UNIVERSITE CADI AYAD

École Normale Supérieure

Marrakech

1
M.F.SEBBAN
 PLAN

Introduction.
Partie théorique.
Chromatographie gazeuse.
Chromatographie liquide.
Partie Expérimentale.
Réalisation d’une chromatographie
sur couche mince(CCM) et sur colonne.
Exemple d’analyse par CCM.
Conclusion.
2
 INTRODUCTION

Comment peut -on savoir la

composition chimique de
cet huile?
Méthodes chimiques d’analyse
3

La chromatographie
4
La chromatographie sous toutes ses formes, est une
méthode de séparation des constituants d’un mélange
gazeux, liquide ou solide.
C’est une méthode de séparation, donc d’analyse,
basée sur les différences d’affinités que peuvent
présenter deux ou plusieurs composés pour deux

phases, l’une fixe ou stationnaire et l’autre mobile.

Ces deux phases constituent le système
chromatographique
5
Plus l’affinité de la molécule pour la phase stationnaire
est grande,
plus elle aura tendance à se fixer et à être ralentie.

Plus l’affinité de la molécule pour la phase mobile est

grande,
plus elle aura tendance à être entraînée.

Cette séparation est gérée par un coefficient appelé

coefficient de distribution, entre deux phases
différentes, l’une appelée : phase mobile et l’autre phase
stationnaire.
6
 Coefficient de distribution K
 Definition:
Concentration du composé A dans la phase mobile

Concentration du composé A dans la phase stationnaire

 Remarque:
KAT=
Suffisamment différents
KBT=

La différence d’affinité des composés dans les7

deux phases permet leurs séparation.
 Vocabulaire
Système chromatographique

Tout système constitué d’une phase mobile et

d’une phase stationnaire.

C’est un gaz ou un liquide (solvant ou mélange de

solvants) responsables de l’élution de
l’échantillion.

La phase responsable de la séparation chimique8

selon différents mécanismes.
 Chromatogramme

Le résultat d’une analyse chromatographique

9
TYPE DE CHROMATOGRAPHIE

On distingue deux grandes catégories de

chromatographie selon la phase mobile utilisée:

Chromatographie gazeuse.

Chromatographie liquide.

10
 11

La chromatographie liquide à haute performance

 LA CHROMATOGRAPHIE GAZEUSE

La chromatographie gazeuse est une technique de

séparation ,de quantification et d’identification des
composés d’un mélange.

Cette méthode est appliquée essentiellement pour

le contrôle des fractions légères des raffineries de
pétrole ;et aussi pour les grandes molécules
organiques telles que les acides gras contenus dans
les huiles.

12
 Principe de la séparation
Elution par un Gaz
vecteur ( phase
mobile) à travers une
phase stationnaire

Composé
Composés à 1
l’état gazeux

Composé
chauffage 2

Composés Composé
solides ou 3 13
liquides
Phase Mobile (gaz Phase stationnaire
vecteur)
choix des phases
Pur liquide solide
Ne contient ni oxygène : O2 Dissoudre le produit. Thermostable.
ni eau : H2O
Inerte vis-à-vis de la phase Thermostable à des Séparation des composés
stationnaire et des produits températures Volatiles.
à analyser. élevées.
De polarité surfaces modifiables.
Exemples: différente.
l’Hélium(He) , l’Azote Exemples: Exemples:
(N2),l’Argon (Ar) ou encore • à base de silicone. 1-agissant par adsorption :
l’Hydrogène (H2); gel de silice , l’alumine
et le charbon actif.
•à base de 2-agissant comme des
polyesters. tamis moléculaires:
le Zéolites.
•à base des
hydrocarbures
ramifiés. 14
•à base de
polyéthers.
Appareillage

15
16
17
 COLONNES
Une colonne est un tube en acier inoxydable,
en verre ou en silice fondue, d’une longueur
et d’un diamètre variables.

Les colonnes remplies Les colonnes capillaires

la phase stationnaire contenue dans La phase stationnaire est

la colonne est immobilisée par
imprégnation sur un support poreux
inerte. La longueur est d’environ 4 m
et le diamètre intérieur est compris
entre 10 et 4 mm.
immobilisée par un dépôt ou greffage
sur la surface interne de la colonne.
La longueur est entre 10 et 100 m et
le diamètre intérieur est entre 100 et
350 μm.

18
19
Comme le montre la figure ci-après le pouvoir de séparation des colonnes
capillaires (N=100000) est beaucoup plus grand que celui des colonnes
remplies (N=4000).

20
Chromatogrammes d’une huile, obtenus (en haut) sur une colonne
capillaire de 50 m et (en bas) sur une colonne remplie de 4m.
Figure : Séparation des énantiomères du linalool [S(+) et R(-)] et
détermination de la composition énantiomérique de huile de lavande
commerciale et de l'extrait de lavande naturelle sur une colonne
capillaire de 25 m (température 80°C) imprégnée d'une a cyclodextrine
21
chirale.
22
EXEMPLES D'ANALYSE EN CPG

ANALYSES BIOLOGIQUES

Chromatogramme d'un mélange de

drogues et substances illégales.
Colonne OV1 12mx0,2mm
Programmation de température de 140° à
260° à 10°/mn

Le chromatogramme reproduit ci-contre

vient du laboratoire de la "New Jersey
State Police"

Ces analyses sont utilisées dans la police

scientifique. l'analyse se fait
essentiellement dans les fluides
biologiques (sang, urine) les drogues sont
retrouvées intactes.
23
Les pesticides (substances utilisées pour lutter contre les
organismes considérés comme nuisibles c’est un terme
générique qui rassemble (les insecticides, les fongicides, les
herbicides et parasiticides).

Ils peuvent être dosés à tous les stades de la chaîne

alimentaire (poissons, légumes...).

24
ANALYSE D'HUILES ESSENTIELLES

Chromatogramme de
l'huile essentielle de
menthe.
Conditions

Colonne: SUPELCOWAX 10, 60m

x 0.25mm, film de 0,25µm
Four : 4 min (75°C) à 200°C puis
4°C/min, enfin 5 min à 200°C.
Phase mobile: hélium, 25cm/sec .

25
 LA CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE

On parle de chromatographie liquide lorsque

la phase mobile est un liquide .

On distingue deux types de chromatographie

liquide :
 sur colonne
 sur surface.

26
CHROMATOGRAPHIE SUR COLONNE

Selon le type d’interaction entre l’échantillon et

la phase stationnaire on distingue quatre types
de chromatographie.

Chromatographie d’adsorption.
La chromatographie de partage.
La chromatographie d'échange d'ions.
La chromatographie d'exclusion.
27
 La chromatographie d'adsorption

Ce type de chromatographie est basé

Le mécanisme d'adsorption
La fixation d’une substance sur une surface
solide; en mettant en jeu des liaisons à faible
énergie (liaisons hydrogène, interactions
électrostatiques...).
28
Les séparation sont basées sur le principe de polarité,
c’est-à-dire :
l’existence de dipôles dans une structure moléculaire.
Adsorbants possibles (du moins polaire au plus polaire):
Papier, cellulose, amidon, carbonate de sodium, gel de
silice, alumine, charbon activé.

Plus un adsorbant est actif, plus il retient fortement

les composés polaires.
Le gel de silice est polaire, il a par conséquence une plus
grande affinité pour les composés polaires :
 Un composé peu polaire est peu adsorbé.
 Un composé polaire est très adsorbé.
29
 Polarité des groupements fonctionnels neutres

Les molécules chargées ne migreront habituellement pas30

sur gel de silice
elles sont trop polaires.
 Phase mobile
Une phase mobile liquide est appelée éluant.
C’est elle qui fait migrer les composés, son choix est
donc important.
Il faut que le soluté soit soluble dans l’éluant.
Il est possible de faire des mélanges de solvants pour
changer sa polarité.

31
 Choix de l’éluant

Deux facteurs interviennent lors de l’interaction entre

l’éluant et le soluté (mélange de composés à séparer):
• la solubilité : on doit être en mesure de dissoudre le
soluté dans l’éluant pour que la migration se fasse.
• la polarité de l’éluant va déterminer à quelle vitesse le
composé migre.
Moins un composé est polaire, moins il s’accroche à
l’adsorbant, plus il migre avec l’éluant.
Choix d’un éluant peu polaire
Plus un composé est polaire, plus il s’accroche à
l’adsorbant, moins il migre avec l’éluant.
Choix d’un éluant polaire 32
 Choix de phases
Phase Mobile Phase stationnaire (adsorbant)

Pur Insoluble dans la phase mobile

Inerte chimiquement vis-à-vis de la

phase mobile et de l’échantillon.

Inerte vis-à-vis de la phase  Capacité d'adsorption

stationnaire et des produits à  Polarité variable
analyser.

Exemple Exemple

Voir tableau Silice, Alumine, Charbon actif …

33
solvant force éluante solvant force éluante
Ether de pétrole 0,01 Acétone 0,56
Hexane 0,01 Dioxane 0,56
Cyclohexane 0,04 Butanol 0,56
Tétrachlorure de 0,18 Acétate d'éthyle 0,58
carbone
Ether 0,28 Acétonitrile 0,65
isopropylique
Toluène 0,29 Pyridine 0,71
Benzène 0,32 Diméthylsulfoxyde 0,75

Ether éthylique 0,38 Isopropanol 0,82

Chloroforme 0,40 Ethanol 0,88
Chlorure de 0,42 Méthanol 0,95
méthylène
Dichloroéthane 0,49 Eau > 0,95
Acide acétique > 0,95
34
Série, sur alumine, de quelques solvants, classés par ordre de polarité
croissante
Domaines d’utilisation
séparation des :

Lipides : stérols et stéroïdes,

phospholipides...
Pigments, médicaments...

Acides aminés.

35
 La chromatographie de partage

Ce type de chromatographie est basé

Le mécanisme de partition

Le partage de l’échantillon à analyser entre

la phase mobile et la phase stationnaire,
selon l’affinité vis-à-vis des deux phases.
36
 Choix de phases
Phase Mobile Phase stationnaire

Pur Film liquide

Inerte vis-à-vis de la phase

stationnaire et des produits à Non miscible avec la phase
analyser. mobile

Visqueux

37
NB : Un film liquide est une phase stationnaire imprégnée sur un support
rigide (silice) ou fixée par liaison covalente (phases greffées).
 La chromatographie
d'échange d'ions
Ce type de chromatographie est basé

Le mécanisme d'échange d'ions

L’interaction avec les groupements ionisés

de la phase stationnaire et ceux du produit
à analyser
 Choix de phases

Phase Mobile Phase stationnaire

Solutions aqueuses Support sur lequel sont greffés des

groupements fonctionnels ionisables.

Contenant des ions échangeables Insoluble dans l'eau

Exemple: Exemple:

Solution acide Résine échangeuse d’ion

Solution basique Voir schéma
39
40
41
42
43
44
Applications
La séparation des molécules ionisables, quelle
que soit leur nature et leur taille :
Protéines.
Ions minéraux.
Acides aminés.
Acides nucléiques.
Glucides ionisés.
Lipides ionisés. 45
La chromatographie d'exclusion

Ce type de chromatographie est basé

Le mécanisme de filtration

voir schéma

46
explication

47
48
49
Applications:

Cette technique est très utilisée pour la

séparation ou l'élimination de sels ou de
petites molécules :

Exemple: dessalement de l’eau de mer.

50
51
COLLECTEUR DE FRACTIONS

52
 Chromatographie liquide à haute
performance HPLC

HPLC signifie chromatographie liquide haute pression

(récemment le terme performance est également employé).
La phase mobile est toujours liquide et sa force éluante joue
un rôle important.

L’HPLC est l’une des méthodes les plus employées dans les
laboratoires d’analyse chimiques. Elle permet l’identification,
la séparation et le dosage de composés chimiques dans un
mélange. Sa grande précision permet la recherche de traces
et il est possible de la coupler à un spectromètre de masse.
53
Quatre types sont couramment employés en fonction de
…………………………………..

 Chromatographie d’adsorption
 Chromatographie de partage : c’est la plus utilisée avec
une phase stationnaire apolaire.
 Chromatographie d’échange d’ions
 Chromatographie d’exclusion : également appelée à
perméation de gel.

A chacune de ces méthodes, il correspond un type de

colonne qui est l’élément essentiel de l’HPLC.
Le choix du solvant d’HPLC va dépendre de la colonne et
des composés à éluer (séparer) et principalement de leur
polarité. 54
55
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE A HAUTE PERFORMANCE

56
57
 La chromatographie sur couche
mince

La chromatographie sur couche mince est

une méthode d’analyse qualitative et
quantitative qui permet la séparation des
différents constituants d’un mélange en
fonction de leur vitesse de migration.

58
Cette séparation est caractérisée par un
rapport frontal noté Rf.

Rf = Distance parcourue par le constituant

Distance parcourue par le solvant

X
Y

Rf = Y/ X
59
60
LA CUVE CHROMATOGRAPHIQUE:

C’est un récipient habituellement en

verre, de forme variable, fermé par un
couvercle étanche.

61
LA PHASE STATIONNAIRE:

C’est une couche d'environ 0,25 mm de

silice ou de gel de silice fixée sur une
plaque de verre , d’aluminium ou de
plastique à l'aide d'un liant. 62
LA PHASE MOBILE:

Est la partie du système chromatographique

qui entraine les constituants d’un mélange à
travers la phase stationnaire.

63
 Influence de l’éluant
 Lorsque la polarité du solvant augmente
le Rf augmente.
Le ∆Rf augmente, puis diminue.
Pour faire une séparation de deux produits par
chromatographie, on cherche un éluant qui donne le plus
grand ∆Rf possible, avec un Rf pour le produit le moins
polaire autour de 0,3.

64
 Comment s’assurer qu’une tâche correspond bien à un
seul composé ?
CCM bidirectionnelles
C’est une expérience qui permet de prouver si un produit
décompose sur la silice, ou si un “spot” de la CCM
contient en fait deux produits.

65
Si élué dans un autre
solvant
66
RÉVÉLATION PAR L’IODE:

• on plonge la
plaque dans un
bocal contenant
un fond d’iode
broyé. Les
composés
apparaissent sous
forme de tâches
brunâtres.
Plaque CCM révélée par l’iode
67
RÉVÉLATION PAR L’ACIDE PHOSPHOMOLYBDIQUE:

Acide
phosphomolyb
dique + H2SO4

Chauffage

68
RÉVÉLATION BIOLOGIQUE:

Pseudokirchneriella subcapitata
Bacillus

69

Vibrio fisheri aspergillus

70
DÉPÔT DE L'ÉCHANTILLON SUR LA PLAQUE

2- Mise en place des espèces

1- Préparation de la plaque chimiques 71
DÉVELOPPEMENT DU CHROMATOGRAMME :

1- Placement de la plaque dans la cuve 2- Elution des produits 72

RÉVÉLATION ET CALCUL DE RF :

a. Révélation:

73
Révélation
Produits séparés aprés révélation
b. Calcul de Rf

Hj H

Hb

74
CHROMATOGRAPHIE SUR COLONNE

75
76
77
Haute sélectivité

Faible sélectivité
78
Vitesse moyenne de déplacement de la phase mobile (cm.s-1 )
L : longueur de la colonne.

Vitesse moyenne de déplacement du soluté

79
Le volume de la phase mobile dans la colonne (encore appelé
volume mort) peut être calculé d’après le chromatogramme, à
condition d’introduire un soluté non retenu par la phase
stationnaire. Cette grandeur est exprimée par :

Le volume de la phase mobile nécessaire pour entraîner le soluté

jusqu’à la sortie de la colonne est le volume qui s’est écoulé
entre le moment de l’injection et celui correspondant au sommet
du pic :

80
Suivie par CCM

81
 CONCLUSION
 La chromatographie sur couche mince est une méthode
simple à mettre en œuvre, mais elle présente parfois certaines
limites d’où l’invention des autres méthodes
chromatographiques.

 La chromatographie liquide est une méthode qui s’applique

pratiquement à toutes les substances liquides ou solides.

 La chromatographie en phase gazeuse est une technique très

répondue grâce à sa grande sensibilité.

82