GTSE1 est impliqué dans la

progression du cancer du sein de

manière dépendante de la mutation
p53
Résumé
Avec le développement rapide des techniques de détection à haut débit, les
données Omics liées aux tumeurs sont devenues une source importante
pour étudier le mécanisme de la progression tumorale, y compris le cancer
du sein, l'une des principales tumeurs malignes dans le monde. Une étude
précédente a montré que les phases G2 et S exprimées en phase 1 (GTSE1)
peuvent agir comme un oncogène dans plusieurs cancers
humains. Cependant, ses rôles fonctionnels dans le cancer du sein restent
insaisissables.

Méthode

Dans cette étude, nous avons analysé les données sur le cancer du sein
téléchargées à partir des bases de données The Cancer Genome Atlas (TCGA)
et d'autres bases de données en ligne, notamment les bases de données
Oncomine, bc-GenExMiner et PROGgeneV2, afin d'identifier les molécules
contribuant à la progression du cancer du sein. Les niveaux d'expression de
GTSE1 ont été étudiés par qRT-PCR, immunoblot et IHC. La fonction
biologique de GTSE1 dans la croissance, la migration et l'invasion du cancer
du sein a été examinée dans les lignées cellulaires MDA-MB-231, MDA-MB-
468 et MCF7. Les capacités prolifératives, migratoires et invasives des
cellules in vitro ont été évaluées respectivement par MTS, formation de
colonies et test transwell. Le rôle de GTSE1 dans la croissance et la
métastase du cancer du sein a été révélé par une étude in vivo utilisant des
souris nues BALB/c.
Résultats

Nous avons montré que le niveau d'expression de GTSE1 était régulé

positivement dans les échantillons de cancer du sein et les lignées
cellulaires, en particulier dans les lignées cellulaires de cancer du sein triple
négatif (TNBC) et p53 mutées. Il est important de noter qu'une expression
élevée de GTSE1 était positivement corrélée au grade histologique et à une
faible survie. Nous avons démontré que GTSE1 pouvait favoriser la
croissance des cellules cancéreuses du sein en activant la voie AKT et
améliorer les métastases en régulant la voie de transition épithéliale-
mésenchymateuse (EMT). De plus, il pourrait provoquer une multirésistance
dans les cellules cancéreuses du sein. Fait intéressant, nous avons
découvert que GTSE1 pouvait réguler la fonction de p53 pour modifier la
distribution du cycle cellulaire en fonction de l'état de mutation de p53.

Conclusion

Nos résultats révèlent que GTSE1 a joué un rôle clé dans la progression du
cancer du sein, indiquant que GTSE1 pourrait servir de nouveau
biomarqueur pour aider à l'évaluation du pronostic du cancer du sein.

Arrière plan
Le cancer du sein est l'une des principales tumeurs malignes dans le monde
[ 1 , 2 ]. Il existe des thérapies standardisées accessibles pour les sous-types
Her2 et luminal, mais pour le TNBC, il n'existe pas de méthodes de
traitement standard en raison de son hétérogénéité. [ 3 , 4 , 5 ]. Des progrès
ont été réalisés dans le traitement du cancer du sein au cours des dernières
décennies, cependant sa récidive et ses métastases restent les causes les
plus fréquentes d'échec thérapeutique [ 6 ]. Afin d'éliminer le goulot
d'étranglement du traitement du cancer du sein, des recherches intensives
ont été menées dans ce domaine, mais les facteurs moléculaires moteurs de
la progression tumorale ne sont toujours pas clairs [ 7]. Par conséquent,
l'identification des événements moléculaires clés associés à la transformation
maligne des cellules cancéreuses du sein et à la progression tumorale est
d'une grande importance car elle permettrait le développement de nouvelles
solutions pour le diagnostic, le traitement et l'amélioration de la survie des
patientes.

Le développement rapide des techniques de détection à haut débit a permis

l'accumulation de données Omics liées à la tumeur qui sont d'une grande
importance pour étudier le mécanisme de progression tumorale [ 8 , 9 ]. La
gestion et l'exploitation de grandes quantités de données biologiques sont
devenues importantes dans la recherche sur le cancer [ 10 ]. La base de
données TCGA fournit une grande quantité de données publiques sur les
tumeurs, largement utilisées dans la recherche sur les tumeurs, fournissant
des informations utiles pour la découverte de nouveaux indicateurs
biologiques tumoraux et de cibles médicamenteuses [ 11 , 12]. En tirant
parti de la bio-informatique, des molécules liées à la classification
histologique, à la récidive et aux métastases du cancer du sein ont été
criblées pour découvrir des cibles thérapeutiques potentielles qui pourraient
bénéficier à la survie des patientes atteintes d'un cancer du sein [ 13 ]. En
analysant la base de données publique, GTSE1 a attiré notre attention.

GTSE1 est situé sur le chromosome 22q13.2-q13.3, qui s'exprime

spécifiquement pendant les phases G2 et S du cycle cellulaire
[ 14 ]. Une étude antérieure a identifié que la protéine GTSE1 est
principalement localisée dans le cytoplasme et est associée à l'activité
de la tubuline cytoplasmique et des microtubules au cours de la mitose
[ 15 ]. C'est un régulateur clé du mouvement chromosomique et de
l'intégrité du fuseau pendant la mitose [ 16 ]. De plus, GTSE1 peut agir
comme un facteur de régulation négatif de p53 en s'accumulant dans le
noyau et en se liant à la protéine p53 pour la transporter hors du noyau
pour une dégradation supplémentaire [ 17 , 18 ]. De plus, la
surexpression de GTSE1 peut entraîner un retard dans la transition de
la phase G2 à M [ 19]. D'autres études ont montré que le niveau
d'expression de GTSE1 était régulé positivement dans différents
cancers humains, alors que son expression élevée n'était pas associée
au pronostic du cancer du poumon [ 20 ]. Après traitement avec le
cisplatine, GTSE1 a été régulé positivement dans les cellules de myélome, ce
qui a montré un mécanisme de résistance aux médicaments acquise en
clinique [ 21 ]. GTSE1 s'est avéré surexprimé dans le CHC et pourrait servir
de marqueur de mauvais pronostic, car en plus de réduire la sensibilité des
cellules du CHC au 5-FU, il pourrait également favoriser le comportement
biologique malin du CHC en améliorant sa capacité proliférative et
métastatique et en régulant positivement l'expression des fabricants d'EMT
[ 22 , 23]. De plus, il a conféré au cisplatine une résistance par l'inhibition
de la signalisation apoptotique p53 dans les cellules cancéreuses gastriques
[ 24 ]. GTSE1 s'est avéré être une protéine régulée du cytosquelette
nécessaire pour favoriser la migration cellulaire [ 25 ]. Des études
antérieures ont également rapporté que GTSE1 a été identifié comme une
nouvelle protéine régulatrice YAP/TAZ-TEAD4 qui pourrait favoriser la
métastase dans les cellules cancéreuses du sein lorsqu'elle est surexprimée,
en particulier dans TNBC [ 26 , 27 ]. Cependant, jusqu'à présent, il n'y a pas
eu d'étude détaillée concernant le rôle fonctionnel de GTSE1 dans le cancer
du sein.

Dans la présente étude, nous avons montré que GTSE1 était associé à des
résultats plus mauvais et à un phénotype malin, y compris des capacités
accrues de prolifération tumorale et de métastases dans le cancer du
sein. De plus, GTSE1 a contribué à la multirésistance aux médicaments
dans les cellules cancéreuses du sein. Curieusement, GTSE1 pourrait
réguler la fonction p53 pour modifier la distribution du cycle cellulaire, en
fonction du statut mutationnel de p53. Pris ensemble, nous avons mis en
lumière la fonction de GTSE1 et montré son importance potentielle en tant
que nouveau biomarqueur pour évaluer la progression du cancer du sein.

Méthodes
Analyse de données TCGA et analyse bioinformatique

Les données RNA-Seq des tissus normaux du sein et du cancer du sein ont

été téléchargées à partir de TCGA et analysées pour trouver des gènes
significativement régulés positivement dans les tumeurs du sein en utilisant
la méthode EdgeR. Les gènes candidats ont été identifiés par les conditions
suivantes : (1) les gènes devaient être significativement régulés à la hausse
dans des échantillons de cancer du sein par rapport à des échantillons de
tissu mammaire normal (taux de fausse découverte [FDR] < 5 %) ; (2) la
différence d'expression doit être d'au moins deux fois le changement ; (3) la
direction de l'expression des gènes devait être inversement et
significativement associée à la survie ( P < 0,05). Des analyses de survie des
gènes candidats ont été effectuées à l'aide des deux bases de données en
ligne, à savoir bc-GenExMiner et PROGgeneV2, afin de déterminer la
signification pronostique du niveau d'expression de l'ARNm de GTSE1 et
d'effectuer une analyse bioinformatique plus poussée.

Lignées cellulaires et culture cellulaire

Les cellules HCC38, MDA-MB-468, MDA-MB-231, MCF7, MCF10A ont été

achetées auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC). Les cellules
HCC38 ont été cultivées dans du milieu RPMI 1640 (GIBCO, C11875500BT)
additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (FBS). Les cellules MCF10A ont été
cultivées dans du milieu RPMI 1640 additionné de sérum de cheval (5%),
d'insuline (10μg/mL) et de facteur de croissance épidermique (20 ng/mL),
d'hydrocortisone (0,5μg/mL). Les cellules MCF7, MDA-MB-231 et MDA-MB-
468 ont été cultivées dans le milieu d'Eagle modifié de Dulbecco (GIBCO,
C11995500BT) additionné de 10 % de FBS à 37 °C et de 5 % de CO2, 100
unités par mL de pénicilline (MDbio, P003- 10 g) et 100 mg/mL de
streptomycine (MDbio, S007-25 g).

Réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel

Le réactif Trizol (Invitrogen) a été utilisé pour extraire l'ARN total des lignées
cellulaires cultivées, qui a ensuite été appliqué à la transcription inverse à
l'aide d'un kit de synthèse d'ADNc (ThermoFisher, EP0441). La qRT PCR a
été réalisée à l'aide d'un UNICONTM qPCR SYBR® Green Master Mix
(YEASEN, 11198ES08). Les données d'expression ont été standardisées sur
le gène de référence GAPDH afin de contrôler la variabilité des niveaux
d'expression et calculées comme 2 - [(CT des gènes candidats) - (CT de GAPDH)] , où CT représente
le cycle seuil pour chaque transcrit. La moyenne pour chaque gène et
échantillon a été calculée et les expériences ont été répétées
indépendamment trois fois. Les amorces utilisées sont répertoriées dans le
Fichier complémentaire 1 : Tableau S1.

Western blot

Western blot a été réalisé selon le protocole standard. Les anticorps

primaires, y compris GTSE1(Proteintech, 21,319–1-AP), Ki67(Proteintech,
27,309–1-AP),mutant p53(Abcam, ab32049), p53(Proteintech, 10,442–1-
AP),Cyclin D1(Proteintech , 60,186–1-Ig),Cycline E1(Proteintech, 11,554–1-
AP), p21(Proteintech,60,214–1-Ig), E-Cadhérine (Proteintech, 20,874–1-AP),
Desmoplakine (Proteintech,25,318– 1-AP), N-Cadhérine (Proteintech, 22
018–1-AP), Vimentine (Proteintech, 10 366–1-AP), Nanog (Proteintech, 14
295–1-AP), ABCG2 (CST, 42078S), TAZ (CST , 4883S), YAP (CST, 14074S),
ERK1/2(Affinité, AF0155), phospho-ERK1/2(Affinité, AF1015), AKT (CST,
2938S), Phospho-Akt (Thr308) (CST, 13038S), Phospho-Akt (Ser473) (CST,
X4060S), FoxC2(CST, 12974S),Slug (CST, 9585 T),Twist1(CST,
46702S),Snail (Proteintech, MG-3879 T) et GAPDH (Proteintech, 60,

Matériel clinique

Nous avons obtenu 16 tissus mammaires non cancéreux et 37 tissus de

cancer du sein primaire du Département du cancer du sein, au Centre de
cancérologie de l'Université Sun Yat-sen (Guangzhou, République populaire
de Chine) pour étudier les niveaux d'expression de l'ARNm de GTSE1. Un
total de 154 tissus de cancer du sein primitif inclus en paraffine ont été
obtenus de patientes avec consentement éclairé qui ont subi une
intervention chirurgicale pour un cancer du sein primitif au Sun Yat-Sen
University Cancer Center entre 2003.04 et 2011.12, avec l'approbation de
l'Institutional Clinical Ethics Review Board of Centre de cancérologie de
l'Université Sun Yat-Sen (numéro d'approbation IRB GZR2019-101). Le score
immuno-histochimique (IHC) était composé d'un score pour le pourcentage
de cellules tumorales positives et le degré d'intensité de coloration. Le
pourcentage de cellules positives a été classé comme suit : 0–5 % de cellules
colorées = 0, 6–25 % = 1, 26–50 % = 2, 50–75 % = 3 et 76–100 % = 4. Le
score d'intensité des cellules positives contenait l'intensité de la coloration
cytoplasmique et du noyau. L'intensité de la coloration a été classée dans les
quatre grades suivants : aucune coloration = 0, faible coloration = 1,
coloration modérée = 2 et forte coloration = 3. Ensuite, nous avons multiplié
la proportion positive avec l'intensité pour produire un score total qui variait
de 0 à 12. Nous puis utilisé les données de suivi de 154 cas de cancer du
sein (TNBC,n  = 90, non-TNBC, n  = 64) pour une analyse de survie plus
approfondie après coloration immunohistochimique (IHC) pour GTSE1.

Transfection de petits ARN interférents

Les siARN et le petit ARN interférent (NC) de contrôle négatif ont été achetés
auprès de GenePharma (séquences présentées dans le fichier
supplémentaire  1 : tableau S2). Des transfections transitoires ont été
réalisées dans un milieu sans antibiotique en utilisant le réactif
Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, 13 778 150) en suivant le protocole du
fabricant. Le silençage de GTSE1 a été réalisé en transfectant les siARN dans
les lignées cellulaires MDA-MB-231 et MDA-MB-468 pendant 48 h.

Transfection et transduction de lentivirus

Pour établir des lignées cellulaires stables knockdown GTSE1, les plasmides
humains GTSE1 'SureSilencing shRNA' ont été achetés auprès de
GeneCopoeia (séquences présentées dans le fichier supplémentaire 1 :
tableau S3). Les lentivirus ont été produits en co-transfectant des cellules T
293 avec le shRNA GTSE1 ou le plasmide shRNA contrôle négatif avec des
plasmides d'emballage à l'aide du kit d'emballage d'expression du VIH Lenti-
Pac (GeneCopoeia, LT003). Après transfection pendant 48 h, les lentivirus
infectieux ont été récoltés à travers un filtre 0,45 (Millipore, SG079) avant de
les utiliser pour infecter les cellules MDA-MB-231. Puis les cellules infectées
ont été criblées avec 1 µg/mL de puromycine (MPbio, 219,453,925) pendant
7 jours. Pour produire des cellules MDA-MB-231 et MCF7 avec une
surexpression stable de GTSE1 (séquences présentées dans le fichier
supplémentaire 1: Tableau S4), le GTSE1 humain complet a été cloné dans
un vecteur lentiviral. L'efficacité de l'inactivation et de la surexpression de
GTSE1 a été déterminée par immunotransfert.

Test MTS et test de formation de colonies

Les courbes de croissance cellulaire ont été tracées à l'aide du logiciel

GraphPad sur la base des données obtenues à partir des tests MTS, qui
utilisaient le kit Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay
(Promega, G3581) pour détecter la viabilité et la croissance des cellules
cancéreuses. En bref, une concentration de 1000 cellules/200 μL de milieu
de mélange a été ensemencée dans une plaque 96 puits (jet, TCP011096) et
cultivée dans des conditions normales pendant 7 jours et testée MTS tous
les jours. À chaque instant correspondant après l'ensemencement, nous
avons incubé des cellules avec 200 μL du mélange de MTS et de DMEM
(1:10) pendant 2,5 h, et ajusté l'absorbance à 490 nm pour détecter sa
viabilité avec un lecteur de recherche de microplaques (Bio-Tek EPOCH2,
Amérique). Afin d'effectuer le test de formation de colonies, 1000 cellules/2
ml ont été ensemencées dans une plaque à 6 puits (jet, TCP011006) et le
milieu de culture a été changé deux fois par semaine. Deux semaines plus
tard, le nombre de colonies a été calculé après avoir lavé ces cellules avec
une solution saline tamponnée au phosphate 1X (MP, 92810307), les avoir
fixées avec du méthanol pendant 20 min et colorées avec du cristal violet à 2
% pendant 30 min. Ces expériences ont été répétées trois fois
indépendamment.

Analyse de la motilité cellulaire

La motilité cellulaire a été déterminée en utilisant les tests de transpuits et
de cicatrisation. Des tests de migration ont été effectués en utilisant des
chambres sans Matrigel (Falcon, 353 097) et des tests d'invasion ont été
effectués avec la chambre d'invasion Matrigel (Corning, 354 480) sur la base
du protocole du fabricant. En bref, des cellules dans 200 μL de milieu sans
sérum ont été ensemencées dans la chambre supérieure et laissées migrer
ou envahir de l'autre côté de la membrane. Après 48 h, les chambres ont été
colorées avec du cristal violet. Les images ont été capturées à partir de
chaque membrane à l'aide du logiciel ImageJ pour compter le nombre de
cellules métastatiques. Dans le test de migration, 30 000 cellules ont été
ensemencées dans la chambre supérieure et la chambre n'a pas été
recouverte de Matrigel. Pendant le test d'invasion, 50 000 cellules ont été
ensemencées dans la chambre supérieure et la chambre a été recouverte de
Matrigel. Après 48h, les chambres des groupes de transfection transitoire
(siNC et siGTSE1) ont été colorées avec du cristal violet, et les groupes de
lignées cellulaires stables (vecteur et GTSE1) ont été colorés après 30 h. Le
nombre moyen obtenu à partir de trois tests indépendants dans chaque
condition expérimentale a été utilisé dans le analyse finale. Le test de
cicatrisation a été effectué à l'aide d'une pointe de pipette de 200 uL pour
gratter la couche cellulaire 24 h après l'ensemencement, et le taux de
cicatrisation a été enregistré après 0, 24, 36, 48 et 72 h. Toutes les
expériences ont été répétées trois fois indépendamment. Le test de
cicatrisation a été effectué à l'aide d'une pointe de pipette de 200 uL pour
gratter la couche cellulaire 24 h après l'ensemencement, et le taux de
cicatrisation a été enregistré après 0, 24, 36, 48 et 72 h. Toutes les
expériences ont été répétées trois fois indépendamment. Le test de
cicatrisation a été effectué à l'aide d'une pointe de pipette de 200 uL pour
gratter la couche cellulaire 24 h après l'ensemencement, et le taux de
cicatrisation a été enregistré après 0, 24, 36, 48 et 72 h. Toutes les
expériences ont été répétées trois fois indépendamment.

Essai de culture de sphère

Une concentration de 1000 cellules/puits a été ensemencée sur des plaques
de culture à faible attachement à 6 puits (Corning, 3471) afin de réaliser le
test de la sphère tumorale. Les cellules ont été cultivées dans du milieu
DMEM/F12 sans sérum (GIBCO, C11330500BT) additionné de 20 ng/ml
d'EGF (facteur de croissance épidermique) (NovoProtein, C029-B) et 20
ng/mL de bFGF (facteur de croissance basique des fibroblastes)
( NovoProtein, C046-A). Le nombre de sphères a été compté à l'aide du
logiciel Image J. Trois expériences indépendantes ont été réalisées.

Apoptose cellulaire et analyse du cycle cellulaire

L'apoptose cellulaire et le cycle cellulaire ont été respectivement détectés par

le kit Annexin V FITC Apop Dtec (BD, 556547) et un kit de coloration du
cycle cellulaire (BestBio, BB-4104-3), conformément au manuel du
fabricant. En bref, les cellules ont été cultivées à 70% de confluence, après
48 h d'incubation avec ou sans médicament (Taxol, 5-fluorouracile et
Adriamycine), les cellules ont été collectées et traitées pour analyse. Les
échantillons cellulaires ont ensuite été analysés à l'aide d'un cytomètre en
flux ACEA NovoCyte équipé du logiciel FlowJo (version 0.7).

Modèle tumoral de xénogreffe

Toutes les expérimentations animales ont été menées conformément aux

instructions approuvées par le Centre de ressources animales de recherche
de l'Université Sun Yat-Sen (numéro d'approbation L102042018030E). Des
souris femelles BALB/c âgées de trois semaines ont été achetées au Sun Yat-
sen University Laboratory Animal Center et maintenues dans des conditions
standard. Les cellules tumorales des groupes MDA-MB-231 scramble et
shGTSE1 (2 × 10 6 cellules/tumeur dans 100 μl de DMEM) ont été mises en
suspension dans 100 μl de DMEM contenant 50 % de Matrigel (Corning, 356
237) et injectées dans leurs zones axillaires gauche et droite. Les souris ont
été observées trois fois par semaine pour la formation apparente de
tumeurs. L'expérience s'est terminée 22 jours après l'inoculation des cellules
tumorales. Pour l'expérience sur les métastases pulmonaires, les cellules
tumorales des groupes MDA-MB-231 scramble et shGTSE1 (1 ×
10 6cellules/tumeur dans 100 μl de DMEM) ont été injectés par voie
intraveineuse à travers la veine caudale des souris. Les nodules
métastatiques pulmonaires ont été calculés après 5 semaines lorsque les
souris sont mortes de cachexie. Les poumons ont été excisés pour coloration
à l'hématoxyline et à l'éosine. De plus, des souris femelles BALB/c âgées de
six semaines ont été utilisées pour effectuer une injection de coussinet
mammaire in situ. Les cellules tumorales du vecteur MCF7 et des groupes
de surexpression de GTSE1 (7 × 10 6 cellules/tumeur dans 100 μl de DMEM)
ont été mises en suspension dans 100 μl de DMEM contenant 50 % de
Matrigel et injectées dans les zones gauche et droite du coussinet
mammaire. Les souris ont reçu une supplémentation en estradiol (0,4
mg/kg) tous les 7 jours pendant 35 jours après l'injection de cellules, et ont
été observées et palpées pour l'apparition de tumeurs. La croissance
tumorale a été mesurée chaque semaine à l'aide d'un pied à coulisse. Le
volume de la tumeur a été déterminé en utilisant la formule standard :
L*W 2*0,52, où L et W désignent respectivement les diamètres les plus longs
et les plus courts.

Dosage β-gal associé à la sénescence

Un essai de ß-gal associé à la sénescence a été effectué pour déterminer

l'état de sénescence des cellules en utilisant un kit de coloration SA-ß-gal
(Roche, 11 828 673 001) selon les introductions. En bref, les cellules ont été
lavées avec du PBS (1X), fixées avec du formaldéhyde à 2% et du
glutaraldéhyde à 0,2% pendant 10 min après avoir retiré le milieu, les
cellules ont été lavées avec du PBS deux fois et incubées avec une solution
de coloration SA-β-gal fraîche, qui a ensuite été conservé une nuit à 37°C
sans CO2. Les cellules ont ensuite été photographiées à l'aide d'un
microscope (Nikon Eclipse 80i), et le pourcentage de cellules sénescentes a
été compté en comptant trois champs aléatoires.

analyses statistiques
Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide de GraphPad Prism
version 7.0 (USA, GraphPad Software) et du logiciel SPSS version 22.0 pour
Windows (IBM, USA). La relation entre l'expression de GTSE1 et l'état
clinicopathologique a été analysée à l'aide du test du chi carré. Les
corrélations entre l'expression de GTSE1 et OS et RFS ont été analysées à
l'aide du test de survie et du log-rank de Kaplan-Meier. Les données ont été
analysées à l'aide du test t de Student ou des méthodes ANOVA. Une valeur
P inférieure à 0,05 a été considérée comme statistiquement significative pour
tous les tests.

Résultats
Identification de GTSE1 dans la progression du cancer du sein
basée sur l'analyse des bases de données en ligne

Les données RNA-Seq et d'autres données de survie associées des cancers du

sein ainsi que des tissus mammaires normaux ont été téléchargées à partir
de la base de données TCGA pour une analyse plus approfondie afin
d'identifier les gènes cruciaux pour la progression du cancer du sein. Dans
cette étude, nous avons choisi de nous concentrer sur GTSE1 pour les trois
causes déterminantes suivantes : il est régulé positivement dans les tissus
du cancer du sein selon la base de données TCGA (Fig.  1 a), et les résultats
de la base de données Oncomine ont indiqué que par rapport au sein normal
tissulaire, son expression était plus élevée dans différents types de types
pathologiques de cancer du sein (Fig. 1 b); son expression était positivement
corrélée avec le degré de malignité des différents sous-types de cancer du
sein (Fig. 1c); plus son expression est élevée, plus l'index pronostique de
Nottingham est élevé, plus le pronostic du cancer du sein est mauvais
(Fig. 1d ) (NPI, l'index pronostique de Nottingham est utilisé pour évaluer le
pronostic après chirurgie du cancer du sein, qui comprend trois critères
pathologiques : lésion taille, le nombre de ganglions lymphatiques impliqués
et le grade de la tumeur) [ 28 ] ; et l'expression est inversement corrélée à la
survie sans rechute métastatique (Fig. 1 e) et à toute survie sans événement
(Fig. 1 f) selon la base de données bc-GenExMiner v4.1 [ 29 ].
Fig. 1
Identification de GTSE1 dans la progression du cancer du sein basée sur
une base de données. a Le niveau d'expression de GTSE1 était élevé dans
1096 tissus de cancer du sein par rapport à 112 échantillons de tissu
mammaire normal dans le profil TCGA. b L'expression de GTSE1 était
significativement régulée à la hausse dans différents types pathologiques de
cancer du sein dans le profil TCGA basé sur les bases de données Oncomine
( c, d, e et f ) et bc-GenExMiner v4.1. c L'expression de GTSE1 était
positivement corrélée au degré de malignité de différents sous-types de
cancer du sein. d L'expression de GTSE1 était positivement corrélée à
l'indice pronostique de Nottingham (NPI) du cancer du sein. eSurvie sans
rechute métastatique chez les patients présentant une expression élevée ou
faible de l'ARNm de GTSE1. n  = 3826, p  < 0,0001, HR = 1,47. f La faible
expression de GTSE1 avait un taux de survie significativement meilleur que
celui des patients à forte expression. n  = 5439, p  < 0,0001, RR = 1,39

Image pleine grandeur

La mutation p53 est corrélée à la forte expression de GTSE1

Le niveau d'expression de l'ARNm de GTSE1 (Fig.  2 a) et le niveau de

protéine GTSE1 (Fig. 2 b) étaient plus élevés dans les tissus cancéreux du
sein que dans les tissus mammaires normaux. La coloration
immunohistochimique a montré que GTSE1 était principalement localisé
dans le cytoplasme des cellules cancéreuses du sein (Fig. 2 c) et que son
niveau d'expression protéique était plus élevé dans TNBC (Fig. 2 d), ce qui
était cohérent avec le résultat de la base de données bc-GenExMiner
montrant le niveau d'ARNm de GTSE1 (Fig. 2 e). La PCR quantitative en
temps réel et le transfert Western de GTSE1 ont montré qu'il était fortement
exprimé à différents niveaux dans différentes lignées cellulaires de cancer du
sein, en particulier dans le TNBC. Puisque GTSE1 était le gène cible de p53
[ 14], le niveau d'expression de GTSE1 était plus élevé dans les lignées
cellulaires mutées p53 que celui de la lignée cellulaire p53 de type sauvage
(Fig. 2 f et g), et ces résultats ont été confirmés par les résultats obtenus à
partir de la base de données Oncomine (Fig. 2 h ). Le gène p53 de type
sauvage est un anti-oncogène important, et le gène mutant p53 codant pour
la protéine perd ses fonctions de suppression tumorale et peut induire une
transformation maligne des cellules [ 30 , 31 ]. MCF7 est une lignée
cellulaire de cancer du sein épithélial luminal et sa malignité est inférieure à
celle des lignées cellulaires de cancer du sein triple négatif telles que les
cellules HCC38, MDA-MB-231 et MDA-MB-468 [ 32 , 33 ]. p53 est muté
dans presque tous les TNBC [ 34]. Étant donné que GTSE1 est l'un des
gènes cibles de p53, nous avons découvert que le niveau d'expression de
GTSE1 était plus faible dans les lignées cellulaires p53 de type sauvage telles
que MCF7 et la lignée cellulaire épithéliale mammaire normale MCF10A par
rapport à la lignée cellulaire mutée p53 telle que HCC38, MDA-MB -231 et
cellules MDA-MB-468. Ces résultats suggèrent que l'augmentation de
l'expression de GTSE1 peut être due à la mutation du facteur de
transcription p53, qui entraîne la perte de la fonction suppressive de la
tumeur. De plus, le niveau d'expression de l'ARNm de GTSE1 est
positivement corrélé avec MKI67, ce qui était cohérent avec les résultats du
niveau de protéine (Fig. 2g, i et j), suggérant que GTSE1 pourrait être un
marqueur tumoral potentiel pour le pronostic. Cependant, une étude
précédente a montré que le Ki-67 est un biomarqueur controversé du cancer
du sein. La détection immunohistochimique du Ki-67 dans le cancer du sein
est un indicateur important de la classification moléculaire du cancer du
sein, et l'indice Ki-67 est étroitement lié au traitement individualisé et au
pronostic du cancer du sein. Cependant, la répétabilité de l'interprétation
des résultats des tests immunohistochimiques du Ki-67 par différents
observateurs était médiocre. Jusqu'à présent, il n'existe pas de méthode
standardisée ni de valeur critique correspondante de l'interprétation
immunohistochimique du Ki-67 du cancer du sein [ 35 , 36 ].

Figure 2
La mutation P53 est corrélée à la forte expression de GTSE1. une expression
de l'ARNm de GTSE1 dans les tissus cancéreux du sein et les tissus
mammaires normaux détectés par qPCR. Le niveau d'expression de l'ARNm
de GTSE1 a été normalisé au niveau d'expression du gène domestique
GAPDH. b Niveau d'expression de la protéine GTSE1 dans six tissus
tumoraux mammaires appariés (T) et leurs tissus normaux adjacents
(N). c Des tissus de cancer du sein contenant 64 non-TNBC et 90 TNBC ont
été colorés avec des anticorps anti-GTSE1. Des images représentatives de la
coloration immunohistochimique (IHC) ont été montrées. d Le niveau
d'expression de la protéine GTSE1 était plus élevé dans le TNBC que dans le
non-TNBC. eLe niveau d'expression de l'ARNm de GTSE1 était plus élevé
dans le TNBC que dans le non-TNBC d'après la base de données bc-
GenExMiner v4.1. f Analyse par PCR en temps réel du niveau d'expression
de l'ARNm de GTSE1 dans la lignée cellulaire normale d'épithélium
mammaire MCF10A et les lignées cellulaires de cancer du sein. g Western
blot de l'expression de GTSE1 et de Ki67 dans les cellules normales de
l'épithélium mammaire et les lignées cellulaires du cancer du sein. h D'après
la base de données Oncomine, le niveau d'expression de GTSE1 était plus
élevé lorsque p53 était muté que celui de p53 de type sauvage. i et j Sur la
base de la base de données bc-GenExMiner v4.1, le niveau d'expression de
l'ARNm de GTSE1 était positivement corrélé avec MKI67. r  = 0,57, p  <
0,0001, n = 5510. GAPDH a été testé comme contrôle de charge dans
l'immunotransfert. Répéter l'expérience trois fois indépendamment

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GTSE1 est étroitement lié à la différenciation et au pronostic du

cancer du sein

Le niveau d'expression de la protéine GTSE1 avec des caractéristiques

cliniques et pathologiques dans 154 cancers du sein (des cas incluant TNBC
et non-TNBC ont été joints respectivement dans le fichier
supplémentaire  2 : tableau S5 et le fichier supplémentaire  3 : tableau S6) a
été analysé, et ces échantillons ont été divisés en deux groupes par la valeur
médiane des scores immunohistochimiques comme valeur seuil. Nous avons
effectué le test χ2, qui a démontré que l'augmentation de l'expression de
GTSE1 dans les tumeurs mammaires primaires était significativement liée à
un grade histologique plus élevé ( p  = 0,0024) (Fig.  3 a). La base de données
Oncomine et bc-GenExMiner a montré que l'expression de GTSE1 était
positivement corrélée au grade histologique (Fig. 3b) et la classification
histologique de Scarff-Bloom-Richardson (SBR) (Fig. 3 c). Scarff-Bloom-
Richardson a été largement utilisé dans la pratique clinique, qui est menée
par une évaluation complète, sur une coloration à l'hématoxyline-éosine
(H&E), la formation tubulaire de la tumeur, le pléomorphisme nucléaire et le
nombre de mitoses [ 37 ]. Le grade tumoral de différenciation du cancer du
sein est un facteur pronostique définitif. Le grade est généralement rapporté
sur une échelle allant de 1 à 3, comprenant le grade 1 bien différencié (G1),
le grade 2 modérément différencié (G2) et le grade 3 peu différencié (G3), où
les tumeurs G3 sont les plus agressives [ 38]. Les courbes de survie de
Kaplan – Meier utilisant la valeur seuil optimale ont révélé que les niveaux
d'expression élevés de GTSE1 étaient négativement corrélés à la survie
globale (OS) et à la survie sans récidive (RFS) chez les patients TNBC et non
TNBC (Fig. 3 d et e), ce qui était cohérent avec les données de survie des
ensembles de données NNK, GSE6532 et GSE11121 dans la base de
données PROGgeneV2 [ 39 ] (Fichier supplémentaire  4 : Figure S1A, B et
C). Ensemble, ces données ont montré que le niveau d'expression de GTSE1
était étroitement lié au mauvais pronostic de ces patients.

Figure 3
GTSE1 est étroitement lié à la différenciation et au pronostic du cancer du
sein. a L'expression de GTSE1 dans les tumeurs primaires était
significativement liée à une différenciation histologique plus élevée ( p  =
0,0024). b La base de données Oncomine a montré que l'expression de
GTSE1 était positivement corrélée au grade histologique. c La base de
données Bc-GenExMiner a montré que l'expression de GTSE1 était
positivement corrélée à la classification histologique de Scarff-Bloom-
Richardson (SBR). d et eLa courbe de Kaplan – Meier a été utilisée pour
analyser les données d'expression des protéines de l'IHC à l'aide du logiciel
GraphPad. Les niveaux d'expression élevés de GTSE1 étaient corrélés
négativement avec la survie globale (OS) et la survie sans récidive (RFS) chez
les patients TNBC et non TNBC

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GTSE1 favorise la croissance des cellules cancéreuses du sein

en activant la voie AKT

Pour étudier le rôle de GTSE1 dans la prolifération des cellules cancéreuses

du sein, nous avons transfecté des cellules MDA-MB-231 et MDA-MB-468
avec des ARNsi (GTSE1 si#1) et des ARNsi de contrôle négatif. Étant donné
que nos résultats de qPCR ont montré que la lignée cellulaire MDA-MB-231
avait un niveau d'expression modéré de GTSE1, nous avons effectué à la fois
un gain et une perte de fonction dans MDA-MB-231. Nous avons établi des
lignées cellulaires de surexpression de GTSE1 dans MDA-MB-231 et
MCF7. Le niveau d'expression de la protéine GTSE1 dans ces cellules
transformées a été confirmé par western blot (Fig.  4 a). Faire taire le GTSE1
a supprimé de manière significative la prolifération des cellules MDA-MB-
231 et MDA-MB-468, ainsi que leur capacité à former des colonies, tandis
que la surexpression de GTSE1 dans les cellules MDA-MB-231 et MCF7 a
favorisé la prolifération cellulaire et la formation de colonies. capacité (fichier
supplémentaire  5: figures S2A et B). En résumé, ces résultats démontrent
que GTSE1 pourrait favoriser la croissance des cellules cancéreuses du sein
in vitro. Nous avons établi la lignée cellulaire MDA-MB-231 avec GTSE1
silencieuse de manière stable via une infection lentivirale et validée par
immunotransfert (Fig. 4 e). Le test de formation de colonies a montré que
l'inactivation de GTSE1 diminuait évidemment le nombre et la taille des
colonies par rapport au groupe SCR (Fig. 4 f). Ensuite, nous avons réalisé un
modèle de xénogreffe animale en utilisant la lignée cellulaire MDA-MB-231
silencieusement stable GTSE1 ou shSCR, et la lignée cellulaire MCF7
surexprimée de manière stable GTSE1 ou vecteur. Les images des tumeurs
isolées sont présentées (Fig. 4 g, Fig. 4c), la croissance et le poids de la
tumeur se sont avérés réduits dans le groupe de cellules MDA-MB-231-
shGTSE1 par rapport au groupe témoin et augmentés dans le groupe de
cellules MCF7-GTSE1 par rapport au groupe de vecteurs (Fig. 4 h et i,
figure 4d ). Étant donné que la voie AKT a une influence cruciale sur le
phénotype malin du cancer du sein [ 40 , 41 ], nous avons déterminé que
GTSE1 avait un effet sur l'activation de l'AKT. L'immunoblot a montré que le
niveau de GTSE1 était positivement corrélé avec l'AKT
phosphorylé. L'expression ectopique de GTSE1 a augmenté les niveaux
d'AKT phosphorylés sans affecter les niveaux d'AKT totaux dans les cellules
cancéreuses du sein (Fig. 4j). Après un traitement spécifique par l'inhibiteur
AKT LY294002, les cellules MDA-MB-231 surexprimant de manière stable
GTSE1 ont été soumises à des tests de formation de colonies, et nous avons
observé que LY294002 pouvait inverser leurs capacités de prolifération
(Fig. 4 k et l). Ceux-ci suggèrent que GTSE1 pourrait favoriser la croissance
du cancer du sein au moins partiellement en activant la voie AKT.

Figure 4
GTSE1 a favorisé la croissance des cellules cancéreuses du sein en activant
la voie AKT. a La diminution de l'expression de GTSE1 a été confirmée par
Western blot dans les cellules MDA-MB-231 et MDA-MB-468 silencieuses
par GTSE1 par rapport aux cellules siRNA de contrôle négatif, et le niveau de
surexpression de GTSE1 dans les cellules MDA-MB-231 et MCF7 a été validé
par immunotransfert . b Les taux de croissance cellulaire ont été mesurés
par le test MTS. c Masses tumorales isolées de MCF7 surexprimant de
manière stable GTSE1 ou vecteur après que les tumeurs se sont développées
pendant 5 semaines. d La surexpression de GTSE1 a favorisé de manière
significative le volume de la tumeur de la xénogreffe chez les souris nude
femelles, les poids finaux de la tumeur. * p  < 0,05, ** p  < 0,01, *** p <
0,001, test t de Student. Les données sont présentées sous forme de
moyenne ± SD ( n  = 5 par groupe) e La diminution stable de l'expression de
GTSE1 a été confirmée par immunotransfert dans les cellules MDA-MB-231
silencieuses par GTSE1 par rapport aux cellules témoins shRNA
brouillées. f Les tests de formation de colonies ont été effectués dans des
cellules GTSE1 knockdown et témoins stables pour détecter l'effet de la
croissance. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD ** p  <
0,01, test t de Student. (à partir de trois exemplaires). g Masses tumorales
collectées à partir de MDA-MB-231 exprimant de manière stable le shRNA
Ctr ou GTSE1 après la croissance des tumeurs pendant 22
jours. h L'inactivation de GTSE1 a considérablement réduit la croissance et
le volume de la tumeur xénogreffe chez les souris nude femelles. jePar
rapport au shRNA contrôle négatif, les poids finaux des tumeurs ont
diminué de manière significative. *** p  < 0,001, test t de Student. Les
données sont présentées sous forme de moyenne ± SD ( n  = 5 par
groupe). j Les niveaux d'AKT phosphorylés et totaux dans les cellules MDA-
MB-231 et MDA-MB-468 du cancer du sein humain faisant taire le GTSE1
ou le siARN de contrôle négatif, et les cellules MDA-MB-231 et MCF7
exprimant de manière stable un vecteur de contrôle ou le GTSE1 ont été
déterminés par immunotransfert. k et l Des essais de formation de clones
sur plaque ont été effectués dans les lignées cellulaires indiquées après un
traitement spécifique à l'inhibiteur AKT LY294002

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GTSE1 a favorisé la métastase du cancer du sein en régulant

l'EMT

Pour explorer la fonction biologique de GTSE1 dans les métastases du

cancer du sein, nous avons effectué un test transwell dans des cellules
MDA-MA-231 et MDA-MB-468 en utilisant l'interférence ARN (ARNi) pour
renverser l'expression de GTSE1, ce qui a suggéré que l'épuisement de
GTSE1 restreignait de manière significative la migration. et les capacités
d'invasion des cellules MDA-MB-231 (Fig.  5 a et c). Cependant, la
surexpression ectopique de GTSE1 a eu l'effet inverse (Fig. 5 b et c) et a
également amélioré la capacité de migration dans les cellules MCF7 (Fichier
supplémentaire  6 : Figure S3A). Le test de cicatrisation des plaies a en outre
démontré que l'extinction de GTSE1 inhibait la motilité cellulaire et que la
surexpression de GTSE1 favorisait la motilité cellulaire (Fig. 5 d, e et f;
Fichier supplémentaire 6: Figure S3B, C, D et E). Pour confirmer davantage
la capacité de métastase promue par GTSE1 in vivo, nous avons établi un
modèle de métastase en injectant des cellules GTSE1 MDA-MB-231
renversées de manière stable dans la veine caudale de souris nude, et avons
constaté que le renversement de GTSE1 inhibait de manière significative la
métastase à les poumons. De plus, le nombre de nodules métastatiques à la
surface du poumon dans le groupe témoin était significativement plus
fréquent et de plus grande taille que celui du groupe renversé (Fig. 5 g). Les
poumons du groupe témoin étaient plus lourds que ceux du groupe knock-
down (Fig. 5 h). Ce phénomène a été confirmé par l'examen des tissus
pulmonaires par coloration HE (Fig. 5i et j). Un niveau élevé de GTSE1
accompagnait des niveaux réduits de protéines épithéliales telles que la
desmoplakine et la E-cadhérine et des niveaux élevés de marqueurs
mésenchymateux tels que la N-cadhérine et la vimentine dans les cellules
surexprimant GTSE1, et le knockdown GTSE1 a démontré des résultats
inverses (Fig. 5 k) . De plus, les résultats du transfert Western des
régulateurs de l'EMT, y compris des marqueurs tels que Snail, Slug, Twist1
et FOXC2, étaient également conformes aux attentes (Fig. 5 l).
Collectivement, ces résultats ont démontré que GTSE1 pouvait réguler la
transition épithéliale-mésenchymateuse. Les données de survie de GSE5327
basées sur la base de données PROGgeneV2 ont également montré que la
survie sans métastases pulmonaires était réduite dans le groupe à
expression élevée de GTSE1 (fichier supplémentaire 6: Figure S3I), suggérant
que GTSE1 est un facteur favorisant les métastases. Par conséquent, nous
avons démontré que GTSE1 pouvait favoriser l'invasion et la métastase des
cellules cancéreuses du sein en régulant la transition épithéliale-
mésenchymateuse. LY294002 n'a pas inversé les phénotypes invasifs et le
fabricant EMT des cellules MDA-MB-231 exprimant de manière stable
GTSE1 (Fichier supplémentaire 5 : Figure S2F, G et H). Ces résultats
indiquent que GTSE1 favorise la métastase indépendamment de l'activation
de la signalisation AKT.

Figure 5
GTSE1 favorise les métastases du cancer du sein en régulant
l'EMT. a et b Le silence de GTSE1 pourrait limiter la capacité migratoire et
invasive des cellules MDA-MB-231 par rapport aux cellules témoins
négatives d'ARNsi. d et e Le silence ou la surexpression de GTSE1 a modifié
de manière distincte la capacité de migration des cellules, telle que détectée
par le test de grattage de la plaie. Les lignes jaunes signifient les marges de
la plaie. Colonnes c et f , moyenne de trois expériences
indépendantes ; Barres, SD * p  < 0,05, ** p  < 0,01. g Des cellules
renversées par GTSE1 transfectées de manière stable (SCR, shGTSE1) ont
été injectées à des souris via la veine de la queue, le poumon des souris a été
lavé avec du NaCl à 0, 9%. hLe poids du poumon humide a été
enregistré. i Des coupes pulmonaires ont été colorées avec de l'hématoxyline
et de l'éosine. j Le nombre de nodules métastatiques microscopiques dans
les coupes a été compté. Les données ont été présentées sous forme de
moyenne ± S. D, n  = 5 par groupe. k Les niveaux de protéines des
marqueurs EMT ont été détectés par des analyses d'immunotransfert dans
les cellules indiquées. l Analyse Western blot des régulateurs de l'EMT dans
les cellules indiquées, et GAPDH comme contrôle de chargement

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GTSE1 peut provoquer une résistance multidrogue dans les

cellules cancéreuses du sein

Le taxol, le 5-fluorouracile et l'adriamycine sont des agents

chimiothérapeutiques couramment utilisés pour les patients atteints de
TNBC [ 42 , 43 , 44 ]. Pour étudier la fonction de résistance à la
chimiothérapie de GTSE1 dans les cellules MDA-MB-231 et MDA-MB-468,
nous avons déterminé l'IC50 du Taxol, du 5-fluorouracile et de
l'Adriamycine. Nous avons constaté que l'inactivation de GTSE1 dans les
cellules MDA-MB-231 et MDA-MB-468 augmentait sa sensibilité au taxol, au
5-fluorouracile et à l'adriamycine par rapport au groupe témoin
(Fig.  6 a). Après le traitement au 5-fluorouracile, les cellules faisant taire
GTSE1 avaient des taux de PARP clivée et de caspase-3 clivée plus élevés,
mais avaient des taux de caspase-3 totale inférieurs à ceux des cellules
témoins, ce qui indiquait que GTSE1 présentait une résistance au 5-
fluorouracile (Fig. 6b). De plus, nous avons effectué une analyse FACS pour
détecter l'apoptose cellulaire, ce qui a montré que les taux d'apoptose
cellulaire induite par le 5-fluorouracile étaient augmentés dans les cellules
MDA-MB-231 et MDA-MB-468 qui ont temporairement réduit au silence
GTSE1 par rapport aux cellules témoins (Fig. 6c et d). Les taux d'apoptose
cellulaire ont été réduits après la surexpression de GTSE1 dans les cellules
MDA-MB-231 et MCF7 (Fig. 6 e et f), le gating de ces cellules est expliqué
dans les données supplémentaires (Additional file  7 : Figure S4A, B, C , D,
E, F, G et H). Le dosage de la β-galactosidase a montré qu'après 48 h
d'exposition au 5-fluorouracile, cela provoquait des altérations dans les
cellules MDA-MB-231 faisant taire transitoirement GTSE1, par rapport aux
cellules témoins, indiquant globalement la sénescence (fichier
supplémentaire  8: figures S5A et B). Ces données soulignent la fonction
importante de GTSE1 dans la multirésistance des cellules cancéreuses du
sein.

Figure 6
GTSE1 peut provoquer une multirésistance dans les cellules cancéreuses du
sein. a GTSE1 faisant taire les cellules MDA-MB-231 ont été traitées avec
diverses concentrations de taxol, de 5-fluorouracile et d'adriamycine pendant
72 h pour détecter l'IC50 à l'aide de tests MTS. b MDA-MB-231
transitoirement silencieux GTSE et les cellules témoins négatives ont été
traitées avec du 5-fluorouracile pendant 72 h, et les niveaux d'expression de
la PARP totale, de la PARP clivée, de la caspase-3 totale et de la caspase-3
clivée ont été déterminés par Western blot. GAPDH a été testé comme
contrôle de chargement. c et d Les cellules MDA-MB-231 et MDA-MB-468
indiquées ont été traitées avec du 5-fluorouracile (5 et 0,9 μg/ml
respectivement) pendant 48 h et testées pour l'apoptose. e et fLes cellules
MDA-MB-231 et MCF7 indiquées ont été traitées avec du 5-fluorouracile (5
et 20 μg/ml respectivement) pendant 48 h, puis ont été testées pour leur
taux d'apoptose. Trois expériences indépendantes ont été répétées pour
chaque essai
 Image pleine grandeur

GTSE1 régule la fonction de p53 pour modifier la distribution

du cycle cellulaire en fonction du statut mutationnel de p53

Les analyses de cytométrie en flux ont montré qu'il n'y avait pas de
différences dans les taux d'apoptose cellulaire sans traitement au 5-
fluorouracile (Fig.  7 a et b), ce qui suggère que l'effet de GTSE1 sur la
prolifération des cellules cancéreuses du sein n'était pas via l'apoptose. De
plus, la cytométrie en flux a été utilisée pour déterminer si le rôle de GTSE1
dans la prolifération des cellules cancéreuses du sein affectait la progression
du cycle cellulaire. Nos données ont montré que l'extinction de GTSE1
augmentait significativement la phase S (Fig. 7 c et d), suggérant qu'il
pourrait y avoir un arrêt de la phase S ; tandis que la surexpression de
GTSE1 augmentait le pourcentage de cellules dans le pic G2 (Fig. 7e et f),
indiquant que la surexpression de GTSE1 pourrait retarder la transition de
phase M à G2 des cellules cancéreuses du sein, ce qui est cohérent avec une
étude précédente. De plus, un test d'immunotransfert a montré que p53 et
l'inhibiteur du cycle cellulaire p21 étaient diminués dans les cellules MDA-
MB-231 et MCF7 transfectées par GTSE1, mais augmentés dans les cellules
MDA-MB-231 silencieuses par GTSE1. Inversement, la cycline D1 et la
cycline E1 étaient régulées positivement dans les cellules MDA-MB-231 et
MCF7 transfectées par GTSE1, mais régulées négativement dans les cellules
MDA-MB-231 silencieuses par GTSE1. De plus, la régulation à la hausse ou
à la baisse de GTSE1 n'a pas modifié les niveaux de p53, p21, cyclinD1 et
cyclinE1 dans les cellules MDA-MB-468 silencieuses par GTSE1. Par rapport
aux cellules MDA-MB-468 avec un mutant p53 homozygote,7 g), qui
indiquait que GTSE1 n'avait aucun effet sur l'homozygote p53 mutant mais
avait un effet sur l'homozygote p53 de type sauvage et l'hétérozygote p53
mutant. Pris ensemble, ces résultats révèlent que GTSE1 pourrait réguler la
fonction de p53 pour modifier la distribution du cycle cellulaire en fonction
de l'état de mutation de p53 GTSE1. Cependant, pour l'inactivation et la
surexpression de GTSE1 dans les cellules MDA-MB-231, le nombre et la
taille des sphères n'ont pas changé (Fig. 7 h et i) et les résultats ont été
confirmés par Western blot (Fig. 7 j). Ces résultats indiquent que GTSE1
favorise le phénotype malin du cancer du sein sans affecter la capacité
d'auto-renouvellement des cellules tumorales.

Figure 7
GTSE1 régule la fonction de p53 pour modifier la distribution du cycle
cellulaire en fonction de l'état de mutation de p53. a et b Les cellules
indiquées ont été collectées sans traitement médicamenteux pour les tests
de cytométrie en flux c et d . La régulation à la baisse de GTSE1 a entraîné
l'accumulation de cellules en phase S par analyse de cytométrie en flux. Les
cellules indiquées ont été colorées avec PI pour analyser la distribution du
cycle cellulaire. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± ET
de trois expériences indépendantes. * p  < 0,05, ** p  < 0,01, test t. e et f La
surexpression de GTSE1 entraîne une accumulation de cellules en phase G2
par analyse par cytométrie en flux. gAnalyse Western blot de l'expression de
GTSE1, P53, mutant p53, P21, cyclinD1, cyclinE1 dans les cellules
indiquées. Le GAPDH a servi de référence interne. Chaque expérience a été
répétée trois fois. h et i EGF et FGF ont été ajoutés au milieu DMEM/F12
pendant 12 à 14 jours pour quantifier le nombre et la taille des sphères
formées en indiquant les lignées cellulaires. j Analyse Western blot de
l'expression de Nanog, ABCG2, TAZ, YAP dans les cellules indiquées. Le
GAPDH a servi de référence interne

Image pleine grandeur

Discussion
Le cancer du sein est une tumeur maligne hétérogène, avec de multiples
altérations épigénétiques et génétiques, et impliquant des voies de
signalisation moléculaires complexes [ 45 , 46 , 47]. Dans cette étude, nous
avons constaté que les niveaux d'expression de l'ARNm et des protéines de
GTSE1 sont augmentés dans les lignées cellulaires et les tissus du cancer du
sein, en particulier dans les cellules cancéreuses du sein mutantes TNBC et
p53. De plus, son niveau d'expression était positivement corrélé avec Ki67,
soulignant son rôle important dans la progression du cancer du sein
humain. Le niveau d'expression de la protéine GTSE1 dans les tissus du
cancer du sein était lié à la différenciation et à la réduction du temps de
survie global et du temps de survie sans récidive des patientes. Dans
l'ensemble, notre étude a démontré que GTSE1 pourrait servir de marqueur
nouveau et potentiel pour le pronostic du cancer du sein.

Nos études fonctionnelles ont démontré que GTSE1 pouvait favoriser la

croissance des cellules cancéreuses du sein, ce qui est conforme aux
données sur le CHC [ 18 ]. De plus, nos données ont démontré que GTSE1
peut affecter la voie AKT pour faciliter la croissance des cellules cancéreuses
du sein. De plus, nos données ont également indiqué que GTSE1 pourrait
améliorer la métastase des cellules cancéreuses du sein en régulant l'EMT,
ce qui est conforme aux données sur le CHC [ 17 ]. L'inhibition de la voie
AKT n'a aucun effet sur la métastase cellulaire, ce qui peut être dû à la
compensation d'autres voies de signalisation tumorales. Il a également été
rapporté que l'expression régulée à la hausse de GTSE1 dans les cellules
cancéreuses gastriques contribue à la résistance au cisplatine [ 19]. Fait
important, nos données impliquaient que la régulation négative de GTSE1
contribuait à une augmentation de la sensibilité à l'apoptose induite par la
chimiothérapie après des traitements au Taxol, au 5-fluorouracile et à
l'adriamycine, tandis que la surexpression de GTSE1 présentait des effets
opposés. Étant donné que GTSE1 pouvait favoriser la capacité proliférative
des cellules cancéreuses du sein, nous avons constaté qu'il n'avait aucune
fonction sur l'apoptose spontanée des cellules cancéreuses du sein, mais
affectait la distribution du cycle cellulaire. GTSE1 est nécessaire à
l'arrangement chromosomique et à la progression vers la mitose [ 48]. Le
silence de GTSE1 a augmenté de manière significative le pourcentage de
phase S en raison de l'inhibition de la mitose résultant d'un arrêt de la
phase S dans les cellules cancéreuses du sein, tandis que la surexpression
de GTSE1 a augmenté le pourcentage de cellules dans le pic G2, indiquant
que la surexpression de GTSE1 a retardé le M transition de phase -à-G2 des
cellules cancéreuses du sein, ce qui est cohérent avec une étude précédente
[ 14 ]. Cependant, étant donné que GTSE1 affecte la différenciation du
cancer du sein sans affecter la capacité d'auto-renouvellement, nous avons
supposé que GTSE1 pouvait réguler la différenciation des cellules
cancéreuses du sein en influençant d'autres processus biologiques tels que
l'EMT et le cycle cellulaire.

Il a été rapporté que GTSE1 est l'un des gènes cibles de p53, qui peut
également servir de régulateur négatif de p53. Des études antérieures ont
démontré que GTSE1 peut influencer la distribution du cycle cellulaire en
transférant p53 du noyau vers le cytoplasme pour la dégradation, et peut
réguler à la baisse le niveau de protéine p53 [ 13 ]. P21 est l'un des gènes
cibles les plus importants en aval de p53 [ 49]. La protéine P21 est connue
comme la protéine inhibitrice du cycle cellulaire avec l'activité d'inhibition de
la kinase la plus étendue, qui se lie au complexe Cycline-CDK et inhibe son
activation. En inhibant l'activation de CyclinD1-CDK4/6 et CyclinE1-CDK2,
p21 peut empêcher la phosphorylation de la protéine Rb et la libération des
facteurs de transcription E2F, provoquant l'arrêt du cycle cellulaire et
affectant la distribution du cycle cellulaire [ 50 , 51 , 52]. Nos résultats ont
révélé qu'une nouvelle fonction GTSE1 dans la régulation de la distribution
du cycle cellulaire. GTSE1 n'a aucun effet sur un homozygote p53 mutant
mais a eu un effet sur l'homozygote p53 de type sauvage et l'hétérozygote
p53 mutant. Dans les cellules exprimant l'hétérozygote mutant p53, le rôle
de GTSE1 dans la régulation de la fonction de p53 dépendait principalement
de la partie de type sauvage de l'hétérozygote mutant p53. Nous avons émis
l'hypothèse que GTSE1 régule la fonction p53 pour modifier la distribution
du cycle cellulaire principalement par les trois manières
suivantes. Premièrement, dans les cellules MCF7, GTSE1 a joué un rôle de
manière dépendante de p53, qui a interagi avec la protéine p53 de type
sauvage pour former un complexe dans le noyau et a transporté le p53 vers
le cytoplasme pour une dégradation résultant de la régulation négative de
p53, qui en retour a régulé à la baisse le niveau de protéine p21 tout en
régulant à la hausse les niveaux de protéine CyclinD1 et
CyclinE1. Deuxièmement, dans les cellules MDA-MB-231, GTSE1 s'est lié à
la protéine partielle de type sauvage des hétérozygotes mutants p53 pour
moduler les niveaux de protéines en aval, jouant un rôle de manière
partiellement dépendante de p53. Troisièmement, dans les cellules MDA-
MB-468, GTSE1 joue un rôle de manière indépendante de p53, qui ne se lie
pas à la protéine p53 mutante et n'a aucune fonction sur celle-ci ainsi que
sur ses protéines en aval. Fait intéressant, Bublik et al ont découvert que
GTSE1 protège p21 de la dégradation dépendante du protéasome dans un
mécanisme indépendant de p53, et que les niveaux de protéine p21 sont
modifiés conformément à l'expression de GTSE1 [ jouant un rôle de manière
partiellement dépendante de p53. Troisièmement, dans les cellules MDA-
MB-468, GTSE1 joue un rôle de manière indépendante de p53, qui ne se lie
pas à la protéine p53 mutante et n'a aucune fonction sur celle-ci ainsi que
sur ses protéines en aval. Fait intéressant, Bublik et al ont découvert que
GTSE1 protège p21 de la dégradation dépendante du protéasome dans un
mécanisme indépendant de p53, et que les niveaux de protéine p21 sont
modifiés conformément à l'expression de GTSE1 [ jouant un rôle de manière
partiellement dépendante de p53. Troisièmement, dans les cellules MDA-
MB-468, GTSE1 joue un rôle de manière indépendante de p53, qui ne se lie
pas à la protéine p53 mutante et n'a aucune fonction sur celle-ci ainsi que
sur ses protéines en aval. Fait intéressant, Bublik et al ont découvert que
GTSE1 protège p21 de la dégradation dépendante du protéasome dans un
mécanisme indépendant de p53, et que les niveaux de protéine p21 sont
modifiés conformément à l'expression de GTSE1 [53 ]. Étant donné que
GTSE1 est un oncogène et que p21 est un gène suppresseur de tumeur, nos
recherches ont montré que la tendance à la variation de GTSE1 était
opposée à celle de p21, et GTSE1 régule le niveau de protéine p21 en
fonction de l'état de mutation de p53 et une telle régulation des niveaux de
p21 dépend de les changements du cycle cellulaire.

Nos nouvelles découvertes sont résumées dans la Fig. 8. Ces résultats ont

dévoilé une interaction possible entre GTSE1 et p53 avec un statut
mutationnel différent. GTSE1 régule la fonction de p53 pour favoriser la
progression du cancer du sein principalement par les trois manières
suivantes. Dans la cellule MCF7, la fonction suppressive de tumeur de p53
de type sauvage a été restreinte par l'oncogène GTSE1 via une régulation
négative du niveau de protéine p53 ; dans la cellule MDA-MB-468,
l'homozygote mutant de p53 était capable de conduire la tumorigenèse et
GTSE1 favorise le processus de cancer d'une manière indépendante de p53
principalement en affectant la stabilité de la tubuline ou de la voie
EMT ; dans la cellule MDA-MB-231, GTSE1 peut inhiber la fonction de la
protéine partielle de type sauvage des hétérozygotes mutants p53 pour
favoriser la progression du cancer du sein d'une manière partiellement
dépendante de p53. Cependant, nous n'avons pas suffisamment de preuves
que GTSE1 ne peut pas se lier au mutant p53, en plus, GTSE1 ne peut pas
être identifié comme un indicateur pronostique indépendant du cancer du
sein en raison du manque de preuves cliniques suffisantes. Par conséquent,
le rôle de GTSE1 devrait être exploré plus avant en tant que marqueur
candidat pour le pronostic du cancer du sein, et la recherche sur les voies de
signalisation améliorera notre compréhension de sa fonction dans la
progression du cancer du sein.

Figure 8
Modèle du mécanisme GTSE1 dans le cancer du sein . a GTSE1 et p21
étaient le gène cible de p53, et GTSE1 pouvait inhiber la fonction de
p53. b Dans les cellules MCF7 avec un homozygote de type sauvage de p53,
GTSE1 a joué un rôle de manière dépendante de p53. c Dans les cellules
MDA-MB-231 avec hétérozygote mutant de p53, GTSE1 a joué un rôle de
manière partiellement dépendante de p53. d Dans les cellules MDA-MB-468
avec homozygote mutant de p53, GTSE1 a joué un rôle de manière
indépendante de p53

Image pleine grandeur

conclusion
En résumé, GTSE1 a des effets sur la régulation de la croissance et des
métastases du cancer du sein. De plus, GTSE1 confère une multirésistance
aux médicaments dans les cellules cancéreuses du sein et peut réguler la
fonction de p53 pour modifier la distribution du cycle cellulaire en fonction
du statut mutationnel de p53.

Abréviations
ATCC  :
Collection de culture de type américain
DMME :
Milieu d'Eagle modifié de Dulbecco
EMT  :
Transition épithéliale-mésenchymateuse
FBS  :
Sérum bovin fœtal
RAD  :
Taux de fausse découverte
GTSE1 :
G2 et S phase-exprimé-1
IL:
Hématoxyline et éosine
IHC  :
Immuno-histochimique
NPI :
Indice pronostique de Nottingham
SE  :
La survie globale
PCR  :
Réaction en chaîne par polymérase
RFS :
Survie sans récidive
ARNi  :
Interférence ARN
SBR :
Scarff-Bloom-Richardson
ARNsi  :
Petit ARN interférant
TGCA  :
L'Atlas du génome du cancer
CNBC :
Cancer du sein triple négatif

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Remerciements
N'est pas applicable.

Financement

Ce travail a été soutenu par National Natural Science Foundation of China

81773162, National Natural Science Foundation of China 81572901,
National Natural Science Foundation of China 31170151, Natural Science
Foundation of Guangdong Province, China 2017A030313866, Science and
Technology Planning Project of Guangdong Province, China
2014A020209024 , Projet de planification scientifique et technologique de la
province de Guangdong, Chine2014B020212017.

Disponibilité des données et des matériaux

Pour tous les manuscrits, en particulier ceux contenant des données du Sun
Yat-sen University Cancer Center (SYSUCC), il est recommandé aux auteurs
de déposer les données dans le Research Data Deposit (RDD) sur le site Web
suivant : http://www.researchdata .org.cn/

Informations sur l'auteur

Remarques de l'auteur
1. Fen Lin et Yu-Jie Xie ont contribué à parts égales à ce travail.
Auteurs et affiliations

1. State Key Laboratory of Oncology in South China and

Collaborative Innovation Center for Cancer Medicine, Sun Yat-sen
University Cancer Center, Guangzhou, 510060, République
populaire de Chine
Fen Lin, Yu-Jie Xie, Yan Mei, Hu Liang, Si-Ting Lin, Fei-Fei Luo, Yan-
Hong Lang, Li-Xia Peng, Chao-Nan Qian et Bi-Jun Huang
2. Université médicale du Guangdong, Zhanjiang, 524023,
République populaire de Chine
Yu-Jie Xie
3. Département de pathologie, Sun Yat-sen University Cancer
Center, Guangzhou, 510060, République populaire de Chine
Xin-ke Zhang
4. Département de médecine nucléaire, deuxième hôpital populaire
de Shenzhen, Shenzhen, République populaire de Chine
Tie-Jun Huang
5. Centre de médecine de précision de Zhuhai, Hôpital populaire de
Zhuhai affilié à l'Université de Jinan, Zhuhai, Guangdong, 519000,
République populaire de Chine
Hong-Fa Xu
 6. Département de médecine traditionnelle chinoise, Premier hôpital
affilié à l'Université Sun Yat-Sen, Guangzhou, 510060, République
populaire de Chine
Hao Hu
7. Department of Nasopharyngeal Carcinoma, Sun Yat-Sen University
Cancer Center, Guangzhou, 510060, République populaire de
Chine
Chao Nan Qian
Contributions

FL et Y-JX ont réalisé la plupart des travaux expérimentaux et l'analyse des

données ; FL était responsable de la rédaction du manuscrit, B-JH a assuré
la supervision scientifique et administrative de la conduite de la recherche et
a révisé le manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Auteurs correspondants

Correspondance à Chao-Nan Qian ou Bi-Jun Huang .

Déclarations éthiques
Approbation éthique et consentement à participer

Tous les échantillons de tissus humains ont été obtenus avec le

consentement du patient et l'approbation du Comité d'examen de l'éthique
clinique de l'établissement au Sun Yat-Sen University Cancer Center. Toutes
les expérimentations animales ont été approuvées par le Comité
institutionnel de protection et d'utilisation des animaux du Sun Yat-Sen
University Cancer Center.

Consentement à la publication

N'est pas applicable.

Intérêts concurrents

Les auteurs déclarent n'avoir aucun intérêt concurrent.

Note de l'éditeur

Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications

juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.