Techniques de contrôle microbiologique

L3 Microbiologie
Introduction
La recherche des micro-organismes dans tous les produits destinés à l’homme est obligatoire, car certains
d’entre eux pourrait être à l’origine de maladies infectieuses microbiennes, de toxi-infections alimentaires
collectives (Tiac) et d’altérations de certains produits.
Le contrôle microbiologique de la qualité technologique vise à détecter la présence de microorganismes
pouvant altérer la qualité marchande de produit fini, et de vérifier l’efficacité de la technologie après leur
application, afin de stocker et de commercialiser des produits alimentaires microbiologiquement stables.

Les fabrications dans les bio-industries supposent la maîtrise des développements microbiens, aussi bien des
souches de cultures utilisées en fermentation, si une telle étape intervient dans la fabrication, que des
microorganismes contaminants. En effet, un levain dont le taux de croissance serait trop faible ne permet pas
de réaliser des fermentations correctes. Par ailleurs des microorganismes contaminants peuvent perturber, à
des degrés divers, le déroulement de la fabrication et mettre en cause la qualité et la conservation du produit
final.
1. Objectifs du contrôle microbiologique

Les contrôles doivent permettre de garantir une bonne qualité hygiénique et une bonne qualité marchande
du produit fabriqué. De plus, les contrôles doivent permettre de minimiser les pertes dues à des mauvaises
conditions de fabrication et donc d’avoir le moins possible de produits non conformes.
• Qualité hygiénique

Une altération de la qualité hygiénique met en cause la santé du consommateur, le produit altéré conduisant
à des intoxications alimentaires de gravité diverse suivant la nature des microorganismes en cause.

Cette altération est généralement invisible.

Elle est due à un développement de microorganismes pathogènes produisant des toxines, deux cas peuvent
alors se présenter :
- La toxine est excrétée dans le produit (exotoxine). A partir d’une certaine quantité de toxine, le
produit est dangereux à consommer même si le microorganisme n’est plus vivant dans le produit.
C’est le cas de staphylocoques pathogènes ou de Clostridium botulinum ;
- La toxine n’est pas secrétée mais reste dans les cellules microbiennes (endotoxine). Pour que le
produit soit dangereux pour le consommateur, le microorganisme doit être présent et vivant. C’est le
cas des entérobactéries par exemple.

Les contrôles microbiologiques permettent donc d’éviter la présence de microorganismes dans les
produits afin de ne pas risquer une altération de la qualité hygiénique des produits finis ou au moins détecter
ces microorganismes s’ils sont présents dans les produits finis avant leur commercialisation.
• Qualité marchande

Une altération de la qualité marchande modifie la texture et la qualité organoleptique du produit.

Cette altération bien que généralement non dangereuse pour la santé du consommateur, rend le produit non
commercialisable.

Cette altération survient lorsque la technologie mise en œuvre pour assurer la stabilité microbiologique a été
défaillante.

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 La nature des microorganismes responsables de ces altérations dépend étroitement du type de produit et de
la technologie mise en œuvre. Exemple, des levures osmophiles peuvent se développer et donc altérer
(gonflement) un produit sucré à faible activité d’eau si ce facteur n’a pas été parfaitement maitrisé.

L’altération de la qualité marchande se produit généralement lentement au cours du stockage. Les contrôles
microbiologiques ont pour objectif de détecter les microorganismes pouvant être responsables de ces
altérations, et de vérifier l’efficacité des technologies après leur application afin de stocker et de
commercialiser les produits microbiologiquement stables

2.Niveaux de contrôle

Les contrôles doivent être répartis en trois groupes :

- Les contrôles préventifs sont effectués sur les matières premières et les différents adjuvants.

Dans le cas où le processus de fabrication fait intervenir une fermentation, des contrôles microbiologiques
sur le levain sont nécessaires.

- Les contrôles en cours de fabrication comprennent les contrôles microbiologiques sur le produit lui-même
mais aussi sur les facteurs ayant une influence sur la qualité du produit comme l’hygiène des matériels, des
locaux et du personnel.

Le nombre des contrôles est défini suivant la longueur des chaines de fabrication (durée) et les risques de
contamination possible.

- Les contrôles des produits finis déterminent la qualité microbiologique du produit fini et sa conformité aux
normes officielles ou aux normes établies par l’usine.

3. Fréquence des contrôles

Il n’y a pas de règle absolue quant à la fréquence des contrôles à réaliser.

4. Associations et organisations de contrôle microbiologique

Les analyses microbiologiques permettent de contrôler l’absence des microorganismes dangereux et le

niveau de la flore tolérable.

Les résultats obtenus sont comparés aux « critères microbiologiques » établis par des commissions de
spécialistes au sein d’organismes.

Il existe actuellement de nombreux organismes nationaux ou internationaux qui se préoccupent de

l’établissement de critères de qualité microbiologique de nos aliments:

AFNOR : L’Association française de normalisation (AFNOR) a été créée en 1926.

Elle est l'organisation française qui représente la France auprès de l'Organisation internationale de
normalisation (ISO).

CEE : Communauté des états européennes

CNERNA : Centre national d’étude et de recommandation sur la nutrition et l’alimentation.

OMS : L'Organisation mondiale de la santé (OMS), est une institution spécialisée de l’ONU (Organisation
des Nations unies) pour la santé publique créée en 1948. Selon sa constitution, l'OMS a pour objectif
d'amener tous les peuples du monde au niveau de santé le plus élevé possible.

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FAO : L’Organisation pour l’alimentation et l’agriculture soit en anglais : Food and Agriculture
Organization est une organisation spécialisée du système des Nations unies, créée en 1945 à Québec.

Son objectif suprême affiché est « Aider à construire un monde libéré de la faim ».

ISO : (International Organization for Standardization): l’Organisation internationale de normalisation est un

organisme de normalisation international composé de représentants d'organisations nationales de
normalisation de 165 pays.

Cette organisation créée en 1947 a pour but de produire des normes internationales dans les domaines
industriels et commerciaux appelées normes ISO.

ICMSF : La Commission Internationale des Normes Microbiologiques relatives aux denrées alimentaires :
(International Commission on Microbiological Specifications for Food) a été créé en 1962 grâce à l'action
du Comité international sur la microbiologie alimentaire et d'hygiène, un comité de l'Union internationale
des sociétés de microbiologie. Leur objectif étant donné les tendances de la salubrité des aliments.

Le codex alimentaire (ou codex Alimentarius):

Est un programme commun de l'Organisation pour l'alimentation et l'agriculture (FAO) et de l'Organisation

mondiale de la santé (OMS) consistant en un recueil de normes, codes d'usages, directives et autres
recommandations relatifs à la production et à la transformation agroalimentaires qui ont pour objet la
sécurité sanitaire des aliments, soit la protection des consommateurs et des travailleurs des filières
alimentaires, et la préservation de l'environnement.

En Algérie :

Les contrôles officiels sont assurés en étroite liaison par les secteurs suivants :
• Ministère du commerce (Algérie) : En matière de qualités des biens et services et de protection de
consommateur, le ministre du commerce est chargé de déterminer, en combinaison avec les
départements ministériels et organismes concernés, les conditions de mise à la consommation des
biens et services en matière de qualité, d’hygiène et de sécurité.
• Le ministère de l’agriculture : le service vétérinaire assure le contrôle sanitaire des animaux et les
produits carnés.
• Le ministère de la santé : s’occupe du contrôle de l’eau d’alimentation, des plats cuisinés et en cas
des intoxications et d’épidémies.

Le critère microbiologique L’analyse microbiologique est réglementée, et au cours du contrôle qui peut être
effectué par des laboratoires d’Etat ou des laboratoires agrées, une distinction est faite entre produit non
conforme et produit toxique. Les normes et critères microbiologiques donnent en général les limites de
conformité et de toxicité de même que les méthodes à utiliser.

Selon le CEQMA (commission pour l’évaluation de la qualité microbiologique des aliments), un critère
microbiologique est un ensemble d’éléments qualitatifs et quantitatifs définissants les caractéristiques
microbiologiques essentielles attendues d’un produit donné et qu’il est possible d’atteindre par des
interventions appropriées.
5. Prélèvement et préparation de l’échantillon en condition stérile
L’échantillonnage destiné à une analyse microbiologique revêt une précaution supplémentaire par rapport au
prélèvement destiné à un contrôle physico-chimique. Celle d’être réalisé en conditions stériles :

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 – flacon stérile, rempli sans toucher l’échantillon avec les mains ni un quelconque matériel (entonnoir,
pipette…) à moins d’avoir été désinfecté ; dans le cas d’une désinfection chimique, attention aux résidus de
produit ; bouchon stérile ; flambage du col de la bouteille.
Après le prélèvement, maintien de l’asepsie :
– interdiction stricte d’ouvrir le flacon jusqu’à l’analyse ; ouverture de l’échantillon seulement sous hotte à
flux laminaire ou à proximité directe de la flamme bleue du bec Bunsen. Aucune culture microbienne, en
tube ou en boîte de Pétri, ne doit être ouverte à l’air libre.
– pour les prélèvements réalisés sur une chaîne technologique, prélever au niveau de chacun des
équipements de façon à diagnostiquer toute source de contamination possible.
En préalable des techniques de comptage ou d’identification, il faut quelquefois intervenir sur l’échantillon
afin d’adapter le taux présumé de sa population microbienne :
• Si la population est très élevée, il faut diluer l’échantillon.
Il s’agit alors d’une dilution similaire à celles que l’on réalise en chimie. À la différence près qu’elle
s’effectue en conditions stériles : matériel et eau distillée stériles.
• Inversement, pour les milieux assez pauvres en germes, il faut concentrer les germes par filtration de
l’échantillon. On procède alors à une filtration sous vide sur membrane de 0,45 µ ; cette porosité est choisie
de façon à retenir tous les germes, levures ou bactéries, sur la membrane filtrante.
Mais sur la membrane de filtration qui a retenu les éventuels microorganismes à sa surface. Il faut, de ce fait,
la manipuler de façon stérile : elle doit être posée et retirée avec une pince stérilisée, réaliser toutes les
opérations sous hotte à flux laminaire, stériliser tout matériel au contact de la membrane.

6. Prélèvement, transport et préparations des échantillons

Les résultats des essais et leur interprétation sont valables et significatifs si l’échantillon soumis est
représentatif du lot et que l’intégrité du produit est assurée depuis le prélèvement jusqu’à l’analyse.
Deux objectifs principaux doivent être visés lors du prélèvement des échantillons :
- Obtenir un échantillon représentatif, c’est-à-dire qui est une image fidèle de l’ensemble d’un lot homogène
ou hétérogène, afin de conclure sur ce lot ;
- Obtenir un échantillon intègre afin d’assurer le maintien de l’état du produit tel qu’il existe au moment de
l’échantillonnage jusqu’à l’analyse.
Toutes les mesures nécessaires doivent donc être prises pour prévenir toute contamination, prolifération ou
destruction microbienne durant la manutention et l’entreposage des échantillons. Comme pour tout
échantillon soumis à des essais microbiologiques, lorsque des produits peuvent faire l’objet d’une action
légale (saisie, poursuite, confiscation ou élimination), la chaîne de froid et la chaîne de possession doivent
être respectées.
Il doit être possible de démontrer que l’échantillon a été conservé, réfrigéré ou congelé, selon le cas, et qu’il
n’y a pas eu d’interruption de la possession à partir du prélèvement jusqu’à l’analyse.
6.1. Prélèvement des échantillons

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La taille de l’échantillon d’un produit de même nature réparti en portions unitaires doit être au moins de 5
unités (lieu de fabrication ou de distribution), de 5 unités pour les conserves. Le laboratoire doit disposer
d’environ 500 g de produits, soit 5 fois 100 g, ces 100 g pouvant être fournis par une ou plusieurs pièces.
Si le prélèvement de 5 échantillons s’avère trop élevé par rapport à la production il est procédé à un
étalement dans le temps des prélèvements. Ces prélèvements doivent avant tout respecter des règles
d’asepsie et de représentativité.
La prise d’essai destinée à la préparation de la suspension mère et de ses dilutions doit correspondre aux
parties superficielles et profondes notamment pour les produits en tranche, hachés, divisés et les plats
cuisinés par exemple.
Pour les produits liquides elle est effectuée sur le produit « homogénéisé » ou sur les parties superficielles et
profondes. Dans le cas d’examens microbiologiques faisant suite à une maladie de type toxi-infections
alimentaires (TIA) il faut rechercher les germes dangereux (pathogènes, toxinogènes) et leurs toxines aussi
bien dans les prélèvements de surface que dans la masse.
6.2. Échantillonnage
Un échantillonnage représentatif est essentiel quand l’analyse a pour but de détecter la présence de germes
pathogènes ou de toxines qui peuvent être distribués de façon hétérogène dans l’aliment ou quand la
commercialisation d’un produit dépend de la qualité microbiologique en relation avec les normes imposées
par la législation. L’objectif de l’échantillonnage influencera le type de plan d’échantillonnage, la nature des
paramètres demandés et l’interprétation du résultat des essais.
Il est nécessaire, en tout premier lieu, de tenir compte du contexte et d’établir le but poursuivi lors du
prélèvement des échantillons :
- complément à une visite d’inspection ;
- programme de surveillance ou étude de profil ;
- contrôle de la qualité ;
- recherche de pathogènes dans l’environnement ;
- poursuites, saisies ;
- vérification de l’efficacité des procédés de nettoyage ;
- suivi d’un résultat non conforme.
- Échantillon, une quantité de produit prélevé d’un lot et soumis à des essais en laboratoire. Un échantillon
peut consister en une ou plusieurs unités d’échantillonnage.
- Unité d’échantillonnage, portion ou contenant individuel de produit prélevé au hasard dans un lot. Une
unité d’échantillonnage peut correspondre à un échantillon.
- Cadre d’échantillonnage, le regroupement de toutes les unités qui nous intéressent, dans un espace-temps
bien défini. L’échantillon décrit la population dont il est issu pour une période de temps et un espace précis.
6.3. Conditions du prélèvement
Les conditions essentielles à respecter pour le prélèvement sont d’abord le respect des règles d’asepsie
(travail correct du microbiologiste) et la non modification des flores présentes. Dans les mesures du
possible, les échantillons du produit à analyser doivent être amenés au laboratoire dans leur conditionnement

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d’origine, ce qui évite certaines contaminations. Si le produit se présente sous forme de grands volumes
(réservoirs à lait par exemple) s’assurer de la bonne homogénéité de la répartition des micro-organismes ;
une partie représentative du produit sera prélevée stérilement. Il est parfois nécessaire de réaliser des
prélèvements à divers niveaux de l’aliment (surface, profondeur d’un aliment solide) ou après broyage et
homogénéisation. Les manipulations effectuées au cours du prélèvement ne doivent en aucun cas être à
l’origine d’une contamination : nécessité d’utiliser des instruments stériles et de travailler stérilement.
Certains instruments doivent être stérilisés sur les lieux du prélèvement. Le trempage dans l’alcool et le
flambage sont parfois insuffisants car la température atteinte n’est pas assez élevée. Il est nécessaire
d’utiliser des flacons propres, secs, étanches, à col large stérilisés au four Pasteur (30 minutes à 1 heure à
170° - 180°C ou 2 heures à 160°C ce qui a pour but d'éviter le brunissement du coton) ou par autoclavage à
121°C pendant 30 min ou encore à usage unique et stériles ; leur taille doit être adaptée au volume de
l’échantillon. Les récipients peuvent être en verre, en métal ou en matière plastique (polyéthylène,
polycarbonate, polypropylène). Les récipients de prélèvement doivent posséder un système de fermeture
hermétique. Le prélèvement d’un produit non emballé doit être réalisé dans la zone de stérilité d’un bec
bunsen ou d’un système équivalent.
a. Prélèvement en surface
L’objectif de ce prélèvement est l’évaluation du nombre de bactéries sur des surfaces (tables de travail,
ustensiles, verres, etc.) et la vérification des procédures de nettoyage et d’assainissement.
- Écouvillonnage, un écouvillon de coton hydrophile est immergé dans une solution stérile de Ringer au 1/4
ou dans un bouillon tryptone-sel additionné de Tween (0,5‰). Le prélèvement est effectué par frottement
sur la surface du produit ; l’écouvillon est alors immergé dans 10 ml de Ringer au 1/4 ou 10 ml de bouillon
tryptone-sel.

(a) boites de contact, (b) et (d) lames d'immersion (c) écouvillons

L’analyse est réalisée à partir de la suspension ainsi obtenue

- Rinçage : cette méthode est utilisée dans le cas de récipients ou de tuyauteries ; un volume connu de
solution stérile est introduit dans le matériel à analyser. Après agitation, le liquide est récupéré et soumis à
l’analyse.
- Méthode des empreintes : un ruban adhésif préalablement stérilisé par les UV est appliqué sur la surface à
étudier. Après quelques secondes de contact il est retiré et appliqué sur la surface d’un milieu gélosé
approprié. Après quelques heures de contact à la température d’incubation désirée il est retiré et la boîte est
incubée jusqu’à apparition des colonies.

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- Méthode du cylindre : un cylindre creux de section connue est appliqué sur la surface à analyser ; on y
introduit alors quelques ml de diluant stérile et après quelques secondes de contact, le diluant est retiré et
analysé.
b. Prélèvement de produits liquides
La technique varie avec le produit, le volume et la forme du contenant. Il faut néanmoins toujours s’assurer
de la parfaite homogénéisation du liquide (agitateurs) avant de prélever à la pipette (ou avec un flacon lesté
stérile ou autre) le volume nécessaire à l’analyse.
c. Prélèvement de produits solides
Selon le produit, le prélèvement sera effectué au scalpel, à la sonde (fromages et produits mous) ou à la
pipette harpon. La surface est souvent éliminée avant de procéder au prélèvement. Si le produit est
hétérogène (plats cuisinés, conserves etc.) il faut s’assurer de la bonne représentativité du prélèvement.

(a) grande pelle et pelle à main (b) et (c) sonde cylindrique (d) (e) échantillonneur de fond ou à soupape

6.4. Emballage et transport des échantillons

Quand le prélèvement aseptique a été réalisé, chaque échantillon doit être identifié ; toutes les informations
doivent figurer sur l’étiquette de prélèvement et être inscrites à l’aide d’un crayon à encre indélébile.
Identifier, si nécessaire, un code ou un numéro qui relie l’échantillon au lot d’origine. Noter la température
initiale, l’heure du prélèvement, la date et la température de transport. Les échantillons doivent être
immédiatement réfrigérés (dans une glacière propre) s’ils ne sont pas stables à température ambiante. Les
échantillons dont la conservation est assurée à température ambiante, tels les boîtes de conserve et les
produits secs, peuvent être expédiés sans réfrigération. Les échantillons sont alors transportés le plus
rapidement possible au laboratoire en maintenant les conditions initiales dans lesquelles se trouvait le
produit. L’analyse devrait être réalisée dans l’heure qui suit le prélèvement. Pour un produit congelé
s’assurer qu’il n’y ait pas de décongélation pendant le transport (ce produit peut être gardé pendant 1 mois
avant d’être analysé). La congélation d’un produit provoque une diminution plus ou moins importante du
nombre de germes qu’il contient. Il faut veiller à ce que la température du produit prélevé soit au moins
égale à -18°C, transporter le produit à cette température et décongeler à l’air ambiant à température voisine
de 20°C pendant un temps inférieur à 3 heures, temps suffisant pour atteindre une texture qui permette le
prélèvement.

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6.5. Préparation de l’échantillon
Quelle que soit la nature initiale du produit, l’analyse microbiologique s’effectue toujours à partir d’une
suspension. Après ouverture aseptique, l’échantillon sera « homogénéisé » (liquide) ou broyé dans un
volume connu de diluant stérile (solide) ce qui constitue en fait la première dilution.
Pour les produits liquides (ou semi-liquides) une agitation manuelle vigoureuse en présence de billes de
verre permet d’obtenir une homogénéité satisfaisante. Pour les produits solides diverses techniques de «
broyage » sont utilisables : Broyage manuel au Potter ou en présence de sable stérile ou de billes de verre
(mortier) ; ou broyage avec un broyeur électrique à couteaux. Au cours du broyage les germes doivent être
dispersés mais non détruits ; la température ne doit pas trop s’élever (le récipient peut être placé dans de la
glace). Le broyage s’effectue en général avec 10 volumes (ou 9) de diluant pour 1 “volume” de produit (par
exemple 10 g de produit et 100 ml (ou 90) de diluant stérile). Le diluant peut être de l’eau distillée, de l’eau
physiologique, du Ringer au 1/4 ou une solution tryptone-sel, etc.

(a) broyeur à main (mortier et pilon), (b) broyeur électrique à pédale type stomacher, (c) broyeur électrique
type mortier et pilon, (d) broyeur électrique type à couteaux.
6.6. Techniques de dilutions
Au cours de la préparation des échantillons (et des dilutions) les microorganismes peuvent être inhibés ou
même altérés par le changement du milieu lié à l’addition de diluant (changement de pH mais surtout de
force ionique). L’effet bactéricide de certains diluants est connu : ainsi Staphylococcus aureus est « tué » en
quelques heures dans de l’eau distillée de même que la plupart des entérobactéries (E. coli) ; il en est de
même pour Streptococcus pyogenes dans du sérum physiologique ou dans du Ringer au 1/4 et pour
Escherichia coli dans de l’eau salée à 8,5‰. Actuellement il paraît souhaitable, sauf indication
complémentaire à un type donné de produit à analyser, de réaliser les préparations et les dilutions des
échantillons à analyser dans une solution de tryptone sel. Tous ces diluants (tableau 1) sont stérilisés à
121°C pendant 20 minutes.

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Les dilutions nécessitent la présence de nombreux tubes à essais contenant le plus souvent 9 ml de diluant
stérile et de nombreuses pipettes stériles de 1 et 10 ml. Les pipettes peuvent être remplacées par des
systèmes de pipetage automatique munis de cônes à usage unique.

Toutes les manipulations sont à effectuer avec toutes les précautions d’asepsie exigées en microbiologie.
L’introduction éventuelle d’un contaminant ou la contamination de l’opérateur ne doivent jamais se
produire.
Le récipient contenant le liquide à diluer est agité manuellement avec précaution pour éviter les projections
pendant une dizaine de secondes. On prélève stérilement 1 ml de ce liquide (aspirer et refouler une fois
avant le prélèvement) que l’on introduit dans un tube contenant 9 ml de diluant stérile. Le tube est agité par
des mouvements de rotation ou au moyen d’un Vortex. On obtient ainsi une dilution au 1/10. Avec une
nouvelle pipette de 1 ml on prélève 1 ml de cette dilution que l’on introduit dans un nouveau tube de diluant
de 9 ml ; on obtient une dilution au 1/100 et ainsi de suite jusqu’au niveau de dilution recherché.
6.7. La revivification
Les micro-organismes sont souvent « endommagés » mais non tués au cours des traitements technologiques
(déshydratation, chaleur, froid, etc.) appliqués aux produits alimentaires ou par suite de leur vieillissement.
Ces altérations se reflètent dans certaines de leurs propriétés physiologiques en particulier au niveau de leur
phase de latence qui est augmentée ou de leurs besoins nutritionnels ou encore quant à leur sensibilité aux
conditions de milieu défavorables (pH, sels biliaires, colorants, sels, etc.). En général ces altérations sont
réversibles et après leur disparition les bactéries récupèrent leurs propriétés initiales, en particulier au niveau
de leur croissance ou de leur pouvoir pathogène. La nécessité de faciliter le « rétablissement » des cellules
ayant subi des altérations sublétals, c’est-à- dire leur « réanimation » ou encore leur revivification, s’impose
avant de les soumettre à des milieux sélectifs souvent peu favorables à la croissance du fait de la présence
d’inhibiteurs. En effet, la présence de cellules endommagées peut entraîner des variations dans les
numérations ou porter à croire qu’il n’y a pas ou peu de germes et donc pas ou aucun risque pour le
consommateur. Ceci est particulièrement important quand il s’agit de déterminer si des micro-organismes
pathogènes ou indicateurs sont présents ou non.

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7. Techniques classiques de numérations
Le terme « dénombrement d’une flore » signifie que l’analyse microbiologique doit permettre de quantifier
dans l’échantillon une flore particulière. Le résultat d’une telle analyse quantitative est rendu sous forme
d’une concentration en micro-organismes (appartenant à une flore particulière) par unité de masse ou de
volume d’échantillon. Bien que de nombreuses techniques de numération soient utilisables, il n’existe pas à
l’heure actuelle de technique parfaite. Certaines méthodes ne permettent pas de différentier les germes
vivants des germes morts, d’autres s’avèrent incapables de compter individuellement les cellules
microbiennes lorsque celles-ci sont associées (Staphylococcus, Streptococcus, mycélium, etc) et permettent
d’évaluer des unités formant colonies (UFC) ou des unités formant trouble (UFT).
Il s’agit d’un dénombrement par observation directe ; la numération cellulaire est réalisée par comptage au
microscope, à l’aide d’une lame de comptage spéciale ou cellule de numération ou hématimètre (Cellule de
Malassez).
8. Réalisation du contrôle
La maîtrise de la qualité microbiologique (hygiénique obligatoire et marchande souhaitée par le fabricant
mais aussi le consommateur) passe par un ensemble de démarches qui vont du contrôle (des matières
premières brutes, en cours de transformation ou de produit fini) aux pratiques de bonnes fabrications en
passant par l’identification des principaux points critiques du système de production / distribution, le plus
souvent par une démarche HACCP (Hazard Analysis Critical Control Point ou système d'analyse des
dangers et points critiques). Ces analyses prennent aujourd’hui largement place dans la plupart des usines et
des réseaux de distribution et permettent (par la réalisation de contrôles judicieux, une bonne évaluation de
la qualité et une mise en évidence d’éventuelles contaminations) les actions correctives qui en découlent.
8.1. Contrôle des matières premières
Le contrôle microbiologique des matières premières doit permettre de vérifier que celles-ci ne renferment
pas de microorganismes risquant de gêner le déroulement de la fabrication ou, de microorganismes qui, ne
pouvant être éliminés par les technologies mises en œuvre, pourraient altérer le produit fini. Il faut distinguer
les biotechnologies comprenant une étape de fermentation ou non.
- Avec fermentation
Pour qu’une fermentation se déroule dans de bonnes conditions, il faut, théoriquement, ensemencer le levain
dans un milieu stérile, sauf dans des cas particuliers où la fermentation est conduite avec des
microorganismes indigènes. Le contrôle des matières premières dans les industries de fermentation est
ramené le plus souvent, à un contrôle de stérilité ou à un contrôle de propreté microbiologique du milieu. En
effet, si pour certaines industries (antibiotiques, acides aminés,) le milieu doit être stérile, pour d’autres,
comme la brasserie, un milieu faiblement contaminé peut être utilisé, mais il ne faut pas qu’il renferme de
microorganismes spécifiquement dangereux pour cette industrie.
- Sans fermentation
Dans le cas de bio-industries ne mettant pas en œuvre une fermentation (technologie enzymatique), la
qualité microbiologique doit être maintenue à l’aide des facteurs physico-chimiques habituels : pH, activité
de l’eau (Aw), température. Au niveau des matières premières, les contrôles microbiologiques consistent à
rechercher les microorganismes potentiellement dangereux.
8.2. Contrôle de la fabrication

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Dans les industries de fermentation, les contrôles consistent essentiellement à apprécier l’évolution des
populations microbiennes dans le milieu au cours du temps, aussi bien le développement du levain que
l’apparition et le développement des contaminants.
Pour ces contrôles, les techniques microscopiques sont les plus utilisées :
- La technique du compte-cellule permet de faire une numération approximative des cellules de levain et
donc permet de vérifier son développement. Les techniques de coloration (gram, bleu de méthylène)
permettent d’évaluer une contamination bactérienne dans le cas de levains à champignons (levures ou
moisissures) mais aussi dans le cas des levains bactériens par les différences de formes ou de Gram des
contaminants par rapport aux bactéries du levain.
- La technique d’immunofluorescence peut être utilisée pour la recherche de contaminations bactériennes
dans les moûts de fermentation.
- la cytométrie de flux permet de détecter plusieurs types de microorganismes séparément (ex, des bactéries
et des levures). Cela peut être appliqué au suivi de fermentation en culture pure (détection de contaminants)
ou en culture mixte (évaluation simultanée du développement de chaque population).
- les méthodes de culture peuvent être utilisées quand un délai de réponse est toléré.
- Dans les industries utilisant des cultures aérées, des contrôles sur l’efficacité des systèmes de filtration
stérilisante de l’air sont nécessaires.
- Dans les industries ne présentant pas une étape de fermentation, les paramètres de transformation (s’ils
sont bien maitrisés) ne permettent que quelques développements microbiens. Au cours de ces processus, le
contrôle microbiologique porte sur la recherche de germes dangereux.
8.3. Contrôle du nettoyage et de la désinfection
Entre deux fabrications, les locaux et les installations doivent être nettoyés et désinfectés avant d’être
réutilisés. Les barèmes de désinfection (nature du produit, concentration/temps de contact) sont définis en
fonction de la nature et du nombre de microorganismes à détruire. Différentes techniques sont applicables
suivant les matériels à contrôler.
- Pour les contrôles microbiologiques des surfaces, les techniques les plus utilisées sont les techniques par
impression. Elles consistent à prélever les germes de ces surfaces par contact direct avec le milieu de culture
qui sert à les révéler. Cette technique peut être mise en œuvre avec les boites « contact » ou tampon de
gélose ou avec les lames gélosées. Ces lames existent avec différents milieux de culture selon le type de
microorganismes recherchés.

Lames gélosées
Pour le contrôle de dispositifs moins accessibles (robinet, canules, …), il est recommandé d’utiliser la
technique d’écouvillonnage :

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 L’écouvillon imprégné de liquide stérile est frotté sur le dispositif à contrôler puis immerger et agité dans
un liquide stérile.
L’analyse de ce liquide est effectuée par des techniques classiques et donne des indications sur le niveau de
contamination et la nature des germes présents.
La technique d’ATP métrie est bien adaptée au contrôle des traitements de nettoyage-désinfection. Dans ce
cas, un écouvillonnage est effectué sur le matériel ou la surface à contrôler.
L’ATP est ensuite mesurée sur la solution de rinçage de l’écouvillon. Cette valeur représente aussi bien
l’ATP microbien que l’ATP de cellules animales ou végétales et est donc un indice de propreté de la surface
contrôlée.
- l’air renferme des particules (poussières) sur lesquelles les microbes (levures et moisissures le plus
souvent à l’état de spores et aussi des bactéries) sont adsorbés. Selon leur concentration (nombre de
microorganismes/unité de volume d’air), ils représentent un risque plus ou moins élevé de contamination
secondaire. Différents phénomènes sont à l’origine de la contamination de l’air :
-la manipulation de certaines matières (ex. les graines) qui émettent une grande quantité de poussière. Les
emballages sont souvent des sources importantes de contamination. Les personnes sont aussi responsables
de la dissémination de particules certaines étant chargées de microorganismes. Il est donc intéressant de faire
des contrôles microbiologiques sur l’air ambiant.
La technique la plus simple consiste à déposer des boites de Pétri contenant un milieu gélosé, ouvertes aux
endroits à contrôler. Cette technique, si elle est appliquée à des intervalles de temps réguliers, de suivre une
évolution et donc mettre en évidence une augmentation de la charge microbienne de l’air. En outre, il existe
des appareils utilisés pour le contrôle de l’air de façon plus rationnelle.
Toutes les techniques de contrôle de la désinfection du matériel et de l’air ambiant ne conduisent pas à des
valeurs absolues. Il convient donc de standardiser les délais opératoires pour que les résultats aient une
signification relative et donnent une idée de l’évolution de la qualité microbiologique des matériels et des
locaux.
8.4. Contrôle des produits finis
Les contrôles microbiologiques des produits finis portent sur leur qualité hygiénique et leur qualité
marchande, et sont plus ou moins importants suivant la nature des produits et leur destination. En effet, dans
certains cas, le contrôle est ramené à une recherche de quelques microorganismes dangereux pour le produit
mais dans d’autres cas, le produit devant être stérile (produits destinés aux injections intraveineuses, par
exemple) les contrôles sont beaucoup plus nombreux et sévères. Par ailleurs, il existe pour certains produits
des normes ou des critères de qualité microbiologique : les contrôles porteront alors sur ces paramètres.
L’analyse microbiologique traditionnelle des produits finis est quand même indispensable car elle permet
avec une certaine inertie d’éviter, dans le cas où des produits dangereux ou non conformes seraient
fabriqués, leur commercialisation ou leur consommation. Ce type de contrôle souvent pratiqué par des
laboratoires officiels (Contrôle et Répression des Fraudes) n’est pas préventif et ne permet pas de maîtriser
la qualité microbiologique des produits fabriqués. Utilisé seul, il se révèle sans grand intérêt et souvent
même inutile si sa mise en œuvre est longue et sans suite.

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