NM EN 17362

Norme Marocaine IC 08.1.669

2021

ICS : 65.120

Aliments des animaux

ne
Méthodes d’échantillonnage et d’analyse

ai
oc
Détermination de la teneur en pentaclorophénol
(PCP) dans les matières premières pour aliments
des animaux et les aliments composés pour

ar
animaux par CL-SM/SM
m
e
Norme Marocaine homologuée
rm

Par Décision du Directeur de l'Institut Marocain de Normalisation N°........., publiée au B.O. N°

2021.
no
de

Correspondance
La présente norme nationale est identique à l'EN 17362:2020 et est reproduite avec la
permission du CEN, Avenue Marnix 17, B-1000 Bruxelles.
et

Tous droits d’exploitation des Normes Européennes sous quelque forme que ce soit
et par tous moyens sont réservés dans le monde entier au CEN et à ses
oj

Membres Nationaux, et aucune reproduction ne peut être engagée sans permission

explicite et par écrit du CEN par l’IMANOR.
Pr

Droits d'auteur
Droit de reproduction réservés sauf prescription différente aucune partie de cette publication ne peut
être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé électronique ou
mécanique y compris la photocopie et les microfilms sans accord formel. Ce document est à usage
exclusif et non collectif des clients de l'IMANOR, Toute mise en réseau, reproduction et rediffusion, sous
quelque forme que ce soit, même partielle, sont strictement interdites.

Institut Marocain de Normalisation (IMANOR) © IMANOR 2021 – Tous droits réservés

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NM EN 17362:2021

Avant-Propos National

L’Institut Marocain de Normalisation (IMANOR) est l’Organisme National de Normalisation. Il a été

créé par la Loi N° 12-06 relative à la normalisation, à la certification et à l’accréditation sous forme d’un
Etablissement Public sous tutelle du Ministère chargé de l’Industrie et du Commerce.

Les normes marocaines sont élaborées et homologuées conformément aux dispositions de la

ne
Loi N° 12- 06 susmentionnée.

La présente norme marocaine a été reprise de la norme européenne EN conformément à

ai
l’accord régissant l’affiliation de l’Institut Marocain de Normalisation (IMANOR) au Comité
Européen de Normalisation (CEN).

oc
Tout au long du texte du présent document, lire « … la présente norme européenne … » avec le
sens de « … la présente norme marocaine… ».

Toutes les dispositions citées dans la présente norme, relevant du dispositif réglementaire

ar
européen (textes réglementaires européens, directives européennes, étiquetage et marquage CE, …)
sont remplacés par les dispositions réglementaires ou normatives correspondantes en vigueur au
niveau national, le cas échéant.
m
La présente norme marocaine NM EN 17362 a été examinée et adoptée par la Commission de
Normalisation des aliments pour animaux (089).
e
rm
no
de
et
oj
Pr
 NM EN 17362:2021

NORME EUROPÉENNE EN 17362

EUROPÄISCHE NORM
EUROPEAN STANDARD Avril 2020

ICS 65.120

Version Française

e
Aliments pour animaux : Méthodes d'échantillonnage et

in
d'analyse - Détermination de la teneur en
pentachlorophénol (PCP) dans les matières premières

ca
pour aliments des animaux et les aliments composés pour
animaux par CL-SM/SM

o
Futtermittel: Probenahme- und Animal feeding stuffs: Methods of sampling and

ar
Untersuchungsverfahren - Bestimmung von analysis - Determination of pentachlorophenol (PCP) in
Pentachlorphenol (PCP) in Futtermittel und feed materials and compound feed by LC-MS/MS
Mischfuttermittel mittels LC-MS/MS

m
La présente Norme européenne a été adoptée par le CEN le 7 mars 2020.

Les membres du CEN sont tenus de se soumettre au Règlement Intérieur du CEN/CENELEC, qui définit les conditions dans
e
lesquelles doit être attribué, sans modification, le statut de norme nationale à la Norme européenne. Les listes mises à jour et les
références bibliographiques relatives à ces normes nationales peuvent être obtenues auprès du Centre de Gestion du CEN-
rm

CENELEC ou auprès des membres du CEN.

La présente Norme européenne existe en trois versions officielles (allemand, anglais, français). Une version dans une autre
langue faite par traduction sous la responsabilité d'un membre du CEN dans sa langue nationale et notifiée au Centre de Gestion
du CEN-CENELEC, a le même statut que les versions officielles.
no

Les membres du CEN sont les organismes nationaux de normalisation des pays suivants: Allemagne, Autriche, Belgique, Bulgarie,
Chypre, Croatie, Danemark, Espagne, Estonie, Finlande, France, Grèce, Hongrie, Irlande, Islande, Italie, Lettonie, Lituanie,
Luxembourg, Malte, Norvège, Pays-Bas, Pologne, Portugal, République de Macédoine du Nord, République de Serbie, République
Tchèque, Roumanie, Royaume-Uni, Slovaquie, Slovénie, Suède, Suisse et Turquie.
e
td
je
o
Pr

COMITÉ EUROPÉEN DE NORMALISATION

EUROPÄISCHES KOMITEE FÜR NORMUNG
EUROPEAN COMMITTEE FOR STANDARDIZATION

CEN-CENELEC Management Centre: Rue de la Science 23, B-1040 Bruxelles

© 2020 CEN Tous droits d'exploitation sous quelque forme et de quelque manière Réf. n° EN 17362:2020 F
que ce soit réservés dans le monde entier aux membres nationaux du
CEN.
 NM EN 17362:2021

EN 17362:2020 (F)

Sommaire
Page

Avant-propos européen .............................................................................................................................................. 3

1 Domaine d’application .................................................................................................................................. 4

ne
2 Références normatives ................................................................................................................................. 4
3 Termes et définitions..................................................................................................................................... 4

ai
4 Principe............................................................................................................................................................... 7
5 Réactifs et matériaux ..................................................................................................................................... 7

oc
5.1 Généralités......................................................................................................................................................... 7
5.2 Produits chimiques......................................................................................................................................... 7
6 Appareillage ................................................................................................................................................... 10

ar
7 Échantillonnage ............................................................................................................................................ 11
8 Préparation de l’échantillon pour essai............................................................................................... 12
9
9.1
9.2
m
Mode opératoire ........................................................................................................................................... 12
Généralités...................................................................................................................................................... 12
Prises d’essai et extraction ....................................................................................................................... 12
e
9.3 CL-SM/SM ........................................................................................................................................................ 13
rm

10 Calcul et expression des résultats .......................................................................................................... 14

10.1 Généralités...................................................................................................................................................... 14
10.2 Critères d’étalonnage.................................................................................................................................. 14
10.3 Identification et confirmation ................................................................................................................. 14
no

10.4 Calculs .............................................................................................................................................................. 14

10.5 Taux de récupération ................................................................................................................................. 15
11 Fidélité ............................................................................................................................................................. 15
11.1 Essai interlaboratoires............................................................................................................................... 15
de

11.2 Limite de répétabilité ................................................................................................................................. 16

11.3 Limite de reproductibilité......................................................................................................................... 16
12 Rapport d’essai ............................................................................................................................................. 16
Annexe A (informative) Essai interlaboratoires ............................................................................................ 17
et

Bibliographie ............................................................................................................................................................... 19
oj
Pr

2
 NM EN 17362:2021

EN 17362:2020 (F)

Avant-propos européen

Le présent document (EN 17362:2020) a été élaboré par le Comité Technique CEN/TC 327 « Aliments
des animaux : Méthodes d’échantillonnage et d’analyse », dont le secrétariat est tenu par le NEN.

Ce document devra recevoir le statut de norme nationale, soit par publication d’un texte identique, soit
par entérinement, au plus tard en octobre 2020, et toutes les normes nationales en contradiction devront
être retirées au plus tard en octobre 2020.

ne
L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. Le CEN ne saurait être tenu pour responsable de
ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.

ai
Le présent document a été élaboré en réponse à une demande de normalisation soumise au CEN par la

oc
Commission Européenne et l’Association Européenne de Libre Échange.

Selon le règlement intérieur du CEN/CENELEC, les organismes de normalisation nationaux des pays
suivants sont tenus de mettre ce document en application : Allemagne, Autriche, Belgique, Bulgarie,

ar
Chypre, Croatie, Danemark, Espagne, Estonie, Finlande, France, Grèce, Hongrie, Irlande, Islande, Italie,
Lettonie, Lituanie, Luxembourg, Malte, Norvège, Pays-Bas, Pologne, Portugal, République de Macédoine
du Nord, République Tchèque, Roumanie, Royaume-Uni, Serbie, Slovaquie, Slovénie, Suède, Suisse et
Turquie. m
e
rm
no
de
et
oj
Pr

3
 NM EN 17362:2021

EN 17362:2020 (F)

1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode de chromatographie en phase liquide couplée à la détection
par spectrométrie de masse triple quadripôle (SM/SM) pour la détermination de la teneur en
pentachlorophénol (PCP) dans les matières premières pour aliments des animaux et les aliments
composés pour animaux.
La limite de quantification (LOQ) applicable à la détermination de la teneur en PCP dans la gomme de
guar, les distillats d’acides gras (FAD) et les aliments composés pour animaux est de 10 µg/kg. Chaque

ne
laboratoire est tenu de s’assurer que l’équipement qu’il utilise atteindra cette limite de quantification.
La méthode a été validée lors d’un essai interlaboratoires international portant sur le pentachlorophénol
présent dans les aliments composés pour animaux, la gomme de guar et les distillats d’acides gras dans

ai
la gamme allant de 9 µg/kg à 22 µg/kg.
Les résultats de l’essai interlaboratoires, auquel ont participé 16 laboratoires, ont montré que la méthode

oc
est applicable à la détermination de la teneur en PCP dans les aliments composés pour animaux, la gomme
de guar et les FAD à la limite souhaitée de 10 µg/kg. Des résultats satisfaisants ont été obtenus pour un
échantillon d’aliment composé, la gomme de guar et les deux échantillons de FAD (HorRat < 2), alors
qu’une valeur de HorRat de 2,2 a été obtenue pour le deuxième échantillon d’aliment composé.

ar
2 Références normatives
m
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des exigences
du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les références non
datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels amendements).
e
EN ISO 6498, Aliments des animaux ― Lignes directrices pour la préparation des échantillons
rm

(ISO 6498:2012)

3 Termes et définitions
no

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes :
— IEC Electropedia : disponible à l’adresse http://www.electropedia.org/
de

— ISO Online browsing platform : disponible à l’adresse https://www.iso.org/obp

3.1
et

étalonnage
ensemble des opérations estimant, dans des conditions spécifiées, la fonction d’étalonnage à partir
d’observations de la variable de réponse obtenues sur des états de référence
oj

[SOURCE : ISO 3534-2:2006, 3.5.13 [1]]

Pr

3.2
essai interlaboratoires
comparaison interlaboratoires
organisation, exécution et évaluation de mesurages ou d’essais sur la même entité ou sur des entités
similaires par deux laboratoires ou plus selon des conditions prédéterminées

[SOURCE : EN ISO/IEC 17043:2010, 3.4 [2]]

4
 NM EN 17362:2021

EN 17362:2020 (F)

3.3
matières premières pour aliments des animaux
produits d’origine végétale ou animale dont l’objectif principal est de satisfaire les besoins nutritionnels
des animaux, à l’état naturel, frais ou conservés, et les dérivés de leur transformation industrielle, ainsi
que les substances organiques ou inorganiques, comprenant ou non des additifs pour l’alimentation
animale, qui sont destinés à être utilisés pour l’alimentation des animaux par voie orale, soit directement
en l’état, soit après transformation, ou pour la préparation d’aliments composés pour animaux ou en tant
que supports des prémélanges

ne
[SOURCE : Règlement (CE) n° 767/2009 (Article 3(2)(g)) [3]]

3.4

ai
HorRat
rapport de l’écart-type de reproductibilité relatif à la valeur calculée à partir de l’équation Horwitz

oc
Note 1 à l’article : Écart-type relatif prévu PRSDR = 2 C–0,15

HorRatR = RSDR / PRSDR (1)

ar
HorRatr = RSDr / PRSDr (2)

Note 2 à l’article : S’il est appliqué à des études intralaboratoires, la plage normale du HorRat(r) est de 0,30 à 1,30.
m
Note 3 à l’article : Pour vérifier le calcul approprié de l’écart-type PRSDR, il convient qu’une concentration C de 10−6
donne un PRSDR de 16 %. C est la concentration exprimée sous forme de fraction massique (le numérateur et le
e
dénominateur étant exprimés dans les mêmes unités). Le HorRat est un indicateur de performance de la méthode
pour une large majorité de méthodes en chimie. Ses valeurs normales sont comprises entre 0,50 et 2,00.
rm

[SOURCE : ISO 16577:2016, 3.75 [4]]

3.5
no

limite de quantification
valeur mesurée, obtenue par une procédure de mesure donnée, qui correspond à la plus petite
concentration d’un mesurande pouvant être déterminée avec un niveau acceptable de fidélité sous des
conditions de répétabilité et de justesse
de

Note 1 à l’article : La « limite de quantification » ne fait pas partie des concepts définis dans l’ISO/IEC Guide 99:2007
[5], mais elle a été définie comme indiqué ci-dessus.

Note 2 à l’article : L’abréviation LOQ est parfois utilisée.

et

3.6
fidélité
oj

étroitesse de l’accord entre les indications ou les valeurs mesurées obtenues par des mesurages répétés
du même objet ou d’objets similaires dans des conditions spécifiées
Pr

Note 1 à l’article : La fidélité est en général exprimée numériquement par des caractéristiques telles que l’écart-
type, la variance ou le coefficient de variation dans les conditions spécifiées.

Note 2 à l’article : Les conditions spécifiées peuvent être, par exemple, des conditions de répétabilité, des conditions
de fidélité intermédiaire ou des conditions de reproductibilité (voir l’ISO 5725-1 [6]).

Note 3 à l’article : La fidélité sert à définir la répétabilité de mesure, la fidélité intermédiaire de mesure et la
reproductibilité de mesure.

5
 NM EN 17362:2021

EN 17362:2020 (F)

Note 4 à l’article : Le terme « fidélité de mesure » est quelquefois utilisé improprement pour désigner l’exactitude
de mesure.

[SOURCE : ISO IEC Guide 99:2007, 2.15 [5]]

3.7
répétabilité
fidélité sous des conditions de répétabilité

ne
Note 1 à l’article : La répétabilité peut s’exprimer quantitativement à l’aide des caractéristiques de dispersion des
résultats.

[SOURCE : ISO 3534-2:2006, 3.3.5 [1]]

ai
3.8

oc
limite de répétabilité
r
différence critique de répétabilité pour une probabilité spécifiée de 95 %

ar
[SOURCE : ISO 3534-2:2006, 3.3.9 [1]]

3.9
écart-type de répétabilité m
écart-type des résultats d’essai ou résultats de mesure obtenus sous des conditions de répétabilité
e
Note 1 à l’article : C’est une mesure de la dispersion de la loi des résultats d’essai ou de mesure sous des conditions
de répétabilité.
rm

Note 2 à l’article : On peut définir de façon similaire la « variance de répétabilité » et le « coefficient de variation de
répétabilité » et les utiliser comme mesures de la dispersion des résultats d’essai ou de mesure sous des conditions
de répétabilité.
no

[SOURCE : ISO 3534-2:2006, 3.3.7 [1]]

3.10
reproductibilité
de

fidélité sous des conditions de reproductibilité

Note 1 à l’article : La reproductibilité peut s’exprimer quantitativement à l’aide des caractéristiques de dispersion
des résultats.
et

Note 2 à l’article : Les résultats considérés sont habituellement des résultats corrigés.
oj

[SOURCE : ISO 3534-2:2006, 3.3.10 [1]]

3.11
Pr

limite de reproductibilité
R
différence critique de reproductibilité pour une probabilité spécifiée de 95 %

[SOURCE : ISO 3534-2:2006, 3.3.14 [1]]

6
 NM EN 17362:2021

EN 17362:2020 (F)

3.12
écart-type de reproductibilité
écart-type des résultats d’essai ou résultats de mesure obtenus sous des conditions de reproductibilité

Note 1 à l’article : C’est une mesure de la dispersion de la loi des résultats d’essai ou de mesure sous des conditions
de reproductibilité.

Note 2 à l’article : On peut définir de façon similaire la « variance de reproductibilité » et le « coefficient de variation
de reproductibilité » et les utiliser comme mesures de la dispersion des résultats d’essai ou de mesure sous des

ne
conditions de reproductibilité.

[SOURCE : ISO 3534-2:2006, 3.3.12 [1]]

ai
4 Principe

oc
Pour vérifier la présence de PCP, une prise d’essai d’échantillon est fortifiée avec des étalons internes
(13C-PCP). La prise d’essai est extraite d’après une approche QuEChERS pour les aliments composés pour
animaux et les FAD.

ar
Une approche QuEChERS « en phase inverse » est utilisée pour la gomme de guar. Pour les échantillons
de FAD, les lipides sont éliminés avant l’extraction QuEChERS en ajoutant de l’acide sulfurique.
Les extraits finaux de toutes les matrices sont analysés par chromatographie en phase liquide couplée à
m
la spectrométrie de masse triple quadripôle, par ionisation en électrospray en mode négatif.
L’identification est effectuée d’après le temps de rétention et le rapport masse/charge. La quantification
est réalisée par la méthode de l’étalonnage interne.
e
rm

5 Réactifs et matériaux
5.1 Généralités
no

Utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue et d’une pureté compatible avec l’analyse
de résidus organochlorés. Vérifier leur pureté en réalisant un essai à blanc dans les mêmes conditions
que celles utilisées dans la méthode. Il convient que le chromatogramme ne révèle aucune impureté
interférente au temps de rétention des composés concernés.
de

5.2 Produits chimiques

5.2.1 Diéthylamine (DEA)

5.2.2 Acétonitrile (ACN)

et

5.2.3 Méthanol
oj

5.2.4 Acétone
Pr

5.2.5 n-Hexane

5.2.6 Acide sulfurique (concentré, 95 % – 98 %)

5.2.7 Eau déminéralisée

7
 NM EN 17362:2021

EN 17362:2020 (F)

5.2.8 Hydroxyde de sodium

5.2.8.1 Solution d’hydroxyde de sodium (10 M)

Peser 4 g d’hydroxyde de sodium (5.2.8) et ajouter 10 ml d’eau déminéralisée (5.2.7) pour atteindre une
concentration de 10 M. Conserver à température ambiante dans un flacon en verre hermétique fermé par
un bouchon en plastique.
5.2.9 Sulfate de magnésium

ne
5.2.10 Chlorure de sodium

5.2.11 Acide formique

ai
5.2.12 Formiate d’ammonium

oc
5.2.12.1 Solution de formiate d’ammonium (1 M)

Peser 6,3 g de formiate d’ammonium (5.2.12) et ajouter 100 ml d’eau déminéralisée (5.2.7) pour

ar
atteindre une concentration de 1 M. Conserver la solution à température ambiante. La solution est stable
dans ces conditions pendant au moins 1 mois.
5.2.13 Phase mobile A
m
Prélever 1 ml de solution de formiate d’ammonium (1 M) (5.2.12.1) et ajouter 999 ml d’eau
déminéralisée (5.2.7) et 20 µl d’acide formique (5.2.11). Bien mélanger. Conserver la solution à
e
température ambiante. La solution est stable dans ces conditions pendant au moins 1 mois.
rm

5.2.14 Phase mobile B

Prélever 1 ml de solution de formiate d’ammonium (1 M) (5.2.12.1) et ajouter 50 ml d’eau déminéralisée

(5.2.7), 949 ml de méthanol (5.2.3) et 20 µl d’acide formique (5.2.11). Bien mélanger. Conserver la
no

solution à température ambiante. La solution est stable dans ces conditions pendant au moins 1 mois.
5.2.15 Pentachlorophénol (sel sodique de PCP, pureté de 95 %)

5.2.15.1 Solution mère de PCP 1 (2 000 µg/ml)

de

Peser 25 mg (± 0,01 mg) de PCP (5.2.15) (en prenant en compte les impuretés) et ajouter 12,5 ml d’eau
déminéralisée (5.2.7) pour atteindre une concentration de 2 000 µg/ml. Conserver la solution au
réfrigérateur à 4 °C (± 3 °C). La solution est stable dans ces conditions pendant au moins 12 mois.
et

5.2.15.2 Solution mère de PCP 2 (1 ng/µl)

Dans une fiole jaugée (5.2.20), diluer 50 µl de solution mère de PCP 1 (5.2.15.1) dans 100 ml d’eau
oj

déminéralisée (5.2.7). Conserver la solution au réfrigérateur à 4 °C (± 3 °C). La solution est stable dans
ces conditions pendant au moins 12 mois.
Pr

5.2.15.3 Solution de travail de PCP 1 (0,1 ng/µl)

Prélever 100 µl de solution mère de PCP 2 (5.2.15.2) et ajouter 900 µl d’acétonitrile (5.2.2). Préparer cette
solution extemporanément.
5.2.15.4 Solution de travail de PCP 2 (0,01 ng/µl)

Prélever 50 µl de solution de travail de PCP 1 (5.2.15.3). Ajouter 450 µl d’acétonitrile (5.2.2). Préparer
cette solution extemporanément.

8
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EN 17362:2020 (F)

5.2.16 13C6-pentachlorophénol de pureté certifiée (> 99 %, 100 ng/µl dans du nonane) comme
étalon interne

5.2.16.1 Solution mère de 13C6-PCP (10 ng/µl)

Prélever 1 ml de 13C6-PCP à 100 ng/µl (5.2.16) et diluer à 10 ml avec de l’acétone (5.2.4) dans une fiole
jaugée (5.2.20). Bien mélanger. Conserver la solution au réfrigérateur à 4 °C (± 3 °C). La solution est stable
dans ces conditions pendant au moins 12 mois.

ne
5.2.16.2 Solution de travail de 13C6-PCP 1 (1 ng/µl)

Prélever 100 µl de solution mère de 13C6-PCP (5.2.16.1) et ajouter 900 µl d’acétonitrile (5.2.2). La solution
est stable dans ces conditions pendant au moins 12 mois.

ai
5.2.16.3 Solution de travail de 13C6-PCP 2 (0,1 ng/µl)

oc
Prélever 50 µl de solution de travail de 13C6-PCP 1 (5.2.16.2) et ajouter 450 µl d’acétonitrile (5.2.2).
Préparer cette solution extemporanément.
5.2.17 Solutions d’étalonnage

ar
Préparer des solutions d’étalonnage conformément au Tableau 1 dans un volume final de 1,0 ml
d’acétonitrile. La plage de concentrations peut être adaptée en fonction des concentrations attendues

Préparer ces solutions extemporanément.

m
dans l’échantillon, tant que la plage est linéaire. Conserver les solutions d’étalonnage à 4 °C (± 3 °C).

Tableau 1 — Solutions d’étalonnage

e
Niveau Concentration PCP PCP PCP Étalon ACN
rm

ng/ml 0,01 ng/µl 0,1 ng/µl 1 ng/µl interne (5.2.2)

(5.2.15.4) (5.2.15.3) (5.2.15.2) 0,1 ng/µl
(5.2.16.3)
1 0 20 µl 980 µl
no

2 0,1 10 µl 20 µl 970 µl
3 0,5 50 µl 20 µl 930 µl
4 1,0 10 µl 20 µl 970 µl
de

5 5,0 50 µl 20 µl 930 µl
6 10 100 µl 20 µl 880 µl
et

7 40 40 µl 20 µl 940 µl

5.2.18 Tube à centrifuger avec bouchon à vis en polypropylène (PP), 50 ml

oj

5.2.19 Tube en verre avec bouchon à vis (revêtement en polytétrafluoroéthylène (PTFE)), 12 ml

Pr

5.2.20 Fiole jaugée, 10 ml

5.2.21 Fiole jaugée, 100 ml

5.2.22 Flacon CL-SM, 2 ml

5.2.23 Papier pH, plage de 0 à 14 ou autre plage d’essai appropriée

9
 NM EN 17362:2021

EN 17362:2020 (F)

6 Appareillage
6.1 Balance analytique, d’une précision de 0,1 mg

6.2 Centrifugeuse

6.3 Bain-marie

6.4 Chromatographe en phase liquide raccordé à un spectromètre de masse triple quadripôle

ne
6.4.1 Conditions de CL

Le chromatographe en phase liquide est équipé d’une colonne Symmetry C18 (5 µm, 3,0 mm × 150 mm)

ai
ou d’une colonne comparable. Le débit de la phase mobile est maintenu constant à 500 µl/min, tandis que
la colonne est maintenue à 40 °C. Le volume injecté est de 20 µl.

oc
Le programme de gradient des phases mobiles A et B (5.2.13 et 5.2.14, respectivement) est indiqué dans
le Tableau 2.

ar
Tableau 2 — Gradient des phases mobiles pour l’analyse CL-SM/SM
Temps Phase mobile A Phase mobile B Débit
[min]
0
1
[%]
55
55
m [%]
45
45
[µl/min]
500
500
e
4 8 92 500
rm

9 8 92 500
9,5 55 45 500
no

16 55 45 500

6.4.2 Conditions de SM
de

Le spectromètre de masse doit pouvoir effectuer du Multiple Reaction Monitoring (MRM) et il convient
de le régler conformément à la description du fabricant. En mode SM/SM, aucune fragmentation du PCP
ne peut être observée au réglage maximal de l’énergie de collision. Par conséquent, un canal de transition
MRM peut être utilisé avec l’énergie de collision minimale en utilisant les mêmes masses pour la sélection
d’ions précurseurs et produits, afin de réduire le bruit de fond. Les paramètres du SM sont indiqués dans
et

le Tableau 3.
oj
Pr

10
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Tableau 3 — Paramètres du SM
Source
ESI négative
Capillaire (kV) 3,50
Cône (V) 30
Température de la source (°C) 120

ne
Température de désolvatation (°C) 350
Débit de gaz du cône (l/h) 200

ai
Débit de gaz de désolvatation (l/h) 600
Analyseur

oc
Résolution LM 1 12,5
Résolution HM 1 12,5

ar
Énergie ionique 1 1,0
Résolution LM 2 12,5
Résolution HM 2
Énergie ionique 2
m 12,5
1
e
Multiplicateur 750
rm

NOTE Il est recommandé d’optimiser ces réglages en

fonction de l’instrument utilisé. Les valeurs indiquées sont
données à titre indicatif.

Les fragments massiques sélectionnés sont indiqués dans le Tableau 4. Au moins une transition de
no

quantification et une transition de qualification doivent être mesurées.

NOTE Le qualificateur et le quantificateur de transition MRM peuvent être optimisés en fonction de
l’instrument utilisé.
de

Tableau 4 — Transitions MRM pour le PCP

Analyte Quantificateur Qualificateur Qualificateur Temps Cône Énergie de
de transition de transition de transition d’acquisition collision
MRM MRM 1 MRM 2
et

[s] [V]a [eV] a

PCP 262,8 > 262,8 264,8 > 264,8 266,8 > 266,8 0,2 30 7
oj

13C6-PCP 272,8 > 272,8 274,8 > 274,8 276,8 > 276,8 0,2 30 7
Pr

a Il convient d’optimiser les tensions du cône et les énergies de collision en fonction de l’instrument utilisé. Les valeurs
indiquées sont données à titre indicatif.

7 Échantillonnage
Pour être réellement représentatif, l’échantillon ne doit pas avoir été endommagé ou modifié pendant le
transport ou le stockage. L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans le présent
document. Une méthode d’échantillonnage recommandée est indiquée dans l’EN ISO 6497 [7].

11
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8 Préparation de l’échantillon pour essai

Préparer l’échantillon pour essai conformément à l’EN ISO 6498.
Il convient de broyer soigneusement les produits secs ou à faible teneur en eau, tels que les céréales et
les produits céréaliers, les aliments composés et le foin, de manière à ce que l’échantillon pour essai passe
à travers les mailles d’un tamis de 1 mm. Mélanger soigneusement.

9 Mode opératoire

ne
9.1 Généralités

Pour chaque série, analyser les échantillons suivants :

ai
1) blanc de mode opératoire ;

oc
2) matrice témoin (n = 1) ;

3) matrice témoin dopée (n = 2) ;

ar
4) tous les échantillons.

NOTE
m
Une matrice peut être de la gomme de guar, un distillat d’acides gras et/ou un aliment composé pour
animaux. Tout échantillon de matrice témoin ayant déjà été prouvé comme étant une matrice témoin lors d’un essai
précédent peut être utilisé pour le contrôle qualité.
e
9.2 Prises d’essai et extraction
rm

9.2.1 Gomme de guar

Peser 1,0 g (± 0,05 g) de l’échantillon pour essai préparé dans un tube à centrifuger avec bouchon à vis
en PP de 50 ml (5.2.18). Ajouter 10 ml d’acétonitrile (5.2.2) et agiter immédiatement pendant 10 s. Doper
no

l’échantillon avec 20 µl de solution de travail de 13C6-PCP 1 (1 ng/µl) (5.2.16.2). Ajouter 10 ml d’eau

déminéralisée (5.2.7) et agiter pendant 1 min. Ajouter les sels préalablement pesés [4 g de sulfate de
magnésium (5.2.9) et 1 g de chlorure de sodium (5.2.10)]. Agiter immédiatement pendant 1 min.
Centrifuger pendant 5 min à 2 000 g. Transvaser 1 ml de phase acétonitrile dans un flacon CL-SM (5.2.22).
de

9.2.2 Aliment composé pour animaux

Pour un aliment composé pour animaux humide, peser 10,0 g (± 0,10 g) de l’échantillon pour essai
préparé dans un tube à centrifuger avec bouchon à vis en PP de 50 ml (5.2.18), doper avec 20 µl de
et

solution de travail de 13C6-PCP 1 (1 ng/µl) (5.2.16.2) et laisser reposer pendant au moins 1 h.

Pour un aliment composé pour animaux sec, peser 2,5 g (± 0,10 g) de l’échantillon pour essai préparé
dans un tube à centrifuger avec bouchon à vis en PP de 50 ml (5.2.18), doper avec 20 µl de solution de
oj

travail de 13C6-PCP 1 (1 ng/µl) (5.2.16.2), ajouter 7,5 ml d’eau déminéralisée (5.2.7) et laisser reposer
pendant au moins 1 h.
Pr

Ajouter 10 ml d’acétonitrile (5.2.2) et agiter pendant 1 min. Ajouter les sels préalablement pesés [4 g de
sulfate de magnésium (5.2.9) et 1 g de chlorure de sodium (5.2.10)], et agiter vigoureusement
immédiatement pendant 1 min. Centrifuger pendant 5 min à 2 000 g. Transvaser 1 ml de phase
acétonitrile dans un flacon CL-SM (5.2.22).

12
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9.2.3 Distillat d’acides gras

Peser 1,0 g (± 0,05 g) de l’échantillon pour essai préparé dans un tube en verre avec bouchon à vis de
12 ml (revêtement en polytétrafluoroéthylène (PTFE)) (5.2.19). Doper l’échantillon avec 20 µl de
solution de travail de 13C6-PCP 1 (1 ng/µl) (5.2.16.2). Ajouter 5 ml d’hexane (5.2.5) et mélanger jusqu’à
dissolution de l’échantillon. Ajouter 1 ml d’acide sulfurique concentré (5.2.6). Placer les tubes dans un
bain-marie (6.3) chauffé à 60 °C pendant 30 min. Mélanger soigneusement toutes les 10 min.
Laisser les échantillons refroidir à température ambiante et centrifuger pendant 5 min à 700 g.

ne
Transvaser la phase organique dans un tube en verre propre (5.2.19).
Répéter l’extraction de l’acide sulfurique dans le premier tube, en utilisant une deuxième portion de 5 ml
d’hexane (5.2.5). Combiner les phases hexane dans le deuxième tube en verre. Ajouter 1 ml d’acide

ai
sulfurique concentré (5.2.6) aux phases hexane combinées. Placer les tubes dans un bain-marie (6.3)
chauffé à 60 °C pendant 30 min. Mélanger soigneusement toutes les 10 min. Laisser les échantillons
refroidir à température ambiante et centrifuger pendant 5 min à 700 g. Transvaser l’hexane dans un tube

oc
à centrifuger avec bouchon à vis en PP de 50 ml (5.2.18).
Répéter l’extraction de l’acide sulfurique dans le deuxième tube en verre, en utilisant une portion de 5 ml
d’hexane (5.2.5). Centrifuger pendant 5 min à 2 000 g. Transvaser et combiner l’hexane dans le tube à

ar
centrifuger avec bouchon à vis en PP de 50 ml. Ajouter 0,2 ml d’hydroxyde de sodium 10 M (5.2.8) et 5 ml
d’eau déminéralisée (5.2.7) à l’hexane combiné dans le tube. Agiter pendant 1 min et centrifuger pendant
5 min à 2 000 g. Transvaser l’hexane dans un deuxième tube à centrifuger avec bouchon à vis en PP de
50 ml (5.2.18). m
Ajouter 0,1 ml d’hydroxyde de sodium 10 M (5.2.8.1) et 5 ml d’eau déminéralisée (5.2.7) à l’hexane dans
le deuxième tube. Agiter pendant 1 min et centrifuger pendant 5 min à 2 000 g. Éliminer la phase hexane
e
du deuxième tube. Dans le deuxième tube, combiner la phase aqueuse provenant des deux tubes.
rm

Ajouter 10 ml d’acétonitrile (5.2.2) aux phases aqueuses combinées et ajuster le pH à < 3 en

ajoutant 0,2 ml d’acide sulfurique concentré (5.2.6). Procéder à un contrôle à l’aide d’un papier pH.
Mélanger le contenu du tube, ajouter les sels préalablement pesés [4 g de sulfate de magnésium (5.2.9)
et 1 g de chlorure de sodium (5.2.10)]. Agiter immédiatement pendant 1 min. Centrifuger pendant 5 min
no

à 2 000 g. Transvaser 1 ml de phase acétonitrile dans un flacon CL-SM (5.2.22).

9.3 CL-SM/SM

9.3.1 Préparation du système

de

Équilibrer le système CL conformément aux conditions opératoires recommandées (6.4). Régler et

étalonner le SM.
9.3.2 Contrôle des réglages de l’instrument
et

Injecter l’étalon de niveau 5 (5.2.17) et contrôler la forme du pic et le temps de rétention.

oj

9.3.3 Détermination

Injecter une portion aliquote suffisante (par exemple, 20 µl) de toutes les solutions d’étalonnage (5.2.17)
Pr

et un volume égal des extraits d’échantillon. Identifier le pic du PCP d’après le temps de rétention et le
rapport des transitions d’ions.
Déterminer la quantité de PCP en comparant la taille des pics de l’échantillon avec ceux de la quantité
connue dans les solutions d’étalonnage (5.2.17). L’étalonnage est basé sur la méthode de l’étalonnage
interne.

13
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10 Calcul et expression des résultats

10.1 Généralités

Les calculs sont effectués à l’aide d’un logiciel d’acquisition des données, réglé comme suit :
— Avant de traiter toutes les données, le temps de rétention du PCP est vérifié et, si nécessaire, modifié
dans la méthode de traitement.

ne
— Utiliser un étalonnage interne sur sept points et calculer le coefficient de corrélation r2. Il est conseillé
d’utiliser une pondération de 1/x.

— Après traitement des données, chaque résultat est vérifié manuellement en termes d’exactitude

ai
d’intégration.

10.2 Critères d’étalonnage

oc
Le critère applicable au coefficient de corrélation est > 0,995. Il convient que les résultats se situent sur
la courbe d’étalonnage. Lorsqu’un résultat dépasse les limites de la courbe d’étalonnage, il convient de

ar
diluer l’échantillon et de le réanalyser jusqu’à ce qu’il se situe sur la courbe d’étalonnage.
10.3 Identification et confirmation
m
Le PCP est identifié d’après le temps de rétention et les transitions MRM, y compris le rapport des
transitions MRM. Les intensités relatives des ions détectés, exprimées en pourcentage d’intensité de l’ion
le plus intense, doivent correspondre à celles de l’étalon, soit à partir des solutions d’étalonnage soit à
e
partir des échantillons dopés, à des concentrations comparables, mesurées dans les mêmes conditions
avec une tolérance de ± 30 %.
rm

La différence entre le temps de rétention chromatographique du PCP et celui de l’étalon interne de 13C6
ne doit pas dépasser 0,1 min.
10.4 Calculs
no

Pour tous les niveaux d’étalonnage, le facteur de réponse relatif (FRR) est calculé comme suit :
Ax  Q is
FRR  n 
de

Q x  Ais (3)
où
Ax est l’aire de l’ion quantificateur du PCP ;
et

Ais est l’aire de l’ion quantificateur de l’étalon interne de 13C6-PCP ;

Qis est la concentration de l’étalon interne de 13C6-PCP, en ng/ml ;
oj

Qx est la concentration en PCP, en ng/ml.

Pr

Par conséquent, le facteur de réponse relatif moyen est calculé comme suit :
7
1
FRR n  
6 FRR i n
i 2 (4)
où
n est le PCP ;
i est le niveau d’étalonnage (i = 2 à 7) (le niveau 1 correspond au blanc).

14
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La concentration en PCP dans chaque échantillon est calculée comme suit :

Ax  Q is  F
Cx 
Ais  W  FRR n
(5)
où
Cx est la concentration en PCP, en ng/g ;
Ax est l’aire de l’ion quantificateur du PCP ;

ne
Ais est l’aire de l’ion quantificateur de l’étalon interne de 13C6-PCP ;
Qis est la concentration de l’étalon interne de 13C6-PCP, en ng/ml ;

ai
F est le facteur de dilution (c’est-à-dire, 10) ;
W est le poids de la quantité d’échantillon, en g.

oc
10.5 Taux de récupération

ar
Le taux de récupération de l’étalon interne de 13C6-PCP est calculé comme suit :
Asa
pourcentage de taux de récupération  %   100

où
Ast m (6)
e
Asa est l’aire de l’étalon interne dans l’échantillon ;
rm

A st est l’aire moyenne de l’étalon interne dans la solution d’étalonnage de niveau 1–7.

Le taux de récupération de l’analyte dans la matrice témoin dopée est calculé comme suit :
no

C sa
pourcentage de taux de récupération %    C sp
 100
(7)
de

où
Csa est la concentration mesurée dans la matrice témoin dopée ;
et

Csp est la concentration de l’étalon externe dans la matrice témoin dopée.

Le taux de récupération de l’étalon interne dans les échantillons et celui de l’étalon externe dans la
oj

matrice témoin dopée doivent être situés dans la plage de 70 % à 120 %.

11 Fidélité
Pr

11.1 Essai interlaboratoires

Les détails d’un essai interlaboratoires portant sur la fidélité de la méthode sont indiqués dans
l’Annexe A. Les valeurs dérivées de cet essai interlaboratoires peuvent ne pas être applicables aux
gammes de concentration et/ou matrices autres que celles indiquées.

15
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11.2 Limite de répétabilité

La différence absolue entre deux résultats d’essai individuels obtenus sur des matériaux identiques
soumis à l’essai par un même opérateur utilisant le même équipement, dans l’intervalle de temps le plus
court possible, ne dépassera la limite de répétabilité, r, que dans 5 % des cas, au plus. Ces limites sont
indiquées dans l’Annexe A.
11.3 Limite de reproductibilité

ne
La différence absolue entre deux résultats d’essai individuels obtenus par deux laboratoires différents
sur des matériaux identiques soumis à l’essai, ne dépassera la limite de reproductibilité, R, que dans 5 %
des cas, au plus. Ces limites sont indiquées dans l’Annexe A.

ai
12 Rapport d’essai

oc
Le rapport d’essai doit contenir au moins les informations suivantes :
1) les informations nécessaires à l’identification de l’échantillon ;

ar
2) une référence au présent document ;

3) la date de réception de l’échantillon ;

m
4) les résultats d’essai ainsi que les unités dans lesquelles ils sont exprimés ; si nécessaire, les taux de
récupération doivent être indiqués avec les résultats d’essai et il faut mentionner si les résultats
d’essai ont été corrigés ou non avec ces taux de récupération.
e
rm
no
de
et
oj
Pr

16
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Annexe A
(informative)

Essai interlaboratoires

L’essai interlaboratoires a été organisé en 2018 par le centre Wageningen University and Research, Pays-

ne
Bas, conformément aux protocoles internationaux [8]. Tous les détails de l’essai interlaboratoires sont
disponibles dans le rapport final [9].
Lors d’une étude de formation, les participants ont pu se familiariser avec la méthode. Seize laboratoires

ai
ont participé à l’étude. Deux échantillons pour essai, différents en termes de concentration en PCP et de
type de matière première pour aliments des animaux, ont été envoyés aux participants. Huit laboratoires

oc
ont renvoyé leurs résultats. Les résultats ont été évalués conformément à l’ISO 5725-2 [10].
Pour l’étude principale, la matière première pour aliments des animaux a été dopée avec l’analyte, broyée,
divisée en portions et son homogénéité a été contrôlée. Après s’être assuré de l’homogénéité, les matières

ar
ont été étiquetées et stockées à 4 °C jusqu’à ce qu’elles soient distribuées. Chaque participant a reçu
10 échantillons pour essai et les échantillons devaient être analysés en simple. Des étalons de PCP natifs
et marqués ont été envoyés aux laboratoires participants.
m
Seize laboratoires ont participé à l’étude principale. Sept de ces seize laboratoires ont participé à l’étude
de formation et neuf autres laboratoires ont rejoint l’étude principale. Cinq échantillons pour essai,
différents en termes de type de matière et de concentration en PCP, ont été préparés, à savoir deux
e
aliments composés pour animaux, la gomme de guar et deux distillats d’acides gras. Les matériaux
(10 échantillons inconnus) ont été envoyés aux participants sous forme de réplicats en double aveugle.
rm

Les ensembles de données ont été renvoyés par 16 laboratoires pour au moins un échantillon, soit 13 ou
14 ensembles de données par échantillon. D’après les statistiques h et k de Mandel, telles que décrites
dans l’ISO 5725-2 [10], 0 à 2 ensembles de données ont été éliminés, selon l’échantillon. Ensuite, des
statistiques robustes, telles que décrites dans l’ISO 5725-5 [11], ont été appliquées à l’ensemble de
no

données final.

Les résultats de l’évaluation statistique sont donnés dans le Tableau A.1. Des valeurs de HorRat
de

inférieures à 2,0 représentent les limites d’acceptabilité de la méthode.

et
oj
Pr

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Tableau A.1 — Résumé des résultats de l’essai interlaboratoires pour le PCP

Aliment Aliment Gomme FAD 1 FAD 2
pour pour de guar
animaux animaux
Nom de la matière 1 2
Analyte PCP PCP PCP PCP PCP
Année de l’essai interlaboratoires 2017/18 2017/18 2017/18 2017/18 2017/18

ne
Nombre de laboratoires 13 14 14 13 14
Nombre d’échantillons 2 2 2 2 2

ai
Nombre de laboratoires non conformes 1 1 0 1 2
Nombre de résultats acceptés 24 26 28 24 24

oc
Valeur moyenne, x , μg/kg 8,4 12,8 14,6 12,2 23,5

Écart-type de répétabilité, sr, μg/kg 0,7 2,9 1,0 2,7 3,6

ar
Écart-type relatif de répétabilité, RSDr, % 8,4 23,0 6,7 21,8 15,3
Limite de répétabilité r [r = 2,8 × sr], 2,0 8,3 2,7 7,5 10,1
μg/kg
Écart-type de reproductibilité, sR, μg/kg 2,1
m 6,2 1,3 3,6 3,6
Écart-type relatif de reproductibilité, 24,6 48,7 8,7 29,9 15,3
e
RSDR, %
rm

Valeur de HorRat 1,12 2,21 0,39 1,36 0,70

Limite de reproductibilité R [R = 2,8 × sR], 5,8 17,5 3,5 10,2 10,1
μg/kg
no
de
et
oj
Pr

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EN 17362:2020 (F)

Bibliographie

[1] ISO 3534-2:2006, Statistique — Vocabulaire et symboles — Partie 2 : Statistique appliquée

[2] EN ISO/IEC 17043:2010, Évaluation de la conformité — Exigences générales concernant les essais
d'aptitude (ISO/IEC 17043:2010)

ne
[3] Règlement (CE) n° 767/2009 du Parlement européen et du Conseil du 13 juillet 2009 concernant la
mise sur le marché et l’utilisation des aliments pour animaux, modifiant le Règlement (CE)
n° 1831/2003 du Parlement européen et du Conseil et abrogeant la Directive 79/373/CEE du

ai
Conseil, la Directive 80/511/CEE de la Commission, les Directives 82/471/CEE, 83/228/CEE,
93/74/CEE, 93/113/CE et 96/25/CE du Conseil, ainsi que la Décision 2004/217/CE de la
Commission, Journal officiel de l’Union européenne, L 229/1, 1.9.2009. Disponible à l’adresse

oc
http://data.europa.eu/eli/reg/2009/767/oj

[4] ISO 16577:2016, Analyse moléculaire de biomarqueurs — Termes et définitions

ar
[5] ISO/IEC GUIDE 99:2007, Vocabulaire international de métrologie — Concepts fondamentaux et
généraux et termes associés (VIM)

[6]
m
ISO 5725-1, Exactitude (justesse et fidélité) des résultats et méthodes de mesure —
Partie 1 : Principes généraux et définitions
e
[7] EN ISO 6497, Aliments des animaux — Échantillonnage (ISO 6497:2002)
rm

[8] AOAC INTERNATIONAL. Appendix D: Guidelines for Collaborative Study Procedures To Validate
Characteristics of a Method of Analysis. AOAC Official Methods of Analysis, 2005
no

[9] Peters R.J.B., Gebbink W. WFSR-WUR report, Determination of pentachlorophenol in feed

materials and compound feed by LC-MS/MS, June 2019. This report can be downloaded at
https://doi.org/10.18174/478523 or at www.wur.eu/food-safety-research under WFSR
publications.
de

[10] ISO 5725-2, Exactitude (justesse et fidélité) des résultats et méthodes de mesure —
Partie 2 : Méthode de base pour la détermination de la répétabilité et de la reproductibilité d'une
méthode de mesure normalisée
et

[11] ISO 5725-5, Exactitude (justesse et fidélité) des résultats et méthodes de mesure —
Partie 5 : Méthodes alternatives pour la détermination de la fidélité d'une méthode de mesure
normalisée
oj
Pr

19