CD4+CD25+Foxp3+ regulatoryTcellsinduce 4 5 p3 g y cytokinedeprivationmediatedapoptosisof cytokinedeprivation effector CD4+ Tcells Tcells

Pushpa Pandiyan,Lixin Zheng,Satoru Ishihara,JenniferReed &MichaelJLenardo

Docente:

MargaridaTelhada Margarida Telhada

Discentes:

Imunologia 2009, FCUL

AndrFaustino,n34847 MariaJooSarmento,n34885 SamuelGilberto,n34898

0.
Tresp:

Introduo

Produzem IL2, necessitando desta para sobreviver e proliferar Activadas pela ligao do TCR a p g pMHC classe II, requerendo co estimulao

Treg:
Suprimem respostas imunes e ficam anrgicas quando estimuladas f No produzem IL2, mas requerem IL2 para sobreviver Inibem Tresp por um mecanismo p no especfico

1. ClulasTreg induzemapoptosedasClulas p p
Tderespostain vitro
Confirmaode Fentipos,exvivo: Tcon =CD4+CD25 Foxp3 CD4 + + + Treg =CD4 CD25 Foxp3

1. ClulasTreg induzemapoptosedasClulasTderespostain vitro

ProliferaodasTresp eefeitosupressordasTreg

Incorporaode [3H]Timidina

DiluiodeCFSE Dil i d CFSE

AntiCD3+APCs

AntiCD3+antiCD28

1. ClulasTreg induzemapoptosedasClulasTderespostain vitro

ProliferaodasTresp eefeitosupressordasTreg
Microfotografiasdascoculturas:

AsclulasTreguladorassuprimem a As clulas T reguladoras suprimem a proliferaodasclulasTderesposta

Hiptese:APOPTOSE

1. ClulasTreg induzemapoptosedasClulasTderespostain vitro

ProliferaodasTrespeefeitosupressordasTreg
Tresp+ Tcon

Tresp+

Treg

Treg no suprimem,inicialmente: aexpressodeCD25 aproduodeIFN (eIL 2) a produo de IFN (e IL2)

Activao inicial das Activaoinicialdas Tresp noinfluenciada pelasTreg pelas T

1. ClulasTreg induzemapoptosedasClulasTderespostain vitro

Hiptese:Apoptose
Testesocorrnciadeapoptose: ColoraocomTrypan blue Ligaodeanexina V eiodetodepropdeo Indicadores deapoptose InibiodasupressomediadaporT napresena Inibio da supresso mediada por Treg na presena deinibidoresdeapoptose

1. ClulasTreg induzemapoptosedasClulasTderespostain vitro

Corantesemarcadoresusados Apoptose A t

Anexina V

IodetodePropdio (PI) I d d P di

Trypan Blue l

1. ClulasTreg induzemapoptosedasClulasTderespostain vitro

InduodaapoptosepelasTreg

Coloraodasclulasmortascomtrypan blue

H mortecelularnacoculturacomTreg

1. ClulasTreg induzemapoptosedasClulasTderespostain vitro

InduodaapoptosepelasTreg
ComTreg:

+ clulascomanexina VePI
Treg estimulama apoptosedasTresp d

1. ClulasTreg induzemapoptosedasClulasTderespostain vitro

InduodaapoptosepelasTreg
Indicadoresdeapoptose: condensaodoncleo condensao do ncleo blebbing damembrana Inibidoresde apoptose

1. ClulasTreg induzemapoptosedasClulasTderespostain vitro

InduodaapoptosepelasTreg
Treg eTresp separadas T d fisicamente,no sistemaTranswells sistema Transwells

Nohapoptose mediadapelasTreg p

1. ClulasTreg induzemapoptosedasClulasTderespostain vitro

Concluses
Activaoinicialdas Tresp noinfluenciada pelasT pelas Treg NapresenadeTreg, aumentaataxade apoptosedasT apoptose das Tresp

AsclulasTreg induzemaapoptosedeclulasTefectorasactivadas invitro,emvezdesuprimiremaactivaoinicialeaproliferao

2.

ClulasT medeiamaprivaode Clulas Treg medeiam a privao de citocinasnasclulasTderesposta

MortemediadaporTreg podesedevera:
ComprometimentodaactivaodasTresp MecanismosapoptticosinduzidospelasTreg

No sodistinguveispelamedioda proliferao

2. ClulasTreg medeiamaprivaodecitocinasnasclulasTresp

BasecelulardamortemediadaporTreg

InibidoresdoPI3K Estimuladores
Wortmanina PMA Ionomicina

LY294002

2. ClulasTreg medeiamaprivaodecitocinasnasclulasTresp

BasecelulardamortemediadaporTreg
zVAD inibeomecanismopeloqualasTreg p q induzemapoptose

MecanismosapoptticosinduzidospelasTreg

MasSerqueessesmecanismossoactivosoupassivos?

2. ClulasTreg medeiamaprivaodecitocinasnasclulasTresp

Serqueaapoptoseactivaoupassiva?
Possveisviasapoptticas sofridaspelasTresp: p TNF: captadopeloTNFRFc PRF1:noproduzidaemTreg Prf1/ Fas/Fasl:Tregs gld tmogeneFasl mutado Granzime B:inactivadacominibidores

AapoptoseinduzidapelasTreg independente demecanismos g citolticos(mecanismosactivos)

2. ClulasTreg medeiamaprivaodecitocinasnasclulasTresp

Serqueaapoptoseactivaoupassiva?

Evoluolenta daapoptose,demorando34diasatatingiropico

2. ClulasTreg medeiamaprivaodecitocinasnasclulasTresp

Serqueaapoptoseactivaoupassiva?

Ascitocinasantiapoptticas como IL2,IL4,IL7,IL15e IL21,bloqueiam aapoptosedasTresp induzidapelasTreg

2. ClulasTreg medeiamaprivaodecitocinasnasclulasTresp

Serqueaapoptoseactivaoupassiva?

ProvasdequeomecanismoPASSIVO Provas de que o mecanismo PASSIVO Citocinas anti anti Lentidoatse apoptticas atingirumpicode bloqueiama apoptose apoptosemediada pelasTreg

Independente demecanismos citolticos

2. ClulasTreg medeiamaprivaodecitocinasnasclulasTresp

ViaantiapoptticadoAkt1
simplificada
PI3K _ Akt1 + Akt1P + LY/wort

Bad

BadP

Apoptose

2. ClulasTreg medeiamaprivaodecitocinasnasclulasTresp

Influnciadaviadocinase Akt1
Apoptose p p promovidapelas Treg nasTresp inibidapor citocinas

Viadocinase Viado i Vi d cinase Akt1 dependentede dependente de citocinas

Serqueaapoptosepromovidapelas Treg derivadainactivaodestavia?

2. ClulasTreg medeiamaprivaodecitocinasnasclulasTresp

Influnciadaviadocinase Akt1
LY wort Inibidoresdo fosfatidilinositol3cinase

ViadoAkt1inibida:

+ Apoptose

CapacidadedaIL7emreduziros Capacidade da IL 7 em reduzir os nveisdeapoptose

2. ClulasTreg medeiamaprivaodecitocinasnasclulasTresp

Influnciadaviadocinase Akt1

Akt1inactiva Akt1 inactiva

Fosforilao

Akt1P activa

Treg diminuem a quantidade de Akt1 activa expressa nas Tresp diminuemaquantidadedeAkt1activaexpressanasT diminuemaquantidadedeAkt1activaexpressanas

2. ClulasTreg medeiamaprivaodecitocinasnasclulasTresp

Influnciadaviadocinase Akt1
BadP inactiva Badactiva
- IL-7

+ IL-7

QuantidadetotaldeBadnoafectada IL7restauraafosforilaodaBad

Treg diminuemaquantidadedeBadfosforilada nasTresp diminuemaquantidadedeBadfosforilada

2. ClulasTreg medeiamaprivaodecitocinasnasclulasTresp

Concluses
Citocinas bloqueiamaapoptose MecanismosapoptticospassivosinduzidospelasT Mecanismos apoptticos passivos induzidos pelas Treg EnvolvimentodaviadoAkt1 Treg di i diminuemaquantidadedeAkt1activaexpressanasTresp id d d Ak 1 i T ApresenadeTreg diminuiquantidadedeBadfosforilada IL7restauraafosforilaodaBad AsclulasTreg promovemamortedasclulasTresp porum p p mecanismocombasesmolecularessemelhantessdaApoptose induzidaporprivaodecitocinas

3.

ClulasT consomemcitocinasin Clulas Treg consomem citocinas in vivo

Alembrar: Treg no produzemIL2 ApenasTresp ofazem

ComoqueasT medeiama Como que as Treg medeiam a apoptosepassiva

3. ClulasTreg consomemcitocinasin vitro

Treg eanoacumulaodeIL2

ConcentraodeIL2 emsoluoem l coculturascomTreg

NapresenadeT Na presena de Treg ,acumulaodeIL 2muitomenor! acumulao de IL2 muito menor!

3. ClulasTreg consomemcitocinasin vitro

ComoqueasTreg evitamaacumulaodeIL2?

Supressoda expressodogene Il2(econsequente secreoreduzida)

OU

ConsumodeIL2

3. ClulasTreg consomemcitocinasin vitro

ComoqueasTreg evitamaacumulaodeIL2?
PCRQuantitativo

ExpressodeIL2 E d IL 2

AquantidadedeIL2mRNA no afectadapelapresenadeTreg

Mas

QuantidadedeIL2mRNA noreflectedirectamentea transcriodeIL2

3. ClulasTreg consomemcitocinasin vitro

ComoqueasTreg evitamaacumulaodeIL2?
Anlisedatranscrio deIL2 d IL 2

14h

36h

knock in comGFP

TranscriodeIL2no afectadapelasTreg p

3. ClulasTreg consomemcitocinasin vitro

ComoqueasTreg evitamaacumulaodeIL2?

ExpressodeIL2no p afectadapelasTreg

3. ClulasTreg consomemcitocinasin vitro

ComoqueasTreg evitamaacumulaodeIL2?

Eainda E i d AreduzidaquantidadedeIL2 nomeiopoderesultardeuma menoractividadesecretora

SecreodeIL2no afectadapelasTreg

3. ClulasTreg consomemcitocinasin vitro

ComoqueasTreg evitamaacumulaodeIL2?
AconcentraodeIL2muitomaisbaixanas co culturascomT quecomT coculturas com Treg que com Tcon TranscriodeIL2noafectadapelasTreg SecreodeIL2noafectadapelasTreg

DepleodaIL 2nasT emco culturacomasT dever Depleo da IL2 nas Tresp em cocultura com as Treg dever IL co seaCONSUMO deIL seaCONSUMO deIL2enoproduo

3. ClulasTreg consomemcitocinasin vitro

ComoqueasTreg evitamaacumulaodeIL2?
Treg necessitamdeIL2parasobreviveresuprimirasTresp

CompetiopelaIL2 Competio pela IL 2

ClulasTreg absorvem q maisIL2queasTresp

Adicionadaaomeio

3. ClulasTreg consomemcitocinasin vitro

DepleodecitocinaslevamortecelulardasTresp

BloqueiodaIL2comum l i d IL 2 anticorpo

MortedasclulasTresp

3. ClulasTreg consomemcitocinasin vitro

DepleodecitocinaslevamortecelulardasTresp

ConsumodeIL2pelasTreg o mecanismoresponsvelpela mortecelulardasT morte celular das Tresp Efeitoeliminadopelaadiode IL2exgena

3. ClulasTreg consomemcitocinasin vitro

DepleodecitocinaslevamortecelulardasTresp

KI knock in nolocus daIL2nasTresp

+ Treg

+
Mas Mas

Apoptose
CoculturascomTreg

Outrascitocinas,comoaIL7,permitemmantera viabilidadedasT viabilidade das Tresp

3. ClulasTreg consomemcitocinasin vitro

DepleodecitocinaslevamortecelulardasTresp
PseudoTreg somenoseficientes aprovocarapoptose a provocar apoptose

Treg expressamtambmreceptores especficosparaoutrascitocinas, comoIL4,IL7,IL15 Competiopeloconsumodeoutras Competiopeloconsumodeoutras citocinas

3. ClulasTreg consomemcitocinasin vitro

ConsumodecitocinaspelasTreg evitamasuaproduo tardiapelasTresp p

ClulasTresp produzemmuitomenosCD25e p CD132napresenadeTreg ClulasTresp forammortas

E
OloopdeIL2quemantmaproduo p q p dosreceptoresfoiinterrompidonas clulasviveis

3. ClulasTreg consomemcitocinasin vitro

ConsumodecitocinaspelasTreg evitamasuaproduo tardiapelasTresp p

3diasapsaestimulao

Treg suprimem produotardiadecitocinasnasTresp

3. ClulasTreg consomemcitocinasin vitro

ConsumodecitocinaspelasTreg evitamasuaproduo tardiapelasTresp p

IL2exgena

Produotardiadecitocinaspelas Tresp no afectada pelas Treg no afectadapelasT

ComaestimulaocomCD3+APC osresultadosnosoevidentes

3. ClulasTreg consomemcitocinasin vitro

ApoptosemediadapelasTregenvolveBim dasTresp
ParaalmdaBad,tambmaprotenaBim levaocorrncia deapoptosedependentedecitocinas de apoptose dependente de citocinas Bcl2:protenaantiapopttica B l2 i i Bim:protenaproapopttica

ClulasT deficientesemBim soresistentes Clulas Tresp deficientes em Bim so resistentes apoptosemediadaporclulasTreg

3. ClulasTreg consomemcitocinasin vitro

ApoptosemediadapelasTregenvolveBim dasTresp

ClulasTresp no produtorasdeBim ou p sobreexpressando Bcl2

Resistnciacompleta p apoptosemediadapelasTreg

3. ClulasTreg consomemcitocinasin vitro

ApoptosemediadapelasTregenvolveBim dasTresp

Produodecitocinas tardiamenterestaurada com oknockoutdaBim

KnockoutdaBim no torna asclulasTresphipersensveis estimulao

3. ClulasTreg consomemcitocinasin vitro

Resumindo...

Competiopeloconsumodecitocinas

Consumoantecipadodecitocinaslevasupresso daproduotardiadecitocinaspelasTresp

Interrupodofeedback Interrupo do feedback positivodesinalizao

Mortedasclulasprogenitoras Morte das clulas progenitoras produtorasdecitocinas

4.

Papeldas ClulasT naapoptosedas Papel das Clulas Treg na apoptose das clulasTcolitognicas in vivo
RatinhoscomInflammatory Bowel Di B l Disease (IBD)

ClulasThy1.1+CD25CD45RBhiCD4+ Aps 1 semana

InjecodePBS InjecodeTregThy1.2+ isoladasdefresco

RatinhosC.B17scid

4. PapeldasClulasTreg naapoptosedasClulasTcolitognicas in vivo

EfeitodasclulasTreg nasTresp emratoscomIBD

Treg providenciam id i efeitoprotectornos ratinhoscomIBD ratinhos com IBD

Desenvolvimento dadoenacome semTreg T

4. PapeldasClulasTreg naapoptosedasClulasTcolitognicas in vivo

EfeitodasclulasTreg nasTresp emratoscomIBD

EfeitodasTreg nasclulasTresp emnduloslinfticosdo mesentrio (MLN) e no clon (MLN)enoclon

ClulasThy1.1+ apresentammaisapoptosena presenadeT in presena de Treg,in vivo

4. PapeldasClulasTreg naapoptosedasClulasTcolitognicas in vivo

EfeitodasclulasTreg nasTresp emratoscomIBD

MLN

Colon

ClulasT noprovocamapoptose nasT (Thy 1.1 )in vivo, Clulas Tcon no provocam apoptose nas Tresp (Thy1 1+) in vivo emcomparaocomasTreg

4. PapeldasClulasTreg naapoptosedasClulasTcolitognicas in vivo

EfeitodasclulasTreg nasTresp emratoscomIBD

NapresenadeclulasTreg humadiminuiosubstancialda quantidadedeclulasTresp

4. PapeldasClulasTreg naapoptosedasClulasTcolitognicas in vivo

MecanismodesupressodaIBDpelasTreg
ProliferaodeTresp inicial normal l

Supressonopodeserexplicada po te e c as a act ao porinterfernciasnaactivao

Maisumavez,apoiaahiptesedopapeldaapoptosena supressodadoena

4. PapeldasClulasTreg naapoptosedasClulasTcolitognicas in vivo

ConsequnciasnaIBDdoknockout daBim emTresp

RatinhosWT ClulasCD25CD45.2RBhiCD4+

RatinhosCD45.1 Ratinhos CD45.1+ Rag1/

RatinhosBimKO

4. PapeldasClulasTreg naapoptosedasClulasTcolitognicas in vivo

ConsequnciasnaIBDdoknockout daBim emTresp

ClulassemBim nosofremapoptose Clulas sem Bim no sofrem apoptose napresenadeTreg nosMLN,esofrem poucaapoptosenoclon pouca apoptose no clon

Bim essencialparaa actuaodasTreg

4. PapeldasClulasTreg naapoptosedasClulasTcolitognicas in vivo

ConsequnciasnaIBDdoknockout daBim emTresp

SupressodadoenapelasTreg Treg no suprimem as Tresp nosuprimemasT deficientesemBim

Treg promovemapoptose p p p pelaviadaBim

4. PapeldasClulasTreg naapoptosedasClulasTcolitognicas in vivo

ConsequnciasnaIBDdoknockout daBim emTresp

Anlisedopesodosratinhos Treg suprimemeficazmenteasTresp, diminuindoossintomasdaIBD

Melhorassignificativasnos ratinhosWT,no verificadasnosBimKO verificadas nos Bim KO

4. PapeldasClulasTreg naapoptosedasClulasTcolitognicas in vivo

Concluses
RatinhoscomInflammatory Bowel Disease (IBD)

Treg suprimem adoena,diminuindo apopulaode clulasTresp atravsdeummecanismo apoptticodependentedeBim

5. ConclusoGeral
AsclulasT induzemaapoptosedeclulasTefectorasactivadas As clulas Treg induzem a apoptose de clulas T efectoras activadas invitro,emvezdesuprimiremaactivaoinicialeaproliferao AsclulasTreg promovemamortedasclulasTresp porum mecanismocombasesmolecularessemelhantessdaApoptose induzidaporprivaodecitocinas Treg competempeloconsumodecitocinas,diminuindoproliferao tambmsupressodaproduotardiadecitocinaspelasTresp In vivo,Treg suprimemIBD,diminuindoapopulaodeclulasTresp atravsdeummecanismoapoptticodependentedeBim atravs de um mecanismo apopttico dependente de Bim

6. Bibligrafia
Pushpa Pandiyan Lixin Zheng Satoru Ishihara Jennifer Reed & Michael J Pandiyan, Zheng, Ishihara, Lenardo (2007). CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells induce cytokine deprivationmediated apoptosis of effector CD4+ T cells. Nature Immunology 8(12):1353 1362 8(12):13531362 Pushpa Pandiyan, Lixin Zheng, Satoru Ishihara, Jennifer Reed & Michael J ( ) p g y y Lenardo (2007). CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells induce cytokine deprivationmediated apoptosis of effector CD4+ T cells. Nature Immunology 8(12): supplementary online material Hamilton K, Clair EW (2000). Tumour necrosis factoralpha blockade: a new era for effective management of rheumatoid arthritis. Expert Opin Pharmacother. 1(5):104152