PROTEASAS ALCALINAS

I INTRODUCCIN Metabolismo de produccin de la proteasa Principio de accin II ESTUDIO DE MERCADO 2.1 Mercado Nacional e internacional 2.2 Competidores 2.3 Producto en el mercado 2.3.1 Presentaciones comerciales 2.3.2 Caracteristicas principales 2,3.3 Especificaciones 2.4 Comercializacin y Distribucin III INVESTIGACIN Y DESARROLLO 3.1 Materias primas 3.1.1 Cepa Seleccin secundaria y mejoramiento de cepas 3.1.2 Medios de produccin 3.2 Mtodo de fermentacin 3.2 Diagrama de flujo del proceso 3.4 Legislacin IV PRODUCCIN 4.1 Localizacin de la planta 4.2 Distribucin de la planta 4.3 Control de puntos crticos y efluentes 4.4 Diseo y presentacin comercial 4.4.1 Diseo del envase 4.4.2 Diseo del empaque 4.4.3 Etiquetas 4.5 Normas de calidad de la Empresa 4.5.1 Aplicadas a la materia prima 4.5.2 Aplicadas al proceso 4.5.3 Aplicadas al producto terminado 4.5.4 Aplicadas al personal V CALIDAD 5.1 Servicios en el laboratorio de pruebas 5.2 Instrumentos bsicos en el laboratorio de pruebas 5.3 Materiales y reactivos en el laboratorio de pruebas 5.4 Programa bsico de mantenimiento de equipo e instrumentos

5,5 Formas para el control de la calidad 5.6 Programa de auditorias de calidad VI SERVICIOS 6.1 Comunicacin de los clientes 6.2 Diseo de la propaganda y la monografa 6.3 Garanta de calidad 6.4 Orden de compra REFERENCIAS

I INTRODUCCIN Las proteasas alcalinas son enzimas capaces de hidrolizar protenas en medios cuyo pH >> 7, por lo que son ideales para su utilizacin en detergentes , este tipo de enzimas son producidas por varias bacterias Gram + siendo el genero Bacillus el mas utilizado para la produccin industrial , debido principalmente a su capacidad para excretarlas al medio de cultivo, de donde resulta fcil obtenerlas al evitarse el trabajo de tener que reventar las clulas para liberar la enzima. Los dos tipos de proteasas presentes en mayor medida en cultivos de Bacillus son las proteasas alcalinas o serinproteasas, (debido a la presencia de serina en el sitio activo de la enzima), y las proteasas neutras o metaloproteasas. Por lo mismo las cepas de Bacillus subtilis pueden clasificarse en cuatro tipos segn el tipo de proteasas que producen: - El primer tipo: produce una gran cantidad de proteasas neutras, solo siendo capas de producir proteasas alcalinas despus de mucho tiempo, desapareciendo gradualmente y en paralelo la produccin de proteasas neutras, siendo por lo tanto baja la produccin de proteasas alcalinas . - El segundo tipo: Produce ambos tipos de proteasas al mismo tiempo, pero la actividad enzimatica disminuye muy rpidamente debido al efecto que cada proteasa causa sobre la otra

. - El tercer tipo: produce nicamente proteasas alcalinas . - El cuarto tipo: produce nicamente proteasas neutras

La alcalin-serin-proteasa excretada por Bacillus subtilis, tambin llamada subtilisin, es una de las enzimas mas estudiadas de ah que sus genes hallan sido clonados repetidas veces, causndole diferentes delaciones para determinar su efecto, de estos estudios se ha podido determinar que subtilisin no se trata de una enzima esencial y que su ausencia no afecta ni el crecimiento ni la especulacin de Bacillus, en general se puede decir que esto se cumple para todas las proteasas producidas por Bacillus. En la figura 1 se muestra el mapa gentico de las proteasas alcalinas de B. subtilis , que como se observa se trata de un plasmido Metabolismo de produccin de la proteasa La va metablica usada para la produccin de proteasas es la misma que la usada para la produccin del resto de las enzimas: ADN ARNm Proteasa

As que la forma general para inducir la produccin de proteasas alcalinas es: * Mantenimiento del medio de cultivo a un pH > 7 * Medio de cultivo con protenas como nica fuente de carbono para inducir la expresin de los genes encargados de la degradacin de protenas

* Evitar que el medio contenga glucosa u otras azucares ( o en caso de contener las concentraciones deben de ser muy bajas), ya que los genes de inters son susceptibles a represin catablica.

Principio de accin
Como dijimos anteriormente las proteasas alcalinas hidrolizan los enlaces peptidico de las protenas, con lo cual convierten una molcula grande- como lo es una protena- en muchas molculas de menor tamao, facilitando con ello la formacin de la esfera de solvetacin en torno a ellas y por lo tanto su arrastre, logrndose que con menor cantidad de detergente sea retirada mayor cantidad de materia orgnica, con esta misma finalidad se agregan tambin lipasas a los detergentes

II ESTUDIO DE MERCADO 2.1 Mercado Nacional e internacional

En terminos generales todas aquellas compaias productoras de biodetergentes son consumidores de enzimas tales como las proteasas y las lipasas alcalinas

2.2 Competidores
La unica empresa en el pais que produce proteasas alcalinas se encuentra ubicada en toluca

2.3 Producto en el mercado

Por las mismas caracteristicas del producto la forma de expendido hacia el mercado es obligatoriamente al mayoreo ya que en se trata de una materia prima para la industria de los detergentes mas que de un producto final de venta directa, por lo mismo las formas en la cual se podria adquirir es hasblando directamente a la empresa o mediante el uso de internet como le

hacen algunas otras empresas internacionales que ofrecen este tipo de bioproductos

2.3.1 Presentaciones comerciales

Como se sealo con anterioridad solo podra adquirise al mayoreo por lo cual se expenderan en tambos de 50 kg c/u

2.3.2 Caracteristicas principales

Se trata de una enzima con las siguientes propiedades: 1) Accin: degradadora de protenas y peptidos; (2) pH optimo: valores de pH de 8.5 a 9; (3) pH estabilidad: en rangos de pH de 5.5 a 10.5, las enzimas probaron ser completamente estables; (4) temperatura optima: aproximadamente 50.. C.;

2,3.3 Especificaciones
1) Se trata de un polvo blanco fino 2) Por su misma actividad deve de evitarse cualquier contacto directo con la piel 3) En caso de hacer contacto lavar inmediatamente con grandes cantidades de agua

2.4 Comercializacin y Distribucin

Se hara la comercializacion pricipalmente en base a la pagina web en internet, la guia amarilla y tambien de forma muy importante mandando folletos promocionales ha nuestros posibles consumidores es diecir a todas aquellas compaias productoras de detergentes, siendo una comercializacin de tipo productor-empresario y de manera secundaria se utilizaria la comerzializacin de productor-distribuidor- emprezario, la distribucin seria principalmente por via terrestre en trailes equipados para poder atender a una contingencia en caso de que alguno de los tambos se derramase

III INVESTIGACIN Y DESARROLLO 3.1 Materias primas 3.1.1 Cepa

Aislamiento Primario Organismo Habitad de donde aislarlo Suelo, Agua pH optimo 10.310.7 7.8-10 Medio de cultivo y aislamiento primario Agar nutritivo

B. subtilis

B. alcalaphilus Suelo enriquecido con pH 10

Parte A.- peptona 5; ext. de levadura 5; KH2PO4 10 ; MgSO4 7H2O 0.2 H2O destilada 900ml Parte B.-Na2CO310H2O 20; H2O destilada 100ml despus de esterilizar A+B PH final 10.5

B. licheniformis B. firmus

Suelo Suelo

6.5-10 10

Agar nutritivo Agar nutritivo

Seleccin secundaria y mejoramiento de cepas

Como sabemos la seleccin secundaria se realiza con la finalidad de obtener aquellas cepas que cubran de manera mas amplia nuestras necesidades, en el caso de las proteasas alcalinas existen dos aspectos fundamentales que deben cubrir las cepas, para que puedan ser utilizadas industrialmente 1.- Que la enzima sea activa y estable en medios que contengan tenso activos 2.- Que el m.o. produzca suficiente proteasa como para poder ser explotado Para cumplir lo anterior se ha utilizado diversos mtodos que van desde aquellos puramente fsicos, hasta la insercin de plasmidos y vectores de otras especies. Por ejemplo : para lograr el aislamiento de cepas con la capacidad de producir enzimas con mayor estabilidad se suelen crecer aquellas cepas que presentaron capacidad proteolitica en medios que contienen como agentes de seleccin jabn o detergente, realizando de esta forma el aislamiento secundario de nuestra cepa. Con este mtodo se obtuvieron dos proteasas alcalinas de Bacillus pumilus DSM 5777 una alcalina Bacillus proteasa que presenta las siguientes propiedades: (1) Accin: degradadora de protenas y peptidos;

(2) pH optimo: valores de pH de 10.5 a 11.0 aproximadamente ; (3)pH estabilidad: en rangos de pH de 9.7 a 10.8, las enzimas probaron ser completamente estables; (4) temperatura optima: aproximadamente 60. C.; Y otra proteasa presento las siguientes propiedades 1) Accin: degradadora de protenas y peptidos; (2) pH optimo: valores de pH de 8.5 a 9; (3) pH estabilidad: en rangos de pH de 5.5 a 10.5, las enzimas probaron ser completamente estables; (4) temperatura optima: aproximadamente 50.. C. Por su importancia econmica tambin se han enfocado esfuerzos para obtener cepas mutadas capaces de sobreproducir la enzima deseada, uno de tales esfuerzos fue realizado por J. P. Aubert, R Longin y Ston J. Millet quienes encontraron una cepa incapaz de esporular pero que posee la misma capacidad proteoltica que la cepa nativa, el mtodo diseado por ellos se basa en el echo de que las cepas de Bacillus subtilis que no esporulan no son resistentes a la exposicin de los vapores del cloroformo, el mtodo consisti en lo siguiente: A) Primeramente las esporas de Bacillus subtilis son suspendidas por 10 minutos a 70 C , seguidamente son germinadas en medio Difco en presencia de cloranfenicol (100 Qg/ml), el cultivo es incubado 48 horas a 39C para finalmente ser tratado con N-metil-nitro-Nnitrosoguanadina (50 Qg/ml) como agente mutagenico B) Se sembr una serie en cajas petri con medio Difco

C) Se sembr otra serie la cual se expuso por 45 minutos a los vapores del cloroformo a temperatura ambiente D) Ambas series son incubadas por 24 horas a 37C F) Se comparan los platos homlogos y se observa crecimiento Despus de medir actividad proteoltica los investigadores encontraron 3 cepas mutantes incapaces de esporular una de las cuales tenia la misma actividad proteoltica que la cepa original, esta cepa fue almacenada en el Instituto Pasteur en Pars con el numero de identificacin 71-1-001 La importancia de esta cepa es que las proteasas alcalinas junto con otras enzimas que son secretadas al medio son producidas cuando el microorganismo se encuentra en la fase exponencial del crecimiento y empiezan a disminuir despus de llegar a un mximo, lo cual sucede poco despus de que el m.o. llega a su fase de crecimiento estable, despus de la cual el m.o. comenzara a esporular por tanto de esta forma se induce a que el microorganismo se mantenga en la fase de produccin de exoenzimas Despues de investigar ampliamente la literatura la cepa que resulto ser mas atractiva para nuestros propositos fue Bacillus pumilus DSM 5777 que da un rendimiento del 90% Especie Fuente de Carbono Glucosa Ys g/mol 81.3 Tiempo de generacin 45.5-68.7min O2 p/cell*h x 10 g 16.1-47.8 O2 p/generacion x10 g 18.0-46.5

B. subtilis

3.1.2 Medios de produccin

Ingrediente Concentracin (g/l)

Medio A Almidn hidrolizado Aceite de Soya Caseina Na2HPO4 50 20 20 3.3

Medio B Almidn hidrolizado Lactosa Aceite de semillas algodn Extracto de levadura Protena de soya K2HPO4 MgSO47H2O Trazas de metales 7.2 3.65 4.3 1,25 de 150 4.3 30

Medio C Cebada Aceite de soya para ajustar pH (9-10) 100 30 Na2CO3

3.2 Mtodo de fermentacin

Uno de los mtodos utilizados para la produccin industrial de las proteasas alcalinas es el conocido como de alimentacin semi-continua, esta alimentacin de nutrientes y sales es regulada en funcin al pH que debe de ser estrictamente controlado para conseguir una mejor productividad y de la etapa en la cual se encuentre el desarrollo de la cintica microbiana, suministrndose nutriente solamente en la etapa de crecimiento exponencial que es en la que se producen la proteasas alcalinas y donde se observan los mayores rendimientos para la obtencin de la misma, esta alimentacin tambin debe de ser muy controlada ya que la concentracin de glucosa en el caldo de cultivo no debe de exceder de 0.43 g/l pues de lo contrario la produccin de nuestro metabolito de inters ( proteasa alcalinas) se ve disminuida al entrar en accin los sistemas de represin catabolica. Otra sugerencia es que en vez de usar harina de soya se use sulfato de amonio como nica fuente de nitrgeno, con la finalidad de eliminar olores desagradables causados por la presencia de compuestos orgnicos nitrogenados en el medio. Este metodo de alimentacin semi-continua resulta 50% mejor que el mtodo de fermentacin por lote

3.2 Diagrama de flujo del proceso 3.4 Legislacin

Por las mismas caractersticas del producto no existe ni a nivel nacional ni a nivel internacional normatividad con respecto al mismo, pero a nivel general podemos decir que: a) Por las condiciones extremas en las cuales es llevada a cabo la fermentacin ph> 10, protena como nica fuente de carbono, T de 50 C, no es necesario llevar a cabo la fermentacin en condiciones estrictas de esterilidad ya que solamente crecern en ese medio m.o. capaces de producir proteasas alcalinas termoestables, mientras para todas las dems clases de m.o. las condiciones de crecimiento son insostenibles b) Las pruebas de actividad se llevan a cabo en medio que contienen caseina y productos tensoactivos tpicos de los detergentes como el tri sulfato de amonio, en estas condiciones y a temperaturas de 25 a 70C se determina la actividad de la enzima midindose la cantidad de protena degradada en un tiempo estandar de 5min para lo cual se utilizan pruebas colorimetricas. c) Los operarios en general debern de vestir oberoles especiales y caretas, que impidan el contacto de las proteasas con la piel, estos no sern muy necesarios en la zona de fermentaciones, pero en las zonas de purificacin, extraccin y empaque sern obligatorias d) Como medida de bioseguridad hacia el ambiente se tendr instalado en estas zonas filtros de aire que se encarguen de filtrar el aire que es expulsado, pensando en lo mismo se tendr presin negativa con la finalidad de evitar que las proteasas salgan y daen el ambiente e) Las aguas residuales sern tratadas para desnaturalizar las proteasas que puedan quedar en el agua y as evitar contaminar los afluentes

IV PRODUCCIN 4.1 Localizacin de la planta

Macrolocalizacin: Veracruz Microlocalizacin: Crdoba

4.2 Distribucin de la planta 4.3 Control de puntos crticos y efluentes

Punto critico Parte del proceso

- Concentracin de glucosa < 0.43 g/l - Mantenimiento del pH en 10

Preparacin de medios Fermentacin

- Mantenimiento de la temperatura a 60C Fermentacin - Concentracin de glucosa < 0.43 g/l - Concentracin de proteasas < 2 U/l Fermentacin Efluentes de desecho

4.4 Diseo y presentacin comercial

4.4.1 Diseo del envase

El envase tendr las siguientes caractersticas: * Tambos de latn forrados de cartn * Dimetro de la base de 50 cm * 75 cm de Altura

4.4.2 Diseo del

empaque

-Los tambos sern empacados en bolsas de plstico - La tapa de los mismos se encontraran selladas con cinta plstica para evitar posibles derrames

4.4.3 Etiquetas
Las etiquetas contendran informacin tales como - Caractersticas del producto - Especificaciones del producto - Pureza y Peso del producto al envasado - Formulacin del Detergente La formulacin tpica de un detergente puede contener, en relacin a su peso seco 1. Minimamente el 5% de su peso, siendo lo mas comn de un 10 a un 50% de su peso , del surfactante o la mezcla de surfactantes

2.Por arriba del 40% en peso de base 3.Por arriba del 40% en peso de blanqueador, preferiblemente un perborante como perborato de sodio tetrahidratado o perborato de sodio monohidratado, 4.Por arriba de 3% en peso de proteasa 5.Constituyentes adicionales como ajustadores, etc., para hacer el 100% en peso.

4.5 Normas de calidad de la Empresa 4.5.1 Aplicadas a la materia prima

- Concentracin de sacaridos < 0.43 g/ kg - Se le harn pruebas de viabilidad a la cepa antes de inocular el bioreactor - El agua utilizada en el proceso deber de ser destilada

4.5.2 Aplicadas al proceso

- Se deber tener sumo cuidado para evitar fugas de cualquier tipo - El proceso ser monitoreado de continuo mediante sensores acoplados a un sistema de control automatizado - Las reas de extraccin y purificacin contaran con presin negativa y filtro de aire que eviten que las proteasas puedan contaminar el exterior de la planta

4.5.3 Aplicadas al producto terminado

- Se almacenara en tambos sellados listos para su entrega - El almacenamiento ser en un lugar seco con temperatura y presin controlada

4.5.4 Aplicadas al personal

- El personal deber portar equipo protector especial para evitar que su piel o vas mucosa tengan contacto con las proteasas ya que estas son enzimas altamente irritantes - Por las mismas razones no se permitir comer en el interior de la zona de produccin

V CALIDAD 5.1 Servicios en el laboratorio de pruebas

- Tomas de electricidad que estn conectadas a la planta auxiliar - Tomas de gas adaptadas para ser conectadas a mecheros - Tomas de agua normal y destilada - Temperatura controlada a 25 C - Humedad controlada - Aire filtrado - Sistema de presin negativa

5.2 Instrumentos bsicos en el laboratorio de pruebas

- Campana de esterilidad - Autoclave para esterilizacin en hmedo - Horno para esterilizado en seco - Horno para incubacin de muestras - Horno de microondas - Centrifuga con control de temperaturas - Espectrofotometro - Plataformas de agitacin - Balanza analtica - Fermentador de 5 litros

5.3 Materiales y reactivos en el laboratorio de pruebas

- Matraces y vasos de precipitados de diferentes capacidades - Pinzas, tijeras, asas bacteriolgicas, mecheros - Plumones indelebles y cinta masking - Cajas petri - Probetas , gradillas, pipetas y pipeteros - Diversos tubos de ensaye

- Agar bacteriolgico, nutritivo y PDA - Peptona de caseina y de soya - cido sulfrico, clorhdrico - Todos los necesarios para realizar las pruebas colorimetricas - Algodn, gasa , papel peridico y papel higinico

5.4 Programa instrumentos

bsico

de

mantenimiento

de

equipo

El mantenimiento continuo ser de tal forma que dia con dia se mantenga en lo mximo posible las condiciones de sanitidad en la planta, lavndose y esterilizndose los bioreactores y las lineas de alimentacin cada vez que sean desocupados Se realizara mantenimiento preventivo , haciendo una revisin rotatoria de equipos cada semana, se procurara ir cambiando aquellas lineas que lleven en servicio mas de 5 aos o de ser necesario antes si muestran signo de corrosin y desgaste. Con lo anterior se pretende no tener que llegar a hacer mantenimiento de tipo correctivo ya que este a la larga resulta ser mas caro y poco funcional

5,5 Formas para el control de la calidad

Mediante el uso de sistemas computarizados y automatizados de control se llevara una bitcora dia a dia de como va avanzando la fermentacin en los diferentes reactores y en los dems procesos, dicha bitcora ser almacenada tanto en la memoria principal de la computadora como en disquets que servirn de respaldo

5.6 Programa de auditorias de calidad

Se realizaran histogramas donde se muestre la calidad del producto y del sistema fermentativo etapa por etapa para cada una de las fermentaciones para que en el caso de que alguna se salga de los limites de control tomar medidas.

VI SERVICIOS 6.1 Comunicacin de los clientes

Esta ser de forma directa o mediante el uso de internet o va telefnica ya sea con el departamento de compras y ventas o con el encargado de relaciones publicas dependiendo del asunto a tratar

6.2 Diseo de la propaganda y la monografa

Este ser realizado mediante los servicios de una compaa especializada en diseo grfico lo mismo la monografa que contendra ademas del logotipo elegido las especificaciones del producto la forma de accin y sus ventajas para el uso industrial

6.3 Garanta de calidad

Despus de realizar las pruebas de estabilidad se expender una garanta de calidad que abarque el tiempo en el cual la mitad de la actividad de la enzima se pierde por las condiciones en las cuales se encuentra sometida

6.4 Orden de compra

Esta ser va internet o mediante va telefnica

REFERENCIAS

- " Bacillus subtilis and another Gram + bacteria " , Cap. 63 Proteasas Janice Pero, Alan Sloma 1993 - " Industrial Enzymes - Recent Advances " Noyes pp 216-226 ed 1977 - " The Prokaryotes " cap 76 The genus Bacillus-Nonmedical R. Slepecky, H. E. Hemphill pp. 1664-1671 A.

- " Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook " Bernard Atkinson, Ferda Mavituna Ed. Stockton press 1987 pp 1147-1153 - "High production ol protease alkaline by B. licheniformis in a fed-batch fermentation using a synthetic medium" Weiying Mao, Renrui Pan, David Freedman Journal of industrial Microbiology, 11 (1992) pp. 1-6 Ed Elsevier

J.P. Euzby : Dictionnaire de bactriologie vtrinaire http://www-sv.cict.fr/bacterio/bacdico/bb/bacillus.html PATN Patent Bibliographic Information WKU Patent Number: 05346822 TTL Title of Invention: "Alkaline proteases from Bacillus pumilus" Inventor Name:Vetter; Roman, Wilke; Detlef, Moeller; Bernhard, Mueller; Martina CTY Inventor City: Burgdorf, Wennigsen, Hannover CNT Inventor Country: DEX http://www.nal.usda.gov/bic/Biotech_Patents/1994patents/05346822.html