Version 02

METHODES D’ANALYSES - EAUX

ISOLEMENT DES PSEUDOMONAS SUR KING PCS04-LC-IT-05.05.071
AGAR
SABC Date de première mise en application : 01/04/2005 Page 1 sur 2

1. Objet

Différentiation de Pseudomonas aeruginosa développés sur Pseudomonas Isolation Agar par la

mise en évidence de la production de pigments spécifiques.

2. Domaine d’application

Toutes colonies suspectes de Pseudomonas aeruginosa développés sur Pseudomonas Isolation

Agar.

3. Principe

Repiquage des colonies suspectes par étalement sur un milieu de sélectivité restreinte constitué
essentiellement de :
 Ions inorganiques sur King A qui favorisent la production de la pyocanine (couleur bleu vert).
 Teneur élevée en phosphate sur King B qui favorise la production de la pyoverdine (couleur
jaune vert fluorescent à 366 nm).

4. Références

4.1. Cd-rom de microbiologie de MERCK, édition de 2000

4.2. http://arachosia.univ-lille2.fr/recherche/labos/Bacteriologie/photos/index.php
4.3. http://www2.ac-lyon.fr/enseigne/biotech/microbio/Milieu_culture/KING.htm

5. Responsabilités

L’opérateur est responsable du strict respect de l’application du protocole qui suit.

6. Fréquence

Pour confirmation de toute(s) colonie(s) suspecte(s) de coliformes.

7. Réactifs

7.1. Milieux King A et King B.

7.2. Alcool dénaturé 70%
7.3. Eau oxygénée 10 volumes
7.4. Ensemble pour coloration Gram
7.5. Huile à immersion.
7.6. Solution de KOH à 3% P/V
7.7. Chloroforme

8. Appareillage

8.1. Microscope.
8.2. Etuve réglée à 37°C (± 1°C)
8.3. Lames porte-objet
8.4. Lamelles couvre objet
8.5. Loupe
8.6. Tubes à vis stériles
8.7. Bec de Bunsen
8.8. Coton hydrophile
8.9. Anse de platine
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ISOLEMENT DES PSEUDOMONAS SUR KING PCS04-LC-IT-05.05.071
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9. Préparation des échantillons

9.1. Couler les milieux de culture dans les tubes stériles de manière inclinée suivant la
procédure PCS04-LC-IT-05.04.050

9.2. Laisser les réactifs et les colonies à identifier à température ambiante (18-25°C) avant
utilisation.

10. Mode opératoire

10.1. Prélever la colonie à examiner à l’aide d’une anse de platine préalablement stérilisée à la
flamme et refroidie.

10.2. Ensemencer abondamment la surface par stries serrées.

10.3. Incuber à 37°C pendant 1 semaine.

10.4. Verser 2 ml de chloroforme dans le milieu King A et agiter pour extraire la pyocyanine.
L’essai est positif lorsque la couche chloroformique est colorée en bleu.

11. Expression des résultats :

Les Pseudomonas aeruginosa donneront sur les milieux King A et B les aspects des schémas 2
et/ou 3

Aspect du milieu King A King B King A King B

avant utilisation Production de Production de la Pyocyanine - Pyoverdine-
la pyocyanine pyoverdine

12. Notes

En cas de doute persistant poursuivre l’isolement sur les Galeries API 20 NE de Bio Mérieux.

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