A.T.

MICROBIOLOGIE n°9

Recherche de bactériophages dans une eau de rivière

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Rechercher des bactériophages dans
une eau de rivière (eau de la - cours de première année sur les
bactériophages
Scarpe) :
- Mise en évidence
- Dénombrement par 2 méthodes

On recherchera ici la présence de phages d'E. coli ou de C. freundii, puisque la Scarpe

contient des germes fécaux (provenant de la station d'épuration), et que les virus
bactériens se multiplient aux dépens des espèces bactériennes présentes.

Jour 1 : PREPARATION DU TEST : ENRICHISSEMENT

On travaillera en binôme : l’un sur E.coli, l’autre sur C. freundii.

Matériel à disposition :
- Eau de la Scarpe : 5 mL
- 1 filtre Millipore+ 1 seringue 5 mL
- 1 flacon de 45 mL de culture jeune en eau peptonée d’E.coli ou C. freundii
- 2 mL d’une solution stérile de CaCl2 à 11,4 g/L et MgCl2 à 10 g/L
- 1 pipette de 1 mL stérile

Manipulation :

➢ Filtrer 5 ml d'eau de la Scarpe sur filtre individuel, à la seringue (noter la taille des pores)
➢ Verser le filtrat dans 43 mL de culture jeune de E.coli (ou C. Freundii selon la souche
choisie) en eau peptonée.
➢ Ajouter 2 Ll d'une solution stérile de CaCl2 à 11,4 g/L + MgCl2 à 10 g/L.
➢ Mélanger et incuber au moins 16 h à 37°C

Jour 2 : PARTIE A : MISE EN EVIDENCE DES BACTERIOPHAGES : (méthode

qualitative)

Matériel à disposition :
- 1 filtre Millipore + 1 seringue de 5 mL
- 1 écouvillon stérile
- une culture jeune de 14 à 16h d’E.coli (ou C.freundii) en eau peptonée.
- 2 tubes de 9 mL d’eau physiologique stérile
- 2 tubes à hémolyse plastique stérile
- 1 centrifugeuse + godets adaptés aux tubes à hémolyse
- 1 godet plastique non stérile
- 1 boites de GN en grande boite de Pétri
- 1 P40 + cônes stériles
Manipulation :

➢ Prélever 5 mL de la culture en tube à hémolyse plastique, puis centrifuger pendant 10

minutes à 1500 rpm (la centrifugation initiale permet de ne pas colmater le filtre)
➢ Transvaser le surnageant en godet, puis filtrer de la même façon qu’à J1. On récupérera
au moins 3 mL de filtrat en tube à hémolyse stérile (noter « phages de E.c (ou C.f) »)
➢ Sur une boite de Gélose Nutritive (GN), ensemencer à l’aide d’un écouvillon une souche
de E.coli (ou C.freundii) diluée approximativement au 1/1000ème en eau physiologique
stérile.
➢ Sécher 30 minutes à 37°C.
➢ Sur la boite, déposer 3 gouttes de 30 L chacune (former un triangle, les gouttes doivent
être bien séparées), soit :
- une goutte d’eau physiologique stérile (témoin),
- une goutte de votre filtrat de phages,
- une goutte du filtrat de phages de votre binôme.
➢ Laisser sécher au pied du bec Bunsen (couvercle entrouvert)
➢ Incuber 24h à 37°C.

Jour 3 : lecture des résultats. Y a-t-il une plage de lyse au niveau des dépôts réalisés ?

Compte-rendu de la Partie A :

• Expliquer l’intérêt de procéder à un enrichissement.

• Pourquoi filtre-t-on l’eau de la Scarpe ?
• Pourquoi est-ce important d’ajouter des ions divalents (Ca2+, et Mg2+) ? Calculer la
concentration en mol.L-1 de CaCl2 et de MgCl2 dans l’eau peptonée.
• Faire le schéma des résultats obtenus : Y a-t-il présence de phages virulents ?
Expliquez.

Jour 2 : PARTIE B : DENOMBREMENT DES PHAGES : METHODES CLASSIQUES

PAR LES PLAGES DE LYSE (méthode quantitatives)

Matériel à disposition :
- 1 boite de GN en grande boite de Petri
- 6 boites de gélose Bactotryptone
- 1 boite contenant environ 20 cônes jaunes stériles
- 1 P200, et 1 P40
- 6 tubes de 9 mL d’eau physiologique enrichie en Ca et Mg
- 6 tubes à essai vides stériles
- 6 tubes de gélose bactotryptone semi-molle (5 mL/tube) en surfusion à 50°C

Manipulation :

➢ Réaliser à partir du filtrat noté « phages de E.c (ou C.f) » et préparé dans la partie A des
dilutions décimales jusqu’à 10-6 dans de l’eau physiologique enrichie en Ca2+ et Mg2+.

B1 / Dénombrement par méthode rapide :

➢ Sur une autre boite de Gélose Nutritive (GN), ensemencer par écouvillonnage une souche
de E.coli (ou C.freundii) diluée approximativement au 1/1000ème en eau physiologique
stérile. (on peut réutiliser la même que celle de la partie A)
➢ Sécher 30 minutes à 37°C.
➢ Réaliser 7 dépôts de 10 L des dilutions 100 à 10-6 (6 sur le pourtour, et 1 au centre)
régulièrement répartis, et suffisamment éloignés les uns des autres (se faire un gabarit sur
du papier si nécessaire).
➢ Sécher au pied du bec Bunsen (ou sous le PSM), boite entrouverte, et incuber 24h à
37°C.

B2 / Dénombrement par méthode classique :

➢ Préparer 6 boites de Gélose Bactotryptone pour les 6 dilutions de 10-1 à 10-6.

➢ Dans 6 tubes à essai stériles, mélanger 100 L de culture non diluée de E.coli (ou
C.freundii) et 100 L de chaque dilution de phages.
➢ Agiter, et laisser poser 10 minutes pour permettre l’adsorption des phages.
➢ Ajouter par transvasement dans chaque tube 5 mL de gélose semi-molle à 50°C.
➢ Agiter, laisser reposer pour faire remonter les bulles, puis couler chaque tube sur la boite
de Gélose Bactotryptone correspondante (procéder rapidement tube par tube, pour
éviter la prise en masse, et les grumeaux)
➢ Laisser solidifier, et incuber 24 h à 37°C.

Jour 3 :

➢ Compter les plages de lyse obtenues avec chaque méthode :

- Méthode rapide : compter les spots contenant jusqu’à 10 plages de lyses
distinctes.
- Méthode classique : compter les boites contenant moins de 100 plages de lyse.

➢ Calculer le nombre de phages par mL dans le filtrat initial.

Compte-rendu de la partie B:

• Pourquoi utilise-t-on une sous-couche de gélose pour la méthode B2 ?

• En vous aidant de schémas, indiquer les principales étapes de l’infection d’une
bactérie par un phage virulent.
• Une plage de lyse = un phage : combien dénombre-t-on de plages de lyse par les
deux modes opératoires ? (organiser votre réponse sous forme de tableau)
• Quel est le résultat final par mL de filtrat ? Les deux résultats sont-ils concordants ?