MERCIER Loïc-2018/2019

1ère Année DUT Génie biologique Option Analyses

Biologiques et Biochimiques

Stage d’observation de 1ère Année de DUT au laboratoire

Biovelys : Validation d’un nouveau kit de dosage de la
ferritine sur différentes espèces

Stage du 03/06/2019 au 28/06/2019

Institut Claude Bourgelat, Laboratoire d’études précliniques Biovelys

1 Avenue Claude Bourgelat, 69280 Marcy l’Etoile

Enseignant Tuteur : CIMAN Emmanuelle

Maitre de stage : DEBARD Cyrille

REMERCIEMENTS

Je remercie Monsieur DEBARD Cyrille, mon maître de stage, qui m’as beaucoup apporté pendant le
stage, autant au niveau manipulation qu’au niveau personnel.

Je remercie Mesdames COUTURIER Solange, ROUSELLIERE Edwige, BARRAL Gaelle, MAURAS

Alexane, des différents services de VetagroSup qui m’ont permis de découvrir leurs quotidiens et
m’ont appris beaucoup de choses.

Je remercie Monsieur BURONFOSSE Thierry, vétérinaire à VetagroSup qui m’as aidé tout au long de
mon stage.

Je remercie Mesdames PLANTAROSE Claire et FORESTIER Laura de BIOVETIM de m’avoir

donnée des conseils tout au long du stage.

Je remercie Madame CIMAN Emmanuel mon enseignant tuteur qui m’as aidé dans ma recherche de
stage.
Table des matières
INTRODUCTION................................................................................................................................1
I-Test d’un nouvel automate pour l’hémostase................................................................................2
A-Le contexte préclinique............................................................................................................................2
B-Protocole..................................................................................................................................................3
C-Résultats...................................................................................................................................................4
1)Effet de la résistance mécanique....................................................................................................................................4
2)Effet du volume de plasma............................................................................................................................................5

II-Test d’un nouveau kit pour le dosage de la ferritine.....................................................................7

A-Le contexte préclinique............................................................................................................................7
B-Principe.....................................................................................................................................................7
C-Matériel et Méthode................................................................................................................................8
a) 1er Calibrage..................................................................................................................................................................8
b) Réactivité croisée........................................................................................................................................................10
c) 2ème Calibrage..............................................................................................................................................................12

D)Résultats (faibles concentrations)...........................................................................................................15

Test des valeurs usuelles............................................................................................................................16

Conclusion :..................................................................................................................................22
ANNEXES :..................................................................................................................................26
INTRODUCTION
J’ai réalisé mon stage d’observation sur le campus vétérinaire de Vetagro Sup, situé à Marcy
l’Etoile.

Vetagro Sup est une école vétérinaire nationale qui possède une clinique vétérinaire où les
étudiants sont en formation pour devenir de futurs docteurs vétérinaires mais il y a aussi une partie de
recherche sur la santé animale. De plus, Vetagro Sup possède des plateaux techniques dont un
Laboratoire de Biologie Médicale qui réalise des analyses
(Hématologie/Hémostase/Biochimie/Endocrinologie) à partir d’échantillon provenant soit de la
clinique vétérinaire soit de cliniques vétérinaires extérieurs.

L’Institut Claude Bourgelat est une plateforme technologique présente au sein de Vetagro Sup,
dédiée aux essais précliniques sur l’animal. L’Institut est composé de 3 entités distinctes et
complémentaires.

Ces 3 prestataires spécialisés sont :

-Biovivo (Imagerie Médicale, Chirurgie, Vaccinologie, …)

-Biovetim (Dosages de biomarqueurs par méthode immunologique (ELISA,RIA,..)
-Biovelys (Analyses de Biochimie, Hématologie/Hémostase et Cytologie)
C’est au sein de la partie Biovelys que j’ai effectué mon stage.

L’enjeu de ce stage pour moi est de découvrir le milieu professionnel au sein d’un laboratoire et
de me rendre compte si c’est un métier qui me plaira à l’avenir. Mon stage était composé de 2
objectifs : dans un premier temps tester un nouvel automate qui a été reçu il y a peu de temps pour
l’hémostase et vérifier si avec des petits volumes (comme pour la souris, le rat ou le singe qui sont
utilisé comme modèle en recherche préclinique) il est possible de réaliser ces tests sans encombre.
Dans un second temps j’ai testé un nouveau kit pour le dosage de la ferritine.

1
I-Test d’un nouvel automate pour l’hémostase
A-Le contexte préclinique

Pour Biovelys qui réalise des analyses précliniques, l’intérêt de tester ce nouvel automate est de
pouvoir travailler avec des volumes de plasma faible (50µL qui sont préconisés par le fabricant) car
des gros prélèvements sont parfois difficile à réaliser sur des petits animaux possédant une quantité de
sang assez faible.

Cet automate est un Start Max commercialisé par Stago, il permet de calculer un temps de coagulation.

Le principe de ce test est simple : l’automate mesure le temps d’arrêt d’une bille en fer placeé dans une
cuve contenant un fond courbe avec le plasma. En effet, la coagulation du plasma entraine une
modification de sa consistance (devient un gel) ce qui va arrêter la bille. Ce temps d’arrêt nous donnera
notre temps de coagulation.

J’ai donc testé ce nouvel automate utilisé pour l’hémostase afin de déterminer si les volumes de plasma
et réactifs utilisés modifient les temps de coagulation. Cet automate peut également mesurer le temps
de coagulation avec une résistance plus ou moins forte pour arrêter le mouvement de la bille. J’ai testé
l’influence de cette résistance sur la mesure des temps de coagulation.

Attention, il est impératif d’utiliser un tube citraté car sur les tubes EDTA ou héparinés il y a des
facteurs anticoagulants incompatibles avec les réactifs utilisés. Enfin le plasma est obtenu après
centrifugation d’un tube de sang à 2500G pendant 15 minutes.

Il existe 2 types de voies pour activer la coagulation, ces 2 voies mènent à la formation de fibrine à
partir de fibrinogène mais ne sont pas activées par les mêmes facteurs.

-La voie extrinsèque aussi appelé voie exogène est déclencher lors d’une lésion d’un tissu. Elle débute
par l’activation du facteur VII en présence de calcium. Pour cette voie, nous allons calculer un Temps
de Quick (TQ) ou Temps de Prothrombine (TP).

-La voie intrinsèque (voie endogène) est activé lors d’une lésion vasculaire et commence par
l’activation du facteur XII. Pour cette voie, nous allons calculer un Temps de Céphaline Activé (TCA).

Pour chaque partie, nous présenterons le contexte préclinique et la nécessité de réaliser ces
tests. Puis nous pourrions déterminer quels sont les avantages.

2
 Les facteurs de coagulation explorés par le TP et TCA

Figure 1 : Schéma des 2 voies de coagulation servant pour l’Hémostase

B-Protocole

Pour déterminer nos temps de coagulation nous allons tester 2 paramètres bien distincts :

- Déterminer si les volumes de plasma utilisés dans les cuvettes peuvent modifier le temps de
coagulation
- Déterminer si la résistance mécanique a un effet sur le temps de coagulation. Il existe 2 types de
résistance : no weak (forte) et weak (faible)

Pour répondre à ces 2 questions, j’ai utilisé les programmes suivants :

- Temps de Prothrombine NO WEAK (TP NO WEAK)

- Temps de Prothrombine WEAK (TP WEAK)
- Temps de Céphaline Activé NO WEAK (TCA NO WEAK)
- Temps de Céphaline Activé WEAK (TCA WEAK)
3
Dans un premier temps j’ai mesuré les temps de coagulation pour déterminer l’effet de la résistance
mécanique en comparant les résultats obtenus entre les programmes « WEAK » et « NO WEAK »
avec le même volume de plasma (50µL).

Dans un second temps j’ai mesuré les temps de coagulation en modifiant les volumes de plasma
utilisés : mesures avec 50µL ou 100µL.

Chaque mesure est réalisée en double sur le plasma de 3 espèces animales différentes : le chien, le chat
et le cheval dont les temps de coagulation sont différents.

C-Résultats

1)Effet de la résistance mécanique

Tous d’abord, le volume préconisé par le fabricant est de 50µL. Les mesures de la résistance
mécanique ont toutes été réalisées avec ce volume.

Les résultats obtenus sont présentés sur les figures 2 et 3.

40
Temps de coagulation en seconde

30

20

10

0
chien chat cheval

TCA NO WEAK TCA WEAK

Figure 2 : Effet de la résistance mécanique sur le TCA

4
 20

15
Temps de coagulation en seconde

10

0
chien chat cheval

TP NO WEAK TP WEAK

Figure 3 : Effet de la résistance mécanique sur le TP

Nous pouvons voir que pour les deux temps de coagulation (TCA et TP), le changement de résistance
mécanique n’a aucune influence sur le temps de coagulation quel que soit l’espèce. Comme attendu les
TP/TCA pour les chiens sont plus faibles que pour les chats et les chevaux.

2)Effet du volume de plasma

Mesure avec une faible résistance Mesure avec une forte résistance
Temps de coagulation en seconde

Temps de coagulation en seconde

40 40
35 35
30 30
25 25
20 20
15 15
10 10
5 5
0 0
chien chat cheval chien chat cheval

50 100 50 100

Figure 4 et 5 : Effet du volume de plasma sur le TCA

5
 Mesure avec une faible résistance Mesure avec une forte résistance

Temps de coagulation en seconde

Temps de coagulation en seconde

16 18
14 16
12 14
12
10
10
8
8
6 6
4 4
2 2
0 0
chien chat cheval chien chat cheval

50 100 50 100

Figure 6 et 7 : Effet du volume de plasma sur le TP

Nous pouvons constater que le volume n’a pas d’effet sur les temps de coagulation mesurés pour les
trois espèces testées.

En conclusion une modification de la résistance (faible ou forte) et du volume de plasma (50 ou

100µL) n’ont pas de conséquence sur la mesure des temps de coagulation.

Il est donc possible de travailler avec un volume de 50µL de plasma ce qui permettra au laboratoire de
proposer ces analyses pour des petits animaux.

6
II-Test d’un nouveau kit pour le dosage de la ferritine
A-Le contexte préclinique

Pour cette étude, nous avons choisi de tester un nouveau kit pour le dosage de la ferritine (protéine
impliquée dans le métabolisme du fer et dont la concentration circulante est le reflet de la réserve
ferrique).

En effet ce dosage est nécessaire pour un projet de recherche utilisant un modèle équin. Le kit utilisé à
ce jour au laboratoire permet de doser la ferritine chez les chiens et les bovins mais pas chez les
chevaux. Nous cherchons donc un kit qui permettrait de doser la ferritine chez le cheval. Un article
publié en 2015 par Francesco Dondi indique qu’il est possible d’utiliser un kit commercialisé par
Beckman Coulter pour mesurer la ferritine chez les chevaux.

J’ai donc vérifié que ce kit permet de doser la ferritine chez les chevaux mais aussi chez le chien, les
bovins et le porc.

B-Principe

Ces kits sont normalement faits pour les analyses humaines. Un anticorps anti-ferritine va se coupler
avec la ferritine chez l’homme. Mais si l’épitope utilisé chez l’homme est conservé chez l’animal alors
il y aura réactivité croisée pour cette espèce et le dosage fonctionnera. Par contre si l’épitope de
l’animal est différent de celui de l’homme, le dosage sera non-fonctionnel. Ce type de dosage
fonctionne en Immunoturbidimétrie. Ce kit est composé d’un anticorps couplé à des billes de latex et
d’une solution tampon. Lors du contact entre le sérum et les réactifs, les anticorps anti-ferritine (+
latex) vont se couplés à la ferritine. Cela va rendre le ferritine « visible » à cause du latex donc
l’automate pourra grâce à son spectrophotomètre mesurée une absorbance.

Pour réaliser le dosage de la ferritine, nous allons utiliser un Konelab 30 qui est un automate dirigé via
un ordinateur. Son fonctionnement est très simple, c’est un automate qui possède 3 bras mécaniques,
un disque avec tous les réactifs, un disque pour mettre les échantillons et un chargeur de cuvettes pour
permettre de réaliser les mélanges entre réactifs et échantillons.

7
De plus pour doser des échantillons on utilise un spectrophotomètre intégré dans l’automate qui va
nous permettre de mesurer une absorbance. Enfin grâce à une équation spécifique à chaque dosage,
nous allons pouvoir passer de l’absorbance à la concentration ou l’activité enzymatique.

Figure 8 : Schéma de la structure interne du Konelab 30

Notre nouveau kit se compose de 2 réactifs :

- R1 qui est un tampon Tris avec un pH à 8,3 et une concentration à 170 mmol/L

-R2 qui est un ensemble de particules de latex revêtues d’anticorps anti-ferritine (lapin) à un pH de 7,3

C-Matériel et Méthode

Pour la réalisation de ce dosage, plusieurs étapes sont nécessaires :

-le mélange de 100µL de R1 avec 5µL d’échantillon qu’on laisse incuber 300 secondes.

-On rajoute 50µL de réactifs R2 on laisse incuber 25 secondes avant de faire le blanc.

- Incuber 260 secondes avant d’effectuer la mesure à 660 nm.

8
a) 1er Calibrage
Nous allons donc devoir calibrer le nouveau kit sur le Konelab 30 et passer des contrôles pour vérifier
le bon calibrage. Nous allons utiliser 3 calibrants et un blanc d’eau qui va nous permettre de faire le 0.
Le premier calibrant (FerritCal1) a une concentration de 130 µg/L, le FerritCal2 260µg/L et enfin le
FerritCal3 675 µg/L. À la fin de la calibration, des mesures sont réalisées à partir d’échantillons
contrôle (avec des valeurs attendues).

Après le calibrage, nous utilisons des contrôles avec une concentration déjà connue afin de valider la
calibration proposée.

Figure 9 : Courbe de calibration de l’ancien kit

Avec l’ancien kit utilisé au laboratoire, le dosage est non linéaire et l’augmentation d’absorbance est
de 0.100 pour une concentration en ferritine de 674 µg/L.

9
 Figure 10 : Courbe de calibration du nouveau kit

Valeur cible Valeur trouvé

Echantillon
(µg/L) (µg/L)

Contrôle 1 49,7 56,5

Contrôle 2 287,00 281,8

Tableau 1 : Tableau des valeurs contrôles

Pour cette courbe, on voit un dosage non linéaire avec une réponse d’absorbance à 0,140 pour
674µg/L. Donc le kit de chez BECKMAN COULTER a une meilleure réponse.

De plus, les contrôles sont justes car ils sont proches des valeurs cibles (+ ou – 2 Écart type).

b) Réactivité croisée
Après avoir réalisé ce calibrage, j’ai pu tester la réactivité croisée chez le cheval, le chien, le cochon et
les bovins (vache et veau).
10
Pour le moment, nous allons comparer les résultats obtenus avec l’ancien et le nouveau kit sur 18
animaux et 5 espèces différentes.

Animal [C] en µg/L

/ Ancien kit Nouveau kit

CHIEN 209 327
CHIEN 279 369
CHIEN 81 99
CHIEN 225 240
CHIEN 6 36
COCHON ND 2
COCHON 21 78
CHEVAL ND 7
CHEVAL ND 5
CHEVAL ND 47
Vache93 NA 104
Vache94 NA 165
Vache95 NA 152
Vache96 NA 190
VEAU1 NA 2
VEAU2 NA 32
VEAU3 NA 8
VEAU4 NA <0
ND= Non détectable NA = Non applicable

Tableau 2: Tableau de comparaison de l’ancien et du nouveau kit

Pour le chien et le cochon, on obtient une meilleure réponse ce qui est positif. Pour le cheval, on
obtient une réponse contrairement à l’autre kit. Et enfin, pour les bovins ont obtient de bons résultats
pour les vaches mais de très faibles concentrations pour les veaux.

Nous allons donc à présent chercher à savoir si avec le nouveau kit et la méthode actuelle utilisé nous
pouvons doser des petites concentrations pour les espèces possédant peu de ferritine.

11
Pour l’instant, le première méthode (1) mise en place est une méthode où la quantité de sérum pipeté
par l’automate est de 5µL.

Pour doser les faibles concentrations, nous avons décidé d’augmenter le volume prélevé par l’automate
en le passant de 5µL à 30µL.

c) 2ème Calibrage

Nous avons donc créé une nouvelle méthode (2) pour doser des concentrations faibles.

Pour la nouvelle méthode (2), nous allons réaliser un calibrage comme pour la 1 ère méthode. Cette fois
étant donné que nous voulons réaliser des dosages sur des faibles concentrations, nous n’allons pas
utiliser le FerritCal3 mais créer un nouveau calibrant qui est FerritCal ½ en diluant le FerritCal1 au ½.

Figure 11 : Courbe de calibrage de la nouvelle méthode (2) avec un volume V=30µL

12
 Echantillon Valeur cible Valeur trouvé
Contrôle 1 49,7 39,1
Contrôle 2 287,0 260,6
Tableau 3 : Tableau des valeurs contrôles

Les contrôles sont justes car ils sont proches des valeurs cibles (+ ou – 2 Écart type).

Après avoir réalisé ce calibrage on peut remarquer que l’on obtient une belle droite entre le S0 et le
FerritCal ½ ce qui va nous permettre de mieux doser entre 0 et 60 µg/L. Le seul problème c’est
qu’entre 2 points, la machine est obligée de faire une droite. On voit qu’au-dessus de 100 µg/L, la
courbe devient presque plate, cela est dut au fait que l’ajout de sérum est trop important pour le
nombre d’anticorps, il y a donc une saturation qui commence vers 100 µg/L mais cela ne nous gêne
pas puisque nous étudiez des concentrations inférieures à 60 µg/L.

Étant donné la courbe de calibration que nous avons obtenu, nous allons essayer d’améliorer notre
courbe de calibration en utilisant des calibrant possédant une concentration encore plus faible.

Nous avons choisi de calibrer cette fois ci en utilisant les calibrants suivants : FerritCal 1/16 ; FerritCal
1/8 ; FerritCal ¼ ; FerritCal ½ et FerritCal 1 qui ont tous été fait à partir de FerritCal 1 par dilution
successive. Pour ce calibrage, nous avons utilisé seulement le Contrôle 1 car le Contrôle 2 est trop
élevé et ne serait d’aucune utilité ici.

13
 Figure 12 : Courbe de calibration finale de la méthode 2 (v=30µL)
Grâce à cette nouvelle calibration, la courbe passe par 4 points, ce qui nous donne une courbe mieux
exploitable entre 0 et 50 µg/L.

Valeur cible Valeur trouvé

Echantillon
(µg/L) (µg/L)
Contrôle 1 49,7 50,9

Tableau 4 : Tableau des valeurs contrôles

Le contrôle est juste car il est proche de la valeur cible (+ ou – 2 Écart type). Et même plus précis que
pour les autres calibrages effectués précédemment.

14
 D)Résultats (faibles concentrations)

Une fois la calibration et les contrôles effectués, nous allons réaliser une dilution en série d’un
échantillon pour déterminer si :
- les valeurs attendues sont proches des valeurs mesurées
- si lorsque l’on arrive dans des petites concentrations on peut doser facilement et précisément.
Pour réaliser tout cela, nous allons partir du sérum d’un chien dont la concentration en ferritine est de
300µg/L. À partir de cet échantillon, nous allons réaliser une série de dilution pour nous permettre de
doser à la fois de fortes, moyennes et faibles concentrations. Pour réaliser ces dilutions nous avons
utilisé comme diluant un Tampon Hepes avec un pH à 7,4 et avec 1% de BSA (Bovin Serum
Albumin), il ne contient pas de ferritine pour ne pas perturber les mesures.

Nous devons réaliser la série de dilution suivante pour obtenir les concentrations estimées :
300 ;150 ;75 ;37.5 ;19 ;10 ;7.5 ;5 ;2.5 ;1,25 ;0,6125.

[C] estimé 300 150 75 37,5 10 5 2,5 1,25 0,6125 7,5 19

Volume de
40µL de 100µL de
départ en 400 200 200 200 150 200 150 150 100
[c]=75 [C]=37,5
µL
Volume
diluant 150
/ 200 200 300 200 150 100 360 100
(sérum) en 200
µL
Volume
400 400 400 400 450 400 300 300 200 400 200
totale en µL

Transfert

Figure 13 : Tableau de dilution à partir d’une solution à 300µg/L

Après avoir réalisé toute ces dilutions, nous avons dosé la ferritine. De plus, pour pouvoir comparer les
2 méthodes nous allons mesurer toutes les dilutions avec la méthode 1(5µL d’échantillon) et les
échantillons avec une concentration estimée <20 µg/L seront quantifiés avec la méthode 2(30µL
d’échantillon).
15
 Ferritine Normal avec Ferritine Nouveau
 
V= 5µL Calibrage V=30µL

[C] attendue [C] en µg/L [C] en µg/L

300 314 NA
150 162 NA
75 81 NA
37,5 43 NA
19 19 20
10 14 17,7
7,5 5 10
5 9 8,4
2,5 4 3
1,25 NA 2,1
0,625 NA 1

Tableau 5 : Résultats du dosage de la gamme de dilution avec la méthode 1 et la méthode 2

Avec ce tableau, nous voyons que les résultats obtenus pour les 2 méthodes par rapport aux résultats
attendus sont bons. Nous voyons aussi que les résultats sont relativement proches.

Nous allons d’abord voir si notre nouveau kit est bien fonctionnel pour le cheval et est-il mieux que
l’ancien. Nous allons ensuite voir quel est la méthode la plus efficace pour doser la ferritine. Et enfin
voir si notre dernier calibrage a été bénéfique pour le calcul des petites concentrations.

16
Test des valeurs usuelles

Pour pouvoir utiliser notre technique de dosage au niveau clinique, nous devons possédez des valeurs
usuelles qui nous permettront de savoir quand un animal a un taux anormalement haut ou bas. Nous
avons pu réaliser ces tests seulement pour les chiens pour le moment.

Pour cela nous avons testé dans un premier temps 10 chiens sains pour obtenir une moyenne et un
écart type.

Concentration en
Numéro échantillon Espèces Date Diagnostic
ferritine en µg/L
BLYS19-14-01 CHIEN 20/06/2019 146 Sain
BLYS19-14-02 CHIEN 20/06/2019 204 Sain
BLYS19-14-03 CHIEN 20/06/2019 135 Sain
BLYS19-14-04 CHIEN 20/06/2019 152 Sain
BLYS19-14-05 CHIEN 20/06/2019 126 Sain
BLYS19-14-06 CHIEN 20/06/2019 143 Sain
BLYS19-14-07 CHIEN 20/06/2019 87 Sain
BLYS19-14-08 CHIEN 20/06/2019 143 Sain
BLYS19-14-09 CHIEN 20/06/2019 134 Sain
BLYS19-14-10 CHIEN 20/06/2019 178 Sain
Moyenne 145
Ecart type 31

Tableau 6 : Tableau des valeurs usuelles pour les chiens sains

Nous avons donc obtenu une moyenne de 145µg/L pour les chiens sains en parfaite santé avec des
valeurs allant de 87µg/L à 204µg/L.

Nous avons donc pu définir un intervalle pour les valeurs usuelles qui est I= [80 ;210] pour pouvoir
exploiter les résultats au niveau clinique.

Nous avons aussi testé certains animaux provenant de la clinique et ayant différents diagnostics pour
voir si la ferritine pouvait être un marqueur de l’inflammation.

17
 Concentration en
Numéro Clovis Numéro échantillon Espèces Date Diagnostic
ferritine en µg/L

Piroplasmose + suspicion
L19-2795 B2019-1137 CHIEN 28/03/2019 551
pemphigus foliacé

Piroplasmose +
L19-3106 B2019-1268 CHIEN 08/04/2109 1271 thrombopénie sevère +
leucopénie

Piroplasmose diagnostiquée
L19-3409 B2019-1555 CHIEN 07/05/2019 347
le 18/04/2019

L18-10159 B2019-2244 CHIEN 19/06/2019 97 NA

L08-1278 B2019-2245 CHIEN 19/06/2019 135 Tumeur digestive

L19-5127 B2019-2246 CHIEN 19/06/2019 96 Anorexie

Syndromes digestifs ; foie
L19-5132 B2019-2247 CHIEN 19/06/2019 480
en surcharge
Piroplasmose +
L17-5099 B2019-2248 CHIEN 19/06/2019 1375
pancytopénie
L19-5235 B2019-2249 CHIEN 19/06/2019 145 Pneumothorax
DM non équilibré (diabète
L14-5231 B2019-2250 CHIEN 19/06/2019 390
sucré)
L18-9977 B2019-2252 CHIEN 19/06/2019 299 Otite
Suspicion incompétence
L19-3802 B2019-2253 CHIEN 19/06/2019 109
sphinctérienne
L13-4269 B2019-2254 CHIEN 19/06/2019 130 Cervicalgie transitoire
Adénocarcinome
L19-3490 B2019-2255 CHIEN 19/06/2019 270
mammaire
Adénocarcinome
L19-3238 B2019-2256 CHIEN 19/06/2019 212
mammaire métastasé
L19-5124 B2019-2259 CHIEN 19/06/2019 326 NA
Suspicion d'arthrite
L19-3921 B2019-2279 CHIEN 19/06/2019 165
septique
L19-3920 B2019-2280 CHIEN 20/06/2019 403 Tendinopathie bicipitale
L08-4783 B2019-2283 CHIEN 20/06/2019 200 Saignements digestifs
L19-2166 B2019-977 CHEVAL 18/03/2019 25 Piroplasmose
18
L19-2166 B2019-1034 CHEVAL 21/03/2019 31 Piroplasmose
L19-2166 B2019-1080 CHEVAL 26/03/2019 1254 Piroplasmose
L19-2166 B2019-1147 CHEVAL 01/04/2019 169 Piroplasmose
L19-2166 B2019-1210 CHEVAL 05/04/2019 281 Piroplasmose
L19-2166 B2019-1311 CHEVAL 11/04/2019 1121 Piroplasmose

Tableau 7 : Tableau de valeurs testés sur différents animaux pris au hasard

On voit en rouge des valeurs extrêmement élevées, à chaque fois supérieures à 1000µg/L. À chaque
fois ces valeurs élevées sont liées à une piroplasmose chez l’animal, nous pouvons donc soupçonner
une réponse inflammatoire ou d’autre signe clinique grâce au dosage de la ferritine.

Pour conclure, on peut dire que :

Premièrement, nous voyons clairement que le nouveau kit marche très bien car nous avons réussi à
doser la ferritine pour beaucoup plus d’espèces que l’ancien notamment le cheval. Il est aussi voire
plus efficace que l’ancien. Ce qui est important c’est que pour le même coût, ce kit possède plus de
réactif, donc est plus rentable car chaque dosage coutera moins cher. De plus, la courbe de calibration
du nouveau kit est plus facilement exploitable que l’ancienne. Le nouveau kit est donc plus précis que
l’ancien.

Deuxièmement, en plus d’un kit fonctionnel, nous avons un kit qui permet de doser la ferritine chez de
nombreuses espèces. Pour le chien, notre réponse au dosage est meilleure. Pour le cheval ont obtient
des résultats contrairement à avant. Et enfin pour les bovins et les porcins le dosage est plus précis.
Contrairement à l’ancien kit nous pouvons doser la ferritine pour plus d’espèces et de manière plus
efficace.

Troisièmement, nous allons pouvoir comparer quel est la meilleure méthode pour doser la ferritine
avec le nouveau kit. On a d’abord vu qu’avec la méthode 1(5µL d’échantillon), nous arrivons à doser
des concentrations relativement élevées mais que lorsque l’on arrive dans les petites concentrations
cette méthode est moins précise et peut nous donner des résultats difficilement interprétables. Pour la
méthode 2(30µL d’échantillon), nous avons vu qu’on avait une bonne réponse pour les dosages
inférieurs à 60 µg/L mais au-dessus, la courbe n’est plus linéaire et les résultats ne peuvent pas être
juste car la courbe est quasiment plate au-dessus de 130µg/L.

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Nous pouvons donc en conclure que la méthode 1 sera efficace lorsque nous allons chercher à
déterminer la ferritine chez des animaux qui possède des concentrations normales ou grandes mais
lorsque nous dosons pour des animaux possédant des concentrations faibles nous allons préférer
utiliser la méthode 2 qui est plus efficace pour les faibles concentrations.

L’utilité de la nouvelle calibration (méthode 2 avec V=30µL) est d’avoir des résultats du dosage de la
ferritine plus précis même lorsque les concentrations sont très faibles. Pour le kit que nous utilisons, la
concentration minimale recommandée est de 4,3µg/L. Ici nous avons réussi à détecter des
concentrations de ferritine proche des 1µg/L soit 4 fois moins que la concentration minimale
recommandée par le fabricant. Ce qui signifie que grâce à cette calibration nous allons pouvoir doser
pour des animaux comme des veaux de lait qui possèdent des concentrations très faibles de ferritine et
nous allons même pouvoir doser ces concentrations précisément pour déterminer si cliniquement
quelque chose ne va pas.

Quatrièmement, pour l’ancien kit qui vient de chez DIASYS il est composé d’un seul flacon de 20 ml
de R1 et 1seul flacons de 10 ml de R2. Le nouveau kit utilisé est un kit provenant de chez BECKMAN
COULTER est composé de 4 flacons de 24 ml de R1 et 4 flacons de 12 ml de R2. Ces 2 kits sont
vendus à prix égale mais le nouveau kit possédant une plus grosse quantité de réactifs est plus rentable
pour le laboratoire. Ce nouveau kit va donc permettre au laboratoire d’augmenter sont chiffres
d’affaires car le dosage leurs coutera moins chers et pourra être réaliser pour plus d’espèces.

Et cinquièmement, on a déterminé des valeurs usuelles chez le chien en utilisant des chiens sains. Par
manque de temps nous n’avons pas pu déterminer ces valeurs pour d’autres espèces. Lorsque
suffisamment d’échantillon seront disponibles, des valeurs usuelles chez le cheval pourront être
déterminées.

Nous pouvons donc conclure qu’avec ce nouveau kit, la combinaison des 2 méthodes permet de doser
n’importe quelle concentration en choisissant la bonne méthode. De plus grâce à ces différents dosages
et articles scientifiques nous avons pu découvrir que la ferritine n’est pas seulement une protéine du fer
mais elle est également une protéine inflammatoire ce qui aurait un grand intérêt clinique. Pour
certains cas, nous pourrions utilisés le dosage de la ferritine pour confirmer ou avoir une suspicion de
certaines maladies.

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21
Conclusion :
Ces 2 études ont permis dans un premier temps de savoir si l’utilisation de petits volumes pour
l’hémostase ou encore le dosage de faibles concentrations pour la ferritine. Tout ça va permettre
d’effectuer des recherche plus précise et plus facile. Dans un second temps, ces 2 tests ont permis
d’améliorer aussi le côté clinique des analyses puisque pour que ce soit l’hémostase ou la ferritine cela
va, nous permettre de donner résultats précis et facilement interprétable à rendre au vétérinaire.

Au niveau personnel, je pense que ce stage m’as permis d’acquérir de nouvelles compétences que je ne
possédais pas ou encore de perfectionner celles déjà présentes. De plus, pendant le stage j’ai pu être en
contact avec le personnel de laboratoire de la clinique vétérinaire ce qui m’a permis de découvrir leurs
quotidiens avec leurs différentes contraintes. Enfin, durant le stage j’ai pu réaliser des manipulations
en hématologie (frottis sanguins, lecture de lames, etc…), en biochimie avec les analyses de différents
paramètres sur l’automate mais aussi en endocrinologie avec la mesure d’hormones. Toute ces
différentes manipulations m’ont permis de découvrir le monde du travail en laboratoire pour mon
avenir.

Pour finir j’ai pu découvrir que la partie administrative prend un temps considérable contrairement à ce
que je pensais car environ 50 % du temps sert à répondre au mail et gérer des papiers administratifs.

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Webographie

http://icbl.vetagro-sup.fr/ visité le 25/06/2019

https://www.sysmex.fr/ visité le 20/06/2019

https://www.stago.com/fr/produits-services/analyseurs-de-la-gamme-max/start-max/
Visité le 14/06/2019
ANNEXES :

A. Fiche technique « Ferritine » de BECKMAN COULTER

B. Fiche technique « Ferritine » de DIASYS
C. Article de Francesco Dondi, 16/05/2015
RESUME

Ce stage de fin de première année de DUT à Vetagro Sup m’a permis d’améliorer et de confirmer les
compétences acquises au fur et à mesure de l’année. J’ai réalisé dans différents domaines des tâches
scientifiques ce qui m’a apporté de nouvelles connaissances car j’ai appris différentes techniques et
interprété des résultats afin de comprendre les différents fonctionnements qui peuvent exister.

J’ai en grande partie réaliser une recherche sur un nouveau kit pour doser de la ferritine. Ce stage m’a
donc permis d’améliorer mes compétences et connaissances scientifiques mais aussi il a pu m’apporter
une expérience professionnelle avec l’aide de personnes qualifiées.

ABSTRACT

This stage of the end of my first year of DUT at Vetagro Sup allow me to ameliorate and confirm the
scientifics skills acquired during this yea. I realized in differents domains scientific duties that brought
me news knowledge because I learnt differents techniques and interpreting results for understand
differents operations who exist.

I realized during a long time a search on a new kit for doser ferritin. This stage enable to ameliorate
my skills and my scientifics knowledges but he could bring me a professional experience with the help
of qualified people.