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39.

Aislamiento y purificacin del DNA de un plsmido recombinante


Aurora Galvn Cejudo, Manuel Tejada, Antonio Camargo, Jos Javier Higuera, Vicente Mariscal, Emilio Fernndez Reyes
Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 14071-Crdoba

RESUMEN

El DNA de un plsmido recombinante presente en una bacteria se asla por un mtodo rpido y sencillo (miniprep) que consiste en lisis bacteriana, precipitacin de protenas y DNA genmico, y finalmente precipitacin del DNA plasmdico. El objetivo es obtener suficiente cantidad del DNA para su anlisis posterior mediante electroforesis. Palabras clave: DNA plasmdico, lisis alcalina, eficiencia de la purificacin Abreviaturas empleadas. DNA: cido desoxirribonucleico; IPTG, isopropil--Dtiogalactopiransido; LB: medio de Luria-Bertani; RNasa, Ribonucleasa.

1. INTRODUCCIN Y OBJETIVOS Los plsmidos son molculas de DNA extracromosmico, circular y generalmente de pequeo tamao que se encuentran en muchas especies bacterianas y que se pueden replicar de manera independiente del DNA cromosmico. A diferencia de ste, los plsmidos no son necesarios para la viabilidad general de la clula, pero pueden contener genes que contribuyen a la supervivencia en condiciones especiales, como los que confieren resistencia a antibiticos, a metales etc. Algunas clases de plsmidos poseen adems la propiedad conocida como "replicacin relajada", esto es, estn presentes en forma de muchas copias por clula, lo que facilita enormemente su aislamiento y purificacin. Los plsmidos poseen un inters singular en Ingeniera Gentica por ser uno de los sistemas vectores ms sencillos de usar. Un vector de clonacin es un sistema que permite introducir en una clula hospedadora un fragmento de DNA que se pretende clonar; en esta clula hospedadora el vector se replica y expresa, en su caso. La molcula que resulta de la unin de un DNA vector con el DNA de inters (denominado entonces "inserto") se denomina molcula de vector recombinante. Para ser utilizado como vector de clonacin, un plsmido ideal debe poseer al menos tres caractersticas: 1) Debe tener su propio origen de replicacin y por tanto la capacidad de replicacin autnoma independiente del genoma del hospedador. 2) Debe tener sitios de clonacin mltiple que permitan la apertura del DNA con enzimas de restriccin y hace posible la clonacin de insertos de
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DNA en la forma y orientacin determinada. 3) Debe poseer marcadores genticos seleccionables que permitan aislar las clulas hospedadores que contengan el vector. La mayora de los plsmidos naturales no cumplen todas estas condiciones, por lo que una primera tarea de la Ingeniera Gentica ha consistido en la construccin de plsmidos artificiales, combinando en una misma molcula diversos rasgos tiles procedentes de los plsmidos naturales. La presencia en el plsmido del gen de resistencia a ampicilina permite seleccionar las bacterias que portan estos plsmidos, gracias a su capacidad para crecer en presencia de dicho antibitico (el gen de resistencia codifica una beta lactamasa, enzima que degrada la ampicilina). La mayora de los plsmidos usados en Biologia Molecular contienen el sitio de clonacin mltiple dentro el gen de la -galactosidasa lo que permite la interrupcin e inactivacin de este gen cuando un DNA inserto se clona en esta regin. En medios de cultivo que contengan el anlogo de la lactosa X-gal, esta estrategia permite distinguir las colonias bacterias que contienen el vector recombinante (con inserto) de aquellas que han recibido un vector no recombinante (sin inserto). Las bacterias que reciben el vector recombinante no pueden utilizar lactosa ni su anlogo y formar colonias blancas. Las bacterias que reciben un vector no recombinante s pueden utilizar la lactosa o su anlogo y formarn colonias azules. El objetivo de esta prctica consiste en la purificacin del DNA del plsmido recombinante contenido en una cepa de la bacteria E. coli, y familiarizarse con las propiedades de DNA plasmdico.

2. LISTADO DEL MATERIAL NECESARIO - Tubos Eppendorf, micropipetas, puntas estriles, pipetas Pasteur, agua estril, microcentrfuga. - Clulas E.coli transformadas: suspensin en medio LB/Amp - Solucin de resuspensin - Solucin de lisis - Solucin 3M de acetato potsico

3. PROTOCOLO A REALIZAR 3.1. Cultivo de bacterias Paso 1. Se preparan frascos de cultivo o tubos con medio LB estril, a los que se aade en el momento de cultivar ampicilina a una concentracin final de 0,1 mg/ml (ya que estamos trabajando con plsmidos que poseen el gen de resistencia a este antibitico). Paso 2. Se toman colonias individuales de la placa de agar, pasndolas al medio lquido, y se incuba una noche a 37C, con agitacin. 3.2. Extraccin del DNA plasmdico

Si bien existen kits comerciales para preparar DNA plasmdico, la realizacin de este protocolo se considera formativo, sencillo y permite obtener de modo rutinario DNA plasmdico con un grado de pureza aceptable. El material que entre en contacto con el cultivo de bacterias deber desecharse en un recipiente con leja. 1. Se toma 1 ml del cultivo de bacterias y se centrifuga en un tubo eppendorf durante 2 min (14000 rpm). Se elimina el sobrenadante por inversin del tubo o con ayuda de una pipeta, dejando el sedimento lo ms seco posible. 2. Se resuspende el sedimento de bacterias en 250 l de tampn de resuspensin empleando una pipeta (aspirar y expulsar el lquido varias veces sobre el sedimento hasta que desaparezca ste). Se incuba 2 min a temperatura ambiente. 3. Se aaden al tubo 250 l de la solucin de desnaturalizacin NaOH/SDS. Se agita el tubo por inversin suave (observar el aspecto y viscosidad de la disolucin). Posteriormente se incuba durante 5 min a temperatura ambiente. 4. Se aaden a continuacin 300 l de acetato potsico 3 M y se mezcla el contenido del tubo (observar el aspecto del tubo, aparecer una turbidez blanca al precipitar las protenas y el DNA cromosmico). Se incuba 10 min en hielo. 5. Se centrifuga 10 min (14000 rpm). 6. Con ayuda de una pipeta se transfiere cuidadosamente la fase acuosa sobrenadante a un tubo eppendorf nuevo. Si la fase acuosa no est suficientemente limpia, y contiene restos del precipitado blanco, volver a centrifugar los tubos. 7. En este sobrenadante se encuentra RNA y el DNA plasmdico. Estos cidos nucleicos se precipitan con 2 volmenes de etanol absoluto fro. Mezclar bien por inversin y guardar a -20C durante al menos 20 min (congelador). 8. Pasado este tiempo, se centrifuga durante 30 min a 14000 rpm. 9. Se elimina todo el sobrenadante volcando el tubo con cuidado. El precipitado se lava de nuevo con 0,5 ml de etanol 70% fro (20 min, centrifugacin). 10. Se elimina todo el sobrenadante volcando el tubo con cuidado. El precipitado casi invisible, que contiene DNA plasmdico y RNA, se debe secar completamente para eliminar los restos de etanol que pueden interferir con procesos posteriores. El precipitado se disuelve en 25 l agua estril. 11. Finalmente se aaden 0,5 l de una solucin de RNasa (1 g/ml) y se incuba 20 min a temperatura ambiente. Este tratamiento con RNAasa
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degrada el RNA quedando una preparacin purificada de DNA plasmdico. Una alternativa a este paso es incluir la RNasa en el tampn inicial de resuspensin o tampn de lisis

4. RESULTADOS ESPERADOS El mtodo empleado para la obtencin del plsmido se denomina de "lisis alcalina": se basa en la desnaturalizacin y precipitacin selectiva del DNA cromosmico en medios con NaOH y SDS. En estas condiciones el DNA plasmdico permanece intacto debido principalmente a su pequeo tamao y su naturaleza circular y superenrollada. El tratamiento con alta concentracin de sal (acetato potsico) y SDS produce la precipitacin de gran parte de las protenas. El tratamiento con RNasa elimina la contaminacin de RNA que puede ser importante. La purificacin del DNA plsmidico se completa entonces por precipitacin con etanol. Es posible obtener DNA plasmdico con diferente grado de superenrrollamiento que se puede visualiza tras la separacin por electroforesis y tincin con BrEt .

5. DISCUSIN Y COMENTARIOS a) Describe el porqu de los tratamientos con: NaOH y SDS, acetato potsico, etanol, y RNasa. b) Realiza un esquema de la purificacin segn se utilice la RNasa en: 1) el tampn de lisis 2) al final. Se podra prescindir de ella? c) Por qu tienen carga negativa las molculas de DNA? d) Cul es el papel de cada componente del tampn de carga? e) Dibujar un esquema con el resultado obtenido en el gel y razona los resultados. f) En caso de tener las formas superenrollada y relajada del plsmido indicar si: Tienen el mismo peso molecular? Y la misma longitud en pares de bases? Cmo se podra convertir una forma en otra?. Cul en cual?

6. BIBLIOGRAFA COMENTADA Old RW, Primrose SB (1989) Principles of Gene Manipulation. Blackwell Sci. Pub. (Oxford, England), pp 11-13. Resumen comprensivo del procedimiento.
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Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp. 1.74-1.84. Excelente recetario con variaciones tiles.

ANEXO 1: MEDIOS, SOLUCIONES Y MATERIAL BIOLGICO EMPLEADO Soluciones - Solucin de resuspensin - Solucin de lisis - Solucin 3M de acetato potsico -Medio de cultivo LB: Extracto de levadura 5g/l Triptona 10g/l NaCl 5g/l Esterilizar en autoclave. Almacenar en fro. -Placas LB/ampicilina/IPTG/X-Gal: Medio de cultivo LB Agar 1,6% Ampicilina 100 g/ml IPTG 500 M X-Gal 40g/ml Material biolgico - Clulas E.coli transformadas: suspensin en medio LB/Amp