SNV – FSB – USTHB – L1 Année universitaire 2022 - 2023

TP n° 01 de biologie cellulaire.

Le microscope photonique:
Est-il l’instrument d’observation adéquat pour l’étude de la cellule ?

Cette planche montre toutes les techniques de bases utilisées en biologie

cellulaire. Il existe d’autres techniques mais en relation avec la biologie
moléculaire de la cellule.
(Cette planche est très importante pour votre cursus de Biologie !)

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 Votre Microscope : Motic 1820
(Manuel d’utilisation téléchargeable gratuitement, Utile durant votre cursus !!)

RECOMMANDATIONS
1 - Brancher la prise mâle à celle qui se trouve en face de vous (prise femelle) ;
2 - Poser la lame porte objet (lamelle vers le haut) sur la platine puis la fixer à l’aide de valet mobile se trouvant sur la
platine ;
3 - Ramener l’objet au niveau de l’orifice à l’aide des deux vis placées sur le côté de la platine ;
4 - Allumer le microscope à l’aide de l’interrupteur ;
5 - Régler l’écartement des oculaires, suivant votre visage;
6 - Remonter le condenseur afin d’avoir un champ lumineux bien centré vers l’orifice puis ouvrir le diaphragme juste
assez pour éclairer l’objet ;
7 - Placer l’objectif à faible grossissement (x4) (Commencer toujours une observation avec le plus faible grossissement );
faire la mise au point en déplaçant le tube mobile de haut en bas à l’aide de la vis macrométrique pour obtenir une vue
d’ensemble, image claire avec la vis micrométrique. NB : ne plus toucher la vis macrométrique pour les autres
grossissements ;
8 - Placer l’objectif (x10), faire la mise au point qu’avec la vis micrométrique 9 - A l’objectif (x40), la lamelle
recouvrant l’objet se trouve au contact de l’objectif; la mise au point se fait uniquement à l’aide de la vis micrométrique
(risque de casser la lamelle !);
9–A la fin revenir au faible grossissement, descendre la platine, et retirer la lame,. Eteindre le microscope, et débrancher
le fil électrique.
NB : Recommencer toutes ces étapes à chaque fois que l’on change d’objet.

Règles à respecter pour une bonne observation des échantillons :

 Utiliser une préparation bien contrastée (colorée) !
o Eclairer convenablement la préparation (Pas à fond la lumière !!)!
 Faire une pré-mise au point l'œil à la hauteur de la platine ! Commentaire [u1]:
!
Les planches pour faire le tableau comparatif entre les 3 microscopes et les 3
techniques de préparation des échantillons et bien comprendre !! !!
Planche 2

a b c

Fig. 1 : Caractéristiques des microscopes (TP 1 et 2):

(a) photonique, (b) électronique à transmission et (c) électronique à balayage
Fig. 2 : Préparation des échantillons pour examen microscopique (TP 1 et 2).

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 Planche A: Technique Histologique – détaillée !!
I- Le but :
C’est une technique destinée principalement à l’observation des tissus au microscope photonique.
Cependant elle permet également de donner une vue d’ensemble des cellules.
II- Le principe
Il repose sur l’obtention de coupes suffisamment minces pour être traversées par un faisceau de
photons et suffisamment contrasté pour obtenir une image au microscope photonique.
III- Les étapes
1. Le prélèvement:
i. Il doit être pratiqué le plus tôt possible après la mort de l’organisme vivant.
Ce prélèvement peut être effectué sur un organisme maintenu en vie.
2. La fixation.

i. . C’est l’action de tuer les cellules, en évitant tout phénomène agonique, de

manière à conserver les structures dans un état morphologique aussi proche
que possible de l’état vivant.
ii. Cette fixation se fait à l’aide de fixateurs (simple : - Ethanol ou alcool
éthylique, ou Le formaldéhyde ou formol ; mélanges :Liquide de Carnoy :
alcool + chloroforme + acide acétique. Liquide de Bouin : formol + acide
picrique).
3. La déshydratation:
a. La déshydratation se déroule dans des bains successifs d’alcool à degrés
croissants. Le dernier bain étant constitué par un solvant parfaitement miscible
avec la paraffine tel que le toluène.
4. L’inclusion à la Paraffine.
a.L’objectif est de solidifier le tissu fixé pour réaliser des coupes fines et
régulières.Le résultat de l’inclusion (ou enrobage) étant l’obtention d’un bloc de
paraffine
5. Réalisation des coupes (ou microtomisation)
a. Cette étape sera réalisée à l’aide d’un instrument de coupes appelé Microtome
(rasoir). , l’épaisseur des coupes sera de l’ordre de quelques microns (2 à 10 microns
(μ) environ), que l’on récupère à l’aide d’un pinceau.
6. Etalement des coupes
a. Une fois les coupes obtenues, elles seront étalées sous forme d’un ruban de
quelques coupes sur une lame porte-objet en verre. Elles y seront fixées à la lame
par des substances collantes telle que l’albumine ou de l’eau gélatinée.
7. Déparaffinage et Réhydratation
a. la première partie de cette étape consiste à enlever la paraffine hydrophobe
contenue dans les cellules en la faisant fondre sur une plaque chauffante.
b. au cours de la seconde partie de cette étape : les lames sur lesquelles sont fixées
les coupes des échantillons subiront des bains d’alcool à degrés décroissant
8. Coloration
a. - La plupart des tissus sont transparents ; - Les colorations réalisées sur lames,
accentuent les contrastes pour pouvoir reconnaître différents éléments du tissu.
b. Exemple : le vert de méthyle colore en vert la chromatine, l’orcéine pour les
fibres élastique ; l'hématoxyline, qui colore les noyaux cellulaires en bleu violacé ;
L’éosine, qui colore les cytoplasmes en rose ; Les bleus (Bleu de méthylène, de
toluidine) sont également employés en routine.
9. Montage et Observation
a. Les lames sélectionnées sont recouverte d’une lamelle qui sera collée à la lame
grâce à de la résine type baume du Canada. Ces lames peuvent être conservées
longtemps Les lames sont observées au microscope photonique qui donnera un
aperçu sur l’organisation histologique des coupes.
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Planche B: Technique Cytologique ou technique des coupes minces
IV- Le but :
Observation de cellules ou portion de cellules au microscope électronique à transmission
V- Le principe
Il repose sur l’obtention, à partir d’un échantillon parfaitement conservé, des coupes
ultrafines transparentes aux électrons, et suffisamment contrasté.
VI- Les étapes
10. Le prélèvement sur le vivant :
i. Anesthésie l’animal ;
ii. Dissèque l’animal et on prélève une toute petite partie de l’organe à
étudier.
11. La fixation
But : Conservation (après la mort) des ultrastructures cellulaires sans
altération. (C’est-à-dire aussi proche du vivant).
On fixe les cellules in vivo à l’aide de produits fixateurs : tetroxyde
d’osmium, glutaraldehyde.
Il s’agit d’une étape critique qui conditionne le succès de l’étude cytologique

12. Rinçage
But : éliminer le fixateur en lui substituant une solution de même pH.
Plusieurs rinçages successifs.

13. La déshydratation:
But : débarrasser les pièces de leurs eaux en les plongeant dans des bains
d’alcool à concentration croissante ou dans de l’acétone.
Dernier bain : oxyde de propylène, solvant de résine.
14. L’inclusion
But : durcissement des échantillons, en remplaçant le milieu aqueux par un
milieu solide (résine).
15. Confection des coupes ultraminces ou ultrafine (ou ultra-microtomie)
But : couper le fragment en coupes de 500 à 700 Å d’épaisseurs :
o Taille des blocs
o Ultra microtomie
o Confection des coupes automatiques
o Recueil des coupes sur une grille métallique de 3mm de
diamètre couverte d’un film : collodion.

16. « Coloration » ou contrastant ou intensification

But : augmenter le contraste des objets biologiques en leur associant des sels
de métaux lourd (acétates d’uranyle, citrate de plomb, nitrate d’argent ; Ce sont
des intensificateurs.
17. Observation directe par le microscope électronique à transmission
18. Observation des micrographies prises au MET (indirecte).

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