Biodégradation Des Hydrocarbures Aromatiques Mono Et Polycycliques Par Les Micro-Organismes D'environnement Pfe Ridha Bouamra

‫الجمهــــــــــــــــــــــــــــــــــــورية الجزائريـــــــــــــــــــــــــة الديــــــــــــــــــــــمقراطـــــية الشعبـــــية‬
REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

‫وزارة التعليــــــــــــــــــــــــــــــــــــم العـــــــــــــــــــــــالي و البــــــــــحث العــــلمـــــــــــــي‬
MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEURE DE LA
RECHERCHE SCIENTISIQUE
_
‫جـــــــــــــامـــعة يحـــي فارس _المـــــديـــة‬
Université Yahia Farès _ Médéa
‫كــلـيــــــة التــــكنــــولــــوجيــــــا‬
Faculté des Sciences
‫قســـــم عـــلـــوم الطـــبـــيـــعـــة والـــحـــيـــاة‬

Département des Sciences de la Nature et de la Vie
N°……………
Mémoire de Master en Biologie
Spécialité : Microbiologie Appliquée
Présenté par :
Zahia BELALOUI
Rida BOUAMRA
Samia KARA
Thème
BIODÉGRADATION DES HYDROCARBURES AROMATIQUES
MONO ET POLYCYCLIQUES PAR LES MICRO-ORGANISMES
D’ENVIRONNEMENT
Soutine publiquement le : Mardi 08/09/2020

Devant le jury :
Dr. Mahfoud AINAS MCB, UYFM Président

Mr. Mounir HAMMOUDI MAA, UDBKM Examinateur
Dr. Ahmed AZIZI MCA, UATL Rapporteur
Année universitaire 2019-2020

Université Yahia Fares Médéa- Pôle urbain – Médéa (Algérie) – 26000.
MONOCYCLIQUES ET POLYCYCLIQUES PAR LES MICRO-
ORGANISMES D’ENVIRONNEMENT
RÉSUMÉ. Les hydrocarbures mono et polycycliques sont des polluants ubiquitaires et
hydrophobes dont la persistance dans les écosystèmes est principalement due à leur
faible solubilité aqueuse en raison de leurs potentialités toxiques, mutagènes et
cancérigènes, certains d'entre eux sont considérés comme des substances dangereuses.
Leur présence au niveau des composantes des différents maillons de l’homme
constitue un risque important pour l'environnement et la santé humaine. Letraitement
de ce type de polluants par les procédés de biodégradation sous l’utilisation des
micro-organismes d’environnement (bactéries et les champignons) considère comme
un processus très favorable à l’échelle international. Ce contexte rassemble un aperçu
sur la biodégradation des hydrocarbures aromatiques mono et polycycliques par les
micro-organismes d’environnement en présence de quelque essaies pratiques
ciblerl’identification de quelques souches microbiennes (bactéries et champignons)
isolées depuis des eaux et sol contaminées par ce type des hydrocarbures.
MOTS CLÉS. Biodégradation; Hydrocarbures aromatiques mono et polycycliques ;
micro-organismes d’environnement.
BIODEGRADATION OF MONOCYCLIC AND POLYCYCLIC AROMATIC

HYDROCARBONS BY ENVIRONMENTAL MICRO-ORGANISMS
ABSTRACT. The mono and polycyclic hydrocarbons are ubiquitous and hydrophobic
pollutants whose persistence in ecosystems is mainly due to their low aqueous
solubility due to their toxic, mutagenic and carcinogenic potential, some of them are
considered as dangerous substances. Their presence at the level of the components of
the various links of man constitutes a significant risk for the environment and human
health. The treatment of this type of pollutants by biodegradation processes under the
use of environmental microorganisms (bacteria and fungi) is considered to be a very
favorable process internationally. This context brings together an overview on the
biodegradation of mono and polycyclic aromatic hydrocarbons by environmental
microorganisms in the presence of which attempts in practice target the identification
of a few microbial strains (bacteria and fungi) isolated from water and soil
contaminated by this type hydrocarbons.
KEY WORDS. Biodegradation; Mono and polycyclic aromatic hydrocarbons;
Environmental micro-organisms.
‫التحمل البيولوجي لمهيدروكربونات العطرية أحادية ومتعددة الحمقات بواسطة الكائنات الدقيقة في البيئة‬
‫ويعود سبب إستعصائها‬ ‫ممخص‪ .‬تتواجد المموثات الهيدروكربونية األحادية ومتعددة الحمقات في كل مكان‬
‫سممات ‪ ،‬طفرات‬
‫وثباتها في النظام البيئي إلى عدم قابميتها لمذوبان في الماء مما يكسبها القدرة عمى إحداث تَ ُ‬
‫روابط وعناصر يزيد كثي ار من خطرها‬ ‫وسرطانات صنفت بعضها عمى أنها مواد خطيرة جدا تواجدها في عدة‬
‫عمى البيئة وصحة اإلنسان معالجة هذا النوع من المموثات بطرق بيولوجية يكون باستعمال كائنات دقيقة متواجدة‬
‫في الطبيعة (البكتيريا والفطريات) حيث تعد هذه الطريقة جد مالئمة عالميا ‪ .‬يجمع هذا السياق نظرة عامة عمى‬
‫التحمل البيولوجي الهيدروكربونات العطرية األحادية ومتعددة الحمقات بواسطة الكائنات الحية الدقيقة المتواجدة في‬
‫الطبيعة وفي وجود محاوالت تهدف إلى تحديد البعض من السالالت الميكروبية (البكتيريا والفطريات) التي عزلت‬
‫من الماء والتربة المموثة بهذا النوع من الهيدروكربونات‪.‬‬
‫الكممات المفتاحية ‪ .‬التحمل البيولوجية ؛ الهيدروكربونات العطرية واألحادية ومتعددة الحمقات؛ الكائنات الدقيقة في‬
‫البيئة‪.‬‬
Remerciements
Nous aimerions en premier lieu remercier Dieu le tout puissant et
miséricordieux qui nous a donné la force, la volonté, la patience et le courage
durant ces longues années d’étude, pour accomplir ce travail modeste et d’avoir
éclairé le chemin de la réussite.
En second lieu, nous remercions chaleureusement notre promoteur Monsieur
AZIZI .A pour ses précieux conseils et son aide durant toute la période du
travail, pour ses orientations, sa patience et sa disponibilité.
Nous vifs remerciements vont également aux membres du jury AINAS .M
et Mr Hamoudi .M. Pour l’intérêt qu’ils ont porté à notre recherche en acceptant
d’examiner notre travail et de l’enrichir par leurs propositions.
Nous tenons à exprimer nos sincères remerciements à tous les professeurs qui
nous ont enseigné et qui par leur compétence nous ont soutenu dans la poursuite
de nos études.
Enfin, nous tenons également à remercier toutes les personnes qui ont
participé de près ou de loin à la réalisation de ce travail.

Je dédie ce travail à :
A mes chères parents mon père et ma mère
Pour leur patience, leur amour, leur soutien et leurs
Encouragements.
A mon frère Walid et
A toute ma grande famille Bouamra
A mes amis
Ma trinôme Belaloui et kara
Ainsi qu'a tous mes professeurs, enseignantes et tous
Mes amis du primaire jusqu'a l'université.
A tous ceux qui ont une relation de proche ou de loin
avec la réalisation du présent travail.

C’est avec une profonde émotion que je dédie ce travail :
A mes très chers et magnifiques parents : Achour et Mahdjouba
Sources de mes joies, secrets de ma force qui m’ont soutenu tout ou long de
ma vie.
A mes chers frère et sœur : Omar, Ismail, Khadidja, Meriem
Sans oublier mes chers grands-parents tous mes oncles et tantes.
A tous mes cousins et cousines sans exception.
A toute la famille KARA et BEN FRAIHA.
A mes collèges : Sara, Hamida, wahiba.
A mon deux binôme Ridha et Zahia.
A tous mes collègues de la promotion 2019/2020.
Et A tous ceux que je porte dans mon cœur et je n’ai pas pu citer le nom.
Je dédié ce modeste travail a :
Ma très chère mère Djamila
Mon père Boudjma
Ma grand-mère Mazohra
Mes chers frères Mohamed Hamza Aziz Nabil Oussama et Ayoub
Mes très chers neveux et nièces ABD EL Rahman Rachid Meriem et Nour EL
HUDA Mes oncles et tantes
Toute la famille BELALOUI
Mes amies Asma, Amina, Djahida, Naoual et Ahlem
A tous mes collègues de la promotion 2019/2020.

Tables des matières i
Table des matières

Résume
Table des matières .................................................................................................................. I
Liste des abréviations .....................................………........................................................... V
Liste des figures ................................................................................................................... VII
Liste des tableaux .................................................................................................................. IX
Introduction générale ................................................................................................... Page 1
Sommaire
1. LES HYDROCARBURES AROMATIQUES
1. LES HYDROCARBURES AROMATIQUES.......................................................................3
1.1 Définition ..........................................................................................................................3
1.2 Origine ..............................................................................................................................3
1.3 Classe .................................................................................................................................4
1.3.1 Hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) ........................................................4
1.3.2 Hydrocarbures aromatiques monocycliques .................................................................5
1.4Propriétés physiques et chimiques .......................................................................................6
1.4Persistance.........................................................................................................................11
1.5Effet des hydrocarbures aromatiques mono et polycycliques sur l’écosystème ..................13
1.5.1 Effets sur les plantes ................................................................................................13
1.5.2 Effet sur animaux ......................................................................................................14
1.5.3 Effets sur santé humain ...........................................................................................15
1.5.2 Les hydrocarbures aromatiques cible a cette étude .....................................................16
2. BIODEGRADATION DES HYDROCARBURES AROMATIQUES

2La biodégradation ................................................................................................................17
2.1 Principe de la biodégradation ...........................................................................................17
2.2Les microorganismes de la biodégradation des hydrocarbures aromatiques .....................18
2.2.1 Gènes impliqués dans la biodégradation des hydrocarbures aromatiques par les
germes microbiens .................................................................................................................19
2.2.2 Adaptations génétiques de micro-organismes ............................................................20
2.2.3 Biodégradation microbienne ......................................................................................21
Tables des matières ii
2.2.3.1 Les bactéries .........................................................................................................23

2.2.3.2 Les champignons ...................................................................................................23
2.3 Biodégradation des hydrocarbures ...................................................................................23
2. 3.1 Biodégradation des hydrocarbures polycycliques .....................................................23
2. 3.2 Biodégradation des hydrocarbures monocycliques ...................................................24
2.4 Voies de la biodégradation des polluants d'hydrocarbures pétroliers ...............................24
2.4.1 Biodégradation aérobie .............................................................................................25
2.4.2 Biodégradation anaérobie ..........................................................................................26
2.4 Cinétique de la biodégradation des HAP et HAM ............................................................27
2.5 Les facteurs influencent la biodégradation .......................................................................27
2.5.1 Facteur liée a hydrocarbure aromatique mono et polycycliques ................................28
2.5.1.1 Les propriétés physicochimiques des hydrocarbures............................................28
2.5.1.2 La concentration en hydrocarbures .....................................................................28
2.5.2 Facteur liée aux microorganismes ...............................................................................28
2. 5.2.1 La concentration en microorganismes .................................................................28
2.5.2.2 La souche bactérienne ...........................................................................................28
2.5.3 Facteur liée a les conditions des développements.........................................................28
2.5.3.1 Éléments nutritifs ..................................................................................................28
2. 5.3.2 L oxygène .............................................................................................................29
2. 5.3.3 Le pH ..................................................................................................................29
2. 5.3.2 Emulsifiants ou dispersants ....................................................................................29
2. 5.3.1 La température ................................................................................................29
2.5.4Autres facteurs ............................................................................................................30
2. 5.4.1 Humidité du sol .................................................................................................30
2.5.4.2 Type de matrice ...................................................................................................30
2. 5.4.3 Effet de l’exposition préalable et adaptation ......................................................30
3Procédés de dépollution ........................................................................................................32
3.1 Procédé chimique .............................................................................................................32
3.2 Procédés Thermiques.......................................................................................................34
3.2.1 L’incinération .........................................................................................................34
3.2.2 La désorption .............................................................................................................34
3.3 Procédés physiques ...........................................................................................................35
3.4 Procédés biologique ..........................................................................................................36
3 .5 procédés couplés ..............................................................................................................37
Tables des matières iii
3.6 Comparaisons entre les procèdes de dépollution ...............................................................38

3.6 .1 le coût de technique dépollution ...............................................................................38
3.6.2 Comparaison entre les différentes techniques de dépollution ..................................39
3. MÉTHODES ET MATERIELS
4 Méthode d’isolement et identification des souches microbiennes .........................................42
4.1 Isolement ........................................................................................................................42
4.2Identification .....................................................................................................................42
4.2.1 Les méthodes classiques ...........................................................................................42
4.2.1.1 Caractérisation phénotypique des isolats ...............................................................43
4.2.1.1 Caractérisation biochimique ..................................................................................44
4.2.2 Diagnostic moléculaire (moderne) ................................................................................47
4.2.2.1 Méthodes d’identification protéomiques ..............................................................48
4.2.2.2 Méthodes d’identification génomiques ................................................................48
5. Les méthodes d’analyses des hydrocarbures aromatiques ..................................................49
5.1 Les méthodes classiques ..................................................................................................49
5.2 Les méthodes modernes ....................................................................................................50
5.2.1 Les colonnes utilisent .................................................................................................50
5.2.2 Les détecteurs ............................................................................................................50
5.3 Amélioration par le couplage ............................................................................................51
5.4 Recherche spécifique ........................................................................................................55
5.5 Les Méthodes tendance .....................................................................................................55
5.6 Méthodes de mesure des hydrocarbures aromatique dans des solutions aqueuses ...........57
4. RÉSULTANTES ANTERIEURS ET DISCUSSION

6. Résultats de notre partie pratique et leur discussion ..........................................................59
6.1.1 Caractérisation microbiologique d’échantillonnes ......................................................59
6.1.1.1 Isolement et dénombrement de la microflore ....................................................59
6.1.1.2 Purification et conservation des souches isolent ...................................................62
6.1.2 Les caractéristiques morphologiques des souches .........................................................63
6.1.2.1 Caractérisation phénotypique des isolats ................................................................63
6.1.2.1.1 Etude macroscopique........................................................................................63
6.1.2.1.2 Observation microscopique ..................................................................................63
6.1.2.1.2.1 Examen a état frais ..........................................................................................63
Tables des matières iv
3.1.2.1.2.2 Coloration de gram ...........................................................................................64

6.1.2.1.3Caractérisation biochimique .................................................................................65
6.1.2.1.3.1 Recherche de la catalase ..................................................................................65
6.2 Résulte des autres chercheurs ...........................................................................................68
6.2.1 La biodépollution du sol contamine par hydrocarbure ...............................................68
6.2.2 Traitement biologique des milieux aquatiques ...........................................................71
6.2.3 La biodégradation d’hydrocarbures par souches bactériennes ...................................74
6.2.4 Isole les souches bactériennes qu’a une capacité de biodégrade les HAP......................77
6.2.5 La biodépollution fongique aérobie et anaérobie .......................................................80
6.2.6 La biodégradation d’hydrocarbure aromatique par les enzymes fongiques .................82
CONCLUSION GENERALE ……………………………………………………… 84

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES …………………………………………… 85
ANNEXES
Liste des Abréviations & Nomenclatures iii
LISTE DES ABREVIATIONS& NOMENCLATURES
Abréviation Signification
DO Densité Optique
JORA Journal Officiel de la Republique Algérienne
HPLC High Performance Liquid Chromatography
HAP Hydrocarbures aromatiques polycycliques
COV composés organiques volatils
HAM Hydrocarbures aromatiques monocycliques
HA Hydrocarbures aromatiques
UE Union européenne
Naph Naphthalène
ANT Anthracène
PHE Phénanthrène
Pyr Pyrène
COD Carbone Organique Dissous
TOL tolérer l'oxydation
NAH oxydation du naphtalène
BTEX benzène, toluène, éthylbenzène, xylène
CPN Carbone Phosphore Azote
OH• Radicaux hydroxyles
AOP processus d'oxydation avancés
UV Rayonnement Ultraviolet
BH Bushnell-Haas
API Analytical Profile Index
BEI le bromure d'éthidium
CCM Chromatographie sur couche mince
GC Chromatographie sur Gel
FID/PID Détecteur de concentration
EI-MS Spectrométrie de masse à Impact Electronique
SIM Système internationale de la normalisation
NPLC La chromatographie en phase normale
RPLC la chromatographie liquide en phase inverse
UHPLC Ultra-Hautes Performances Chromatographie en phase Liquide
MSPD solidification matricielle dispersion de phase
IR Infrarouge
Nc Nombre des microorganismes
N1/N2 nombre de boites dénombrées
UI Unités Internationales
d/V Volume/ dilution
UFC Unité Forment Colonie
GN Gélose Nutritive
Cat Catalase
Ox Oxydase
AMX Amoxicilline
FOX Céfoxitine
P Pénicilline
TPH Pétrole total hydrocarbure
Liste des Abréviations & Nomenclatures iv
Nomenclature et Symboles
Lecture Désignation Unité
[] Concentration molaire ou massique (mol L-1) ou (mg L-1)
pH potentiel d’Hydrogène (-)
Ppb Particule par unité de temps (-)
POA Procédé d’Oxydation Avancée (-)
Rpm rotation par minute (tr mn-1)
T Température (°C)
UI unités internationales 1 UI =0,0006 g
Indices
Lecture Désignation
C Critique
F Final
Max Maximal
Opt Optimal
T Totale
Liste des Figures iv
LISTE DES FIGURES

Numéros Titres des figures Pages
1.1. Structure des hydrocarbures aromatiques monocycliques 5
1.2 Les principales familles d’hydrocarbures et autre composés d’un pétrole 6
1.3 Influence d’hydrocarbures sur les être vivant 13
1.4 Effet des hydrocarbures sur l’organisme 14
1.5 Exemples sur effet d’hydrocarbure sue plusieurs échelles 16
2.1 Intervention de microorganismes lors de la biodégradation des hydrocarbures 19
aromatiques
2. 2 Les différentes positions de gène alkb sur une séquence génomique 20
2.3 Dégradation du naphtalène en salicylate par des bactéries aérobies du genre 22
Pseudomonas
2.4 La biodégradation d’hydrocarbure aromatique dans un cellule 23
4.1 La galerie API 20E avant incubation. 44
4.2 La Candida avant incubation 45
4.3 Méthode de dichotomique pour bacilles gram +. 46
4.4 Méthode de dichotomique pour les grams +, CATA+ et cocci 47
4.5 Méthode de dichotomique pour les gram (+ / -) 47
5.1 Pic d’analyse par HPLC d’hydrocarbure 51
5.2 Analyse par GC/MS des hydrocarbures aromatiques 53
5.3 Analyse des HA dans du thé bouilli à l'aide de LLE miniaturisé 57
6.1 Résultats du isolent sur milieu solide Bushnell Hass agar 59
6.2 Les nombre de microorganisme dans chaque échantillonne 61
6.3 Comparaison entre eau et sol 62
6.4 Résultats de la purification sur milieu solide Bushnell Hass agar 63
6.5 Résultats de la purification sur milieu GN 63
6.6 Observation microscopique des souches a état frais. 64
6.7 Observation de coloration de gram à immersion. 65
6.8 Pourcentage de Gram + et - 65
6.9 Résultats du test de la catalase 66
6.10 Effet de la concentration initiale sur le taux de dégradation après 48h 72
d’incubation (a anthracène, b naphtalène)
6.11 Effet de la salinité sur le taux de dégradation après 48h d’incubation (a 69
anthracène, b naphtalène)
6.12 Effet du ph sur le taux de dégradation après 48h d’incubation (a anthracène, b 73
naphtalène)
6.13 Biodégradation d’anthracène (a) et du naphtalène (b) par la souche K1C dans 73
l’eau de mer
6.14 La concentration des hydrocarbures dans les échantillons de sols étudiés. 75
6.15 Biomasse bactérienne des différents échantillons de sols étudiés 75
6.16 Effet de la salinité sur la croissance des souches (A 30°C ; B 40°C) 76
6.17 Effets du ph et de la température sur la croissance des isolats 76
6.18 La biodégradation d’hydrocarbure aromatique 80
6.19 La biodégradation aérobie de HA par champignons 81
6.20 La biodégradation en anaérobiose 81
Liste des Tableaux v
LISTE DES TABLEAUX

Numéros Titre des tableaux Pages
1.1 Propretés physico-chimiques des quelque HAP/HAM prioritaires de la liste EPA 10
1.2 Toxicité de quelque type des Hydrocarbures aromatiques sur animal et hommes 15
Divers gènes interviennent dans la biodégradation des hydrocarbures
2.1 21
aromatiques mono et polycycliques
Sélection des espèces de champignons et de bactéries intervient dans la
2 .2 22
biodégradation des HAP et HAM
Principaux souches bactériennes aérobies qui participent à la dégradation
2.3 26
des HAP/HAM
2.4 Condition optimale récapitulative de la biodégradation des HAP et HAM 31
Principaux procédés chimiques rencontrés dans la dépollution la dépollution des
3 .1 33
HAP et HAM
3. 2 Principaux procédés thermique rencontrés dans la dépollution des HAP et HAM. 35
3.3 Principaux procédés biologiques intervient dans la dépollution des HAP et HAM 37
3.4 Principaux procédés couplés interviens dans la dépollution des HAP et HAM 38
3.5 Estimation des coûts des procédés de décontamination 39
Avantages et inconvénients des différentes méthodes de traitement des sols
3.6 41
contaminés
5.1 Les techniques utilisent dans l’identification des hydrocarbures aromatiques 55
6.1 Echantillonne de hassi messaoud de type sol 60
6.2 Echantillonne station épuration Baraki sol 60
6.3 Échantillonne station épuration Baraki eau 61
6.4 Échantillonne Hassi messaoud eau contamine par pétrole 61
6.5 Résultats de coloration de gram 65
6.6 Résultats du test de la catalase obtenus sont présentés dans le tableau 3.2 66
6.7 Les capacitaires biochimiques de souche isolent 68
6.8 Effet de la concentration en hydrocarbures 70
6.9 Tableau récapitulative d’étude 71
6.10 Les facteurs étudient et qu’influence sur le rendement 72
6.12 Résultats de l’identification moléculaire des isolats 76
6 .13 Tableau récapitulative d’étude 77
Les antibiotiques utilisés au cours de la présente étude des bactéries dégradant le
6.14 78
fluoranthène isolées des sédiments lagunaires
Profils des résistances aux métaux lourds des souches les plus résistantes isolées
6.15 75
à partir des sédiments lagunaires
Profils des résistances aux antibiotiques des souches les plus résistantes isolées
6.16 à partir des sédiments lagunaires (mai 2004) sur milieu minéral et ajoute de 79
fluoranthène
6.18 exemples des Co-métaboliser champignons/ bactérie 82
6. 19 Tableau récapitulative d’étude 83
INTRODUCTION GENERALE
INTRODUCTION GENERALE 1
INTRODUCTION GÉNÉRALE
Les hydrocarbures et les produits pétroliers sont les sources d'énergie et matière première les
plus importantes pour tous les industries et la vie quotidienne. En raison de la massive
utilisation que entraînant un grand nombre de résidus dans l'environnement, provoquant de
nombreux impacts environnementaux (Das et Chandran, 2011; Ahmed et al, 2017). Varjani et
al., 2015, qu’ils provoquent des risques direct ou indirect pour la santé de tous formes de vie
sur le globe terrestre (Margesin et Schinner, 2001; Deppe et al, 2005; Souza et al,
2014; Sajna et al, 2015)
L’Algérie a été également touché cette pollution car elle a une position prandiale dans
la production des producteurs dans le tour méditerranéen (Tedjani, 2011), tel qu’elle
rejetterait chaque année près de 10 000 tonnes d’hydrocarbures dans la Méditerranée. Ces
rejets seraient principalement dus à des fuites d’exploitation et à des boues toxiques provenant
des raffineries, celles-ci seraient concentrées dans les sédiments portuaires. Ceci explique que
lorsque ces résidus ne se retrouvent pas stockés à ciel ouvert avec les ordures ménagères, ils
sont évacués par les précipitations (Tedjani, 2011).
Les hydrocarbures aromatiques polycycliques et monocyclique (HAP/HAM) sont considérés
les hydrocarbures comme les plus toxiques. Ils sont issus de la combustion incomplète de la
matière organiques, d’origine naturelle (incendie de foret) et anthropiques (chauffage au gaz,
industrie, trafic routier...), peuvent causer des nuisances à l’environnement une fois déversées
dans le milieu récepteur sans traitement préalable (Chahin, 2010). Ce type de rejet engendre
d’une manière directe la pollution du sol, caractérisée par des teneurs élevées d’hydrocarbures
et de métaux lourds (Boudjema et al, 2009).
El existe plusieurs procédés d’élimination de ce type de polluants : tels que les procédés
physiques et chimiques (stripping, La flottation, le lavage, la désorption thermique,
l’extraction par solvant, l’oxydation avancée, l’ultrason et le traitement électrochimique, que
sont généralement très chère et nécessite des équipements très lord pour être réaliser (Fritsche
et Hofrichter ,2008).
Les procédés de biodégradation par les micro-organismes tel que : les bactéries, les
champignons ou les algues, fournées des solutions durables et à faible coût pour la
dégradation des HAP et HAM (Cybulski et al., 2003 ; Arulazhagan et Vasudevan, 2011;Mao et al.,
2012; Hamamura et al., 2013;Sun et al., 2014; Cébron et al., 2015; Darmawan et al., 2015; Ferreira
et al., 2015; Okai et al., 2015; Singh et al., 2015, W. et al., 1999; Li et al., 2005; Chan et al., 2006;
INTRODUCTION GENERALE 2
Elisabet Aranda, 2009; Hadibarata et al., 2009; Hadibarata et Kristanti, 2014; Bonugli-Santos et al.,
2015; Cébron et al., 2015; Jové et al., 2015; Marco-Urrea et al., 2015; Mineki et al., 2015; Simister et
al., 2015; Young et al., 2015, Chan et al., 2006; Diaz et al., 2014; Luo et al., 2014).
Ce travail rassemble notre travail pratique effectué sur l’identification dessouches de micro-
organismes vivants dans milieux contaminés par les hydrocarbures ainsi que les méthodes et
les résultats antérieurs sur la biodégradation des hydrocarbures par les bactéries, les
champignons et les algues.
Pour cette raison, ce contexte est structuré en quatre parties :

 La première partie comporte des notions sur le problème de pollution par les
hydrocarbures en particuliers les hydrocarbures aromatiques mono et polycycliques.
 La deuxième partie présente les différentes solutions sur notre problème et plus
spécifiquement les procédés de biodégradation des hydrocarbures par divers micro-
organismes tel que : les bactéries, champignons et les levures.
 La troisième partie consacrée aux méthodes et matériels qu’elles permettre de réaliser
de suivre la biodégradation des hydrocarbures.
 La quatrième partie rassemble notre résultat et les résultats antérieurs avec les
discussions.
Enfin, une conclusion générale incluant des perspectives de l’étude clôturera ce travail.
1. LES HYDROCARBURES
AROMATIQUES
1. Les hydrocarbures aromatiques 3
1. LES HYDROCARBURES
AROMATIQUES
1.1 Définition
Les hydrocarbures qu’inclure, huile ou brut, et les fractions pétrolières qui en sont
issues sont essentiellement composés de molécules résultant de la combinaison d’atomes de
carbone tétravalents et d’atomes d’hydrogène monovalents (Chitour, 1983), est utilisé comme
carburants, combustibles et comme base pour la fabrication des huiles lubrifiantes, ils
constituent aussi la matière première des synthèses pétrochimiques (Lefebvre, 1986). et aussi
utilisés comme source de carbone pour la culture des microorganismes, et se différencient
fondamentalement des sucres par l’absence d’oxygène (Champagnat et al, 1974).
Par définition Hydrocarbure ou « Pétrole » est tiré du mot latin « pétra oléum » qui veut
dire « huile de pierre ». C’est une huile minérale naturelle combustible, de couleur noir très
foncé. Quelques fois avec des reflets verdâtre et généralement plus léger que l’eau ; il est plus
au moins fluide, doué d’une odeur caractéristique plus ou moins prononcée. Il est constitué
d’un nombre différent de carbone et d’hydrogène, de molécules de taille et de structures
différentes, ce qui détermine leur état physique solide, liquide, et gazeux (Tranchmontagne,
1999).
1.2 Origine
Le pétrole s’est formé il ya des millions d’années. Il provient de la transformation
naturelle de sédiments organiques (accumulation de débris végétaux et animaux) sous l’action
de la température et de la pression. Cette transformation s’opère sur une substance organique
nommée kérosène, qui résulte d’une lente dégradation de débris organiques par des bactéries
anaérobies. Sous l’effet de la température, les molécules organiques complexes sont rompues
en molécules d’hydrocarbures plus petites (molécules formées uniquement de carbone et
d’hydrogène) et dans une moindre proportion, en diverses molécules complexes, dont le
mélange est appelé pétrole (Nowak, 2000).
Le pétrole est contenu dans les roches sédimentaires et migre-le nettement vers la
surface. Parfois, il est piégé par d’autres roches (grès poreux, schistes fracturés, restes
calcaires d’anciens récifs) (Mac Donald, 2001).
Un piège rempli d’hydrocarbures peut, suivant les cas, contenir du pétrole seulement, du gaz
seulement ou les deux. S’il y a du pétrole et du gaz, le gaz, plus léger, se rassemble au
sommet du piège et le pétrole se place en dessous. Il faut retenir que, pour une accumulation
de pétrole seul, d’importantes quantités de gaz sont tout de même dissoutes, De plus, il reste
toujours un peu d’eau collée aux grains de la roche réservoir, qu’on appelle eau résiduelle. Il
existe différents types de pièges. On distingue deux grandes familles : les pièges structuraux,
de loin les plus nombreux, et les pièges stratigraphiques (Fimes et al, 2002).
Les principales sources d’hydrocarbures aromatique poly et monocyclique sont :
 D’origine agricole (principalement les dérivés du méthane

 La Combustion incomplet ;
 Les industries pétrochimiques.
 Le pétrole brut ;
 Le charbon, fumé de tabac et bois;
 Les gaz naturels ;
 Les animaux et les plantes ;
 Les schistes bitumineux.
Mais c’est incontestablement le pétrole brut qui reste la source la plus importante
(Lefebvre, 1978;Finlayson-Pitts et al 1997;Sander et al, 2016).
1.3 Classe
Les hydrocarbures aromatique sont classe selon le nombre de cycle aromatique que
comporte et leur radicale que attache a cycle a deux type monocyclique (est que a un seul
noyau aromatique) et polycycliques (que a deux ou plusieurs cycle aromatique)
1.3.1 Hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP)
Sont un grand groupe de produits chimiques avec deux ou plusieurs aromatiques fondus
anneaux en dispositions linéaires, angulaires ou groupées. HAP ave moins de six cycles
aromatiques sont souvent appelés petits Les HAP et ceux contenant plus de six cycles
aromatiques son souvent appelés grands HAP (Haritash et Kaushik, 2009). Ils se présentent
sous forme de solides incolores, blancs / jaune pâle à faible solubilité dans l'eau, points de
fusion et d'ébullition élevés et vapeur plus faible, Avec une augmentation moléculaire poids,
leur solubilité dans l'eau diminue; fondre et bouillir le point augmente et la pression de vapeur
diminue (Patnaik, 2007).
La présence répandue d'HAP est due à leur génération à partir de la combustion incomplète
ou de la pyrolyse de nombreuses matières organiques, comme le charbon, le pétrole, le gaz de
pétrole, et le bois. Les HAP présentent la variété la plus structurelle de la nature par rapport à
toute autre classe de molécules non halogénées dans l'éco et la biosphère. De plus, avec la
poursuite de la production de pétrole et le transport, les quantités de ces hydrocarbures dans
l'eau et les sédiments continueront d'augmenter (Arun et al, 2008).
Le devenir des HAP /HAM dans l'environnement comprend la volatilisation, photo-
oxydation, oxydation chimique, adsorption sur le sol particules et lessivage (Haritash et
Kaushik, 2009). Elles sont difficiles à dégrader dans les matrices naturelles et leur persistance
augmentent avec leur poids moléculaire. Par conséquent, ces les composés représentent une
préoccupation importante en raison de leur présence répandue dans l'environnement, leur
résistance vers la biodégradation, leur potentiel de bio-accumulation et leurs effets mutagènes
et cancérogènes qui se produisent par respirer de l'air contenant des HAP sur le lieu de travail
ou en venant en contact avec l'air, l'eau ou le sol à proximité de sites de déchets dangereux, ou
en buvant de l'eau ou du lait contaminé, etc.(Lei et al., 2007).
Les HAP sont parmi les contaminants les plus cancérigènes de l'environnement (ATSDR,
2009).
1.3.2 Hydrocarbures aromatiques monocycliques
Sont des composés organiques volatils livres également abrégés comme COV, sont
principalement les produits chimiques synthétiques d'origine des activités industrielles et le
manque de leur gestion. Généralement, ils sont classés ci-dessus catégories sur la base de
leurs points d'ébullition (OMS, 1989). La classification reflète la différence dans les propriétés
chimiques qui décrivent leur fortune écologique et leur transport ainsi que les méthodes de
diagnostic pour leur détection quantitative et qualitative.
Couverture COV composés organiques (méthane, propane, butane, benzène, xylène) ayant
le point d'ébullition la gamme de 24c Ce 260C et donc peut être évaporé à température
normale et condition de pression (Lane et al, 2017). Par conséquent, ils peuvent facilement
entrer dans l'atmosphère (Sander et al, 2016).
Figure 1.1. Structure des hydrocarbures aromatiques monocycliques.

La majeure partie de la contribution de ces HAM est d'origine agricole (principalement les
dérivés du méthane), les industries pétrochimiques, les solvants organiques, etc., (non
méthane et leurs dérivés). En raison de la différence de méthode d'analyse, les gaz tels que le
méthane, l’éthane, le propane ou le butane ne sont pas classés comme COV, tandis que leurs
dérivés halogénés entrent dans cette catégorie.
Figure 1.2. Les principales familles d’hydrocarbures (Syakti 2004).
1.4 Propriétés physiques et chimiques

Le terme «HAP/HAM» est généralement utilisé pour les composés aromatiques ne
contenant que des atomes de carbone et d’hydrogène (c’est-à-dire les HA parents non
substitués et leurs dérivés substitués). Ces composés sont constitués de deux ou plusieurs
aromatiques fusionnées des anneaux constitués d'atomes de carbone et d'hydrogène dans leurs
structures chimiques. Par conséquent, ils ont de nombreux isomères structurels.
Plus de 100 HA ont été détectés dans l'environnement atmosphérique, et environ 200 HA
ont été détectés identifier dans la fumée de tabac. De plus, 660 isomères des HA peuvent être
récupérés dans une base de données ‹ ,Polycyclic Aromatic Hydrocarbon › Structure Index
(Sander et 1997), qui est présenté comme une aide à l'identification des structures chimiques
et nomenclature des HAP/HAM.
Parmi une variété de HAP /HAM, ont été sélectionnés comme substances prioritaires pour
la surveillance environnementale par l’United States Environmental Protection Agence
(EPA). Ces hydrocarbures aromatique comprennent: Naph, acénaphtène (Ace),
acénaphtylène (Acn), fluorène (Fl), Phe, An, fluoranthène (Flu), Py, B [a] A, chrysène
(Chry),benzo [b] fluoranthène (B [b] F), benzo [k] fluoranthène (B [k] F), B [a] P, DB [ah]
A,benzo [ghi] pérylène (B [ghi] P) et indéno [1,2,3-cd] pyrène (In [cd] P). Huit d'entre euxLes
HA, c'est-à-dire B [a] A, B [b] F, B [k] F, B [a] P, Chry, DB [ah] A, Flu et In [cd] P, sont
connus pourêtre cancérigène et / ou mutagène. L'avis national toxicologique italien Le Comité
(Menichini et al 1991). a recommandé sept HA, à savoir B [a] A, B [a] P, B [b] F, benzo [j] -
fluoranthène (B [j] F), B [k] F, DB [ah] A et In [cd] P, pour les enquêtes liées à la santé.
Ces HA ont été sélectionnés sur la base de leur classification comme ayant «probable» ou
cancérogénicité «possible» pour l'homme. Le règlement européen 2065 /La directive 2003 /
CE sur les arômes de fumée utilisés ou destinés à être utilisés dans ou sur les denrées
alimentaires requiert les précurseurs des arômes de fumée commerciaux doivent être
enregistrés comme principaux produits dans l'Union européenne (UE).
La demande d'enregistrement doit être Hydrocarbures aromatiques accompagné d'un
dossier contenant des données sur la composition chimique, groupe de 15 HA qui ont été
reconnus par l'ancien comité scientifique, La nourriture en 2002 comme étant une
préoccupation pour la santé publique. Ces HA comprennent: B [a] A,Cyclo [cd] P, Chry, 5-
méthylchrysène, B [b] F, B [j] F, B [k] F, B [a] P, In [cd] P, DB [ah] A,B [ghi] P, DB [al] P,
DB [ae] P, DB [ai] P et DB [ah] P.
Les formules structurales des isomères hydrocarbures aromatiques sélectionnés sont
illustrées autableau1.1.Ceux-ci ont été sélectionnés pour être inclus dans ce chapitre car ils
sont soupçonnés être plus nocifs et il y a une plus grande possibilité que les gens soient
exposés à ces hydrocarbures aromatique qu’aux autres. Les propriétés chimiques et physiques
de ces Les hydrocarbures aromatiques sont également résumées dans tableau1.1. Les données
sont principalement extraites d'Interactive Démo de la base de données PhysProp.
Les HA ont généralement des structures planes comme la montre. Aussi pur chimiques, ils
existent sous forme de cristal pâle ou jaune verdâtre, blanc ou incolore et avoir une légère
odeur aromatique. Parmi eux, certains HA tels que B [a] A, DB [ai] Pet In [cd] P montrent
une fluorescence allant du jaune verdâtre au bleuâtre brillant violet à brun. À température
ambiante, la plupart des HAP/HAM sont généralement solides, très hydrophobes et sont très
solubles dans les solvants organiques. La solubilité des HAP/HAM dans l'eau est inversement
proportionnelle au nombre d'anneaux aromatiques contenus. HAP/HAM ont également des
points de fusion et d'ébullition élevés et de faibles pressions de vapeur. Vapeur la pression a
tendance à diminuer avec l'augmentation de la masse moléculaire, variant de plus de 10 ordres
de grandeur.
Ces propriétés physicochimiques affectent la distribution des hydrocarbures aromatique

dans environnement. En milieu aqueux, les HAP/HAM se retrouvent généralement adsorbés
sur particules ou solubilisées dans toute matière huileuse, qui peut polluer l'eau.
Les HAP/HAM de poids moléculaire plus élevé, qui contiennent quatre cycles aromatiques
ou plus, sont presque exclusivement lié aux particules, tandis que le poids moléculaire plus
faible. Les HAP/HAM peuvent également être trouvés dissous dans l'eau. Dans
l'environnement atmosphérique, le des HA plus légers sont répartis entre la phase gazeuse et
les particules. Le plus lourd Les HAP/HAM ne sont associés qu'aux particules. Les
hydrocarbures aromatiques sont principalement plutôt inertes composés. Cependant, en
présence de lumière solaire, ils se décomposent facilement en HAP/HAM oxygénés. La
photo-oxydation se produit généralement beaucoup plus rapidement pour les particules sans
particules HAP/HAM que pour les composés liés aux particules. HAP/HAM dans les
environnements atmosphériques peut également réagir facilement avec les oxydes d'azote
pour former des HAP /HAM nitrosubstitués.
Dans l'analyse des HAP/HAM, il est par conséquent important de prêter attention à
l’instabilité de ces composés à tous les stades pour éviter leur photo-décomposition. Pour
concevoir et choisir une méthode analytique pour les HAP/HAM, il convient de noter que
leurs propriétés physiques et chimiques sont une considération importante. Accompagné d'un
dossier contenant des données sur la composition chimique, groupe de 15 HA qui ont été
reconnus par l'ancien comité scientifique La nourriture en 2002 comme étant une
préoccupation pour la santé publique. Ces HA comprennent: B [a] A,Cyclo [cd] P, Chry, 5-
méthylchrysène, B [b] F, B [j] F, B [k] F, B [a] P, In [cd] P, DB [ah] A,B [ghi] P, DB [al] P,
DB [ae] P, DB [ai] P et DB [ah] , Les propriétés chimiques et physiques de ces Les
HAP/HAM sont également résumés dans le tableau1.1.
Les données sont principalement extraites d'Interactive. Démo de la base de données
PhysProp. Aussi par chimiques, ils existent sous forme de cristal pâle ou jaune verdâtre, blanc
ou incolore et avoir une légère odeur aromatique. Parmi eux, certains HA tels que B [a] A,
DB [ai] Pet In [cd] P montrent une fluorescence allant du jaune verdâtre au bleuâtre
brillantviol et à brun. À température ambiante, la plupart des HA sont généralement solides,
très hydrophobes et sont très solubles dans les solvants organiques. La solubilité des HA dans
l'eau est inversement proportionnelle au nombre d'anneaux aromatiques contenus.
HAP/HAM ont également des points de fusion et d'ébullition élevés et de faibles pressions
de vapeur. Vapeur la pression a tendance à diminuer avec l'augmentation de la masse
moléculaire, variant de plus de10 ordres de grandeur.
Ces propriétés physicochimiques affectent la distribution des HAP/HAM dans

environnement. En milieu aqueux, les HAP/HAM se retrouvent généralement adsorbés sur
particules ou solubilisées dans toute matière huileuse, qui peut polluer l'eau. Les HA de poids
moléculaire plus élevé, qui contiennent quatre cycles aromatiques ou plus, sont presque
exclusivement lié aux particules, tandis que le poids moléculaire plus faible Les HA peut
également être trouvés dissous dans l'eau. Dans l'environnement atmosphérique, le des
hydrocarbures aromatiques plus légers sont répartis entre la phase gazeuse et les particules. Le
plus lourd Les hydrocarbures aromatiques ne sont associés qu'aux particules. Les HAP/HAM
sont principalement plutôt inertes composés. Cependant, en présence de lumière solaire, ils se
décomposent facilement en oxygénés. La photo-oxydation se produit généralement beaucoup
plus rapidement pour les particules sans particules.
HA que pour les composés liés aux particules. Dans les environnements atmosphériques
peut également réagir facilement avec les oxydes d'azote pour former des HA nitrosubstitués.
Dans l'analyse des HA, il est par conséquent important de prêter attention à l’instabilité de
ces composés à tous les stades pour éviter leur photo-décomposition. Pour concevoir et
choisir une méthode analytique pour les HA, il convient de noter que leurs propriétés
physiques et chimiques sont une considération importante.
Tableau 1.1. Propriétés physico-chimiques des quelque HAP/HAM prioritaires de la liste EPA d’après Vandecasteele, 2005
Formule Formule Masse Point de Point Solubilité Coefficient de Toxicité Cancérogène Propriétés
HAP/HAM semi- brute molaire fusion(C°) d’ébull- (mg/L) partage octanol ou mutagène
développée (g/mol) ition(C°) /eau log Pow
Naphthalène Non confirmé Cancérigène chez les animaux
C8H10 128.2 80 218 31 3.35 Modérée
Fluorène C13H10 166.2 116 294 1.9 4.18 Faible Constaté Mutagène pour l’homme
Phénanthrène Photo-sensibilisateur de peau

C14H10 178.2 100 338 1.10 4.52 Modérée Constaté
Anthracène Cancérigène chez les animaux. Cancérigène/
C14H10 178.2 216 340 0.045 5.54 Modérée Constaté Retenu par la norme européenne relative à
Fluoranthène l’eau potable
C16H10 202 107 383 0.26 5.22 Modérée Constaté
Pyrène Dommage sur ADN.Mutagène pour l’homme
C16H10 202 150 393 0.132 5.18 Modérée Constaté
Benzo[a] anthracène C18H12 228.3 167 435 0.011 5.91 Elevé Confirmé Cancérigène, Mutagène pour l’homme
Chrysène Confirmé Cancérigène chez les animaux.

C18H12 228.3 254 441 0.002 5.79 Elevé Mutagène pour l’Homme
Benzo[b] fluoranthène Confirmé
C20H12 252.3 169 443 0.015 5.8 Elevé Cancérigène chez les animaux
Benzo[k] fluoranthène Confirmé
C20H12 252.3 169.4 443 0.0008 6 Elevé Cancérigène chez les animaux
Benzo[a]pyrene Confirmé Cancérigène de l’humain. Mutagène pour
C20H12 252.3 179 496 0.0038 6.04 Elevé l’Homme
Dibenzo[g,h,i] pérylène Cancérigène chez les animaux.Mutagène
C21H16 268.4 280 501 0.00026 6.5 Elevé Confirmé pour l’Homme
Indéno[1,2,3c,d]pyrene Confirmé Cancérigène chez les animaux

C18H12 276.03 163 536 0.062 6.6 Elevé
1.4 Persistance
De nombreux facteurs affectent la persistance des HA dans l'environnement. Bactéries, les
plantes et d'autres organismes peuvent métaboliser les HAP/HAM et la dégradation
microbienne est une méthode importante pour éliminer les hydrocarbures aromatiques du sol
et des sédiments. En comparait-on à d'autres polluants organiques, la perte de HAP/HAM
dans l'environnement peut être plutôt rapide. Les facteurs qui influencent le taux de
décomposition comprennent la présence ou l’absence de l'oxygène, le pH et la taille des
particules du sol ou des sédiments. L'oxygène soutient l'aérobie bactérie qui métabolise plus
efficacement les HAP/HAM que les micro-organismes anaérobies; un pH bas inhibe la
dégradation des hydrocarbures aromatiques, donc l'élimination se produit le plus rapidement
dans des conditions neutres ou légèrement alcalines; et une grande taille de particules, comme
dans le sable, accélère la perte de HAP/HAM par rapport aux argiles et aux limons. En plus à
la dégradation biologique.
Les HAP/HAM peuvent se volatiliser dans l'atmosphère ou précipiter dans les sédiments
où ils sont moins disponibles pour les organismes. Dans l'atmosphère, la majorité des HA se
trouvent attachés ou en particulier forme tardive. Les hydrocarbures aromatiques de poids
moléculaire plus léger sont volatils ou semi-volatils et sont à l'état gazeux. Les HA volatils
sont particulièrement sensibles à la lumière ultraviolette et peuvent ne durer que quelques
heures avant de se décomposer ou de se photo-dégrader ; depuis le processus entraîne la perte
d'électrons des hydrocarbures aromatiques ou l'oxydation, le terme la photo-oxydation est
également appropriée. Les HA particulaires peuvent également se dégrader l'exposition à la
lumière ultraviolette, mais sont plus résistants que ceux du gazous phase. L'ozone peut
également être efficace dans la dégradation mais à moins d'effet que la lumière du soleil. Par
exemple, la demi-vie de l'anthracène sous la lumière solaire simulée seule était de 0,20 heure
et a chuté à 0,15 heure en présence d'ozone.
En dessous de dans des conditions d'obscurité, la demi-vie a augmenté à plus d'une
heure, même avec l'ozone présent (Ravindra et al, 2008).La persistance de différents HA sur
terre dépend en partie de leur molécule poids important. Par exemple, le goudron de houille et
l'asphalte sont largement utilisés comme fourmis sur les parkings, les routes et les allées à
travers le pays. Nouvellement appliqué le goudron de houille contient 93 000 mg / kg de HA
ou 9,3% en poids (Mahler et al, 2014).Environ la moitié de cette quantité se volatilise ou
s'écoule dans un mois environ. 80–99% des HAP/HAM plus légers à deux ou trois cycles tels
que le naphtalène, l'acénaphtène et le fluorène disparaît pendant ce temps. Les auteurs ont
attribué la diminution de ces composés plus légers à volatilisation. Le ruissellement des

produits d'étanchéité au goudron de houille était dominé par des HAP/HAM de poids moyen.
HA les plus lourds étaient généralement les plus sédentaires. En revanche, les mastics
bitumineux ne contiennent initialement qu'environ 6% des HAP/HAM trouvés dans du
goudron de houille. (Mahler et al. 2014) ont noté que d'autres produits d'asphalte qu'ils
avaient testés en moyenne seulement 50 mg / L de HAP, bien en deçà de celle du goudron de
houille. Le goudron de houille est encore utilisé dans le monde entier pour le pavage et le
rapiéçage des routes, les parkings et autre visages. Les résultats de cette étude reflètent ceux
de plusieurs autres études - à faible Les HA de poids moyen ont tendance à se volatiliser
davantage, les HA de poids moyen contribuent le plus au ruissellement et aux rejets
d'effluents, et les plus lourds sont les plus sédentaires (ATSDR, 1995).
A la surface de l'eau, les films de HA sont exposés à la lumière ultraviolette et se
décomposent rapidement. Les hydrocarbures aromatiques qui se mélangent aux sédiments
peuvent persister ils se trouvent dans des zones ombragées et si les sédiments sont anaérobies.
Contrairement aux dioxines, furannes et organochlorés, les HA ne sont pas inclus dans
liste des polluants organiques persistants par la Convention de Stockholm, l’accord
international visant à limiter l'utilisation et la propagation des polluants les plus persistants,
parce que les HAP/HAM ne sont pas aussi résistants à la dégradation que les PCB
(www.unido.org). L'inscription de naphtalènes chlorés a été proposée.
Un bon exemple pour illustrer seulement une partie de la complexité de la dégradation des
HA. Montant des carbone organique dissous (COD) et par les nitrates dans l'eau. En théorie,
le COD peut s’adsorber sur les contaminants et diminuer leur disponibilité. Ils peuvent
également augmenter les ions OH - dans l'eau, ce qui facilite l'oxydation dans l’eau a été
démontrée par (Jacobs et al. 2008). Ils ont examiné la photo taux de dégradation des
HAP/HAM dans l'eau collectée à Gary, Indiana et Wilmington, Caroline du Nord et a
déterminé que les taux étaient affectés par le de HAP/HAM, augmentant ainsi le taux de
dégradation. Cependant, les DOC peuvent également réduire pénétration de la lumière et
inhibe la photo-dégradation. Les nitrates, qui libèrent également OH-, n’atteignent pas des
concentrations élevées dans l'eau, sauf dans le ruissellement urbain et zones culturelles en
raison de l'utilisation d'engrais. Dans l'eau de Gary, Indiana, les niveaux de nitrateraient plus
élevés, mais la COD était inférieure à celle de l'eau de Wilmington, en Caroline du Nord.
Les HAP/HAM se dégradaient plus rapidement dans les eaux de Gary que dans les eaux de
Wilmington et les auteurs ont attribué cela à l'augmentation de l'OH- à Gary, qui a amélioré la
photolyse et une réduction de la pénétration de la lumière à Wilmington l'inhibant. Il y a
tellement de facteurs qui affectent la stabilité des HAP/HAM que l'attribution des durées de
demi-vie précises peut être trompeuse. Au contraire, il est sûr de dire que deux anneaux, Les
HAP/HAM ont une demi-vie de jours ou moins dans l'atmosphère, des semaines dans l'eau,
des mois dans les sols et des années dans les sédiments. Ceux avec trois à quatre anneaux ont
des demi-vies qui sont environ le double de celles des structures à deux cycles. HA avec cinq
ou plus d'anneaux persistent pendant des semaines dans l'atmosphère, des mois dans l'eau et
des années sédiments et sols (Wick et al, 2011).
Figure1.3 Influence d’hydrocarbures sur les être vivant.
1.5 Effet des hydrocarbures aromatiques mono et polycycliques sur l’écosystème

Le HAP/HAM exercer un large effet et sur plusieurs domaine et échelle one étude que les
plus touche.
1.5.1 Effets sur les plantes
Les plantes peuvent absorber les HAP/HAM des sols par leurs racines et les déplacer vers
d'autres parties de la plante. Les taux d’absorption sont régis par la concentration, la solubilité
dans l’eau et leur l'état physicochimique ainsi que le type de sol.
Phyto-induite par les HAP/HAM les effets toxiques sont rares. Informations complètes et
base de données à ce sujet sont encore limitées. Certaines plantes contiennent des substances
qui peuvent qui agissent comme des hormones de croissance (Beyer, et al 2010).
1.5.2 Effet sur animaux
Les mammifères peuvent absorber les HAP/HAM par diverses voies, par exemple
inhalation, contact cutané et ingestion (Dong, Cet al201 ; Beyer, et al 2010). La toxicité des
HAP /HAM pour les organismes aquatiques est affectée par les bolisme et photo-oxydation.
Ils son généralement plus toxiques la présence de lumière ultraviolette. Les HAP /HAM ont
un niveau modéré à élevé toxicité aiguë pour la vie aquatique et les oiseaux. Les HAP /HAM
dans le sol sont peu probables exercer des effets toxiques sur les invertébrés terrestres, sauf
lorsque le sol est très contaminé Figure 1.1, 2 et 3
Effets néfastes sur ces organismes comprennent les tumeurs, la reproduction, le
développement et l'immunité Naphtalène, premier membre du groupe HAP/HAM, est un
micropolluant courant dans l'eau potable. La toxicité du naphtalène a été bien documentée et
une activité cataractogène a été signalée chez animaux de laboratoire (Goldman, et al.
2001;Mastrangela, et al.1997).
Le naphtalène se lie par covalence aux molécules du foie, des reins et des poumons les
tissus, augmentant ainsi sa toxicité tableau 1.2; c'est aussi un inhibiteur de la respiration
mitochondriale ( Falahatpisheh, et al.2001).
Figure 1.4. Effet des hydrocarbures sur l’organisme.

1.5.3 Effets sur santé humain

Plusieurs HAP et HAM ont été identifiés comme étant les plus préoccupants
concernant l’exposition potentielle et les effets néfastes sur la santé humains et sont donc
considérés comme un groupe. Moniteur biologique, L’exposition aux HA revêt un intérêt
primordial, en raison de la rediffuser la diffusion de ces composés et à leurs effets
toxicologiques pertinence.
Cependant, les effets sur la santé de chaque HA ne sont pas exactement pareils. En fait, le
Centre international de recherche on Cancer (CIRC 2010) classe certains HA comme connus,
possiblement ou cancérigène pour l'homme (groupe 1, 2A ou 2B). Parmi ceux-ci sont le benzo
[a] pyrène (groupe 1), le naphtalène, le chrysène, le benz [a]anthracène, benzo [k]
fluoranthène et benzo [b] fluoranthène (Groupe 2B) (CIRC 2010). Certains HA sont bien
connus comme cancérogènes, mutagènes et tératogènes et constituent une menace pour la
santé. Le plus important l’effet sur la santé à attendre de l’exposition par inhalation aux HA
est un risque excessif de cancer du poumon (Kim, et al 2013). (Figure 1.4)
Tableau 1.2. Toxicité de quelque type des Hydrocarbures aromatiques sur animal et
hommes.
Chez l’animal : ingestion létale (souris, rat lapin),

anémie hémolytique (chien), cataracte (lapin).
Aiguë
Chez l’homme : anémie hémolytique, cataracte,
intoxication aiguë, hémolyse.
Chez l’animal : anémie hémolytique, cataracte,
inflammation chronique des poumons et des
Hydrocarbures Chronique muqueuses nasales.
Naphtalène
Chez l’homme : céphalées, confusion, nausées,
Aromatiques vomissements et anémie hémolytique.
Aiguë Chez l’animal : troubles hépatiques.
Mono et Chez l’animal : troubles hépatiques et
Fluorène
Chronique hématologiques, ulcération de l’épithélium de
Polycycliques l’intestin grêle.
Aiguë Chez l’animal : troubles du comportement.
Fluoranthène
Chronique Chez l’animal : néphropathie et lésions du foie.
Aiguë Chez l’animal : néphropathie.

Pyrène
Chronique Chez l’animal : papillomes.
Figure 1.5. Exemples sur effet d’hydrocarbure sue plusieurs échelles.
1.2. 5 Les hydrocarbures aromatiques cible a cette étude

La List de hydrocarbures aromatiques monocycliques et polycycliques cible a notre étude
est 2 type de mix hydrocarbures aromatiques polycycliques regroupe (Naphthalene,
Acenaphthylene, Acenaphthene, Fluorene, Phenanthrene, Anthracene, Fluoranthene, Pyrene,
Benzo(a) anthracene, Chrysene, Benzo(b) fluoranthene, Benzo (k) fluoranthene, Benzo(a)
pyrene, Dibenzo (a,h) Anthracene, Benzo (ghi) perylene et Indeno (1,2,3-cd) pyrene) et
hydrocarbures aromatiques de type monocycliques (Methyltert-butylether, Benzene, Toluene,
Ethylbenzene, m-Xylene, p-Xylene, o-Xylene, 1,3,5-Trimethylbenzene ,1,2,4-
Trimethylbenzene et naphthalene).
Autre information sur les deux mélanges de l’hydrocarbure sont situé dans l’annexe.
2. BIODEGRADATION DES
HYDROCARBURES
AROMATIQUES
2. Biodégradation des hydrocarbures 17
2. BIODEGRADATION DES HYDROCARBURES

AROMATIQUES
2. LA BIODEGRADATION
La biodégradation est le moyen naturel de recycler les déchets (les polluant) ; et la
Transformation de la matière organique ou inorganique en nutriments soit en présence
d'oxygène (biodégradation aérobie), soit sans oxygène (biodégradation anaérobie). La
biodégradation est l’élément clé du devenir des polluants organiques dans les sols et l’eau,
elle assurer l’élimination complète des hydrocarbures.
Les polluants organiques peuvent être traités par des méthodes biologiques, c’est-à-dire que
sont les microorganismes qui vont dégrader les polluants ; ceci rend le processus de
dégradation plus adapté à l’environnement, puisque les polluants ne sont pas transformés mais
détruits. Ces méthodes peuvent être utilisées pour la décontamination des sols
(Tranchmontagne, 1999).
Les hydrocarbures constituent une source de carbone et d’énergie pour les
microorganismes rependus dans l’environnement marin (bactérie, moisissures, champignons
et levures) responsables de la transformation des hydrocarbures en produits oxydés La
biodégradation consiste à transformer les hydrocarbures en Dioxyde de Carbone (CO2), en
Eau, en Ions, Nitrates, Phosphates ou en Sulfates. (Destribat et coll ; 1994).
2.1 Principe de la biodégradation
La biodégradation des hydrocarbures aromatique est une oxydation biochimique par des
micro-organismes. Les processus d’oxydation qui aboutissent à la formation des
hydrocarbures de poids moléculaires plus faibles, appelée bioconversion. Mais aussi à la
formation de gaz carbonique, d’eau, de sels minéraux et de biomasse lorsque la réaction est
complète (Pelmont, 1994 ; Goyer et al. 1995).
Ce procédé peut donc convertir un composé inoffensif en composé toxique, changer une
substance immédiatement métabolisable en substance difficile à détruire, ou altérer la toxicité
du composé. La biodégradation primaire, tant qu’à elle, est utilisée pour indiquer une simple
transformation, alors que le terme de biodégradation partielle signifie n’importe quelle
transformation entre la biodégradation primaire et la minéralisation. La transformation la plus
avantageuse serait la dégradation totale du composé toxique (Crady, 1985).
2.2 Les microorganismes de la biodégradation des hydrocarbures aromatiques

Les microorganismes impliqués dans la de biodégradation des hydrocarbures sont
appelés « Hydrocarbonoclastiques » (Goyer et al, 1995). Plusieurs espèces de
microorganismes ont la capacité de dégrader ces composés (Sirvins et Tramler, 1985). Plus de
deux cents microorganismes (bactéries, levures, champignons) ont été reconnus capables de
transformer (métaboliser) en produits de dégradation les hydrocarbures, ce sont, pour la
plupart des espèces aérobies.
Il est admis que les microorganismes dégradants les hydrocarbures possèdent les
mécanismes enzymatiques nécessaires à leur oxydation. Leur action initiale est due à des
enzymes oxygénases spécifiques qui provoquent la rupture des hydrocarbures. L’efficacité de
cette action dépend donc, en grande partie, de la quantité d’oxygène moléculaire disponible,
outre l’oxygène d’autres corps sont nécessaires à l’action des bactéries (Lacaze, 1980 ; Sirvins
et Tramler, 1985 et Goyer et al, 1995). En effet, les données récentes en microbiologie et en
physiologie de la biodégradation des contaminants indiquent que les microorganismes
capables de réaliser ces réactions possèdent le matériel génétique nécessaire à l’induction des
enzymes (Goyers et al, 1995).
Selon Servins et Tramler (1985) et Magot et al. (1994), les espèces bactériennes les plus
fréquentes appartiennent aux genres suivants : Pseudomonas, Acinetobacter, flavobacterium,
Mycobacterium, Brevibacterium, Corynebacterium, Arthrobacter, Achromobacter,
Micrococcus, Actinomycètes et Nocardia.. Cependant, d’autres microorganismes sont
capables de dégrader les hydrocarbures notamment les levures (Rhodotorula, Candida,
Torulopsis, Cryptococcus, Pichia et Hansenula) et les moisissures (Fusarium, Aspergilluset
Penicillium) (Champagnat et Adrian, 1974).
Figure 2 .1. Intervention de microorganismes lors de la biodégradation des

hydrocarbures aromatiques.
2.2.1 Gènes impliqués dans la biodégradation des hydrocarbures aromatiques par les
germes microbiens
Oxygénases et les peroxydases sont des enzymes synthétisés par les microorganismes (porte
par des gènes et synthétisé après la transcription et la traduction) qui sont impliqués dans le
processus oxydatif de la biodégradation des hydrocarbures ; catalysent l'activation ainsi que
l'incorporation d’oxygène. Diverses voies de dégradation et des gènes cataboliques pour la
biodégradation de chaque groupe d'hydrocarbures et les enzymes sont nécessaires pour
introduire de l'oxygène dans le substrat d’hydrocarbures pour démarrer la biodégradation.
(Widdelet Rabus, 2001; Hendrickx et al., 2006; Foght, 2008; Meckenstock et al., 2016).Les
enzymes impliquées dans la dégradation des polluants des hydrocarbures pétroliers sont Selon
la longueur de la chaîne et le type de polluants d'hydrocarbures pétroliers
Quelque exemple des gènes impliqués dans la biodégradation
 gène alkB pour alcane monooxygénase,
 gène xylE pour catéchol dioxygénase
 gène nahAc pour le naphtalène dioxygénase
Les trois gènes cités sont des gènes majeurs impliqués dans la dégradation microbienne les
polluants d'hydrocarbures (Whyte et al, 1998; Baldwin et al, 2003; Hendrickx et al, 2006;
Wilkes et al, 2016).
Figure 2.2. Les différentes positions de gène alkB sur une séquence génomique.
2.2.2 Adaptations génétiques de micro-organismes

Il y a des nombreuses souches microbiennes isolées ont la capacité de Métaboliser des
hydrocarbures avec des taux de biodégradation variables. Plusieurs études ont signalé une
adaptation et une augmentation taux de dégradation des Hydrocarbures. (Caparello et La
Rock 1975) .la zone et le type d’échantillon (eau ; sole) avec des charges d'hydrocarbures plus
importantes avaient activité oxydante des hydrocarbures.
L’augmentation de l'exposition des sédiments d'eau douce à un pétrole synthétique le taux
de dégradation des hydrocarbures est plus important (Sayler et al 1983). Il y a des
mécanismes d’adaptation des populations microbiennes aux contaminants sont changements
génétiques ; l’enrichissement et dépression des enzymes (Leahy et Colwell, 1990).le
mécanisme génétique primaire pour l'adaptation des microbes est l'amplification des gènes qui
sont impliqués dans le métabolisme du polluant par enrichissement sélectif et le transfert de
gènes (Barkay, 1988).
Suivi de l'adaptation par le développement de sondes ADN spécifique des gènes codant
pour les voies cataboliques des hydrocarbures.
La technique d'hybridation des colonies a montré une relation entre l'augmentation des taux
de la biodégradation dans les sols contaminés par les hydrocarbures et une augmentation du
nombre de colonies contenant Séquences d'ADN qui s'hybrident à TOL (tolérer l'oxydation)
et Sondes plasmidiques NAH (oxydation du naphtalène) (Sayler et al, 1985)
Exemples de l’adaptation bactérienne : Pseudomonas putida G7 ont un dioxygénase est une
enzyme qui transforme l'hydrocarbure aromatique par l’oxydation. Les dioxygénase de bas
poids moléculaire présentent de nombreuses similitudes entre les Gènes codant pour les
dioxygénases des Gènes appartenant aux familles TOL et NAH (Burlage, et al ,1989 ; Menn
et al, 1993).
Tableau 2.1. Divers gènes interviennent dans la biodégradation des hydrocarbures

aromatiques mono et polycycliques
Gène Localisation Genres References
BphAl pNLl Spli!•e• m aearoinalicivoransF199 Romine et al., 1999
DntAc Plasmide Btirkliolderia .sp. DNT Suenet al., 1996
NagAC pWWF6 Ralstonia sp. t/2 Fuenmayoret al., 1998
DoxB Plasmide Psetidomonas .sp.C18 Denomeet al., 1993
NahAc Plasmide Psetidomonas .sp. Yen et Gunsalus, 1982 ;
Bosch et al, 1999
NAP7 Psetidomonas .sttit7eri
NbzAc Comamona.s sp. JS765 Lessner et al., 2002
NarAa Chromosome Rhodococcus sp. NCIMB 12038 Larkin et al., 1999
NdoB Plasmide Psetidomonasputida NCIB9816 Kurkela et al., 1988
NtdAc PDTG800 Pseudonionas sp.JS42 Paraleset al., 1996
PahAc Chromosome Comamonastestosteroni Moser et Stahl, 2001;
Takizawaet al., 1999 ;
Pseudonionas aeruginosa
Takizawaet al., 1999
Pseudonionasputida 0 US82
pdoA1 Chromosome Mycobacterium sp. 6PYI Krivobok et al., 2003
2.2.3 Biodégradation microbienne.

L’eau marins et les sédiments contiennent des populations microbiennes (bactéries et
champignons) tableau 2.2 capables de biodégrader certains ou plus des hydrocarbures
pétroliers (Leahy et Colwell, 1990). Les bactéries et les champignons d’eau et des sédiments
montrent une l’adaptabilité dans l’utilisation de différents types d’hydrocarbures en tant que
source de carbone supplémentaire. De nombreux groupes de micro-organismes peuvent
oxyder certains des hydrocarbures aromatiques en dioxyde de carbone et l'eau et les utiliser
comme source de carbone pour la croissance. (Ahn et al. 1999) ont isolé 89 souches des
bactéries dégradant les HA du sol contaminé. (Ravelet et al. 2000) isolé 40 souches de
micromycètes (microfungi) capables de biodégrader le pyrène dans les sédiments marins.
Souvent, les hydrocarbures aromatiques et les composés hétérocycliques sont métabolisés
uniquement partiellement à une variété de métabolites polaires oxygénés (Fedorak et
Westlake, 1984; Bossert et Bartha, 1986; Kuhn et Suflita, 1989; Qiu et McFarland, 1991).
Suite à un déversement de pétrole brut ou raffiné, différentes classes d'hydrocarbures sont

dégradé simultanément dans la nappe superficielle, dans la colonne d'eau, sur le rivage ou
dans sédiments, mais à des taux très différents selon le microbiote indigène (Atlas, 1981,
1995 ; Oudot, 1984 ; Leahy et Colwell, 1990 ; Gough et al, 1992 ; Oudot et al, 1998). Les
hydrocarbures aromatiques cycliques, les HA, et enfin les cycloalcanes hautement condensés,
les résines, et les asphaltènes.
Figure 2.3. Dégradation du naphtalène en salicylate par des bactéries aérobies du genre
Pseudomonas (Vandecasteele, 2005)
Tableau 2.2. Sélection des espèces de champignons et de bactéries intervient dans la

biodégradation des HAP et HAM.
HAP/HAM Bactéries / Champignons Références
Phénanthrène Pseudomonas sp; Agrobacterium sp; Aitken et al 1998
Bacillus sp; Burkholderia sp. Et
Sphingomonas sp.
Benzo (α) pyrène Sphingomonasyanoikuyae JAR02 Rentz et al 2008
Benzo (α) pyrène Rhodococcussp. 14 Song et al. 2011
Pyrène Rhodococcussp. UW1 Walter et al. 1991
Pyrène, benz (α) anthracèneet Mycobacterium sp. souche RJGII-135 Schneider et al.1996
benzo (α) pyrène
Phénanthrène Pseudomonas fluorescens, Yuan et al. 2002
Haemophilussp.
Fluorène Phanerochaetechrysosporium Bogan et al. 1996
Benzo (α) pyrène Marasmiellustroyanus Nemergut et al.2000
Benzo (α) pyrène Fusariumsolani Morales et al. 2017
Benzo (α) pyrène P. chrysosporium May et al.1997
La dégradation de certains hétérocycliques du soufre, tels que le dibenzothiophène et ses

homologues alkyles, semble exiger des assemblages microbiens mixtes et substrats (Kropp et
al, 1994 ; Dyreborg et al. 1996). Habituellement, ces microbiens mixtes des assemblages et
des co-substrats sont présents dans les sédiments contaminés par le pétrole sur le terrain, et les
dibenzothiophènes ont tendance à se dégrader à des taux similaires à ceux des HA de poids
important (Douglas et al. 1996 ; Burns et al. 1997).
2.2.3.1 Les bactéries
Les bactéries sont impliquées dans la dégradation des hydrocarbures des sites contaminés.
Un certain nombre d'espèces bactériennes sont connues pour la dégradation des HAP et
HAM. (Tableau 3.2) La plupart d'entre eux, représentant l'efficacité de la biodégradation, elles
sont isolées à partir de sols contaminés à long terme par les déchets pétrochimiques (Haritash
et Kaushik, 2009).
2.2.3.2 Les champignons
De nombreuses études en sols ont démontré l’utilité et l’efficacité des champignons pour la
biodégradation de sols pollués par les hydrocarbures (Haemmerli et al, 1986; Sutherland et al,
1991; Eggen et Majcherczyk, 1998; Bogan et al, 1999) parmi ces champions les genres:
Amorphoteca, Neosartorya, Talaromyces, Graphium, Candida, Yarrowia, Pichia, Aspergillus,
Cephalosporium, Pencillium, Cunninghamella, Fusarium, Mucor, Phanerochaete,
Rhodotorula, Sporobolomyces et Trichoderma (Young et Cerniglia 1995 ;Chaillan et al,
2004; Singh, 2006).(tableau 3.2) Les avantages principaux des champignons par rapport aux
bactéries sont leur capacité à se propager dans les sols grâce à leur mycélium et à produire des
enzymes extracellulaires par exemple des oxydases à large spécificité de substrats qui
permettent un meilleur contact avec les hydrocarbures (Young et Cerniglia, 1995).
Figure 2.4. La biodégradation d’hydrocarbure aromatique dans une cellule.

2.3 Biodégradation des hydrocarbures

2. 3.1 Biodégradation des hydrocarbures polycycliques
Les hydrocarbures aromatiques polycycliques sont des substances potentiellement
mutagènes et cancérigènes présentes à des concentrations variables dans l’atmosphère, les
sols, les eaux et les sédiments (Van Hamme et al, 2003). HAP issus de processus naturels ou
anthropiques, sont des polluants organiques persistants du fait de leur inertie chimique et de
leur résistance à la biodégradation (Van Hamme et al, 2003).
Les hydrocarbures aromatiques polycycliques de trois anneaux benzéniques ou moins sont
entièrement biodégradés par des bactéries hétérotrophes qui peuvent les utiliser comme seule
source de carbone et d’énergie, tandis que l’utilisation par des microorganismes des HAP de
quatre noyaux benzéniques. Puisque les HAP de plus de quatre noyaux ne peuvent
généralement être utilisés comme seule source de carbone et d’énergie, l’oxydation
biologique semble s’effectuer par le biais de la Co-oxydation (Schneider et al, 1996).
2. 3.2 Biodégradation des hydrocarbures monocycliques
La biodégradation des hydrocarbures aromatiques par les microorganismes est très
importante pour l’élimination de ces composés des systèmes aquatiques et terrestres. Les
procaryotes et les eucaryotes ont des capacités enzymatiques qui leurs permettent d’oxyder les
composés aromatiques (Van Hamme et al, 2003).
La biodégradation des hydrocarbures aromatiques apparait comme un processus
essentiellement aérobie, l’étape initiale de ce processus est une réaction directe d’oxydation
par l’oxygène de l’air faisant intervenir des oxygénase, cette réaction initie alors des voies
permettant une dégradation complète (minéralisation) en CO2 et une croissance microbienne.
Elle peut aussi conduire à une dégradation partielle et donc à l’accumulation de métabolites.
Dans ce cas, l’hydrocarbure n’est pas un substrat de croissance et sa dégradation n’intervient
que par Co-métabolisme, le microorganisme concerné est alors un dégradeur mais pas un
minéralisateur (Bouchez et al, 1996).
2.4 Voies de la biodégradation des polluants d'hydrocarbures pétroliers
Les micro-organismes dégradent les polluants d'hydrocarbures pour obtenir l'énergie ou
les assimiler dans la biomasse cellulaire (Leahy et Cowell, 1990). Processus
aérobie; cependant, certains micro-organismes sont signalés pour la dégradation anaérobie de
les hydrocarbures (Widdel et Rabus, 2001; Abbasian et al, 2015; Meckenstock et al, 2016).
Diverses réactions à savoir. L’oxydation, la réduction, l'hydroxylation et la
déshydrogénation sont commun pour les voies aérobies et anaérobies de dégradation
microbienne du pétrole les polluants d'hydrocarbures (Abbasian et al, 2015; Wilkes et al,
2016). La biodégradation peut être caractérisée par une augmentation de l'abondance relative
des fractions polaires ainsi qu'une perte de saturation et les hydrocarbures aromatiques (Mittal
et Singh, 2009;Varjani et al, 2015; Varjani et Upasani, 2016).
2.4.1 Biodégradation aérobie
Les polluants d'hydrocarbures pétroliers peuvent être dégradés par diverses voies (terminal
oxydation, oxydation sous-terminale, ω-oxydation et β-oxydation ….) (Salleh et al,
2003;Abbasian et al, 2015)
Les hydrocarbures aromatiques sont moins biodégradables que les hydrocarbures saturés
Ils présentent des effets plus dégradants dans l'environnement et les formes de vie. Attaque
oxydative initiale suivie par clivage du cycle benzénique sont les étapes clés de la dégradation
des hydrocarbures aromatiques (Hendrickx et al, 2006). La dégradation bactérienne des
hydrocarbures implique la formation d'un diol, suivie d'un clivage du cycle et de la formation
d'acide di-carboxylique.
Les champignons et autres eucaryotes oxydent généralement les aromatiques à l'aide de
mono-oxygénases, formant un trans-diol (Zhang et al, 2011). Le moyen le plus courant
d'oxydation initiale est la formation de cis-dihydrodiols par incorporation des deux atomes
d'oxygène d'une molécule d'oxygène, puis à formation de catéchols (Abbasian et al, 2015).
L'anneau de benzène est clivé par des micro-organismes de différentes manières par des
enzymes appropriées (Li et Liu, 2002): clivage ortho- ou méta-des voies conduisant à la
formation d’intermédiaires centraux tels que les catéchols qui sont ensuite convertis en
intermédiaires du cycle de l'acide tricarboxylique (TCA) (Abbasian et al, 2015).
Les voies de clivage ortho- et méta diffèrent selon le site de clivage. Le clivage ortho est
catalysé par des dioxygénases intradiol qui sont soit des homomultimères, soit composé de
deux sous-unités différentes contenant du fer ferrique. Cependant, le méta-clivage est catalysé
par des dioxygénases d'extradiol qui sont des multimères d'une seule sous-unité contenantfer
ferreux (Li et Liu, 2002). Les gènes de méta-clivage sont localisés sur les plasmides. Ortho-les
gènes de clivage sont localisés sur le chromosome alors que les ortho-gènes génétiquement
modifiés sont situé sur des plasmides cataboliques (Van der Meer et al, 1992).
Tableau 2.3 .Principaux souches bactériennes aérobies qui participent à la dégradation des
HAP/HAM
Composes Microorganisms References

Naphtalène Pseudomonas Sp. Eaton et Chapman, 1992
Rhod‹›c‹›ccussy. M Grund et al„ 1983
ycobacierium sp. Daane et al. 2001
Fluorène Pseudomonas sp. Genneyetal., 2004
Rodococcus sp. Boldrinetal., 1993
Anthracène Pseudomonas sp. Juhaszet al., 2009
Phénanthrène Pseudomonas sp. Kang et al., 2005
Fluoranthène Pseudomonas sp. Lopez et al., 2005
Paucimobilis sp.
Pyrène M ycobacterium sp. Boldrin et al., 1993
Benzo[a]pyrène Beijerinckia sp. Jerinaet al., 1976
Pseudomonas sp. Kanaly et al., 2000
2.4.2 Biodégradation anaérobie

Les composés (benzène, toluène, éthylbenzène, xylène) sont généralement éliminés à peu
près au même rythme par le métabolisme aérobie et anaérobie (Abbasian et al, 2015). Sous
métabolisme anaérobie, ces composés aromatiques sont d'abord oxydés en phénols ou des
acides organiques, puis transformés en acides gras volatils à longue chaîne, qui sont
finalement métabolisé en CH4 et CO2 (Heider et al, 1999; Abbasian et al, 2015; Wilkes et al,
2016).
Divers accepteurs d'électrons à savoir. Les ions nitrate, fer ferreux, manganèse ou sulfate
sont signalés pour la dégradation anaérobie des hydrocarbures pétroliers (Widdel et Rabus,
2001; Foght, 2008; Abbasian et al, 2015), ainsi que (Jaekel et al.2013), ont signalé une
dégradation anaérobie du propane et du butane par des bactéries sulfato-réductrices enrichi de
suintements froids d'hydrocarbures marins. Ils ont constaté que les cultures enrichies amas
phylogénétique distinct affilié à l'amas de Desulfosarcina – Desulfococcus dans
δProtéobactéries.
Selon Wilkes et al. (2016), ont proposé deux mécanismes biochimiques, à savoir l'addition
du fumarate et de la carboxylation comme activation initiale des alcanes. (Heider et al.1999),
rapporté Benzoyl-CoA comme intermédiaire commun dans le catabolisme anaérobie de
nombreux aromatiques composés. Biodégradation des hydrocarbures aromatiques non
substitués à savoir. Benzène et certains hydrocarbures polyaromatiques (naphtalène et
phénanthrène) ne sont pas très bien compris (Widdel et Rabus, 2001 ; Meckenstock et al,
2016). Toluène, alkyl benzène et l’éthy lbenzène est oxydés en benzoyl-CoA. Le benzène et le
naphtalène sont initialement activé par carboxylation mais le mécanisme détaillé reste flou
(Foght, 2008).
Plus loin la dégradation suit les voies du benzoyl-CoA ou du naphtalène-CoA (Foght,
2008 ; Meckenstock et al, 2016; Harwood et al.1998 et Wilkes et al.2016), ont rapporté que
les voies centrales benzoyl-CoA sont différentes pour de nombreux aspects de la
dénitrification, bactéries phototrophes et en fermentation.
2.4 Cinétique de la biodégradation des HAP et HAM

Les caractéristiques du sol déterminent la diversité et l’activité de sa microflore qui est
responsable de la dégradation des hydrocarbures. De plus, ces caractéristiques influencent la
force des interactions entre les hydrocarbures et les microorganismes du sol. (Cutright 1995)
La cinétique associée aux champignons Cunninghamellaech-inulata en association avec
différents suppléments nutritifs, La Cunninghamellaech-inulata var. élégants dégrade
efficacement les Hydrocarbures dans présence de ces nutriments tandis que tous autres micro-
organismes ne le sont pas. Le taux de variation de la concentration des contaminants est
proportionne là type et la concentration de contaminants dans le sol et à type de
microorganismes, Les différentes enzymes impliquées dans les champignons la dégradation a
une activité maximale à différentes température et certains d'entre eux sont actifs même à des
températures extrêmes.
La surveillance de la cinétique de diverses souches fongiques est compliquée, mais la
plupart d'entre eux ont de bonnes capacités de dégradation dans une gamme mésophile. Le
taux de dégradation peut être amélioré par prétraitement à une température élevée qui entraîne
une volatilisation et la diminution du coefficient de partage sol-eau, en tant que la dissolution
résultante des polluants augmente le taux de dégradation (Haritash et Kaushik, 2009).
2.5 Les facteurs influencent la biodégradation
Les micro-organismes sont très sensibles à l'environnement de croissance et répondent
aux changements de leur environnement (Boopathy, 2000). Les taux de biodégradation sont
influencés par de nombreux Facteurs de type de microorganismes ; quantité du polluant Les
propriétés physicochimiques des hydrocarbures ; PH ; salinité du milieu ; éléments nutritifs.
2.5.1 Facteur liée a hydrocarbure aromatique mono et polycycliques

2.5.1.1 Les propriétés physicochimiques des hydrocarbures
Notamment la taille et la structure moléculaires, l'ionisation potentiel, affinité électronique,
coefficient de partage ; et la solubilité dans l'eau joue un rôle important et variable dans la
transformation et la dégradation processus Les de hydrocarbures des faibles poids moléculaire
sont plus sensibles à la transformation et dégradation que les HA plus hydrophobes de haut
poids moléculaire (Jonsson et al, 2007).
2.5.1.2 La concentration en hydrocarbures
Les concentrations élevées d’hydrocarbures peuvent inhiber la biodégradation par
limitation des nutriments et d’oxygène. L’effet toxique exercé par certains hydrocarbures
pendant que la plupart des microorganismes meurt à des concentrations de solvants
organiques très faibles (0.1%), Pseudomonas, Actinomycétes, et Nocardia sp, peuvent
assimiler les solvants organiques à une concentration de 0.3% (Merzouk, 2001).
2.5.2 Facteur liée aux microorganismes
2. 5.2.1 La concentration en microorganismes
La biodégradation des hydrocarbures est influencée par de nombreux facteurs. Le
premier de ces facteurs est la faible concentration en microorganismes capables de
métaboliser les hydrocarbures, car plus la concentration en microorganismes est importante,
plus la biodégradation sera importante (Van Hamme et al. 2003)
2.5.2.2 La souche bactérienne
Selon (Boudjema et al, 2009), les réactions chimiques (oxydation, hydro oxydation) de
biodégradation des hydrocarbures catalysées par les enzymes des bactéries dépendent aussi de
la souche bactérienne. Des souches ont la capacité de dégradation plus que autre souches
(Gatellier, 1971 ; Lacaze, 1980 ; Sirvzns et Tramlef, 1985).
2.5.3 Facteur liée a les conditions des développements.
2.5.3.1 Éléments nutritifs
Le facteur probablement le plus limitant est la teneur en élément nutritifs. Comme tout
organisme vivant, les micro-organismes nécessitent l’apport de carbone et de différents macro
et micronutriments permettant aux activités métaboliques de se produire. A l’inverse, une
carence en nutriments aura pour effet de ralentir considérablement les processus de
dégradation (Goyer et al, 1995).
Les hydrocarbures contiennent du carbone et de l’hydrogène avec de petite quantité
d’azote et de soufre, mais pas de phosphate. Ces micro-organismes doivent trouver ces
éléments dans leur environnement pour effectuer les différentes activités métaboliques de la
croissance (Rosenberg, 1993).

Le carbone joue un rôle prééminent dans l’édification des molécules organiques de la
matière vivante (sucres, lipides, protéines, acide nucléiques). L’azote également (protéines,
acide nucléiques) joue un rôle primordial dans la formation de la biomasse. Bien que limitée,
la demande en phosphore reste essentielle pour répondre aux besoins de la cellule bactérienne
en ATP et la synthèse des protéines et des acides nucléiques (Das et Chandra, 2010).
Pour réajuster le déséquilibre qui se crée après un déversement dans le sol entre le
carbone d’un côté et l’azote et le phosphore de l’autre côté, il est nécessaire d’ajouter un
fertilisant composé de corps simples qui peuvent être assimilés sans transformation digestive
par les organismes, donc ils favorisent la croissance des populations des bactéries (Khaznadji
et Houara, 2000).
2. 5.3.2 L oxygène
L’oxygène est un élément essentiel à la dégradation aérobie, et serre d’un facteur
limitant de la biodégradation (Goyer et al, 1995). L’efficacité des enzymes oxygénases qui
provoquent la rupture des hydrocarbures dépend en grande partie de la quantité d’oxygène
moléculaire. (Rosenberg, 1993 ; Lacaze, 1980).
En effet, le terrain à dépolluer doit être labouré jusqu’à une profondeur de 1m afin
d’assurer une aération d’où l’apport d’oxygène qui est nécessaire au métabolisme microbien
(Khaznadji, Houara, 2000).
2. 5.3.3 Le pH
La plupart des bactéries hétérotrophes et champignons préfèrent un pH proche de la
neutralité. Les pH extrêmes vont donc influencer négativement la capacité des populations
microbiennes à dégrader les hydrocarbures. Pour augmenter les valeurs de pH, on peut
procéder au chaulage (adjonction de chaux : oxyde de calcium) et lorsque on veut le diminuer,
on procède à l’ajout de la même façon des produits acidifiants ou encore des composés
soufrés (Goyer et al, 1995).
2. 5.3.2 Emulsifiants ou dispersants
Ce sont des substances qui favorisent la dispersion d’une substance. Ils activent la
désorption des hydrocarbures, ce qui augmente les surfaces de contacte des hydrocarbures
avec les bactéries. Cependant, il existe des bactéries qui secrètent souvent leurs propres agents
émulsifiants. Ces derniers sont appelés les « surfactants » ou émulsifiants (Pelmont, 1995).
Les émulsifiants est d’augmenter la croissance des bactéries sur les hydrocarbures par
deux mécanismes :
 Augmentation de la zone de surface des hydrocarbures.
 Désorption des bactéries des gouttes de pétrole utilisées (Rosenberg, 1993).

2. 5.3.1 La température
La température varie sur une très large gamme suivant les conditions climatiques et
géographiques et l’on sait que l’activité biologique des microorganismes est très sensible aux
variations de la température (Sirvens et Tramler, 1985).
Elle agit sur :
 L’état physiologique et la composition chimique du pétrole
 La vitesse de la biodégradation
 La composition de la communauté microbienne.
En effet, la biodégradation déclinera avec la baisse de la température en raison d’une

réduction de la croissance microbienne et d’un ralentissement du métabolisme microbien, et
l’augmentation de la température favorisera la dégradation des hydrocarbures aromatiques
polycycliques de faible poids moléculaire.
En générale, on peut situer la température optimale de dégradation biologique aux
alentours de 27°C. Cette température peut varier en fonction des hydrocarbures impliqués
ainsi que la population microbienne autochtone du milieu (Goyer et al, 1995).
2.5.4Autres facteurs
2. 5.4.1 Humidité du sol
La présence d’eau dans le sol est essentielle à la biodégradation puisqu’elle permet
aux microorganismes de se mouvoir à travers les macro-agrégats des sols et d’activer les
processus métaboliques de ceux-ci. L’eau permet également aux hydrocarbures aromatiques
polycycliques de se solubiliser relativement, augmentant ainsi leurs biodisponibilités aux
microorganismes.
Par contre un excès d’eau entraînera des conditions d’anaérobie dues à l’absence de
diffusion de l’oxygène causé par la saturation en eau du milieu. Ces conditions extrêmes
d’humidité seront alors défavorables à la croissance microbienne, à l’opposé une carence en
eau aura des effets d’inhibition sur l’activité bactérienne (Colin, 2000).
2.5.4.2 Type de matrice
Dans les sols argileux, les différents éléments permettant la biodégradation (air, nutriments)
ne peuvent pas bien circuler dans ce milieu. Par contre, si les sols sont des graviers grossiers,
l’eau qui apporte l’oxygène et les nutriments se draine très rapidement à cause de la porosité
du sol et par conséquence ne peuvent pas créer les conditions optimales de biodégradation
(Colin, 2000).
2. 5.4.3 Effet de l’exposition préalable et adaptation

Les communautés microbiennes sont sujettes à des expositions préalables aux
hydrocarbures à des niveaux d’activité différents tels que :
 Les endroits d’activité d’exploitation, de transport, de pétrole et des ports ;
 Les endroits de nettoyage et des réservoirs ;
 Les effluents des déchets industriels.
Le tableau ci-dessous regroupe les facteurs les plus importent et leur optimale pour un bon
rendement et développent de microorganismes que utilise pour la biodégradation de
hydrocarbures aromatique poly et mono. La condition optimale jour un rôle pour amélioration
aussi et orientation de voies de dégradation favorable.
Tableau 2.4.Condition optimale récapitulative de la biodégradation des HAP et HAM (Sims

et al, 1990) o1990]
Paramètres Conditions pour l’activité microbienne Valeurs optimales
Humidité 25 à 90 % de la capacité de rétention en eau 30 à 90 %
PH 5à9 7–8
Potentiel Aérobies et anaérobies facultatives > 50 mV
d’oxydoréduction Anaérobies < 50 Mv
En conditions aérobies: minimum de 10 %

10 à 40 % O2
Teneur en oxygène En conditions anaérobies:< 1% par volume
Azote et phosphore, Carbone (C): Azote (N): C: P: N 48000: 60: 1

Teneur en nutriments
Phosphore (P) 120: 10 : 1 Concentration en sel<4%
Température 15 – 45 °C De 20 à 30 °C
3. PROCEDES DE DEPOLLUTION
Le type de procédé de dépollution hydrocarbures aromatiques monocycliques et

polycycliques il est nécessaire de vérifier plusieurs paramètres :
 Type de polluants et variabilité de leur comportement (volatilité, polarité …etc.),
 Diversité des conditions locales (nature du sol, de la nappe, accessibilité, disponibilité
de surfaces utilisables à proximité, zone urbaine ou non),
 Pollution récente ou ancienne, étendue ou non.
 Les exigences économiques et administratives à prendre en compte
 Le type de milieu touche (sol, eau ou solutions aqueuses air ou l’atmosphère)
(Boukamouche, 2012).
Il est existe plusieurs technique proposées pour éliminer les HA et remédier les sites
contaminés. Chaque technique à des points fort et autre fable est des conditions et de manière
pour utilisation :
3.1 Procédé chimique
Dueso et al, (2011) technique consiste a utilise des molécules comme L’ozone (O3) (Miller
et al,2004 ;Mahony et al. 2006 ; Alderman et al. 2007) utilisation de l'acide peroxy , élément,
des produits chimiques et même des réactions comme Le réactif de Fenton (Flotronet
al.2005) purement chimique pour bute d oxyde les différent molécules de HA cible
(hydrocarbures aromatiques polycycliques contenant (Naphthalene , Acenaphthylene,
Acenaphthene, Fluorene, Phenanthrene, Anthracene, Fluoranthene, Pyrene, Benzo(a)
anthracene, Chrysene, Benzo(b)fluoranthene, Benzo(k) fluoranthene ,Benzo(a)pyrene,
Dibenzo(a,h) Anthracene, Benzo(ghi) perylene et Indeno(1,2,3-cd)pyrene) et hydrocarbures
aromatiques de type monocycliques (Methyltert-butylether, Benzene, Toluene, Ethylbenzene,
m-Xylene, p-Xylene, o-Xylene, 1,3,5-Trimethylbenzene, 1,2,4-Trimethylbenzene et
Naphthalene)
Cette technique pourrait éliminer efficacement les HA des eaux de surface (Moursy et al
1983).et a des conditions pour donne un bon rendement Le poids moléculaire et structure du
composé, son état physique, sa température, et la force de l'agent oxydant, (Alebic–Juretic et
al.1990) Ont rapporté que le fluoranthène était le plus stable des HA testés pour l'oxydation
par l'ozone (Alebic – Juretic et al. 1990)
Autre molécules utilise comme la catalyse TiO2 ou ZnO qu’efficace pour la dégradation des
HA dans un sol contaminé (Zhang et al 2008; Hassan et al 2015 ; Petsas et al. 2013).
(Wlodarczyk-Makuła 2011).les molécules chimique peut être utilisé pour amélioration
comme les cas de H2O2 en phase solide que améliorer la photo-dégradation des pyrènes sous
irradiation UV (Wang et al 2009).
Cette technique chimique utilisant des combinaisons d'oxydants, catalyseurs et irradiation
ultraviolette pour générer des radicaux hydroxyles (OH•) dans les solutions ont suscité un
intérêt pour la dégradation de HA ou ca s'appelle processus d'oxydation avancés (AOP), les
HA sont oxydés par les radicaux et les minéraux adapté à l'eau, aux sels minéraux et au
dioxyde de carbone. Plusieurs AOP (par exemple, réactif de Fenton, ozonation, oxydation
électrochimique et UV) qui ont été appliqués pour l'oxydation d'une diversité de contaminants
sont connus pour transformer les composés parents en plus inoffensifs et les produits
intermédiaires biodégradables ( Vagı et Petsas, 2017 ).
Les AOP a inconvénients tels que la consommation d'énergie et coûts de maintenance ,
et autre a tableau 3.5 et 3.6, Plusieurs travaux signalés et utilise dans ce domaine pour la
dépollution des différent contaminants et, que résume dans le tableau suivent :
Tableau 3.1. Principaux procédés chimiques rencontrés dans la dépollution la dépollution des
HAP et HAM.
Oxydant contaminant HAP/HAM étudiés Référence
Boues Fluoranthène, benzo (b) fluoranthène, benzo (a) Flotron et al.

d'épuration, pyrène, Acénaphtylène, naphtalène, 2 2005;
Le réactif de agricoles sol, méthylnaphtalène, benzo (a) pyrène, Kawahara et
Fenton sédiment dibenzofuran, chrysène, benzo (b) fluoranthène, al.2005 ;
Bain d'eau benzo (a) anthracène, pyrène, fluorène, Bogan et al.
phénanthrène 2003
H2O2, réactif de sodium Naphtalène, acénaphtylène, acénaphtènes, Ferrarese et
Fenton modifié, activé fluorène, phénantrène, anthracène, fluoranthène, al.2008 ;
persulfate de pyrène, chrysène, benzo (a) anthracène, benzo Brown et al.
sodium activé, (b) fluoranthène, benzo (k) fluoranthène, benzo 2003
KMnO 4,combiné (a) pyrène, dibenzo (a, h) antracène, benzo (g, h,
KMnO4 et H2O2 i) pérylène, indéno (1,2,3-c, d) pyrène
Sol Naphtalène, acénaphtylène, acénaphtène, fluor, Alderman et
contaminé phénanthrène, anthracène, fluoranthène, pyrène, al.2007
Peroxy-acide par sites benz (a) anthracène, chrysène, benzo (a) pyrène,
superfonds indéno (1, 2,3-c, d) pyrène, dibenzo (a, h)
anthracène, benzo (g, h, i) pérylène
3.2 Procédés Thermiques

Les procédés thermiques utilisent la chaleur pour détruire ou volatiliser les HA dans les sols
contaminés. Plusieurs travaux signalés dans ce domaine ont résumés dans le tableau 3.2.
3.2.1 L’incinération
Incinération du sol à haute température variant de 870 °C à 1200 °C détruit efficacement les
contaminants tels que les HA mono et polycycliques. Dans un projet d'assainissement financé
par l’US EPA, un site fortement contaminé par la créosote situé en Louisiane a été excavé et
introduit dans une température transportable et élevée, installation d'incinération modulaire
(Acharya et al.1993) ,solides contaminés contenant des concentrations de HAP/HAM
supérieures à1000 mg / kg ont été corrigés avec succès à des concentrations inférieures à 100
mg / kg , les produits polluants qui sont convertis en gaz carboniques et en vapeur d’eau (C02
et H20).
L’incinération se déroule en deux (02) étapes : La volatilisation, qui se fait dans un four
rotatif à 400°C et la destruction à plus de 1000°C. (GABET, 2004) a (Benyahia et al.
Mahdaoui, 2012).
Il y a des inconvénients et des avantages suit à l'application de cette technologie et que bien
illustre a parte comparative entre les méthodes.
3.2.2 La désorption
La désorption thermique in-situ est un processus de séparation physique la chaleur pour
volatiliser les contaminants organiques des matrices de déchets tels que sous forme de sol, de
boues et de sédiments. Dans un les travaux menés par (Renoldi et al. 2003), sol contaminé par
une usine de fabrication de gaz a été traitée à l'échelle du laboratoire par désorbeur thermique.
La concentration des HA était surveillée en continu par un détecteur. Après traitement à des
températures maximales supérieures à 450°C, la concentration des HA réduites à moins de
0,05 mg/kg de poids sec, ce qui correspond à une efficacité d'élimination de 99,9%.
Cependant, il a été noté que quelques composés de faible poids moléculaire tels que le
naphtalène et le fluorène ainsi que l'acénaphtène sont restés dans le sol traité à des
pourcentages de 0,2% et 1,0%, respectivement. Ces HA de faible poids moléculaire sont
connus pour se former via craquage des HA de plus haut poids moléculaire. En raison de la
haute les températures aussi, certaines molécules oxygénées comme les furannes et d'autres
HA ont été trouvés présents dans le sol traité, formés par décomposition ou oxydation des
contaminants d'origine lors chauffage.
Cette méthode a des autre inconvénients et avantages suit à l'application et que bien
illustre a parte comparative entre les méthodes.
Tableau 3.2 : Principaux procédés thermique rencontrés dans la dépollution des HAP et
HAM.
Technique contaminants Les HA ciblent Référence

Naphtalène, acénaphtylène, acénaphtène,fluorène, Acharya
Sol contaminé phénanthrène, anthracène,fluoranthène, pyrène,
et al. 1993
Incinération par produit la benzo(a)anthracène,chrysène,bnz(b) fluoranthène,
organique bnz(k)fiuoranthène, bnz (a) pyrène,dibenzo (a, h)
anthracène, bnz(g,h,i) pérylène
Naphtalène, acénaphtylène, acénaphtène,fluorène, Renoldi et
phénanthrène, anthracène, fluoranthène, pyrène, al.2003
Désorption benzo (a) anthracène,chrysène, benzo (b)
Sol
fluoranthène, benzo (k) fiuoranthène, benzo (a)
pyrène, dibenzo (a, h) anthracène, benzo (g, h, i)
pérylène, indéno (1,2,3-c, d) pyrène
3.3 Procédés physiques

Les procédés physiques consistent à transférer et concentrer les polluants, sans les modifier
ou les détruire, vers des points de récupération en se servant, pour leur transport, de fluides
(eau ou gaz) injectés ou présents dans les sols (Boukamouche, 2012).
Récent application base sur utilisation des membranes ou un matériau qui fait une mince
barrière capable de résistante au mouvement de divers constituants d'un fluide, ce qui
permettant la séparation des constituants. Utilise différente systèmes tels que la
microfiltration, l’ultrafiltration, la nano-filtration et l'osmose verset est utilisée dans le
traitement de l'eau et des eaux usées (Mojiri et al, 2013). Les membranes ont l'inconvénient
de nécessiter traitement et consommation d'énergie (Zazouli et Kalankesh, 2017;Smol et al.
2016) ont éliminé 59% à 72% des HA par osmose inverse, tandis que (Smol et Włodarczyk-
Makuła 2012) ont étudié l'élimination de HA d'eaux usées industrielles utilisant un procédé
d'ultrafiltration et atteint une efficacité d'élimination de 66,6% à 85,0%.
Autre technique physique comme adsorption que est l'une des plus simples, méthodes
les plus efficaces, les plus rapides et les plus largement applicables types de technologies
d'assainissement (Balati et al.2015). L'adsorption peut être utilisée pour l'assainissement de

divers polluants, y compris les composés organiques HA et métaux lourds.
Différents adsorbants dont le charbon actif (Dowaidar et al., 2007 ), bentonite ( Karaca et
al., 2016 ), biochar (Guoet al., 2018), le chitosane ( Crisafully et al., 2008), graphène ( Li et
al.,2018), nano-tubes ( Paszkiewicz et al., 2018 ) et zéolithe(Vidal et al.,2011 ) ont été utilisés
pour éliminer les HA. (Smol et Wlodarczyk-Makula 2017) a rapporté que le recyclage des
sorbants et le traitement des HA est difficile, ce qui peut présenter un risque décontamination.
3.4 Procédés biologique
Les chercheur et les scientifique sont récemment oriente vers les méthodes biologique
pour la décontamination par des microorganismes (bactéries on première place, les algues,
champignons, par des virus indirect) (Ueno et al.2008 ; Silva et al.2009 Hawthorne et al.
2000 ; Wang et al. 1990) les êtres vivant comme Vers de terre(WC Ma et al. 1994) que
l’élimination des polluants organiques et /ou minéraux présents dans des sols, les boues, les
sédiments ou les effluents liquides (Boukamouche, 2012).
Contrairement aux autres procédés, la biodégradation est une solution économiquement
et écologiquement intéressante pour la dépollution des sites contaminés par les HA à cause de
l’utilisation des microorganismes au lieu des aditifs chimiques.
Le caractère plus intéresse est Co-métabolisme ou mixage entre les espèces, ordre
famille…etc. Ou entre bactérie-bactérie, bactérie-champignon. bactérie-algue bien développe
le tableau suivent :
Tableau 3.3 : Principaux procédés biologiques intervient dans la dépollution des HAP et
HAM.
Bioprocédés Les contaminants HAP et HAM Référence
Naphtaline,1-méthylnaphtalène,2 Wang et
méthylnaphtalène, acénaphtylène, acénaphtène, al.1990 ;
fluor,dibenzothiophène,phénanthrène,anthracène Hawthorne
Micro- Sol
, fluoranthène, pyrène,benz (a) anthracène, et al. 2000
organismes Contamine par
chrysène,benzo (b) fluoranthène, benzo (k)
indigènes Diesel
fluoranthène,benzo (e) pyrène,benzo (a) pyrène,
pérylène,indéno (1,2,3-cd) pyrène,dibenz (a, h)
anthracène,benzo (ghi) pérylène
Vers de terre Phénanthrène, fluoranthène WC Ma et

(Lumbricusr Sol sableux al.1994
ubellus)
2 .5 procédés couplés
Chacune des technologies de dépollution sections a ses propres forces et faiblesses. Pour
résoudre le problème itérations des techniques d’échec, fable rendement, efficacité …etc.
plusieurs chercheur intègre et mix diverses combinaisons entre les techniques connu pour la
bon d'élimination des HA. Comme illustre à tableau 3.4.
Haapea et Tuhkanen (2006) étudie la faisabilité de l’intégration lavage des sols, ozonation
et traitement biologique pour la dépollution des sols eau vieillis contaminés par les
HAP/HAM. Trois doses d'ozone différentes et le lavage des sols ont été expérimentés avec
différents pH afin d’évaluer leur effet sur la dégradation et la biodégradabilité
d’hydrocarbures aromatique. L’objectif d'élimination de 85% n'a pu être atteint avec aucun
des tests mais a été satisfait par plusieurs combinaisons des méthodes testées. En outre, il a été
observé que la consommation d’ozone était 5 à 10 fois plus faible dans les traitements intégrés
de lavage des sols, ozonation et traitement biologique que sans prélavage.
Tableau 3.4. Principaux procédés couplés interviens dans la dépollution des HAP et HAM.
Technique HA etudie Référence

Naphtalène, 2-méthylnaphtalène,1-méthylnaphtalène, 2,6- Kronholm et
diméthylnaphtalène, acénaphtylène, acénaphtène, al.2002;Kronholm
2,3,5-triméthylnaphtalène, phénanthrène, anthracène, 1- et al.2003 ;
Physico-
méthylphénanthrène, fluoranthène, pyrène, benzo (a) Lundstedt et al.
chimique
anthracène, chrysène, b (b) fluoranthène, b (k) fluoranthène, b 2006 ; Dadkhah et
(e) pyrène, b (a) pyrène, pérylène, dibenz (a, h) anthracène, al.2006
indéno (1,2,3-c, d) pyr,b (g, h, i) pérylène
Napht, acénaphtylène, acénaphtène, fluorène,phénanthrène, Lee et al.2001
Physico- anthracène, fluoranthène, pyr,benzo (a) anthracène, chrysène, b
biologique (b) fluoranthène, b(k) fiuoranthène, b (a) pyr,dibenzo (a, h)
anthracène, b (g, h, i) pérylène,indéno (1,2,3-c, d) pyr
Biologique- Naphtalène, acénaphtène, phénanthrène, anthracène, Derudi et al.2007;
chimique fluoranthène, pyrène, chrysène, pérylène,benzo (a) pyrène Kulik et al 2006
Naphtalène, 2-méthylnaphtalène, 1-méthylnaphtalène, Haapea et al.2006
Physico- acénaphtène, fluorène, phénanthrène, anthracène, fluoranthène,
chimique- pyrène, benzo (a) anthracène, chrysène, b (b) fluoranthène, b
biologique (k) fluoranthène, b (a) pyr, pérylène, dibenz (a, h) anthracène,
indéno (1,2,3-c, d) pyr, b (g, h, i) pérylène
3.6 Comparaisons entre les procèdes de dépollution
3.6 .1 le coût de technique dépollution

Les procédés biologiques sont souvent qualifiés d’économiques (tableau 3.5) et
d’écologiques. Cependant, ceux-ci restent à développer compte tenu des nombreuses
interactions entre le sol, les microorganismes et les polluants.
Tableau 3.5. Estimation des coûts des procédés de décontamination (Koller, 2004).
Procédés de dépollution Coût (€)
Lavage sur / hors site 150 à 200

In situ 60 à 100
Stabilisation 27,7 à 221,5
Procédés physiques
Stripping 27,7 à 55,4
pompage et traitement 18,5 à 92,3
Venting 10 à 40
Lavage chimique sur sol excavé 28,7 à 110,7

Procédés chimiques
Réduction / oxydation 18,5 à 110,7
Pyrolyse 100 à 400
Procédés thermiques Incinération 240 à 554
Vitrification 200 à 300
Biopiles 75 à 100
compostage, land farming 18,5 à 73,8
Procédés biologiques Bioréacteurs 50 à 100

biosparging, bioventing 18,5 à 55,4
phytoremédiation (phytoextraction) 0,03 à 2,2
3.6.2 Comparaison entre les différentes techniques de dépollution

Avant de procéder au choix de la technique, il faut présenter les avantages et les
inconvénients de chaque technique.
Le tableau 3.6 indique avec une grande précision les limites et les performances de chaque
méthode de traitement. Et a partir du tableau nous pouvons conclure que :
 Les méthodes thermiques sont des techniques à écarter puisqu’elles engendrent une
autre forme de pollution (pollution atmosphérique par dégagement de gaz toxiques).
Elles ne permettent pas une réutilisation des sols qui seront complètement détruits et les
couts de ces méthodes sont très onéreux.
 Les méthodes physiques et chimiques sont beaucoup plus recommandées du fait de
leur efficacité et leur fiabilité, mais la mise en place de ces méthodes fait appel à des
installations complexes.
 Les méthodes biologiques ont le mérite d’être des technologies propres qui permettent
une dégradation de polluants sans risque majeur d’engendrer une autre pollution. Leur aspect
très économique les rend très à la mode d’autant plus que des rendements très intéressants ont
été obtenus à des couts attractifs en plus de leur application facile.
Les techniques soit physique chimique et surtout biologique peuvent réduit ou bien limite
leur inconvénients par intègre de différent technique enter aux pour amélioration comme
indique dans les titre précédent.
Tableau 3.6. Avantages et inconvénients des différentes méthodes de traitement des sols contaminés. (Bounif et Mekbel ,2005).
Type Méthode Avantages Inconvénients
Thermique Incinération Elimination de la pollution. -Demande un grand apport énergétique. -Les sols traités ne sont
plus réutilisables -Couts onéreux. -Nécessité de traitement de
gaz dégagé
Vitrification -Rapide. -Faible teneur en polluants résiduels. Pas de réapparition du tapis végétal. -Cout onéreux.
Physique Confinement -Simple, rapide et radicale.-Isolation de la pollution. -Dégradation du sol
Stabilisation -Radicale -Pas de risque de migration de la pollution -Dispersion possible des polluants
Excavation -Simple, rapide et radicale -Dispersion possible des polluants
Pompage -Très efficace -Dégradation du sol
Venting -Efficace pour les hydrocarbures légers (essence) et -Risque d’étendre la pollution
tous les produits volatils.-Efficace pour les pollutions -Problème de transport et de stockage des terres excavées
étendues pour de grandes profondeurs
Chimique Mobilisation et -Peu chère et facile à mettre en œuvre -Risque de dispersion de la pollution -Les solutions réactives
toxiques peuvent sérieusement dégrader le sol
Extraction
Réaction -Augmentation de dioxygène ce qui favorise une -Ne sont pas spécifique
chimique biodégradation
Lavage -Rendement de 80%-Cout acceptable -Risques d’étendre la pollution
Biologique Biopiles -Contrôle des émissions vers l’atmosphère -Processus très lents
-Rendement très intéressant
Champignons -Efficace -Stade expérimental
Landfarming -technique légère -Cout attractif -Assez efficace -Processus lents-Mobilisation de grandes superficies de terre
-Terre en surface
3. MÉTHODES ET
MATERIELS
3. Méthodes et Matériels 42
3. MÉTHODES ET MATERIELS
4 Méthode d’isolement et identification des souches microbiennes
4.1 Isolement
Le mode microbien est varié utilisé dans un plusieurs domaines (industriels
environnement …etc.). La technique pour l’isolement des souches microbiennes a été
effectué à partir de sole, eau ou autre support contamine par des hydrocarbures en suite
passe a culture d’enrichissement sur un milieu contenant une source de carbone, une source
d’azote, de phosphore, de potassium, de magnésium, et de sodium (Grifoll et al, 1992 ;
Dean et al, 2001).
À autre cote Les milieux de cultures sont différents soit des milieux spécifiques ou non
spécifiques. Certains chercheurs sont utilisés des milieux non spécifiques comme PDA
MSM ,(Pfennig et Trüper 1992) qui permet d’isolement des plusieurs souche soit que
biodégradent l’hydrocarbure ou non par contre autre chercheur sont utilisés des milieux
plus spécifiques exemple le milieu minéral de Bushnell-Haas (BH); ce dernier permet de
l’isolement les souches qui dégradent les hydrocarbures seulement(Allred, et al, 1963;
Cécile Noel 2014 ; Abdel Aal et al., 2014)
4.2Identification
Généralement l’identification des souches microbiennes de la dégradation d’hydrocarbures
aromatique sont par deux techniques (classiques ou modernes).
4.2.1 Les méthodes classiques
Les méthodes classiques (méthodes traditionnelles de microbiologie, dites
pasteuriennes), permet de définir les trais morphologiques, physiologiques et/ou
métaboliques des microorganismes d’un écosystème donné après isolement et culture sur
boîtes de Pétri ou en milieux liquides (Heitkamp etal.1988).
La technique de dichotomique consiste en la comparaison de divers caractères
phénotypiques de la souche à étudier vis à vis de ceux d’une souche de référence. Cette
identification utilise un faible nombre de caractères considérés comme importants. De fait,
elle ne reflète qu’un nombre réduit d’informations, les caractères considérés comme
importants étant. La dichotomique nécessite a plusieurs caractères et voila quelque caractère
majore.
4.2.1.1 Caractérisation phénotypique des isolats

L’identification bactérienne est effectuée conformément aux critères du Bergey’s
manual:9ème éd (Holt et al, 1994), l’aspect microscopique et macroscopique des colonies, les
tests biochimiques d’orientation, les galeries biochimiques miniaturisées API et le test de
sensibilité des souches aux antibiotiques.
a. Étude macroscopique
L’observation de l’aspect macroscopique des colonies isolées permet d’effectuer une
première caractérisation, avec une orientation possible des résultats au cours de
l’identification.
 Aspect des colonies
L’aspect des colonies dépend du milieu utilisé, la durée et la température de l’incubation,
d’après (Joffin et Leyral, 2001), les éléments d’identifications macroscopiques sont :
La forme des colonies : punctiforme, irrégulières,…etc.
La taille des colonies par la mesures du diamètre : petite ; moyenne ou grande taille.
La pigmentation : couleur de la colonie.
L’élévation : bossue, convexe, plane.
L’opacité : opaque, translucides, transparente.
Aspect : lisse, rugueuse, sèche.
b. Observation microscopique
L’observation de l’aspect microscopique des colonies obtenue est effectuée par l’examen à
l’état frais et la coloration de Gram.
 Examen a état frais
L'état frais est une étape qui permet de mettre en évidence la forme des bactéries ainsi que
le type de leur mobilité et leur regroupement (Bousseboua, 2002).
 Coloration de gram
La coloration de Gram est une double coloration qui nous permet de connaître la
forme, l'arrangement, la pureté ainsi que la nature biochimique de la paroi des cellules
purifiées. Cette coloration est réalisée systématiquement sur les différentes colonies
purifiées pour préciser le caractère Gram+ ou Gram-. Avec cette coloration double, les
bactéries Gram positif apparaissent en violet foncé tandis que celles de Gram négatif sont
colorées en rose ou en rouge (Dellarras, 2008)
4.2.1.1 Caractérisation biochimique

Les caractères biochimiques sont détectés par diverses techniques commerciales (galeries
API, systèmes Vitek, Phoenix, Biolog…). L’identification repose sur l’utilisation de galeries
d’identification. Elles permettent une identification rapide des bactéries (Freney; 2007).
Parmi l’ensemble de ces systèmes.
La galerie API (Analytical Profile Index) est couramment utilisée. Elle se présente sous
forme de cupules prêtes à l’emploi contenant les substrats lyophilisés nécessaires aux
différents tests biochimiques. Lorsqu’une suspension bactérienne de densité convenable est
répartie dans les différentes alvéoles de la micro-galerie, les métabolites produits durant la
période d’incubation se traduisent par des changements de couleur spontanés ou révélés par
addition de réactifs.
Elles ont l’avantage de standardiser les caractères biochimiques recherchés. Elles limitent
la variabilité technique et permettent l’identification d’une centaine de bacilles à Gram
négatif (Venter et al ,1989).
Et voilà quelques exemples des galeries API et leurs utilisations :
1. La galerie API 20E
La galerie API 20E (Bio Mérieux, Marcy l’Etoile, France) composée de 20 micro-tubes
contenant des milieux et substrats sous forme déshydratée est utilisée selon les
recommandations décrite par le fabricant (figure 4.1). Les micro-tubes de la galerie API 20E
sont inoculés avec une suspension bactérienne, incubées à une température de 30 °C à un
intervalle temps de 48 h. Les réactions produites durant la période d’incubation se traduisent
par des virages colorés spontanés ou révélés par l’addition de réactifs (Emanuel et Lorrence,
2009). L’identification se fait par un programme d'identification microbienne.
Figure 4.1. La galerie API 20E avant incubation.
2. La galerie API Candida

API Candida (Bio Mérieux, Marcy l’Etoile, France) est un système standardisé pour
l'identification en 18-24 heures des levures, La galerie API Candida comporte 10 tubes
contenant des substrats déshydratés, pour réaliser 12 tests d'identification (acidification de
sucres ou réactions enzymatiques) (figure 4.2). Les réactions produites durant l'incubation se
traduisent par des virages colorés spontanés. La lecture des réactions se fait à l'aide du
tableau de Lecture et l'identification est obtenue en consultant un logiciel d’identification api
web.
Figure 4.2. La Candida avant incubation.
Les galeries API ou autre type sont généralement facile mais coûts elle existe des teste
complémentaire pour bien réalisation de technique dichotomique.
4.2.1.1.1 Quelque test biochimique d’identification
1. Recherche de la catalase
La catalase est une enzyme catalysant la dismutation de l’eau oxygénée (peroxyde
d’hydrogène), selon l’équation 4.1 suivante :
2H2O2  O2 + 2H2O (Eq.4.1)
Elle est mise en évidence par contact de la culture avec une solution fraiche d’eau oxygénée.
Pour chaque souche, une goutte d’eau oxygénée est placée sur une lame stérile, sur laquelle
quelques colonies sont réparties. Un dégagement gazeux abondant sous formes de mousse
ou de bulles d’air traduit la décomposition de l’eau oxygénée sous l’action de la catalase
(Joffin et Leyral, 2006).
2. Recherche de l’oxydase
Le terme exact est « recherche du cytochrome oxydase». Les cytochromes sont des
protéines qui appartiennent à la chaîne respiratoire, composée d’une succession de
transporteurs d’électrons, en particulier les cytochromes. En fait, ce test recherche le
cytochrome c-oxydase.
Ce test consiste à mettre en évidence la capacité de la bactérie testée à oxyder la forme
réduite incolore de dérivés N-méthyle du paraphénylène diamine en leurs
formes oxydées semi-quinoniques rose-violacées. Une réaction positive se traduit par un
virage rapide du réactif de l’incolore au violet. Sinon il reste incolore (Delarras, 2008). La
lecture se fait après 30 secondes.
3. L’hydrolyse de l’urée
L’uréase est une enzyme qui hydrolyse l’urée et conduit à la formation d’ammoniac et de
dioxyde de carbone. En solution, le produit final de la réaction est le carbonate d’ammonium
qui alcalinise le milieu selon la réaction 4.2 /4.3 suivante :
CO (NH2)2  H 2O  2NH3 + CO2 (Eq.4.2)
CO2  2NH3 + 2H2O  CO3 (NH4)2 (Eq.4.3)

Le milieu urée indole (annexe) est ensemencé puis incubés à 30 °C pendant 24h. La
présence de l’uréase se traduit par une coloration rose à rouge violacée (annexe). (Joffin et
Leyral, 2006).
4. Test Mannitol Mobilité Nitrate
Les tubes mannitol (annexe) sont ensemencés par piqure centrale à l’aide d’une pipette
pasteur, puis incubés à 30 C pendant 24h, l’utilisation du mannitol se manifeste par le virage
de la couleur de l’indicateur de pH, du rouge au jaune et la mobilité se manifeste par un
trouble toute au tour de la piqure centrale (annexe). (Joffin et Leyral, 2006).
5. Test Recherche de la voie d’attaque du glucose
Ce milieu permet de déterminer la voie d’attaque du glucose utilisé comme source
d’énergie par la plupart des bactéries, pour synthétiser de l’énergie, les bactéries peuvent
attaquer par :
Cas 1 voie oxydative : le glucose est utilisé uniquement en présence de dioxygène (faible
libération d’acides).
Cas 2 voie fermentative : le glucose est utilisé en absence de dioxygène et en présence de
dioxygène ou seulement en absence de dioxygène (forte libération d’acides).
Figure 4.3. Méthode de dichotomique pour bacilles gram +

Figure 4.4. Méthode de dichotomique pour les grams+, CATA+ et cocci.
Figure 4.5. Méthode de dichotomique pour les gram (+ / -)
4.2.2 Diagnostic moléculaire (moderne)

Sont des méthodes génétiques e plus rapides et spécifiques pour identification le type de
microorganisme
Méthodes d’identification protéomiques et génotypiques ; Ces techniques permettent de
caractériser les micro-organismes d’un échantillon, qu’ils soient cultivables ou non, dans
leur environnement naturel. Les méthodes moléculaires peuvent s’affranchir de la mise en
culture (Huybens et al, 2009). Certaines applications de biologie moléculaire, dans un souci
de spécificité, nécessitent une étape préliminaire d’extraction d’ADN.
Les techniques de biologie moléculaire peuvent également permettre de détecter et
d'identifier les supports moléculaires des résistances aux antibiotiques et des facteurs de
virulence (Roux et Rolain, 2014). L’identification bactérienne moléculaire peut se faire par
méthodes protéomique ou génotypique.
4.2.2.1 Méthodes d’identification protéomiques

La protéomique consiste à étudier (identifier, caractériser et quantifier) l’ensemble des
protéines d’un organisme, d’un fluide biologique, d’un organe, d’une cellule ou même d’un
compartiment cellulaire. Cet ensemble de protéines est nommé « protéome ». La bactérie
possède un protéome. Elle est constituée à 55% de protéines. L’analyse protéomique se
compose de trois étapes :
1) Séparation des protéines contenues dans l’échantillon biologique étudié par
électrophorèse bidimensionnelle ;
2) Traitement et mise en image de la séparation protéique permettant l’établissement d’une
carte protéique ;
3) Spectrométrie de masse.
4.2.2.2 Méthodes d’identification génomiques
Chaque espèce possède dans son génome au moins une séquence d’acides nucléiques
(ADN ou ARN) qui lui est propre et qui la distingue des autres espèces. Le diagnostic
moléculaire fait appel à des techniques fondées sur l’étude, la détection et la modification de
ces séquences.
En microbiologie, ces techniques permettent d’étudier, de classer et d’identifier les
microorganismes. Ainsi, dans le cadre du diagnostic microbiologique, on peut rapidement et
simultanément détecter, identifier, voire quantifier les bactéries en s’affranchissant des
techniques conventionnelles.
De plus, contrairement aux méthodes de culture, il n’est pas nécessaire de préserver la
vitalité cellulaire en biologie moléculaire. Les techniques moléculaires ont un bénéfice
clinique lié à un gain de sensibilité, de spécificité, de temps et une détection d’organismes
morts ou difficilement cultivables (Chardin et al, 2006).
4.2.2.2.1 La technique d’électrophorèse des acides nucléiques sur gel
L’électrophorèse sur gel consiste en la séparation des macromolécules (acides nucléiques
et également protéines) en fonction de leur taille, de leur charge électrique et d’autres
propriétés physiques. Le terme « électrophorèse » décrit la migration de particules chargées
sous l’influence d’un champ électrique (Sambrook). La technique se fait sur gel d’agarose
ou de polyacrylamide. L'électrophorèse des acides nucléiques sur gel est une technique de
base au laboratoire de biologie moléculaire.
Elle peut être utilisée : - Soit à des fins analytiques, dans le but de séparer et identifier des
fragments d'ADN, pour déterminer leur taille, pour en estimer la quantité ; - Soit à des fins
préparatives, afin de purifier un fragment d'ADN de taille connue. La taille des fragments
d’ADN qu'il est possible de séparer est comprise entre 0,2 et 50 kilobases. Ces derniers sont
facilement détectés sur le gel grâce à un colorant fluorescent, le bromure d'éthidium (BEI).
On peut ainsi visualiser en lumière UV des quantités très faibles d'ADN (de l'ordre de 5-10
nanogrammes). La technique est très sensible ; elle est de plus rapide et simple à mettre en
œuvre (52,53).
4.2.2.2.2 Les techniques d’hybridation
Base sur identification bactérienne avec sondes nucléiques et Le principe des sondes
nucléiques est de faire agir l’ADN ou l’ARN bactérien à identifier (la cible), avec une
séquence d’ADN ou d’ARN spécifique de la bactérie recherchée (la sonde). Cette technique
repose sur le phénomène d’hybridation qui se produit entre ces deux séquences d’acides
nucléiques et qui peut s’effectuer sur un support solide ou en milieu liquide.
De plus, l’une de ces séquences est toujours marquée de manière radioactive,
enzymatique ou chimique. De cette façon, lorsque l’hybridation entre la sonde et la cible se
produit, un signal est émis par le complexe, et il peut être étudié. Cette méthode permet alors
la détection et l’identification de la cible (Hilario ,2007).
5. LES METHODES D’ANALYSES DES HYDROCARBURES AROMATIQUES
Plusieurs méthodes ont été signalées pour la détermination des concentrations de HA dans
les échantillons a analyse , principalement basées sur une variété de graphiques, tels que TLC
(Chem., 1987) , OMS , chromatographie sur colonne (Tateno, et al 1990; Tateno et al
2002 ; Menichini et al 1991) couplé avec MS A.- (DouAbul Ali, et al 1997; Guillen et al
2000 ; Husain et al 1997; Nemoto et al 1998; Korenaga, et al 1999) et HPLC (Jarvenpaa, et
al 1996), avec une fluorescence détecteur (US EPA , 1990; Kayali-Sayadi, et al 1998;
Nakagawa, et al 1991; Perfetti, et al 1992 ;Sanders, et al 1995; van Stijin, et al 1996;
Falcon,et al 1999; Kayali-Sayadi, et al 2000; Tamakawa, Yet al 1987).
5.1 Les méthodes classiques
Dans le passé, la CCM couramment utilisée pour la détection de certains HA tels que B
[a] P et autre compose. Cette méthode présente l'avantage d'être peu coûteuse et technique
analytique, l'efficacité de séparation n’est pas suffisamment élevée pour effectuer la
détermination simultanée de nombreux HA. (Borneff et al.1979) amélioré ce point faible en
utilisant des processus bidimensionnels.
5.2 Les méthodes modernes

Comme alternative à TLC, HPLC et GC sont supérieurs en raison de leur efficacité et
reproductibilité de séparation. Comme la plupart des HA ont une forte fluorescence, la HPLC
couplée à la fluorescence la spectrométrie est une méthode prometteuse pour le dépistage de
routine des hydrocarbures aromatique, en raison de sa sensibilité et de sa sélectivité.
La HPLC a certains avantages dans la détection HAP/HAM dans l'analyse de routine. La
réalisation est a une température ambiante (température ambiante), il n'y a donc aucune
décomposition thermique, contrairement a l'analyse GC, ou à propos de la vaporisation,
comme dans la procédure TLC.
Les HAP et HAM a haut poids moléculaire, ne peut pas être détecté par la méthode GC,
peut être identifié par la méthode HPLC.L'efficacité de résolution de la HPLC est supérieure à
celle de la TLC et de la colonne chromatographie et inférieure à celle de la méthode GC,
notamment dans l'analyse des HAP/HAM de faible poids moléculaire.
Néanmoins, dans la séparation de certains HA tels que B [a] P et B [e] P, la HPLC montre
une excellente résolution par rapport au GC une analyse. La linéarité des courbes d'étalonnage
de HPLC avec le détecteur de fluorescence est satisfaisante, allant des nano grammes à l'ordre
des microgrammes. La sensibilité et la spécificité sont également suffisantes pour détecter les
HA dans l'environnement. Système de détection programmé en longueur d'onde, qui modifie
l'excitation et longueur d'onde d'émission aux valeurs optimales automatiquement dans le
temps prédéfini lors d'une analyse chromatographique, a été actuellement utilisé pour
l'analyse des échantillons que contient HA.
Un chromatogramme d'un mélange de HA standard par HPLC avec la fluorescence le
détecteur est représenté sur la figure 5.1 (Maita, et al 2005). Ce système automatisé est un
puissant technique d'analyse de routine des échantillons (Simko et al 1993; Stijin, et al 1996 ;
Chiu et al 1997).
5.2.1 Les colonnes utilisent
Parmi colonnes de séparation pour HPLC qui est disponibles dans le commerce, c’est la
colonne en phase inverse comme la colonne à liaison octadécyle cette colonne le plus
fréquemment utilisé, en raison de son efficacité haute résolution pour la cible composée
comme HAP et HAM. Les tailles moléculaires des hydrocarbures aromatiques peuvent être
estimées à partir de leurs temps de rétention sur le graphique HPLC.
5.2.2 Les détecteurs
Les détecteurs typiques équipés d'un appareil GC sont un FID, un détecteur de
concentration (PID) et une spectrométrie de masse à impact électronique quadripolaire (EI-
MS).Le FID a une grande linéarité et est généralement non sélectif pour les produits
chimiques. Comme le la réponse du FID est proportionnelle au nombre de carbones, on peut
quantifier composés du même groupe même si aucun calibrant pour l’appariement n'est
disponible. PID est plus sélectif pour les hydrocarbures aromatiques mono et polycycliques ou
les espèces d'organo-hétéroatomes mais est ne réagissant pas suffisamment à certains alkyl
benzènes (Lebo, et al 1991).
La sélectivité de ces détecteurs n'est pas nécessairement suffisant, une purification
supplémentaire est nécessaire pour obtenir les meilleures conditions chromatographiques.
Figure 5.1. Pic d’analyse par HPLC d’hydrocarbure.
5.3 Amélioration par le couplage

Une variété de techniques GC couplées à diverses méthodes de détection a développé
pour l'analyse des HAP ou HAM.(Poster et al, et al 2006)
La détection des HA est le plus souvent réalisée par EI-MS dans le mode de surveillance
des ions (SIM). GC / EI-MS est probablement le plus utilisé pour sélectivité et sensibilité.
L'identification des HAP/HAM par GC/MS en mode SIM est basé sur les ions principaux du
spectre de masse caractéristique de chaque composé avec l'abondance relative des autres ions
sélectionnés pour chaque hydrocarbure aromatique. Typique Le chromatogramme GC / MS
(EI-SIM).
Nemotoet al(1998) ont mis au point un procédé pour déterminer les produits liés au pétrole
contaminants dans les échantillonne de mer en utilisant GC-MS (EI-SIM). Les limites de
détection étaient 2B3 ppb pour le n-alcane, 0,1B 0,2 ppb pour les hydrocarbures aromatiques
en générale.
La spectrométrie de masse à ionisation chimique par ions négatifs (NCI-MS) est connue
méthode sensible et sélective pour la détermination de certains types de HAP et HAP alkylés
(Simko et al 1993; Hilpertet al 1987) a rapporté que l'anion moléculaire de B [a] P était
environ 1 000 fois plus abondant que celle du B [e] P et celle de la grippe était 100 fois plus
abondante que celle de Py. Spectrométrie de masse à temps de vol en combinaison avec la
chromatographie en phase gazeuse capillaire tography (GC-TOF-MS) est une autre technique
puissante avec des limites de détection la plage de picogrammes faible. (Vreuls et al 1999)
ont évalué le taux de stockage du spectre, linéarité de la réponse et des limites de détection
des GC-TOF-MS pour les micro-contaminants, y compris les HAP et HAM, dans un sédiment
et du thé bouilli (Simon et al2006).
Pour ces analytes, GC-TOF-MS a fourni une bonne linéarité dans la plage 2pg – 1ng
(Simon et al 2006).En raison de résolution de masse plus élevé, TOF-MS peut permettre un
meilleur rapport de bruit que les analyses quadripolaires. En tant que phases stationnaires de
la colonne de séparation, les méthylpolysiloxanes, en particulier SE-52 (5% phényl-substitué)
et SE-54 (5% phényl-, 1%vinyle-substitué), sont couramment utilisés pour l'analyse des HA.
SE-30, OV-101(non substitué) et OV-17 (50% phényl-substitué) sont également utilisés.
Silice fondue colonnes capillaires, qui ont une excellente résolution (par exemple 3 000
plaques par mètre) et peuvent séparer plus de 100 HA dans des mélanges complexes, sont
commercialement disponible. Concernant la comparaison entre l’analyse échantillon des HA,
(Simko et al 1993) a indiqué qu'il n'y avait statistiquement aucune différence dans l'analyse
données de B [a] P dans les préparations de fumée liquide entre HPLC avec fluorescence
détection et méthode GC-MS (EI-SIM).
Chiuet al (1997) a démontré les différences entre les données analytiques utilisant HPLC
avec UV, fluorescence détection et ceux par GC-MS utilisant la détection de piège à ions
(ITD). Limites de détection de détection de fluorescence étaient 20 à 320 fois plus faibles que
celles de détection UV, et1 à 50 fois inférieur à celui de l'ITD. Ils ont montré que la
concentration des hydrocarbures aromatique détectées par HPLC étaient généralement
inférieures à celles obtenues par GC-MS / ITD, et la présence d'impuretés, telles que les
hydrocarbures aliphatiques et les esters d'acide gras, peut interférer avec l'identification et la
quantification des hydrocarbures aromatique par HPLC. (Simon et al 2006)ont rendu compte
du résultat d’une comparaison de 15 analyse prioritaire des HAP/HAM dans 17 laboratoires
pour valider une méthode analytique surveillé l'utilisation.
Les méthodes testées étaient basées sur GC-MS / SIM de cyclohexane extraire avec SPE à
travers du gel de silice. Les récupérations variaient entre 50% et 85%, sauf ceux pour cyclo
[cd] P, DB [ai] P et DB [ah] P. Pour B [a] P, la valeur validée la plage analytique couvrait 5–
20 μg / kg, et pour B [a] A 10–25 μg / kg. Cette méthode, par conséquent, il a été reconnu
approprier pour surveiller B [a] P et B [a] A à leurs niveaux maximaux autorisés de 10 et 20
μg / kg, respectivement. Trois analytes, B [b] F, B [j] F et B [k] F n'ont pas pu être séparés par
tous les participants.
Figure 5.2. Analyse par GC/MS des hydrocarbures aromatiques
La simplifier l'analyse, est par une combinaison en ligne de LC, GC et MS a été utilisée. Le
premier système GC-capillaire LC en ligne a été développé par Majors et al 1980, qui ont
déterminé l'athrazine dans le sorgho en utilisant une LC conventionnelle connecté à un
échantillonneur automatique GC utilisé comme interface. Certains avis ont été signalé sur les
différents systèmes de transfert LC-GC et leurs applications, Marcel Dekker, Inc., New York
(Dugo, et al 1990), LC – GC couplé en ligne: Théorie et applications,
Récent L'introduction directe d'une grande quantité de solvant dans le GC nécessite
l'utilisation de techniques spéciales pour éliminer le solvant de l'échantillon, laissant le soluté
dans une bande tranchante à l'entrée de la colonne de séparation.
Plusieurs interfaces ont été proposées pour le couplage LC-GC. Parmi eux, une interface
sur colonne basée sur la technique de l'écart de rétention (Boselli, et al 2000; Hyotylainen et
al2000), interface de type boucle par éluant simultané l'évaporation. (Boselli, et al 2000;
Magnusson et al 2000) et l'interface du vaporisateur(Grob et al 2001; Ruiz del Castillo et
al 2000) sont couramment utilisées aujourd'hui.
La chromatographie en phase normale (NPLC) et la SEC sont plus facilement couplées
avec GC que la chromatographie liquide en phase inverse (RPLC). Concernant les
hydrocarbures aromatiques dans les huiles comestibles, (Moret et al. 1996)ont signalé une
mise en ligne Système LC-LC et LC-LC-GC pour l'analyse des hydrocarbures aromatique. Le
système implique HPLC NP-RP couplé et une interface. La principale difficulté de la HPLC
couplée est la nécessité d'effectuer un échange de phase mobile entre différents systèmes de
solvants. Ils ont développé un évaporateur de solvant en ligne, qui fonctionne sur les principes
d'évaporation simultanée d'éluant et de débordement de vapeur avec deux vannes 10 ports
supplémentaires. Récupérations et répétabilité des HA lourds, tels que B [b] F, B [k] F, B [a]
P, DB [ah] A et B [ghi] P auraient été supérieurs à 80% et2,4 à 5,7%, respectivement. (Van
der Wielen et al 2006).
LC-LC appliqué avec système de détection de fluorescence pour la quantification du B [a]
P dans les huiles alimentaires et les compléments alimentaires. Selon l'auteur, le système à de
bonnes caractéristiques de performance et produit des bonnes donne lieu à des tests de
compétence.
De 2002 à 2004, environ 1 350 échantillons d'huiles et des compléments alimentaires ont
été analysés en utilisant cette méthode pour tester le niveau de B [a] (Vreuls et al 1991) ont
rapporté le couplage en ligne de HPLC, GC capillaire et MS pour la détermination et
l'identification des hydrocarbures aromatique dans les huiles végétales. Le LC fraction,
contenant des HA, a été transférée au GC en utilisant une interface de type boucle. Après
évaporation du solvant par la sortie de vapeur de solvant, les composés ont été introduits dans
le GC-MS pour la détection et l'identification. L'installation totale a permis l'analyse directe
d'échantillons d'huile après dilution dans du n-pentane sans aucune purification.
Les limites de détection sont d'environ 40 pg (20 ppb) en mode de balayage complet et
environ 1 pg (0,5 ppb) avec SIM. Les techniques avec trait d'union, telles que LC-GC et LC-
LC-GC pour la détermination des hydrocarbures aromatique dans les huiles, sont traités dans
une revue de (Moret et al 2000; Shimmo et al 2004) examiné le LC-GC / MS couplé avec
SFE en ligne comme technique d'extraction dans particules atmosphériques.
Les procédures en ligne ont de nombreux avantages d'être automatisées et minimiser les
pertes d'échantillonnage et les contaminations, en plus de simplifier l'échantillon purification.
Les méthodes NPLC-GC déjà disponibles sont assez simples à utiliser (Hyötyläinen et al
2003).
Cependant, le système RPLC-GC en ligne, qui est essentiel pour l'analyse des
hydrocarbures aromatique , est compliqué et n'est pas nécessairement devenu une méthode de
routine malgré de nombreux encourageant les développements (Hyötyläinen et al 2003) .
Tableau 5.1. Les techniques utilisent dans l’identification des hydrocarbures aromatiques
Hydrocarbures aromatique Méthode Détecteur Références

Soares et al
2015 ; Gong
Cible 16 HAP et 5NPAHs GC / MS Masse sélective(MSD)
et al. 2017 ;
Zhao et al.2019
NAP, PYRACE, NAP, Smol et al.
PHACE, ANT, FL,NAP, 2014 ; Zhang
HPLC / FL Fluorescence
PHEHPLC / FLACE, ANT, et al. 2018 ; Li
FL,FLU, NAP,PHE, PYR et al. 2019
BaP, FLU, PYR HPLC / UV UV Zhao et al. 2019
UHPLC (ultra-hautes
performances Réseau de diodes photo
16 HAP chromatographie en (PDA) et Layton et al. 2018
phase liquide) / PDA et Fluorescence
UHPLC / FL
Spectrophotomètre UV Les longueurs d'onde
ANT, FL, FLU, PHE, PYR Topuz et Uyar
– Vis maximales (λmax)
2017
étaient de 200 à 800 Nm
5.4 Recherche spécifique

Albero et al (2003) développé méthode multi-résidus pour la détermination de HAP et
même HAM dans le miel par solidification matricielle dispersion de phase (MSPD) et GC-MS
(EI-SIM). Recouvrements moyens pour tous les HA étudiés se situaient entre 80 et 101%,
avec des écarts-types relatifs de 6 à 15%.
5.5 Les Méthodes tendance

La purification a été simplifiée par la procédure SPE au lieu de chromatographie sur
colonne à garnissage conventionnelle. Cette préparation est cependant gênante et toujours
long parce que la procédure SPE nécessite une certaine étape, (l’élution par le solvant
organique des cartouches et la concentration non sécher) avant analyse.
Aux fins du dépistage de routine, un processus simplifié, rapide, rentable et précis est
essentiel. MSPD peut-être comme une technique d'extraction et de nettoyage simultanée.
Cette La méthode est basée sur la dispersion de l'échantillon sur un adsorbant tel que Florisil
ou C18. Pigments et lipides, qui peuvent interférer avec les déterminations analytiques sont
retenus à la surface de l’adsorbant ; par conséquent, un autre la purification n'est pas
nécessaire.
La méthode MSPD nécessite moins de temps et de solvant que l'extraction liquide-liquide

ou Soxhlet, et est alternative à ces méthodes conventionnelles (Heiden et al 2001), pour
réduire la consommation de solvant et réduire la préparation de l'échantillon à un une
extraction par sorption minimale par agitation (SBSE) est également utile. Dans SBSE, un
analyte est extrait en phase organique enrobé sur barreau d'agitation, à base d'octanol – eau
coefficient de partage. Par conséquent, l'optimisation des conditions d'extraction (c.-à-d. Le
sel saturation, ajout de solvant, température et pH, etc.) Est requis pour chaque échantillon.
SBSE est très populaire en tant que procédure d'extraction de matières organiques
micropolluants dans les échantillons d'eau de l'environnement (Falcó et al 2003; Heiden et al
2001).
Cette technique n'a guère été appliquée à l'étude des HAP/HAM dans les aliments. SBSE
peut être utile pour l'analyse des boissons. Les systèmes LC-GC en ligne ont de nombreux
avantages d'être automatisés et minimiser les pertes d'échantillonnage et les contaminations.
De plus, le système automatisé les systèmes sont généralement importants pour éviter les
erreurs manuelles liées à l'intervention.
Les systèmes LC-GC ne sont pas simplement un couplage de deux techniques bien établies
(Hyötyläinen et al 2003). Quelques optimisations de la condition, de l'adaptation et des
nouvelles sous-jacentes des principes sont encore nécessaires. Bien que les systèmes LC-GC
soient un peu compliqués et pas si robustes, ces systèmes en ligne semblent être idéaux pour
l'analyse de routine (Dugo et al 2003; Kamm et al 2001).
De nos jours, le débit d'échantillonnage est un autre aspect important lors du choix d’une
méthode analytique dans les applications analytiques de routine. À cette fin, l’appelé GC
rapide est une méthode prometteuse. Récemment, intérêt pour des séparations très rapides
l'utilisation de GC a considérablement augmenté. GC rapide est conçu pour minimiser
l'analyse sans influencer la résolution chromatographique. Par exemple, l'analyse des Les
HAP/HAM peuvent être réalisés en 3 minutes en GC rapide. Ceci est un facteur 10
améliorations du temps d'analyse par rapport à la procédure US EPA pour les HA.
Cela est dû aux nombreuses améliorations technologiques, telles que la haute vitesse
systèmes d'injection, conditions de sortie basse pression (LP) (LP-GC), four rapide chauffage
/refroidissement, réduction de la longueur, du diamètre et de la phase stationnaire de la
colonne épaisseur (capillaires à alésage étroit), système de détection rapide et amélioration de
Logiciel. Parmi eux, la colonne à alésage étroit, LP-GC et résistive le chauffage ont été les
principales approches pour une analyse plus rapide des aliments.
Figure 5.3. Analyse des HA dans du thé bouilli à l'aide de LLE miniaturisé. (Wang1999)
Des rapports décrivant les concepts et l’application de (Falcó et al 2003; Llobet et al 2006;
Garcia-Falcon 2007).
La principale limitation du GC rapide est la vitesse de réponse du détecteur. GC rapide est,
par conséquent, limité principalement à GC-FID, GC-ECD (ECD, détection de capture
d'électrons) et GC-TOF-MS (Hanus 2003).
La combinaison d'une sensibilité élevée de TOF-MS et de pics étroits de GC rapide permet
la détection d'analyte au niveau de la trace (Vreuls1999). De plus, GC-TOF-MS est utilisé
avec succès pour l'analyse rapide (3–5 min) des pesticides organophosphorés, herbicides à
base de triazine et hydrocarbures aromatique dans plusieurs types d'échantillons
(Landrum1987) . Dans le cas de thé bouilli, 11 HA parmi l'EPA 16 HA ont été détectés à un
niveau de moins de 10 μg / L en un peu plus de 300 secondes (figure 5). GC-TOF-MS peut
créer de nouvelles possibilités dans le domaine de l'analyse des HA dans les aliments
5.6 Méthodes de mesure des hydrocarbures aromatique dans des solutions aqueuses
Il existe principalement trois types de techniques utilisées pour leur identification :
chromatographique, immunoessai et spectrométrique (Adeniji et al, 2018).
Techniques d'immunoessais (EPA 4030 et 4035, Update III), qui existent sous forme de
kits, ne sont pas populaires en raison de leur tendance à introduire de forts biais dans les
résultats finaux (Adeniji et al, 2017).
Les méthodes spectrométriques, l'ultraviolet (UV) et l'infrarouge Les techniques (IR) sont
les plus courantes; cependant, les techniques UV (absorption et fluorescence), qui sont
remarquées sensibles et sélectives aux composés aromatiques tels que les HAP et HAM, sont
plus fréquemment affectés par interférence causée par la présence d'autres composés tels que
les lipides. La technique spectrométrique IR, rapide et peu coûteuse, l’échantillon doit subir
une étape de nettoyage obligatoire après traction avant détermination analytique (Adeniji et al,
2018).
Techniques chromatographiques pour tester les HA dans les milieux environnementaux ont
également été établies et largement appliquées, la chromatographie liquide et / ou gazeuse
(LC et GC) étant les principales méthodes utilisées (Poster et al, 2006). Le plus commun Les
méthodes signalées pour l'analyse des HA dans les sources d'eau sont énumérées .Simplicité
de fonctionnement, réduction du volume de solvants utilisés, et la possibilité d'automatisation
sont quelques avantages de l'utilisation chromatographie en phase gazeuse (GC) et
chromatographie liquide à haute performancetography (HPLC) pour analyser les
hydrocarbures aromatique (Gilgenast et al, 2011).
Varlet et al. (2007) ont signalé qu'un des avantages de l'utilisation de GC / MS était la
spécificité permet de se concentrer sur les transitions des HA. Plus-De plus, l’utilisation du
GC / MS permet d’optimiser l’extraction pour prouver le signal. (Gilgenast et al. 2011) ont
énuméré les avantages de la HPLC comme suive :
 perspective d’observer l’éventail des fractions collectées en utilisant un détecteur
HPLC (indice de réfraction, fluorescence ou UV),
 probabilité d'utiliser le rétro-lavage dans la colonne HPLC pour éluer les composants
hautement polaires, entraînant une réduction substantielle dans le temps d'analyse,
 modification de la récupération des HAP/HAM et baisse valeurs d'écart type.
4. RÉSULTATS
ANTÉRIEURS ET
DISCUSSION
4. Résultats antérieurs & discussion 59
4. RÉSULTATS ANTÉRIEURS ET DISCUSSION
Dans ce chapitre subdivisé en deux parties, dans le premier qu’est spécifique à nos
résultats, et l’autre parties aperçues les résultats des autres chercheures qui décrire la
biodégradation des hydrocarbures aromatique mono et polycyclique, soit par intervient des
bactériennes, champignonne, soit par d'autres méthodes biologiques.
6. Résultats de notre partie pratique et leur discussion
6.1.1 Caractérisation microbiologique d’échantillonnes

6.1.1.1 Isolement et dénombrement de la microflore
A partir de chaque type de échantillonne que est subi plusieurs série de dilution en choisi
3 dilution pour étale sur le milieu culture solide Bushnell Hass agar selon la méthode de
suspension /dilution (Waksman, 1927; Dav et, al, 1997; Benyahia et al,2012).que est
méthode classique pour isolement (Ben saidet al , 2007)
Les résultats obtenus sont illustrées dans la (figure 6.1).
Figure 6.1. Résultats du isolent sur milieu solide Bushnell Hass agar
Selon résulte les souches est isole et bien développe température 30°c et PH 7 comme montre
étude de (Mesbaiah et Badis 2013 ; Bouderhem ,2018) que conclue que la température
optimale est environne 30°c et le PH de 7.
Les souches est aussi bien développe sur le Milieu que recommande pour isolement des
microorganismes hydrocarbonclastes (Bushnell et Haas, 1941, Cécile Noel 2014, Abdel Aal et
al, 2014).
Le Source de carbone est additionné a milieu pour utilise par les microorganismes pour le
développement et croissance (Ben said et al, 2007 ; Ali ahmed, 2011; Mesbaiah et Badis
2013 ;Bouderhem ,2018)
Les colonies est en suite dénombre pur chaque échantillonne comme indiquée dans les
tableaux ci dessus
A Echantillonne de hassi messaoud de type sol
Tableau 6.1. Echantillonne de hassi messaoud de type sol
Facteur de dilution Nubr moyenne des colonies

Dilution 10⁻ ³ 88 colonies
Dilution 10⁻ ⁴ 22 colonies
Dilution 10⁻ ⁵ 04 colonies
Selon (Dutruc-Rosset, 2003) la dilution utilise est 10⁻ ³ et par application de loi pour
détermine nombre de colonies selon AFNOR
Nc= ∑ C / [N1+ 0,1N2] d.V

N1 + 0,1N2 𝑈𝐹𝐶
𝑁𝑐 = C =
d×V d×V
88
Danc Nc= 0,1×10⁻3 =880 000=‬8,8 ×105
Tableau 6.2. Echantillonne station épuration Baraki sol

Dilution 10⁻ ³ Incomptable
Donc selon même auteur la dilution applique est 10⁻ 4
20
Et donc Nc= 0,1×10⁻4 =2000 000= 20 ×105
Tableau 6.3. Échantillonne station épuration Baraki eau.

32
Donc Nc= 0,1×10⁻4 =3 200 000=32 ×105
Avec utilisation de d=10⁻ 4
Tableau 6.4. Échantillonne Hassi messaoud eau contamine par pétrole

26
Donc Nc= 0,1×10⁻4 =2 600 000=26 ×105 et Avec utilisation de d=10⁻ 4
3500000
3000000
2500000 sol HM
2000000
sol station
1500000
eau station
1000000
eau HM
500000
0
sol HM sol station eau station eau HM
Figure 6.2. Les nombre de microorganisme dans chaque échantillonne

Comparaison entre eau et sol
33% sol
eau
67%
Figure 6.3. Comparaison entre eau et sol.
La figure 6.3 montre quel nombre de les échantillonne de seau (liquide) est plus importent
de 67% par conter le nombre a échantillonne sole est seulement 33%, nombre des micro-
organismes eau est plus deux fois que a sol.
Cette différence entre le nombre est liée a la condition des chaque support par exemple eau
a station épuration Baraki est stagnant que favoriser plus la développent que dans le sol.et eau
de Hassi messaoud récemment contamine par hydrocarbure.
Il a y plusieurs condition que aide les bactéries et autre microorganisme pour le
développement a façonne charges et varie talque la stagnent de support, temps sur support,
type de support (eau, sol …), d’après les résultats, on constats que nombre de micro-organisme
est élevée a eu que sol et sur support stagnent que autre circule (Amblard, 2001).
Les résulte est aussi cohérent avec de (Bouderhem, 2018) que dit que. Le sol contamine par
les hydrocarbures est riche en bactéries; ces dernières plus importante dans des sols anciens
pollués par rapport aux sols nouveaux contamine. Les bactéries utilisent les hydrocarbures
comme source de carbones.
6.1.1.2 Purification et conservation des souches isolent
Apre les souches sont purifiées par la méthode de repiquage successif sur le même milieu
qu’utilise pour l’isolement des microorganismes figure 6.4.
Figure 6.4. Résultats de la purification sur milieu solide Bushnell Hass agar.
Les souches est ensuite étalé sur milieu de gélose nutritive GN pour la conservation des
microorganismes figure 6.5.
Figure 6.5. Résultats de la purification sur milieu GN.
6.1.2 Les caractéristiques morphologiques des souches

6.1.2.1 Caractérisation phénotypique des isolats
6.1.2.1.1 Etude macroscopique
L'observation macroscopique de différentes colonies bactériennes prélevées sur milieu BH
aide de reculer les éléments d’identifications macroscopiques suivent.
Souche A : Blanche aspect lisse transparent colonies grandes.
Souche B : Jaune aspect lisse transparent colonies moyennées.
Souche C : Blanche aspect lisse translucide colonies moyennées.

Souche D : Rose aspect lisse translucide colonies petites.
Souche E : Jaune claire aspect lisse translucide colonies petites.
Souche F : Blanche aspect lisse transparent colonies moyennées.
6.1.2.1.2 Observation microscopique
6.1.2.1.2.1 Examen a état frais
L'observation à la microscopique optique à l'état de frotti des souches montre des cellules
ayant une forme comme suive (Figure 6.6) la mobilité des souches isole est confirmé par le
test de mobilité par culture.
Souche A : cellules a une forme sphérique dite cocci.
Souche B : cellules a une forme sphérique dite cocci.
Souche C : cellules a une forme sphérique dite cocci.
Souche D : cellules a une forme allongée dite bacille.
Souche E : cellules a une forme sphérique dite cocci.
Souche F : cellules a une forme sphérique dite cocci.
Figure 6.6. Observation microscopique des souches a état frais.
3.1.2.1.2.2 Coloration de gram

L'observation à la microscopique optique avec coloration de gram des souches montre des
cellules ayant une forme comme suive (Figure 6.7) et résultats est indiqué tableau 6.5.
Figure 6.7. Observation de coloration de gram à immersion.
Tableau 6.5. Résultats de coloration de gram.
Souche A Souche B Souche C Souche D Souche E Souche F

Coloration gram gram gram gram gram gram
de Gram négative positive négative négative négative positive
Type Cocci Cocci Cocci bacille Cocci cocci
Forme Ronde Ronde Ronde Long Ronde ronde
regroupent diplocoque Diplocoque Diplocoque chainette Isole isole
Pourcentages de Gram +/-
Gram +
33%
Gram -
67%
Figure 6.8. Pourcentage de Gram + et -.

La figure 6.7 / 6.8 et tableau 6.5 montre que les souches de gram (–) est de pourcentage de
67%cette valeur plus élevés deux fois que les souches de type + avec pourcentage de 33%.
Les résultats préliminaires (morphologiques et biochimiques) montrent que les bactéries
dégradant les HAPs appartiennent à différents groupes de bactéries Gram+ (30 %) et
prédominent de Gram- avec pourcentage de 74 %. (Bouderhem ,2018) et résulte de Gram- (76
%) et bactéries Gram+ (30 %).de (Aliahmed, 2011)
6.1.2.1.3Caractérisation biochimique
6.1.2.1.3.1 Recherche de la catalase
Apre le testage de capacité d’activité catalasique les résulte a été comme suive
Figure 6.9. Résultats du test de la catalase
Tableau 6.6. Résultats du test de la catalase obtenus sont présentés dans le tableau 3.2
Souche A Souche B Souche C Souche D Souche E Souche F
Résulte de catalase Positive Positive Positive positive Positive Positive
Degré de catalase +++ ++ +++ +++ ++ +++
Le tableau 6.6 et la figure 6.9 montre que toute la souche isole est de caractère biochimique
catalase + 100% c’est qu’explique que les souches résiste conter H2O2 est a un moyenne
conter cette éliment toxique pour la cellule est leur membrane externe.
Les même résulte sont ce qui trouve a comme le cas des 100 %de catalase positive (Ali
Ahmed, 2011) et même cas a résulte de (Bouderhem ,2018).
La liste des souches possible semblable isole a notre étude, Selon les capacitaire
macroscopique, microscopique, est biochimique (catalase) trouve est : Pseudomonas
fluorescens et Pseudomonas mendocina. (Cerniglia, 1992 ; Fan et Scow, 1993 ; Sanseverino
et al., 1993 ; Ali Ahmed, 2011). Alcaligenes denitrificans (Cerniglia, 1992 ; Ali Ahmed,
2011). Aeromonas (Cerniglia, 1992 ; Ali Ahmed, 2011), Klebsiella sp, Klebsiellapneumonai
Staphylococcus haemolyticus, Acinetobactercalcoaceticus, Acinetobacterradioresistans

Stenotrophomonasmaltophila Rhodococcusequi, Pseudomonas parfulva, Pseudomonas fulva,
Enterobacterhormaechi, Bacillus licheniformis, Ochrobactrumcicerti, Pseudomonas putida
(Bouderhem ,2018)
Bidegradation de pyrène sont des actinomycètes du genre Mycobacterium (Schneider et al,
1996), Rhodococcus (Bouchez et al, 1995), Gordonia (Kastner et al, 1994) ou Bacillus cereus
(Seo et al, 2009). Des espèces Gram-négatives ont également été identifiées, comme
Pseudomonas fluorescens (Boonchan et al, 1998), Sphingomonas paucimobilis (Kastner et al,
1998), Burkholderia cepacia (Juhasz et al, 1997), Xanthamonas sp. ou Stenotrophomonas
maltophilia (Seo et al, 2009).
Le genre Mycobacterium, a capacités à dégrader les HAPs avec un grand nombre de cycles,
et donc les plus récalcitrants (comme le Benzo[a]Pyrène) (Kim et al, 2006; Kweon et al,
2007).
Sphingomonas yanoikuyae B1 (Gibson et al, 1975) et de Mycobacterium sp. RJGII-135
(Schneider et al, 1996) qui sont capables de cométaboliser le benz[a]anthracène et le
benzo[a]pyrène.
Gram négatif comme Achromobacter, Burkholderia, Pseudomonas et Sphingomonas
(Rockne et al, 2000). Des bactéries du genre Pseudomonas, appartenant à la classe des
Gamma- Protéobactéries, ont servi de modèles pour étudier le métabolisme du naphtalène et
du phénanthrène. De même, Pseudomonas aeruginosa a été isolée pour ses capacités à
dégrader le phénanthrène (Romero et al, 1998). L'étude de Juhasz et al. (1997) est l'une des
premières à montrer que Burkhoderia cepacia a été capable de croître sur du pyrène.
Les bactéries des genres à Gram positif comme Mycobacterium, Nocardia, Peanibacillus,
et Rhodococcus. Les études montrant des genres bactériens à Gram positif capable de croître
sur le fluoranthène sont plus rares (Lopez et al, 2005). La diversité des bactéries dégradantes
peut être définie par une diversité génétique des gènes codant les arènes dioxygènases, plus
particulièrement les gènes codant la sous-unité ɑ des HAP-dioxygènases. Le gène nah est un
des premiers à avoir été étudié (Yen et Gunsalus, 1982).
La souche K1C (Mesbaiah et Badis 2013).
6.2 Résulte des autres chercheurs

Où nous résumerons les informations les plus importantes à ce sujet, les thèmes que traiter
la biodégradation que est semblable à notre thème soit nationale ou universele.des recherches,
mémoire (doctorant, master ou magister), articles des revue… etc. qui parlent a la
biodégradation des hydrocarbures aromatique mono et polycyclique, soit par intervient des
bactériennes, champignonne, soit par d'autres méthodes biologiques.les exemple est comme
suit :
6.2.1 La biodépollution du sol contamine par hydrocarbure

6.2.1.1. Objective d’étude
Pour obtenu le diplôme de magistère en sciences agronomiques le Melle (Ali Ahmed ,2011)
avec leur promoteur Dr.Cherid-tiliouine a école nationale supérieure agronomique et sous titre
″Essai de réhabilitation d’un sol contamine par les hydrocarbures a l’aide de tensioactifs
obtenus par voie biologique″
Dans cette étude Ali ahmed identification et caractérisation quater 4 souches isolées sur
milieu contenant une source de carbone, une source d’azote, de phosphore, de potassium, de
magnésium, et de sodium. Les souches teste est : Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas
mendocina, Alcaligenesdenitrificans et Aeromonashydrophila.
Objectif est de teste la capacité de biodégradation de quelque type de HAP par les quater
souche isole:
Les souches sont caractérise macroscopique, microscopique, et biochimique comme illustre
ci-dessous.
Tableau 6.7. Les capacitaires biochimiques de souche isolent
S Cat Ox L G GS Esc ADH LDC Ind TDA NO3 Citrate O/F Vf
S1 + + - - + - - - + - + + O As
S2 + + + + + - + - + - - + O As
S3 + + - - + - + - + - - + O As
S4 + + - + + + + - + - + + O/f Af
Après l’examen macroscopique, l’observation microscopique et l’étude biochimique, nous

sommes arrivés à caractériser les quatre souches comme suit :
 Souche S1
Les cellules sont en bâtonnets individuels et mobiles de 1,6 µm sur 0,5 µm. Cette espèce
appartient au groupe de bactéries G- à métabolisme oxydatif. Elle peut avoir une respiration
anaérobie en présence de nitrates.
Elle répond positivement aux tests de catalase, d’oxydase, de gélose au sang, d’indole, de
nitrate et de citrate.
Elle est ONPG négative, n’utilise pas le lactose, le glucose et l’esculine, ne produit pas
d’H2S à partir de sulfure de métaux.
Elle n’a pas d’activité désaminase, décarboxylase et déshydrogénase sur le tryptophane, la
lysine et l’arginine respectivement.
 Souche S2
Les cellules se présentent sous la forme de bâtonnets mobiles de 2,2 µm sur 0,7µm,
individuels ou en paires. Les cultures produisent un pigment fluorescent diffusible dans le
milieu.
Les souches de cette espèce sont capables d’utiliser 60 à 80 sources différentes de carbone
et même plus. Ce sont des aérobies obligatoires qui peuvent être rencontrées dans l’eau et
dans le sol.
Elle est catalase et oxydase positive, utilise le citrate, le lactose et le glucose mais pas
l’esculine. Elle répond positivement au test Indole. Elle a une activité arginine déhydrolase,
mais n’a pas d’activité lysine décarboxylase et tryptophane désaminase ainsi que la
galactosidase. Elle ne peut pas produire de l’H2S et n’est pas capable d’utiliser les nitrates.
Elle a un métabolisme oxydatif.
 Souche S3
Ce sont des bacilles de 2 µm sur 0,6 µm, individuelles ou groupées en pairs et sont mobiles.
Les colonies sont jaunâtres à cause de la production d’un pigment caroténoïde intracellulaire.
Ses souches sont capables d’utiliser 56 à 65 ou plus de composés organiques différents
comme source de carbone.
Ce sont des aérobies obligatoires à métabolisme oxydatif. Elle répond positivement aux
tests de catalase, d’oxydase, de gélose au sang, d’ADH, d’indole et de citrate. Elle est ONPG,
lactase, glucose, H2S, esculine, LDC, TDA et NO3 négatifs.
 Souche S4
Ce sont de petits bacilles G- de 0,8 µm sur 0,3 µm, mobiles, pouvant vivre en absence
d’oxygène, ce sont des anaérobies facultatifs. Se rencontrent dans l’eau, le sol, les aliments et
les égouts.
Elle répond positivement aux tests d’oxydase, de catalase et de nitrate réductase, ainsi que
l’ONPG. Elle a une activité d’hémolyse. Elle utilise l’esculine, le glucose et le citrate, mais
n’utilise pas le lactose. Elle produit l’ H2S, et peut utiliser les nitrates. Elle est ADH positive
mais LDC et TDA négative.
Les souches en suit subi une étude de conditions du milieu (concentration des hydrocarbures,
pH, température et salinité)
Tableau 6.8. Effet de la concentration en hydrocarbures.
Facteur Concentration du kérosène (% v/v)

Souche 0 2 5 10 20 30
Alcaligenesdenitrificans + ++ ++ + + +
Pseudomonas fluorescens + ++ ++ + + +
Pseudomonas mendocina + ++ ++ + + +
Aeromonashydrophila + ++ ++ + + +
De nombreux travaux signalent l’implication des souches obtenues dans la dégradation des
hydrocarbures.
En effet, parmi les souches connues pour leur capacité à dégrader les alcanes figurent
Pseudomonas fluorescenset Pseudomonas mendocina.
Ces deux souches sont également retenues comme capables de dégrader certains
composés aromatiques (Cerniglia, 1992 ; Fan et Scow, 1993 ; Sanseverino et al.,
1993).
Alcaligenesdenitrificansest, elle aussi, capable de dégrader les hydrocarbures aromatiques tels
que le pyrène et le naphtalène, le fluoranthène et le benz[a]anthracène (Cerniglia, 1992).
Des souches du genre Aeromonassont également impliquées dans ladégradation des
hydrocarbures aromatiques tels que le phénanthrène (Cerniglia, 1992).
6.2.1.1 Méthodes analysent
Efficacité de biodégradation est suive par une méthode utilisation de chromatographie en
phase gazeuse et pourcentage accumulation de CO2 lorsque la croissance.
Tableau 6.9. Tableau récapitulative d’étude.
référence Souche Compose Analyse

Pseudomonas Type des HA (pyrène ; Les hydrocarbures
fluorescens, naphtalène, aromatiques sont analyse
(Ali ahmed, 2011)
Pseudomonas fluoranthène, par chromatographie en

mendocina, benz[a]anthracène) phase gazeuse et la
Alcaligenesdenit croissance est suive par
rificansetAerom mésuser le pourcentage de
onashydrophila. CO2 accumulé.
6.2.2 Traitement biologique des milieux aquatiques

6.2.2.1 Sur l’étude
Le thème de (traitement biologique des milieux aquatiques contamines par les
hydrocarbures aromatiques polycycliques) est réalise par (Mesbaiah et Badis 2013)a
université de SAAD Dahlab. Blida. Algérie
Ou les chercheur explique la gravite de la contamination par Les Hydrocarbures
Aromatiques Polycycliques, leur gravite comme il dit (classées cancérigènes, mutagènes et
reprotoxiques. Outre leur caractère ubiquiste, leur forte toxicité justifie leur classement en
Polluant Organique Persistant et leur inscription comme substances prioritaires sur les listes
de la Commission Européenne, de l’Agence de Protection de l’Environnement des Etats-Unis
et de l’Organisation Mondiale de la Sante (Marchand, et al, 1996).
La souche bactérienne utilise pour biodégrade quelque compose de hydrocarbure type HAP
que existe dans un milieu liquide est la souche K1C que est déjà isole par équipe à partir d’un
sol sableux contaminé par le pétrole brut, et que a un caractère fondamentale comme une
souche thermophile. La souche est à Régine de Hassi-Messaoud.
La détermination de Anthracène et Naphtalène est quantifié par UV-VIS (6800 UVVIS
JENWAY) avec utilisation de onde égale 293 pour Anthracène et 266 pur détermine
Naphtalène, en suite utilise la méthode CPG pour la confirmation.
Les deux chercheur étudie aussi quelque facteur que agie sur la rondement comme La
concentration du substrat, le pH du milieu et la salinité avec fixation de température a45°C et
sous une agitation de 150 tr/min. tableau 6.4.
Tableau 6.10. Les facteurs étudient et qu’influence sur le rendement
Les facteurs Les valeurs ont testé

Ph 2.5 4 5.5 7 8.5 10 11.5
Concentration de sel% 0 1 2 4 6 8 10
Naphtalène mg/l 50 100 150

Concentration de HA
25 50 100
Anthracène mg/l
6.2.2.2 Résulte
Figure 6.10. Effet de la concentration initiale sur le taux de dégradation après 48h
d’incubation (a : anthracène, b : naphtalène)
Résultats montent que l’efficacité de dégradation est proportionnelle à la quantité du substrat

; plus la quantité est élevée plus le taux d’élimination augmente.
Figure 6.11. Effet de la salinité sur le taux de dégradation après 48h d’incubation
(a : anthracène, b : naphtalène)
La souche K1C montre une bonne résistance à des concentrations en sol très importantes
arrivant à 100g/l, ce qui favorise l’utilisation de cette souche dans la biodégradation des
milieux extrêmes.
Figure 6.12. Effet du pH sur le taux de dégradation après 48h d’incubation (a :

anthracène, b : naphtalène)
La figure 6.13 montre l’influence du pH sur la biodégradation du naphtalène et d’anthracène.

Le pourcentage de réduction le plus élevé est révélé lorsque le pH du milieu est de 7,
Figure 6.13. Biodégradation d’anthracène (a) et du naphtalène (b) par la souche

K1C dans l’eau de mer
Les résultats montrent que la souche K1C dégrade les deux substrats dans l’eau de mer
D’âpres les chercheurs
 La biodégradation du naphtalène et d’anthracène est possible avec dans des conditions

extrêmes du pH et salinité est possible à cause de la résistance de la souche
K1C : 4≤ pH ≤ 10 est 0 % ≤ salinité≤ 10%.
 La souche K1C résiste bien aux conditions environnementales du milieu marin, une
bonne croissance bactérienne a été observée accompagné par une dégradation du naphtalène
et d’anthracène dans le milieu ce qui favorise l’utilisation de cette souche dans la
biodégradation des milieux extrêmes.
La référence Souche, méthode Les conditions Résulte

analyse et compose
Mesbaiah et Badis - Souche de K1C Les facteurs que 1 La possibilité de
-HA est Analyse par influence sur le biodégradation du
2013
UV-VIS avec le rendement de la naphtalène et
Sous titre de CPG pour la biodégradation d’anthracène.
(TRAITEMENT confirmation. d’âpre les deux 2 des conditions extrêmes
BIOLOGIQUE DES -sélectionne deux chercheur est la du pH et salinité est
MILIEUX types d’HA concentration de possible à cause de la
AQUATIQUES anthracène et hydrocarbure cible, résistance de la souche
CONTAMINENT PAR naphtalène la PH le pourcentage K1C : 4≤ pH ≤ 10 est 0 %
LES de salinité, ≤ salinité≤ 10%.
HYDROCARBURES
AROMATIQUES
POLYCYCLIQUES)
6.2.3 La biodégradation d’hydrocarbures par souches bactériennes

telluriques sahariennes
6.2.3. 1 Sur l’étude
Résultats de mémoire d’université Kasdi Merbah-Ouargla, avec thèse pour l’obtention du

diplôme de Doctorat en Sciences Spécial: Biologie Présentée Par : (Bouderhem ,2018), titre
(utilisation des souches bactériennes telluriques sahariennes dans la bioremédiation des sols
pollués par les hydrocarbures pétroliers).
6.2.3.2 Isolement et purification des bactéries hydrocarbonclastes

Protocole pour d’isoler des souches bactériennes hydrocarbonclastes à partir des
échantillons de sols étudiés, l’enrichissement par l’ajout 5 g de sol contenu dans 45 ml de
milieu liquide M63 un volume de 5 ml de pétrole. Ensuit incubées pendant une semaine sous
agitation à 150 tr/min à 30°C. Le milieu M63 solide est ajoute 60µl de pétrole brut comme
source de carbone.
6.2.2.3 Identification des isolats
Idontification est par etude caractéristiques morphologiques, biochimiques et moléculaire.
6.2.3.4 Les résultats
La figure laisse apparaitre des teneurs variables d’hydrocarbures dans les différents
échantillons de sols analysés. L’échantillon du sol II est le plus chargé en ces polluants avec
une teneur de 253.15g/kg de sol, comparé aux échantillons du sol I et du sol III dont les
concentrations en hydrocarbures sont de 165. 2g/kg de sol et 131.4g/kg de sol respectivement.

Les échantillons des sols IV et V n'ont révélé que des traces de polluants (Figure 6.14).
Figure 6.14. la concentration des hydrocarbures dans les échantillons de sols étudiés.
1 Les résultats de dénombrement bactérien des différents échantillons de sols étudiés
Figure 6.15. Biomasse bactérienne des différents échantillons de sols étudiés.
Une biomasse bactérienne (2,3 102 UFC/g) de sol est dans l'échantillon du sol le plus
récemment contaminé ; et dont la teneur en hydrocarbures totaux est la plus élevée (sol II).
Le sol III, plus anciennement pollué mais moins pourvu en hydrocarbures totaux présente la
charge bactérienne tolérant les hydrocarbures pétroliers la plus importante (11,2 .102 UFC/g
de sol).
2 Résultats de l’identification moléculaire des isolats

Tableau 6.12. Résultats de l’identification moléculaire des isolats.
N° Souche Genre ou espèce déterminé par séquençage de l’ARNr16S

S1 Klebsiellasp
S2 Klebsiellapneumonai
S3 Staphylococcus haemolyticus
S4 Acinetobactercalcoaceticus
S5 Pseudomonas putida
S6 Acinetobacterradioresistans
S7 Stenotrophomonasmaltophila
S8 Rhodococcusequi
S9 Pseudomonas parfulva
S10 Pseudomonas fulva
S11 Enterobacterhormaechi
S12 Bacillus licheniformis
S13 Ochrobactrumcicerti
A B
Figure 6.16. Effet de la salinité sur la croissance des souches (A: 30°C ; B: 40°C)
Figure 6.17. Effets du pH et de la température sur la croissance des isolats.
A partir de cette mémoire ; on conclut

 Le sol contamine par les hydrocarbures est riche en bactéries; ces dernières plus
importante dans des sols anciens pollués par rapport aux sols nouveaux contamine
Les bactéries utilisent les hydrocarbures comme source de carbones.
 Il existe plusieurs facteurs qui affectent la croissance des bactéries chaque type de
bactérie nécessite des conditions pour une meilleur croissance (pH, salinité et une
température…etc.) que limite le rendement de la biodégradation.
Référence Les souches Les hydrocarbures étudie Les conditions

Klebsiellasp pétrole Les conditions
Klebsiellapneumonai Gasoil
Staphylococcus haemolyticus Xylène sève par
(Bouderhem ,2018)
Acinetobactercalcoaceticus Toluène Température

Pseudomonas putida Benzène
Acinetobacterradioresistans Le PH
Stenotrophomonasmaltophila
Rhodococcusequi Salinité
Pseudomonas parfulva
Pseudomonas fulva
Enterobacterhormaechi
Bacillus licheniformis
Ochrobactrumcicerti
6.2.4 Isole les souches bactériennes qu’a une capacité de biodégrade les HAP
6.2.4.1 Présentation et Objective
Un collaboration des chercheur France et Tunisie 2007 pour isole les souche
bactériennes de la lagune de Bizerte que a un capacité de biodégrade les hydrocarbure
aromatiques polycycliques cette publication a sous titre caractérisation préliminaire a partir de
la lagune de Bizerte (Tunisie) des bactéries tolérantes aux hydrocarbures aromatiques
polycycliques (HAPs).
6 .2 .4.2 Protocole Isolement
Equipe utilisé échantillonnage d’eaux et de sédiments a été réalisée en mai 2004 à partir de
16 stations. L’isolement des souches est par méthode classique d’enrichissement liquide et
milieu minéral salin de base (MSB) additionné de fluoranthène, La croissance bactérienne a
été suivie par spectrophotométrie en mesurant la densité optique à 600 nm pondent 30 jours.
Caractérisation morphologique des souches est sur milieu PCA, autre caractère biochimique
comme: tests enzymatiques, oxydase, catalase, uréase, fermentation des sucres, production de
H2S a été identifie
La profile de la résistance contre quelque case de antibiotique tableau 6.16 et métaux lourds
est illustre comme suive
Tableau 6.14. Les antibiotiques utilisés au cours de la présente étude des bactéries dégradant
le fluoranthène isolées des sédiments lagunaires. (Société française de Microbiologie, 1998)
Famille Antibiotique utilisé Code Quantité

Pénicilline P 10 UI
Amoxicilline AMX 25 µg
β-lactamines
Oxacilline OX 5 UI
Cefoxitime FOX 30 UI
Streptomycine S 10 UI
Aminosides
Néomycine N 30 UI
Tétracyclines Tétracycline TE 30 UI
Sulfamides Cotrimoxazole SXT 1.25UI
Avec UI : unités internationales (1 UI correspond à 0,0006 g)
Tableau 6.15. Profils des résistances aux métaux lourds des souches les plus résistantes
isolées à partir des sédiments lagunaires.
Souche Station Zinc Cadmium Cuivre Plomb Cobalt Chrome Fer Nickel
S 99 12 - - - + + + - +
S 112 3 + - - + + + + +
S 10 6 + + + + + + - -
S7 13 + - + - + + + +
S 26 7 + + + + + + - +
S 77 8 - - + + + + + +
S 94 4 + + + + + + + +
Tableau 6.16. Profils des résistances aux antibiotiques des souches les plus résistantes
isolées à partir des sédiments lagunaires (mai 2004) sur milieu minéral et ajoute de
fluoranthène.
Souche Station P AMX OX FOX S N TE SXT

S 99 12 + + + + + - + +
S 112 3 + - + + + - - +
S 10 6 + + + + + + - -
S7 13 + + + + + - + +
S 26 7 + + + + + - + +
S 77 8 + + + + + + - +
S 94 4 + + + + + - + +
Avec : + : croissance, - : inhibition de la croissance, P: pénicilline, AMX: amoxicilline, OX:
oxacilline, FOX: céfoxitine, S: streptomycine, N: néomycine,SXT: cotrimoxazole,
TE:tétracycline.
6 .2 .4.3 RESULTATS
Les résultats préliminaires (morphologiques et biochimiques) montrent que les bactéries
dégradant les HAPs appartiennent à différents groupes de bactéries Gram+ 30 % et Gram- 30
% parmi lesquels prédominent les bacilles Gram- 74 %.
D’après les résultats des tests de résistances aux différents antibiotiques et aux métaux
présentés respectivement dans les tableaux 6.15 et 6.16. , 90 % dessouches sont capables de
résister aux moins à deux antibiotiques et à deux métaux différents.
D’après ce travail
 La biodégradabilité du fluoranthène semble essentiellement le fait des bacilles gram.
 Cependant, quelques espèces bactériennes parmi les grams positif, essentiellement
Bacillus spp et Mycobacterium spp capables de dégrader des HAPs
 Nous avons par ailleurs constaté que la capacité de dégrader les HAPs des souches
isolées dans la lagune de Bizerte est dans la majorité des cas associée à une résistance
multiple aux métaux et /ou antibiotiques, à cela rien de bien singulier puisque les polluants
organiques,
 Les métaux lourds et les antibiotiques sont fréquemment présents dans les secteurs
proches des zone surbanisée sont isolé des bactéries utilisant le naphtalène et résistantes au
mercure dans un environnement acide.
Référence Le compose cible et les souches Résulte
Ben Said et al, 2007 Biodégrade la Fluoranthène par les bactéries dégradant les
130 souches isole puis caractérise hydrocarbures aromatiques
morphologiquement, profils polycycliques appartiennent à
biochimique, de résistance à métaux différents groupes de bactéries
lourds et antibiotiques. Gram- et Gram+ respectivement
à des taux de 70 %et 30 %. Ce
sont les bactéries de type bacilles
Gram- qui sont prédominantes 74
%.
6.2.5 La biodépollution fongique aérobie et anaérobie
Article de (Métabolisme fongique aérobie et anaérobie et Perspectives omiques pour

augmenter l'aromatique polycyclique biodégradation des hydrocarbures est présenter par
(Aydin et al 2020), les équipe essaye de présente la avantage de utilisation de différent
champignons que a la capacité pour la biodégradation de hydrocarbure en générale et HAP en
particulaire.
Le chercheur explique le mécanisme de biodégradation par le microorganisme soit
bactrienne, champignon ou algue. Attaque contre les hydrocarbures aromatiques est grâce ales
systèmes enzymatiques, comme le montre la figure 6.19.
Figure 6.18. La biodégradation d’hydrocarbure aromatique.
Les champignons peut développe en plusieurs milieu aérobie et même anaérobie comme
les chercheur explique a sont revue, et le mécanisme principal permet aux champignons
aérobies de s'attaquer au problème de la dégradation est liée à la capacité de l'oxygénase à
diminuer l'oxygène élémentaire afin d'activer les champignons, puis le laisser entrer dans le
substrat. L'accepteur d'électrons avec un plus petit standard le potentiel de réduction des
particules est favorisé par les conditions aérobies et converti en plus petites alternatives
d'énergie libre Gibbs standard.
Figure 6.19. La biodégradation aérobie de HA par champignons.
Elles aussi biodégrade les HA en milieu anaérobie, les championnes utilise les
compositions aromatique livres agissent comme substrat donneur d’électrons et microla
croissance de se produit par oxydation de ces composés dans la présence d'un accepteur
d'électrons terminal.
Figure 6.20. La biodégradation en anaérobiose.
Equipe aussi parle sur la Co métabolique entre les championne et bactérie ou dit que la
biodégradation était amélioré deux fois lorsque les bactéries et les champignons étaient
utilisés en raison de leur activité synchrone. Et donne des exemples sur la Co métabolique
tableau 6.18.
Plusieurs espèces de champignons de la pourriture blanche peuvent co-métaboliser avec les
dérivés des bactéries en développant la biodisponibilité composée dans des conditions
naturelles.
Tableau 6.18. Exemples des Co-métaboliser champignons/ bactérie.
Microorganismes Hydrocarbures Références

Penicillium janthinellum VUO 10201 Benzo [a] pyrène Boonchan et al.
(Consortium fongique-bactérien) 2000
Glomus caledonium NW03 Pétrole total hydrocarbure Chen et al. 2012

(Consortium fongique-bactérien) (TPH)
Trichodermapseudokoningii, Hydrocarbures pétroliers de Morais et
Eurotiumamstelodami, Aspergillus flavus, Tauk-tornisielo
Pseudallescheriaboydii, Aspergillus versicolor, 2009
Aspergillus terreuset Cylindrocarpondidymum
6.2.6 La biodégradation d’hydrocarbure aromatique par les enzymes fongiques
Selon Kadri et al 2016 que parle dans une revue sur la biodégradation d’hydrocarbure
aromatique par les enzymes fongiques.
Objectif est du la présente revue est de comprendre la biodégradation enzymatique des
HAP utilisant des souches fongiques, ou parle sur rôle importent de enzyme fongique a la
biodégradation car ils produisent des enzymes extracellulaires extrêmement spécificité de
substrat réduite. Cela a évolué en raison de l'irrégularité directement, tandis que les
peroxydases fongiques de manganèse les co-oxydent indirectement par la peroxydation de la
lignine à médiation enzymatique.
Les chercheurs citez que tous les champignons que est études produit trois enzymes
ligninolytiques, LiP, MnP et laccase, les sources d’enzyme de la biodégradation est :
 P. chrysosporium
 B. adusta
 P. ostreatus
Enzyme Les souches productrices La condition de culture

LiP B. adusta les micro-organismes nécessitent
KUC9107 des conditions de croissance
Skeletocutisperennis appropriées (par exemple, source
de carbone, nutriments,
MnP Phanerochaetevelutina KUC8366 température, pH, potentiel redox et
Phanerochaetesp teneur en oxygène qui), affectent
KUC9015 498 fortement leur croissance.
Laccase Cerrenaconsor KUC8416
Cerrenaconsor KUC8421
Ou est explique bien la mode action des chaque enzyme et leur cible de hydrocarbure
aromatique et leur capacitaire par référence des chercheurs et fin la revue par une conclusion
générale que résume les touts :
 Les champignons ont prouvé son efficacité dans le domaine de déchets contaminés par
des hydrocarbures aromatiques par le biais d'enzymes, sous forme de MnP, LiP,
laccase…etc.
 plusieurs enzyme fongique a la capacité de la biodégradation comme ( MnP, LiP,
laccase et autres enzymes fongiques, telles que Cytochrome P450 monooxygénase,
époxyde hydrolases, lipases, protéase et dioxygénases.)
 Généralement, taux fongiques de dégradation des HAP sont lents et inefficaces par
rapport aux bactéries
 La biorestauration enzymatique d'un polluant et le taux de auquel il est parvenu
dépend des conditions environnementales, nombre et type de micro-organismes,
caractéristiques du composé chimique à dégrader.
CONCLUSION GENERALE
Conclusion générale
CONCLUSION GENERALE
La pollution des sols et d’eau par les hydrocarbures résulte des conséquences cumulées de
diverses activités humaines. Cette contamination trop négligée jusqu'à une époque récente est
préoccupante par ces conséquences environnementales, sanitaires et socioéconomiques.
Les sites contaminés par les hydrocarbures représentent un vrai réservoir contenant une
variété de microorganisme comme les bactéries et les champignons qui ayant un potentiel de
biodégradation très élevé des hydrocarbures aromatiques mono et polycycliques. Le
traitement biologique est une solution bien fondée et prometteuse qui permettra au monde,
une réelle prise en charge de la pollution des sols et de l’eau à des coûts abordables et pas de
risque pour la santé humain et l’environnement. Elle représente toujours une solution
intéressante qu’on doit la prendre en considération au futur grâce à leur capacité d’assimiler,
propriétés physicochimiques des HAP et HAM, conditions climatiques et abiotiques et la
population microbienne peuvent jouer divers rôles influents dans la transformation et
dégradation des HAP et HAM.
Malheureusement, notre étude pratique qu’elle concerne l’élimination de quels que HAP et
HAM par les micro-organismes d’environnement a été confiné sur l’isolement des
microorganismes à partir de l’eau usée et de sols contaminé par les hydrocarbures et la
caractérisation morphologique et biochimique de ces isolats.
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ANNEXES
Annexes
ANNEXES
Annexe 01: Appareillages et verreries
Appareillage Verreries Autre matériel

Autoclave Anses de platine
Bain marie Papier aluminium
Balance électrique Papier parafilm
Becher
Etuve Pince en platine
Boite de pétrie
Réfrigérateur Pissettes
Erlenmeyer
Congélateur Tube Eppendorf
Fiole
Microscope optique Spatule
Flacons
pH-mètre Bec bunsen
Lame et lamelles
Plaque chauffante Gants jetables
Verre de montre
Agitateur rotatif Shaker Marqueurs
Spectrophotomètre Micro pipette
HPLC Portoir pour tube
Annexe 2 Protocole des tests

1: Le protocole etat frais
Le test à l'état frais permet d'observer les bactéries vivantes. Ce qui permet de mettre en
évidence la mobilité, le mode de groupement et une approche sur la morphologie d'une culture
jeune en milieu liquide (48 heures).
Le protocole à suivre est comme suite:
Homogénéisation de la culture liquide
à prélever.
Prélèvement d'une goutte de culture liquide
(à l'aide d'une pipette Pasteur ou à l'anse
de platine) et dépôt sur une lame propre.
 Pose de la lamelle, en partant d'une position

inclinée à 45°.
Les observations sont obtenues au microscope optique de grossissement X40.

Annexes
2:Le protocole coloration de Gram

1-Déposer une goutte d’eau physiologie stérile sur une lame bien propre.
2-Prélever un échantillon de colonie et mélanger avec la goutte d’eau, strier et sécher par
passage rapide sur la flamme d’un bec benzène.
3-Couvrir le frottis par du cristal violet pendant 60 secondes.
4-Laver l’excès du colorant avec de l’eau distillée.
5-Couvrir de lugol pendant 30 secondes.
6-Laver à l’eau distillée pendant 5 secondes.
7-Rincer immédiatement le frottis avec le mélange alcool-acétone en inclinant la lame et par
goutte à goutte jusqu’à disparition complète de la coloration violette.
9-Couvrir avec de la fuschine pendant 15 secondes.
11-Déposer une goutte d’huile à immersion sur le frottis et observer au microscope à un fort
grossissement. Les cellules Gram+ absorbent la couleur du cristal violet et demeurent bleues
violettes en apparence, contrairement aux cellules Gram- qui apparaissent distinctement rosâtres.
Annexe 3: Préparation et composition des milieux de culture(Composants g/ litre)

Pour chacun des milieux, les ingrédients sont pesés à l'aide d'une balance de précision et
déposés dans une fiole jaugée puis rajouter le volume d'eau distillée à raison de 1000 ml. Le pH
est mesuré par un pH-mètre puis ajusté par l'ajout soit du KOH ou du HCl ensuite répartir dans
des flacons de 250 ml et autoclavés à 120°C pendant 15 minutes, une fois refroidies (45°C) et
déposés stérilement a des boites ou conserve jusque utilisation. Les milieux utilise est:
Le milieu solide Bushnell Hass agar

-Magnesium sulphate MgSO4 ……………………………………………………. 0.20
-Calcium chloride CaCl2…………………………………………………………. 0.02
-Mono potassium phosphate KH2PO4 ……………………………………………. 1.00
Annexes
-Di potassium phosphate K2HPO4 …………………………………………………1.00

-Ammonium nitrate NH4NO………………………………………………………1.00
-Ferric chloride FeCl3………………………………………………………………. 0.05
-Agar …………………………………………………………………. 20.00
pH final: 7± 0,2 .
Gélose a uréase
-Peptone…………………………………………………………………. 1g
-Glucose…………………………………………………………………. 1g
-Nac………………………………………………………………………. l 5g
-Na2HPO4………………………………………………………………. 1.2g
-KH2PO4…………………………………………………………………. 0.8g
-Rouge de Phénol…………………………………………………………. 0.0012g
-Urée …………………………………………………………………50ml (40%) stérile
-Agar ……………………………………………………………………. 15g
pH final: 7± 0,2 .
Gélose Nutritive(GN) :
-Peptone…………………………………………………………………. 5,0 g
-Extrait de viande…………………………………………………………1,0 g
-Extrait de levure………………………………………………………… 2,0 g
-Chlorure de sodium………………………………………………….….. 5,0 g
-Agar agar …………………………………………………………….....12,0 g
-L’eau distillée………………………………………………………….1000 ml
pH final: 7± 0,2 .
Milieu Mannitol-Mobilité-Nitrate
-Peptone de caséine…………………………………………….…… 10,00g
-Mannitol……………………………………………………………… 7,50g
-Nitrate de potassium………………………………………….….….. 1,00g
-Rouge de phénol………………………………………………..…... 0,04 g
-Agar……………………………………………………………….... 3,50 g
-Eau distillée……………………………………..………..………....1000ml
pH final: 7± 0,2 .
Milieu gélose VF viande-foie

-base viande foie …………………………..………..………....30,0 g
Annexes
-glucose …………………………………..………..……….... 2,0 g

-agar ……………………………………..………..………....6,0 g
pH final: 7± 0,2 .
Milieu Hugh et Leifson

- Base nutritive avec peu de peptones ……………………..………..………....2 g
- Bleu de bromothymol ………………………………..………..…………....30 mg
- Chlorure de sodium ……………………………………..………..……….... 5 g
- Hydrogénophosphate de potassium K2HPO4……………………..………....0,3 g
- Agar-agar . ……………………………………..………..……….... 2,5 g
pH final: 7± 0,2 .
Annexe 4 : Les réactifs et tampons
Lugol
Diiode ………..………..………....1g
Iodure de potassium ………..………..………....2g
Ethanol ………..………..………....10ml
Eau distillée ………..………..………....1000ml
Cristal violet 1 %
Cristal violet ………..………..………....1g
Eau distillée ………..………..………....1000ml
Fuschine
Fuschine basique ………..………..………....1g
Alcool éthylique à 90o ………..………..………....10ml
Phéno………..………..………....l 5g
Eau distillée qsp ………..………..………....100ml
La solution est diluée au 1/15.
Catalase (réactif pour la mise en évidence).

Eau oxygénée 10 volumes (10%).
Annexes
Annexe 4 :les fiches technique des mix utilise
1er ficher est pour le mix de HAP et 2 eme pour le mix HAM
MONOCYCLIQUES ET POLYCYCLIQUES PAR LES MICRO-ORGANISMES
D’ENVIRONNEMENT
Ahmed AZIZI, Ridha BOUAMRA, Zahia BELALOUI, Samia KARA
RESUME. Les hydrocarbures mono et polycycliques sont des polluants ubiquitaires et hydrophobes dont
la persistance dans les écosystèmes est principalement due à leur faible solubilité aqueuse en raison de
leurs potentialités toxiques, mutagènes et cancérigènes, certains d'entre eux sont considérés comme des
substances dangereuses. Leur présence au niveau des composantes des différents maillons de l’homme
constitue un risque important pour l'environnement et la santé humaine. Letraitement de ce type de
polluants par les procédés de biodégradation sous l’utilisation des micro-organismes d’environnement
(bactéries et les champignons) considère comme un processus très favorable à l’échelle international. Ce
contexte rassemble un aperçu sur la biodégradation des hydrocarbures aromatiques mono et
polycycliques par les micro-organismes d’environnement en présence de quelque essaies pratiques
cibler l’identification de quelques souches microbiennes (bactéries et championnes) isolées depuis des
eaux et sol contaminées par ce type des hydrocarbures.
MOTS CLES. Biodégradation ; Hydrocarbures aromatiques mono et polycycliques ; Micro-organismes

d’environnement.

Biodégradation Des Hydrocarbures Aromatiques Mono Et Polycycliques Par Les Micro-Organismes D'environnement Pfe Ridha Bouamra

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Biodégradation Des Hydrocarbures Aromatiques Mono Et Polycycliques Par Les Micro-Organismes D'environnement Pfe Ridha Bouamra

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‫الجمهــــــــــــــــــــــــــــــــــــورية الجزائريـــــــــــــــــــــــــة الديــــــــــــــــــــــمقراطـــــية الشعبـــــية‬

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

‫قســـــم عـــلـــوم الطـــبـــيـــعـــة والـــحـــيـــاة‬

Soutine publiquement le : Mardi 08/09/2020

Dr. Mahfoud AINAS MCB, UYFM Président

Année universitaire 2019-2020

BIODEGRADATION OF MONOCYCLIC AND POLYCYCLIC AROMATIC

‫من الماء والتربة المموثة بهذا النوع من الهيدروكربونات‪.‬‬

Nous aimerions en premier lieu remercier Dieu le tout puissant et

miséricordieux qui nous a donné la force, la volonté, la patience et le courage

éclairé le chemin de la réussite.

En second lieu, nous remercions chaleureusement notre promoteur Monsieur

travail, pour ses orientations, sa patience et sa disponibilité.

Nous vifs remerciements vont également aux membres du jury AINAS .M

d’examiner notre travail et de l’enrichir par leurs propositions.

participé de près ou de loin à la réalisation de ce travail.

A mes chères parents mon père et ma mère

Pour leur patience, leur amour, leur soutien et leurs

A mon frère Walid et

A toute ma grande famille Bouamra

Ma trinôme Belaloui et kara

Ainsi qu'a tous mes professeurs, enseignantes et tous

Mes amis du primaire jusqu'a l'université.

A tous ceux qui ont une relation de proche ou de loin

avec la réalisation du présent travail.

A mes très chers et magnifiques parents : Achour et Mahdjouba

A mes chers frère et sœur : Omar, Ismail, Khadidja, Meriem

Sans oublier mes chers grands-parents tous mes oncles et tantes.

A tous mes cousins et cousines sans exception.

A toute la famille KARA et BEN FRAIHA.

A mes collèges : Sara, Hamida, wahiba.

A mon deux binôme Ridha et Zahia.

A tous mes collègues de la promotion 2019/2020.

Ma très chère mère Djamila

Mon père Boudjma

Mes chers frères Mohamed Hamza Aziz Nabil Oussama et Ayoub

HUDA Mes oncles et tantes

Toute la famille BELALOUI

Mes amies Asma, Amina, Djahida, Naoual et Ahlem

A tous mes collègues de la promotion 2019/2020.

Table des matières

2. BIODEGRADATION DES HYDROCARBURES AROMATIQUES

2.2.3.1 Les bactéries .........................................................................................................23

3.6 Comparaisons entre les procèdes de dépollution ...............................................................38

4. RÉSULTANTES ANTERIEURS ET DISCUSSION

3.1.2.1.2.2 Coloration de gram ...........................................................................................64

CONCLUSION GENERALE ……………………………………………………… 84

LISTE DES ABREVIATIONS& NOMENCLATURES

LISTE DES FIGURES

LISTE DES TABLEAUX

Pour cette raison, ce contexte est structuré en quatre parties :

 D’origine agricole (principalement les dérivés du méthane

Figure 1.1. Structure des hydrocarbures aromatiques monocycliques.

Figure 1.2. Les principales familles d’hydrocarbures (Syakti 2004).

1.4 Propriétés physiques et chimiques

Ces propriétés physicochimiques affectent la distribution des hydrocarbures aromatique

Ces propriétés physicochimiques affectent la distribution des HAP/HAM dans

Phénanthrène Photo-sensibilisateur de peau

Chrysène Confirmé Cancérigène chez les animaux.