quatre dNTP qui
serviront de substrats.
On soumet le tout à l’activité d’une DNA polymérase (Taq polymerase) qui
synthétise à 72°C un brin complémentaire à partir du 3’OH de l’amorce
hybridée. On obtient quatre brins de DNA.
On recommence à dénaturer ces 4 brins, puis on les laisse s’hybrider
avec les amorces (toujours en excès) et la polymérase entre en action pour
aboutir à 8 brins de DNA.
Et ainsi de suite 30 à 40 fois, ce qui aboutit à 34359738368 brins de DNA
(34 milliards), ce qui représente une quantité suffisante pour étudier le
fragment de DNA amplifié.
 2/ Utilisation des produits PCR

2-1/ Mise en évidence de mutations ponctuelles par

hybridation des produits PCR avec des sondes oligo-
nucléotidiques (« dot-blot »

Les produits PCR peuvent après transformation en monobrins

être hybridés avec des sondes oligonucléotidiques fixées sur un

support solide. Ces sondes correspondent à des séquences

normales et pathologiques (présence de mutations ponctuelles

par exemple) pour un gène donné.

 2-2/ Analyse de restriction

Digestion enzymatique du produit PCR par une enzyme de

restriction.
Si une mutation ponctuelle modifie le site de restriction
initialement présent, la taille des fragments d’ADN obtenus après
digestion sera modifiée et décelable après électrophorèse des
fragments d’ADN (sur gel d’agarose ou gel de polyacrylamide).
Site de restriction de l’enzyme Dde I : C / TNAG (N = A, T, C ou G).
2-3/ Introduction du produit PCR dans un vecteur :
clonage du produit PCR.

2-4/ Séquençage direct du produit PCR.

 3/ Variantes de la PCR

La technique PCR a évolué considérablement. De nouveaux types

de PCR ont été introduits.

• La PCR « Multiplex » pour amplifier des gènes avec de

nombreux exons (le gène CFTR impliqué dans la mucoviscidose
possède 27 exons), il est possible d’introduire dans le milieu
d’amplification des couples d’amorces spécifiques différentes.

• La PCR dite « Nested PCR ». Elle correspond à une seconde

PCR réalisée en utilisant des nouvelles amorces situées à l’intérieur
du domaine défini par les amorces de la première PCR.
Nested
PCR

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• La RT-PCR. Elle se déroule en deux phases :
Copie d’ARN messager en ADN complémentaire

(ADNc);

et réaction PCR classique sur le ADNc synthétisé.

Trois stratégies pour synthétiser un premier brin d’ADNc :
a – Initiation aléatoire

b – amorce oligo (dT)

c – amorce spécifique
• La PCR quantitative ou PCR en temps réel (QPCR)
 C’est une technique destinée à pouvoir quantifier la quantité d’un
type d’ARN ou d’ADN initialement présent dans un échantillon.
 C’est une technologie ayant de nombreuses applications, basée sur
une réaction enzymologique, la PCR et sur la mesure en continue de
son produit. A chaque cycle d’amplification, la quantité d’ADN total
ou d’amplicon est mesurée grâce à un marqueur fluorescent.
 L’obtention de la cinétique complète de la réaction de
polymérisation permet d’obtenir une quantification absolue ou relative
de la quantité initiale d’ADN cible, ce qui était très difficile à obtenir
en PCR en point final.
 Chimies de détection

􀃘 Intercalant de l’ADN : SYBER-green

􀃘 Quenching : Sonde d’hydrolyse (taqman)

CYBR Green
 􀃘 Quenching : Sonde d’hydrolyse (taqman)

On utilise des sondes = oligonucléotides à l’extrémité 5’ desquels est

attaché un groupe fluorescent qui sert de rapporteur et à l’extrémité 3’
un groupe suppresseur qui absorbe la fluorescence du premier.
La sonde s’hybride à un site de la séquence-cible situé en aval de celui
des amorces.
Pendant l’élongation de l’amorce, l’activité nucléase de 5’ vers 3’ de la
polymérase Taq clive la sonde et sépare le groupe fluorescent
rapporteur du groupe suppresseur ce provoque une augmentation du
signal
Stratégie du diagnostic bactériologique direct de la coqueluquche
 Protéines recombinantes

Définition

Protéines recombinantes = protéines produites par des

cellules dont l'ADN a été modifié par recombinaison

génétique.
 Pourquoi produire des protéines recombinantes ?

• L’étude des phénomènes se produisant dans les êtres

vivants.

• La production de médicaments.

• La production de vaccins.

• La production d’enzymes pour l’industrie.

• La production de protéines modifiées.

 La production de protéines recombinantes s'appuie sur :
• l'emploi d'un vecteur d'expression (en général un plasmide ou un
virus), jouant le rôle de transporteur génétique du gène d'intérêt codant
pour la protéine recherchée ;
• l'utilisation d'une cellule hôte, chargée d'exécuter les instructions
fournies par le gène d'intérêt qui lui est inséré, dans l'objectif de
synthétiser la protéine recherchée ;
• une phase de production proprement dite permettant de fabriquer les
volumes de protéines souhaités ;
• enfin, une séparation et extraction de la protéine du milieu de
culture, suivie par une purification de celle-ci.
La production de protéines recombinantes se base sur la
technologie de clonage.
 1/ Facteurs importants pour la production de protéines
hétérologues
a- Le vecteur d’expression

• Un vecteur d’expression idéal doit être stable et en grand

nombre de copie dans l’hôte.

• Il doit posséder :
– Un marqueur de sélection
– Un promoteur
– Un site de liaison aux
ribosomes
– Un signal de
recombinaison
1/ Facteurs importants pour la production de protéines
hétérologues

b- La cellule hôte

• Elle doit pousser en grande densité dans des fermenteurs.

• Son temps de génération doit être le plus court possible.
• Le milieu de culture doit avoir le pris le plus bas possible.
• La maturation des protéines doit s’effectuer comme la protéine
naturelle.
1/ Facteurs importants pour la production de protéines
hétérologues

c- L’expression de la protéine

• De préférence la protéine sera excrétée dans le milieu.

• Elle doit être identique à la protéine naturelle.
• Elle doit avoir une activité correcte et ne pas être immunogène.
1/ Facteurs importants pour la production de protéines
hétérologues

d- Extraction et purification

• La protéine doit être soluble et facile à purifier.

• Le coût global / rendement du système doit être favorable.
 2/ Vecteurs d’expression utilisés

• Les plasmides.
• Les phages.
• Les cosmides.
• Les YACs (Yeast artificial chromosome).
• Les BACs (Bacterial artificial chromosome).
 Taille maximum de l’insert en fonction du vecteur

Plasmide bactérien 15 kbp

Phage λ 25 kbp

Cosmide 45 kbp

BAC 100-350 kbp

YAC 300-500 kbp

 3/ Hôtes utilisés pour la production de protéines
recombinantes
a- Les bactéries

Escherichia coli :
• Premier hôte utilisé pour la production de
protéines recombinantes (insuline, hormone de
croissance humaine …).

Avantages E. coli
• Cultivable en bioréacteur.
• La protéine recombinante peut représenter 25% des protéines totales.
Inconvénients E. coli
• Protéines intracellulaires.
• Présence de corps d’inclusions.
• Pas de modifications post-traductionnelles :
Phosphorylation, Carboxylation, Glycosilation, Repliement, … etc

Autres bactéries utilisées comme hôtes

Bacillus Streptomyces
 3/ Hôtes utilisés pour la production de protéines
recombinantes
b- Les levures et les champignons filamenteux

• La levure Saccharomyces cerevisiae, un ascomycète, est le micro-

organisme le mieux connu après E. coli.

• Protéines hétérologues destinées à la

recherche, à une utilisation industrielle
ou encore médicale.
• Contrairement à E. coli, elle ne produit pas d'endotoxines ou de
pyrogènes.
• Contrairement aux cellules de mammifère, elle ne contient pas
d'oncogènes, ni d'ADN viral.
• Cultivée à haute densité sur des milieux simples et peu coûteux.
• Organisme eucaryotique dont la génétique est la mieux connue.
• La levure S. cerevisiae ne sécrète que 0,5 % de ses protéines. Par
conséquent, une protéine hétérologue s'accumule sous une forme
pratiquement pure dans le milieu de culture.
• Des protéines qui s'expriment sous une forme insoluble dans E. coli
sont souvent exprimées sous forme soluble dans la levure.
• Rendements généralement faibles.
• La machinerie d'épissage de la levure n'est pas adaptée à
l'expression de gènes d'eucaryotes supérieurs qui contiennent
beaucoup d'introns. C'est pourquoi les séquences exprimées en levure
sont en général des cDNA.
• Formation parfois de corps d’inclusion. L'expression à basse
température (15-20°C au lieu de 30°C) ou l'utilisation d'un promoteur
moins puissant permettent souvent d'augmenter la proportion de
protéines solubles.
 D'autres espèces de levures sont utilisées pour la
production de protéines hétérologues. Les avantages
principaux de ces levures résident dans leurs grandes
capacités de sécrétion et leur capacité à croître à des
densités cellulaire très élevées. Les principales espèces
utilisées sont Pichia pastoris, P. methanolica, Hansenula
polymorpha, Kluyveromyces lactis et Yarrowia lipolytica.
• Les champignons filamenteux sont utilisés depuis des dizaines
d'années pour la production d'enzymes industriels, d'antibiotiques, et
de différentes substances organiques.
• Ce n'est que depuis les années 80 que les outils permettant leur
manipulation génétique ont été développés.
• Les principales espèces utilisées pour la production de protéines
recombinantes sont Neurospora crassa, Aspergillus nidulans, A.
niger, Trichoderma reesei et Penicillium nalgiovense.
• L'avantage principal de ces organismes réside dans leur capacité
de sécréter d'énormes quantités de protéines. Par exemple A. niger
sécrète une glucoamylase à raison de plus de 20 g/l.
 3/ Hôtes utilisés pour la production de protéines
recombinantes
c- Les cellules animales

• Cellules d’insecte et Vecteur = Virus Ac-NPV (Autographa

californica nuclear polyhedrosis virus), un virus à ADN double brin.
• Le promoteur du gène polh, codant pour la polyhédrine, la
protéine structurale majeure du virus est beaucoup utilisé.
• Ce promoteur puissant permet d'obtenir des niveaux de production
très élevés. Des protéines membranaires, très difficiles à produire
dans les système basés sur des micro-organismes, y sont produites en
quantités allant jusqu'à 150 mg/l. D'autres promoteurs du virus ont
également été utilisés.
Baculovirus : expression de protéines en cellules d’insectes (ex. vers
à soie).
Vaccins recombinants, production de protéines insolubles en
bactéries.

Avantages
Promoteur très fort, niveau d’expression élevé
 Modifications post-traductionelles proches du système
mammifère .
Glycosylations : high-mannose mais pas hybride et complexes
Transport et processing ad-hoc
Taille des inserts > 50kb
Production aisée de titres infectieux
 Pas d ’infection possible de l ’homme (restriction au niveau de
la transcription)
Inconvénients
coût de production élevé.
 nécessité de posséder une installation pour la culture de cellules
animales ou pour la croissance et la reproduction du vers à soie.

• Le vecteur baculovirus est injecté dans la larve de Bombyx mori, où

le virus se propage dans tous les tissus.
• L'hémolymphe est récoltée après quelques jours (0,5 à 1,0 ml par
larve).
• Les rendements de production sont en général 100 fois plus élevés
(et même parfois jusqu'à 10000 fois plus élevés) qu'en culture
cellulaire. Ainsi des rendements de l'ordre de 1 mg de protéine
recombinante par larve ont été obtenus en 3 à 4 jours.
Préparation du vecteur baculovirus
 Cellules de mamifère

Généralement les cellules CHO : Chinese Hamster Ovary

• Beaucoup de protéines à usage médical sont produites dans des

cellules de mammifère en culture.
• Le TPA (Tissue Plasminogen Activator) utilisé dans le traitement de
l'infarctus du myocarde.
• le facteur VIII utilisé dans le traitement de l'hémophilie.
• Produit des protéines bien conformées et correctement modifiées.
• Risques d’oncogènes ou des virus dangereux pour l'homme.
 3/ Hôtes utilisés pour la production de protéines
recombinantes
d- Les plantes

Les grands progrès réalisés au cours de ces 10 dernières années

en génie génétique des plantes supérieures ont permis
d'envisager d'utiliser la plante comme hôte pour la production de
grandes quantités de protéines recombinantes.
 Les principaux avantages de l'utilisation d'une plante
comme organisme hôte sont :
• la possibilité de réaliser des modifications post-
traductionnelles (glycosylation, maturation de pré-protéines, ...),
qui ne peuvent pas être réalisées par des bactéries;
• le repliement d'une protéine en une structure
tridimensionnelle active et stable a plus de chance de s'opérer
correctement que dans un environnement procaryotique ;
• le compartimentage des protéines produites dans la cellule
permet éventuellement de les protéger des protéases
intracellulaires ;
• le faible coût de production de la biomasse, au contraire des
micro-organismes qui exigent des installations de fermentation
et des milieux de culture souvent onéreux ;
• l'innocuité des espèces cultivées et des produits qui en sont
extraits pour la santé humaine.
 Expression dans les graines en fusion avec une
protéine de réserve
Insertion de la séquence de la leu-enképhaline entre la
6ème et la 7ème Cys de l’albumine 2S de A. thaliana

Pat2S1 at2S1 lekp 3’at2S1

C P T L K Q A A K A V R L Q G Q H Q P
Y G G F L K
(Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu)
Transformation de A. thaliana et du colza
Fusion avec une albumine 2S
Accumulation de grandes quantités de la protéine fusion
dans les graines

CPTLKQAAKYGGFLKQHQP

trypsine

CPTLK QAAK YGGFLK QHQP

carboxypeptidase B

YGGFL
 Fusion avec une albumine 2S
– Rendement chez A. thaliana :
 206 nmoles ou 113 µg de leu-euképhaline / g
de graine
– Rendement chez le colza :
 50 nmoles ou 27 µg de leu-euképhaline / g de
graine
 3 T de graines par ha et par an, donc 75 g de
leu-enképhaline par ha.
4 - Quelques exemples de protéines recombinantes

a- Production
d’insuline
recombinante

• L’insuline fut la première

protéine à être complètement
séquencée en 1955.
• La première à être
synthétisée chimiquement en
1958.
• La première protéine
humaine produite par
biotechnologies en 1979 et
commercialisée en 1982.
4 - Quelques exemples de protéines recombinantes
b- Production de la somatostatine
• La somatostatine est une hormone qui exerce un contrôle inhibiteur sur
la sécrétion de nombreuses autres hormones pancréatiques, intestinales et
hypophysaires.
• C’est un ensemble de peptides dérivant d’une séquence de 28 acides
aminés.
• La somatostatine efficiente est principalement constituée par un
fragment de 14 acides aminés (tétradécapeptide) dérivant d’un peptide de
28 acides aminés (la somatostatine N-étendue). On parle donc de S14 ou
S28 selon les cas. Elle est parfois encore appelée SRIF, GIF ou GH-IF.
• Sa séquence est :
NH2-ser-ala-asn-ser-asn-pro-ala-met-ala-pro-arg-glu-arg-lys-ala-
gly-cys-lys-ans-phe-phe-trp-lys-thr-phe-thr-ser-cys-COOH.
4 - Quelques exemples de protéines recombinantes
c- Hormone de croissance humaine (HGH)

• Substance chimique naturelle que sécrète l'hypophyse.

• Elle règle la croissance et le développement normal chez les enfants.
• Un déficit en hormones de croissance entraîne une maladie appelée le
nanisme hypophysaire.

• L'hormone de croissance recombinante humaine (rHGH) est produite à

partir de cellules modifiées par génie génétique.