Rompimiento Celular

Separacin y Procesos Biotecnolgicos

Caldo de Fermentacin
Con Clulas

Protenas Intracelular

Separacin de Clulas

Rompimiento Celular

Clulas inmovilizadas Clulas retenidas Sobrenadante

Sin Clulas

Separacin Material Intracelular

Precipitacin cidos Nucleicos, Proteasas

Tratamiento de cuerpos incluidos Concentracin

Purificacin Alta Resolucin

Refinamiento

Permite Altos niveles de pureza Estabilidad del producto

Cundo se usa?

ROMPIMIENTO DE CLULAS ( Cell Disruption)

Los procesos de bio-separacin se inician con una separacin de la biomasa desde el resto del cultivo. En muchos casos los productos se encuentran en el medio. En estos casos la biomasa se descarta y hasta se puede vender como sub-producto.

Pero en otros casos el producto de inters se encuentra en el interior de las clulas, en particular la mayora de las protenas producidas por manipulacin gentica de bacterias que no segregan las protena al medio, pero que son precipitadas en el interior de la clulas en forma de cuerpos incluidos (inclusion bodies) . Se trata de protenas intracelulares.

Procesos y Equipos La liberacin de las protenas intracelulares involucra la ruptura o permeabilizacin de la pared celular. Los equipos involucrados en esta etapa no han sido diseados especialmente para el rea biotecnolgica sino que son prestadas de otras reas (rea de alimentos, de pinturas y pigmentos). Este rompimiento o permeabilizacin se puede llevar a cabo por dos mtodos: Mtodos No - Mecnicos Mtodos Mecnicos

La seleccin de una u otra tcnica depender las caracter sticas del producto se desea purificar,tales como: Resistencia a: Medios alcalinos Solventes Detergentes Enzimas Temperatura Esfuerzo de corte. La tcnica utilizada determinar el tamao de los desechos que se producirn.

Mtodos Mecnicos

Mtodos Mecnicos El rompimiento se lleva a cabo por accin mecnica, pudiendo ser: Friccin Efecto de la presin Colisiones. Estos mtodos incluyen las operaciones unitarias ultrasonido, homogenizacin , molinos de bolas, etc. de

Estos m todos resultan ser agresivos con las protenas de inters, debido principalmente a la generacin de calor. Adicionalmente, el escalamiento resultan ser un problema significativo.

Mtodos Mecnicos
Tcnicas
Homogenizador de cuchillos Homogenizador alta presin

Principios
Las clulas son rotas en un mezclador
Las clulas son forzadas a pasar a travs de un pequeo orificio lo que produce que se rompan por el esfuerzo de corte

Stress
Moderado

Costos
Moderado

Ejemplos
Rompimiento de tejidos y clulas animales.
Tratamiento a gran escala de suspensin de clulas. Rompimiento de suspensiones de clulas a lo menos en pequea escala

Fuerte

Moderado

Ultrasonificacin

Las clulas son quebradas en una cavidad ultrasnica

Las clulas son rotas por medio de una molienda con abrasivos

Fuerte

Caro

Molienda

Moderado

Barato

Molinos de bolas

Las clulas son trituradas con bodas de acero o vidrio

Fuerte

Barato

Rompimiento a gran escala para suspensiones de clulas y clulas de plantas

Mtodos No-Mecnicos Pueden ser de dos tipos: Agente qumicos Solventes orgnicos Detergentes Alcalis Agua (shock osmtico) Enzimticos se trata de enzimas que permeabilizan en forma selectiva las membranas celulares, tales como lisozima, glucanasas, mananasas, etc. Los mtodos no-mecnicos son fciles de escalar, si uno necesita tratar 10 veces m s materia orgnica basta con adicionar 10 veces m s reactivo qumico o enzimtico.

Mtodos No-mecnicos
Tcnicas
Permeabilizacin Enzimtico

Principios
Permeabilizacin de la pared celular, lo cual produce el rompimiento de la clula

Stress
Suave

Costos
Caro

Ejemplos
Tratamiento de M. lysodeikticus con lisozima.
Ruptura de Clulas de Glbulos Rojos.

Shock Osmtico
Solubilizacin

Ruptura Osm tica de la membrana Disolucin de la membrana celular con detergentes

Solventes orgnicos que disuelve la pared celular y tambin la desestabilizan Solubilizacin de la membrana por saponificacin de los lpidos

Suave
Suave

Barato
Moderadamente Caro

Rompimiento de bacterias con SDS.

Disolucin de Lpidos

Modera do

Barato

Rompimiento de levaduras con tolueno.

Tratamiento con lcalis

Fuerte

Barato

Rompimiento Celular Mtodos Mecnicos

Separacin y Procesos Biotecnolgicos

MTODOS MECNICOS Los mtodos mec nicos se pueden dividir en dos tipos : Mtodos a pequea escala son : Ultrasonificacin Molina con abrasivos Homogenizadores Mtodos a gran escala Homogenizadores Molinos de bolas a alta presin

Ambos son operaciones unitarias t picas de la Ingeniera de Procesos y de la industria de alimentos.

MTODOS MECNICOS Pequea Escala

Desintegracin completa de una clula Para determinar el contenido de protenas total de una clula se debe realizar la desintegracin total de ellas, para ello se utiliza la siguiente metodologa:
1. 2. Se adicionan 1 volumen de bolas de vidrio en un ependorf. Se adiciona 1 volumen de las c lulas a desintegrar (en forma de pasta, previamente
separadas del caldo)

3.

Se adiciona 0.5 volumen de buffer, se puede adicionar algn detergente (SDS,

Triton X-100)

4. 5. 6.

Se agitan fuertemente en un vortex, entre 2 y 5 minutos (controlando que no se caliente) Se repite el punto 4 hasta asegurarse que no se rompen ms las clulas. Se separan los desechos de la solucin y se analiza la concentracin de protenas.

100% Rompimiento

Ultrasonificacin Se utilizan frecuencias de 20 Khz esto produce vibraciones que provocan el fenmeno de cavitacin. Se producen zonas de baja presin en el lquido El lquido se transforma en gas formndose pequeas burbujas Las burbujas colapsan debido a los cambios de presin. Se producen fuertes esfuerzos de corte en el lquido que rompen las clulas.

Ultrasonicador

Molina con abrasivos Procedimiento: 1. Se utilizan un recipiente donde se agrega algn agente abrasivo, como bolas de vidrio. 2. El sistema se hace vibrar lo que produce: Colisiones de las bolas con la biomasa Fuertes esfuerzos de cortes Se produce la ruptura de las clulas. 3. Posteriormente, se separan las bolitas y desechos celulares y se recupera el sobrenadate.

Homogenizadores La idea es generar altos esfuerzos de corte que produzcan la ruptura de las clulas. Los altos esfuerzos de corte se pueden obtener por: 1. Embolos 2. Cuchillas 3. Pistones

mbolos

Cuchillas

Pistones

MTODOS MECNICOS Gran Escala

Homogenizadores a alta presin Son los equipos ms ampliamente usado en el rompimiento celular. Resulta ser un mtodo no selectivo Se componen de: Pistn a alta presin Laboratorio 1-2 Industria Vlvulas La suspensin que se procesa se hace pasar varias veces hasta lograr el nivel de liberacin deseado.

Descripcin

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Mecanismo Las clulas se rompen cuando la suspensin pasa a alta presin por la vlvula de descarga. Las clulas son sometidas a : Turbulencia Cavitacin Fuertes esfuerzos de corte

Parmetros de Diseo 1. 2. 3. 4. 5. Presin de operacin Diseo de la vlvula Localizacin del Producto Temperatura de operacin Nmero de Pasadas

1.- Presin de operacin Condiciones: -A mayor presin mayor liberacin de protenas. -Siempre se trabaja P >30 Mpa -La presin ms usada es 55 MPa

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2.- Tipo de Vlvula

Las vlvulas en forma de Cuchillas provocan mayor turbulencia, lo que implica mayor Rompimiento

3.- Localizacin del Producto Dependiendo donde se encuentre localizado el producto se debern aplicar diferentes condiciones para romper la clula, por ejemplo: Si el producto se encuentra en la membrana, se debe aplicar un menor esfuerzo. Si se encuentra dentro de un organelo, debe ser mayor esfuerzo. 4.- Temperatura La temperatura tiene un doble efecto, dado que ha mayor temperatura: Se reduce la viscosidad, lo cual es positivo para el proceso Pero se puede denaturar el producto SE DEBE BUSCAR UNA TEMPERATURA OPTIMA

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5.- Nmero de Pasadas

A medida que aumenta el nmero de pasadas aumenta la protena liberada.

DISE O DE UN HOMOGENIZADOR A ALTA PRESION La cintica de desintegracin de las clulas es de 1 orden respecto al nmero de pasos

dR = k ( RM R ) dN
R: Producto liberado luego de N pasos. RM: Producto mximo que se podra liberar. N: Nmero de pasos k: Constante cintica f(T,P, tipo de vlvula) Generalmente k = k* P a a= 2.9 Levaduras a= 2.2 E.coli

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Integrando

N =0 N=N

R=0 R=R

ln

RM =kN RM R

La ecuacin de Diseo queda de la forma:

ln

RM = k* P a N RM R

SE DETERMINA EL NUMERO DE PASADAS PARA UN NIVEL DE ROMPIMIENTO DADO

EJEMPLO 1 En la recuperacin de -galactosidasa de E.coli, se hace pasar por un homogenizador de alta presin. La suspensin contiene 47,6 g/l en peso seco. La presin de operacin utilizada fue de 60 MPa. La cantidad de protena liberada despus de cada paso se presenta en la siguiente tabla Paso 1 2 5 10 % Recuperacin 63.0 79.0 96.0 99.9

1. Estime el valor de la constante cintica de rompimiento. 2. Estime el nmero de pasos para liberar el 93% de la enzima.

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ESCALAMIENTO El escalamiento se hace en base al factor que se define como:

Porcentaje de Protena liberada Potencia Consumida

La Potencia consumida se determina como:

Potencia

= F P = N V P

F: Caudal a tratar V: Volumen a tratar por pasada P: Presin

El porcentaje de protena liberada se calcula como:

Porcentaje de Protena Liberada =

Luego =

R *100 = (1 e k P N ) *100 RM
a

(1 e

k Pa N

F P

)*100

Se puede encontrar la presin de operacin ptima que maximiza Q, para un nmero de pasadas dada:

d =0 dP

d 2 <0 dP 2

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EJEMPLO 2 Clulas de Micrococcus son rotas, a 5 C, en un homogenizador Manton-Gaulin que opera a presiones entre 200 y 550 kgf/cm2. Se han realizado experimentos en el equipo obteniendo los diversos porcentajes de liberacin de protenas en funcin del nmero de pasadas. Tabla N2: Porcentaje de Rompimiento de Clulas N Pasadas 200 1 3 5 5 14 22 Presin 300 13.5 33.5 47.5 550 42 83 94.5

Si se necesita liberar el 80% de las clulas indique : Que condiciones de Operacin son ms convenientes: trabajar a una presin de 230 430 (kgf/cm2)? .

Calentamiento Como se por una aumento mediante sealo el proceso de rompimiento celular se produce entrega de energa al sistema, esto provoca un de la temperatura el cual se puede determinar la siguiente relacin:

Potencia
Donde : Densidad Cp: calor especfico D: Aumento de temperatura

= F C p T

Ejemplo 3 Determine el aumento de temperatura si la presin en el homogenizado es de 700 bar, la densidad 1100 kg/m3 y el calor especfico 4000 J/kg K

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