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Service de Protéomie et de Biochimie des protéines

Travaux pratiques de Biochimie

Professeur : R.Wattiez Assistante : C. Rosier

2 Bac Biologie 2 Bac Chimie

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Dosage des protéines

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Le dosage des protéines :
Intérêts du dosage :
Il est souvent nécessaire de connaître la concentration totale de l’ensemble des protéines contenues dans un échantillon, par exemple pour suivre les différentes étapes d’une purification. Pour ce faire, on cherche à mesurer stoechiométriquement l’ensemble des protéines contenues dans cet échantillon. Les critères importants pour une bonne technique de dosage des protéines sont :      Le seuil de détection très faible La spécificité importante La facilité de mise en œuvre La rapidité Le coût peu élevé

L’ensemble des techniques de dosage protéique repose sur l’utilisation des propriétés physiques et chimiques intrinsèques des protéines. Citons parmis les plus répandues : 1. Folin (O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Far rand R.J. Randall (1951). J. Biol. Chem. 193, 265). 2. Absorption U.V. (J. Janin, (1985) Spectroscopie d’absorption. Collection Méthodes, Hermann, 125-135). 3. Bradford (M.M. Bradford (1976) Anal. Biochem. 72, 248-254). 4. Réaction de la fluorescamine avec les amines primaires. (S. Udenfried. (1978) Science 1978, 871-872). Différentes méthodes utilisées pour le dosage des protéines :

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1) Absorption U.V. :
Les mesures d’absorption d’un composé en solution aqueuse sont limitées à l’ultraviolet ou à la partie visible du spectre, zone où le solvant n’absorbe pas ou très peu. Les molécules qui absorbent dans ces longueurs d’onde sont appelées chromophores. Ce sont principalement les molécules comportant des noyaux aromatiques ou des doubles liaisons conjuguées. Dans le cas des protéines, les chromophores sont les résidus d’acides aminés aromatiques (TRP, TYR : absorption à 280nm) et les liaisons peptidiques (absorption à 230nm). L’absorption d’un chromophore à une longueur d’onde donnée (λ) dépend de sa nature, de sa concentration et de la longueur du trajet optique. C’est ce qui est représenté par la relation de BeerLambert :

A λ = ε λ LC
Où A est l’absorption du chromophore à la longueur d’onde λ, ε représente le coefficient d’extinction molaire (mg-1.ml.cm-1), L est la longueur du trajet optique dans la cuvette de mesure (cm) et C est la concentration du chromophore (mg.ml-1). Au vu de cette relation, il est aisé d’imaginer une méthode de dosage des protéines d’un échantillon par mesure de son absorption à une longueur d’onde donnée. Afin d’obtenir une sensibilité maximale, il est préférable de choisir une longueur d’onde correspondant à un pic d’absorption. Les protéines montrent un maximum d’absorption ultraviolette à 280nm. La mesure de l’absorbance à 280nm peut être utilisée comme moyen d’estimer la concentration totale en protéine ; toutefois l’absorbance dépend du contenu des protéines en deux acides aminés seulement, et peut donc varier considérablement d’une protéine à l’autre. D’une manière générale, l’avantage de la technique d’absorption UV pour le dosage du contenu total en protéines d’un échantillon est que cette technique est non destructive. Néanmoins, la présence de substances non protéiques (autres que les acides nucléiques) qui absorbent dans l’UV peut invalidés la technique.

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2) Folin (réactions chimiques)
En 1927, Folin et Colciateu mirent au point la réaction qui porte aujourd’hui leur nom et qui est à la base d’une des méthodes de titration des protéines les plus utilisées. L’acide phosphomolybdo-tungstique (3H2O.P2O5.13WO3.5MoO3.10H2O et 3H2O.P2O5.14WO3.4MoO3.10H2O) est le constituant actif du réactif de Folin. La présence d’une protéine entraîne sa réduction par perte d’un à trois atomes d’oxygène. La fixation de cuivre par chélation faciliterait le transfert d’électrons vers l’acide mixte. On obtient ainsi plusieurs espèces réduites possédant une couleur caractéristique (absorption maximale à 745750nm). 3H2O.P2O5.13WO3.5MoO3.10H2O 3H2O.P2O5.14WO3.4MoO3.10H2O

Espèces réduites colorées (bleues) λ max = 745-750nm

Le mélange d’acides mixtes phosphomolybdo-tungstiques est réduit par une réaction rapide avec des résidus d’acides aminés aromatiques (TYR et TRP) et par une réaction plus lente avec les complexes cuivre-liaisons peptidiques et/ou cuivre-chaînes latérales polaires.

3) Réaction de la fluorescamine avec les amines primaires (fixation covalente sur la protéine)
Il est possible d’utiliser la réactivité de certains groupements d’une protéine pour y greffer des molécules de type chromophore ou fluorophore. La fluorescamine en est un exemple. Cette molécule se fixe sur les amines primaires. A l’état libre, elle n’est pas fluorescente. Très rapidement à pH 9, on obtient un produit de couplage fluorescent entre l’amine primaire et la fluorescamine. Cette réaction se déroule en parallèle avec une réaction de dégradation de la fluorescamine, plus lente, produisant des composés non fluorescents. On mesure la fluorescence à une longueur d’onde d’émission de 475nm consécutive à une excitation à 390nm. Il est alors possible de détecter 0.5µg de protéines (10 fois plus sensible que la méthode de Folin).

acides aminés. cationique) ayant chacune un spectre d’absorption caractéristique. c'est-à-dire la quantité d’amine primaire. neutre. C’est la forme anionique qui interagit (de manière non covalente) préférentiellement avec les protéines. tampon tris.). La fixation du bleu de Coomassie se réalise si la molécule à évaluer comporte des groupements fonctionnels basiques et/ou aromatiques. il est possible de les utiliser pour doser les protéines en solution. cette technique est plus variable que les méthodes vues précédemment puisque la fluorescence est principalement due à un seul acide aminé seulement (LYS). 4) Bradford (fixation non covalente d’une colorant) Certaines molécules ont une affinité pour les protéines et peuvent donc s’y fixer plus ou moins fortement. L’exemple le plus courant est certainement la méthode de Bradford qui utilise la fixation du bleu de Coomassie sur les protéines.-6- L’intensité de fluorescence reflète la quantité de fluorescamine couplée. Ce colorant existe sous trois formes différentes (anionique. Glycine…. Dans le cas où le spectre d’absorption de ces molécules est modifié par la fixation (avec ou sans traitement ultérieur) ou quand une forme ayant un spectre caractéristique se fixe seule (équilibre déplacé vers cette forme). De plus. cette méthode n’est pas absolument spécifique des protéines et ne doit donc être utilisée que pour le dosage des protéines débarrassées de toute contamination par des amines primaires (peptides. Bien que très sensible. .

comme le Triton et le dodécyl sulfate de Na (SDS). . des interférences possibles avec des contaminants non protéiques puis de la facilité de mise en œuvre. comportant souvent un certain nombre de variantes. Le choix d’une méthode de dosage dépendra avant tout de la quantité de protéines à doser. et des bases fortes interfèrent avec celle-ci. 5) Conclusions : Il existe de nombreuses méthodes de dosage des protéines. Cette méthode est très sensible (2-5 µg de protéines) et très rapide. le bleu de Coomassie G250 aux protéines.-7- Cette méthode est donc basée sur l'adsorption d’un colorant. Elle est aussi assez résistante à la plupart des interférents qui nuisent à la plupart des autres méthodes. ainsi que des conditions de dosage. de la rapidité de la réponse souvent importante en cours de procédé. Seuls les détergents.

vous effectuerez une courbe d’étalonnage donnant l’absorbance du réactif colorant en fonction de la concentration de protéine standard. . 80ml d’acide phosphorique 88% et 40ml d’éthanol 95%. c'est-à-dire l’absorbance à 595nm en fonction de la quantité d’albumine bovine (µg) . Celle-ci contient 1g de bleu de Coomassie G250 dissout dans 200ml d’acide phosphorique 88% et 100ml d’éthanol 95%.Réaliser un spectre d’absorption dans l’UV d’une solution de blanc d’oeuf diluée entre 250 et 350nm. ici l’albumine bovine. Cette solution vous permettra de tracer une courbe d’étalonnage. Pour cela :       Préparer trois séries de tubes numérotés de 1 à 6 Pipeter les quantités de la solution d’albumine bovine indiquées dans le tableau ciaprès Amener le volume. vous utiliserez les techniques d’absorption UV et de Bradford.66 ) (Concentration théorique de 1mg/ml). additionner à 30ml de solution stock. vous déterminerez la concentration en protéines totale d’une solution diluée de blanc d’œuf. amener à 600ml avec de l’eau distillée.9% nécessaire à la réalisation des différentes dilutions de blanc d’œuf.Mesurer l’absorbance à 280nm d’une solution stock d’albumine bovine afin d’en calculer la concentration protéique exacte. Diluer cette solution 2X puis la filtrer sur papier Wathman N°1. Pour ce faire. Une solution stock d’albumine bovine à 1mg/ml a été préparée. 2) Méthode Bradford : Une solution stock de colorant a été préparée. Manipulation : Dans un premier temps. à 100µl à l’aide d’eau distillée Additionner 4ml de réactif colorant à chaque tube et bien homogénéiser à l’aide du vortex Après 5 minutes et avant 1 heure. préparer le réactif colorant. A partir de cette solution. Préparer une solution de NaCl 0.-8- Manipulations expérimentales : But : Au cours de ces travaux pratiques. dans chaque tube. (ε280nm BSA = 0. Pour ce faire. mesurer l’absorbance à 595nm par rapport à de l’eau distillée Tracer la courbe d’étalonnage. 1) Absorption UV : .

déterminer la concentration protéique du blanc d’œuf.9% Numéroter ensuite 2 tubes pour chacune des dilutions réalisées Placer dans ceux-ci. . vous allez déterminer la concentration en protéines du blanc d’œuf. à partir de la droite d’étalonnage. 1000X) dans une solution de NaCl 0. 500X.-9- Tube n° 1 1’ 1’’ 2 2’ 2’’ 3 3’ 3’’ 4 4’ 4’’ 5 5’ 5’’ 6 6’ 6’’ Albumine à 1mg/ml (µl) - Eau distillée (µl) 100 Colorant (ml) 4 Albumine Concentration finale (µg) D. mesurer l’absorbance à 595nm par rapport à de l’eau distillée A partir de la courbe étalon.O. Dans un second temps. 100X. à 595nm D. 100µl de la dilution adéquate de blanc d’œuf Additionner 4ml de réactif colorant à chaque tube et bien homogénéiser à l’aide du vortex Après 5 minutes et avant 1 heure.O. à 595nm blanc 10 90 4 20 80 4 50 50 4 80 20 4 100 0 4 La concentration finale d’albumine dans chaque tube peut être calculée précisément à partir de la concentration réelle de la solution stock d’albumine calculée préalablement par la loi de Beer-Lambert. Pour cela :       Réaliser plusieurs dilutions de blanc d’oeuf (10X.

O..10 Blanc d’œuf dilué (µl) 100 100 100 100 D. à 595nm . à 595nm blanc Concentration protéique (µg) Tube n° Blanc Blanc’ 10X 10X’ 100X 100X’ 500X 500X’ 1000X 1000X’ NaCl 0.9% (µl) 100 - Colorant (ml) 4 4 4 4 4 D.O.

.11 - Electrophorèse sur gel de polyacrylamide .

1. La charge portée par ces acides aminés dépend du pH et de la constante d’ionisation des groupes fonctionnels. La portion protéique du complexe protéine-SDS ainsi obtenu subit un changement de conformation conduisant à un haut degré d’ordre : le complexe (chargé négativement) prend la forme d’un bâtonnet. Dans le cas des protéines. sous l’influence d’un champ électrique.12 - L’électrophorèse sur gel de polyacrylamide : Introduction : La technique d’électrophorèse repose sur le déplacement (et la séparation) de particules chargées dans un champ électrique. f : coefficient de frottement entre les particules et le solvant.4gr de SDS se lie par gramme de protéine. E : champ électrique . acides aspartiques et glutamiques. le SDS est constitué d’une tête polaire (-) et d’une queue hydrophobe. sur les protéines et les dénature complètement. cystéine et tyrosine). la charge est due essentiellement aux groupements fonctionnels des chaînes latérales (lysine. soit une molécule de SDS pour 2 acides aminés. grâce à sa chaîne aliphatique. On parle alors de SDS-PAGE pour SDS-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis (voir plus bas). La vitesse de déplacement d’un ion (mobilité). Ce détergent s’adsorbe. arginine. La technique d’électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de Sodium Dodécyl Sulfate (SDS) permet de séparer les protéines par rapport à leur masse moléculaire. On a : mobilité d’une molécule = (champ appliqué * charge de la molécule)/(friction de la molécule) Soit : V=qE/f avec q : charge de la particule . . dépend d’une part de la charge de l’ion et d’autre part des forces de viscosité qui ralentissent son mouvement dans le solvant (friction). Electrophorèses sur gel de polyacrylamide en présence de dénaturant : le dodécyl sulfate de sodium (SDS) : Le SDS est un détergent dont la formule est : CH3-(CH2)11-OSO3-Na+ Comme toutes les substances amphiphiles. histidine. Ce qui permet une séparation des protéines dans un champ électrique en fonction exclusivement de leur masse moléculaire..

initiée par l'addition de persulfate d'ammonium et de TEMED (NNN'N'-tétraméthyléthylènediamine). Le gel de polyacrylamide : Le réseau de polyacrylamide est formé par la polymérisation de monomère d'acrylamide (CH2=CH-CO-NH2) (acryl) en présence de bis acrylamide (CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-COCH=CH2) (NN'méthylène-bisacrylamide). le TEMED catalysant la décomposition des ions persulfates pour donner des radicaux libres. on peut alors représenter la polymérisation ainsi : .13 - Cette méthode permet de déterminer rapidement la masse moléculaire des protéines. celles-ci ayant une migration électrophorétique inversement proportionnelle au logarithme de leur masse moléculaire. Le bis acrylamide. La polymérisation de l'acrylamide est un exemple de catalyse par radicaux libres (polymérisation vinylique). est l'équivalent de 2 monomères d'acrylamide liés par un groupement méthyl et est utilisé comme agent pontant. Figure 1 : formules des monomères L'acrylamide polymérise en longue chaîne incorporant des molécules de bis acrylamide au sein du polymère ainsi formé. Figure 2 : initiation de la polymérisation Si on représente ce radical R· et M un monomère d'acrylamide.. appelé aussi Bis.

le gel obtenu se comporte donc comme un tamis moléculaire (les macromolécules migrent d’autant moins vite qu’elles sont volumineuses). ..14 - Figure 3 : réaction de polymérisation Figure 4 : structure moléculaire du gel Remarque : L’oxygène. On obtient ainsi un réseau. molécule qui peut se transformer en radical libre. interfère avec ce processus de polymérisation. dont les mailles sont de tailles variables en fonction des proportions d’acrylamide et de bisacrylamide utilisées .

quelles sont les caractéristiques générales d’un gel électrophorèse SDS-PAGE et comment se déroule la migration des protéines dans celui-ci ? Caractéristiques générales : Un gel SDS-PAGE comprend deux parties distinctes : le gel de concentration d’une part et le gel de séparation d’autre part.15 5 . Caractéristiques moléculaires : Un gel SDS-PAGE typique comprend 2 parties distinctes : gel de concentration et gel de séparation.100 100 . Le passage de l'une à l'autre se fait avec un changement de pH et une augmentation de la concentration en acrylamide d’un gel à l’autre.20 10 .300 300 . Masse moléculaire (KDa) 10 . Le gel de concentration est de 4%. qui correspond à la porosité du gel. le gel de séparation varie entre 5 et 20 % suivant la taille des protéines que l'on veut séparer.10 5 .. Le taux de réticulation de ces gels.40 40 .15 - Champ électrique Plus précisément.500 % d'acrylamide 15 . L'objectif du gel d'électrophorèse en deux parties est de pallier aux problèmes liés aux faibles quantités de protéines et aux volumes parfois non négligeables déposés dans les puits. dépend des quantités d'acrylamide et de bis acrylamide. On réalise donc une étape de concentration des échantillons jusqu'à l'obtention de zones protéiques très fines dans le gel de concentration (stacking gel). qui migreront ensuite dans le gel de séparation (resolving gel).

ce sont en fait les vitesses au niveau des protéines si ces ions étaient seuls. Figure 8 : vitesse des différents composés ioniques Les vitesses de migration indiquées dans le tableau de la figure 8 sont celles des différents acteurs de l'électrophorèse. le gel de concentration étant à 6.8) cette modification de pH ne modifie pas la mobilité des protéines mais augmente la mobilité des ions glycinates complètement ionisés à ce pH.8 du gel de concentration. Ces changements se font sur deux niveaux :   Le gel de séparation est plus réticulé que le gel de concentration. . les ions glycinates ont une faible mobilité comparés à celles des protéines. des changements drastiques vont s’opérer.8. il est basique (pH=8. Les complexes protéines-SDS vont donc se concentrer entre les ions chlorures et les ions glycinates. L’électrophorèse se déroule dans un tampon Tris-Glycine contenant du SDS (TGS).. les ions chlorures contenus dans le gel ont une mobilité plus importante (ions pilotes). Ceci induit la formation de 2 limites mobiles : une entre l'ion d'arrière garde et le complexe SDS-protéines et une entre SDS-protéines et l'ion pilote. principe de la concentration : Le gel de concentration a pour but de concentrer les échantillons déposés. A pH 6. Celui-ci sert dès lors de tamis moléculaire. Par contre.16 Phénomène d’isotachophorèse. Le gel de séparation a un pH différent. Au niveau de l’interface du gel de concentration et de séparation.

. on obtient ainsi une droite de pente négative.17 Au terme de l’électrophorèse. la coloration au bleu de coomassie ou la coloration à l’argent. Da). Cette masse moléculaire est comparée à des étalons calibrés en unité de masse protéique (Dalton. le gel est coloré afin de faire apparaître les protéines ainsi séparées. La mesure des distances de migration parcourue par les protéines de référence permet de tracer une droite étalon représentant le logarithme du poids moléculaire de celles-ci en fonction de leur mobilité. L’intensité des différentes bandes protéiques reflète partiellement leur abondance dans l’échantillon et la position/migration reflète la masse moléculaire relative de chaque protéine.. parmis les plus courantes. les petites protéines migrant plus bas que les grosses. il suffit dès lors de rapporter la distance de migration observée pour celle-ci sur la droite d’étalonnage. Pour déterminer la masse moléculaire d’une protéine donnée. lorsque le bleu de bromophénol contenu dans les échantillons atteint le bas du gel. Différents types de coloration existent.

18 - Expérimentations : 1. quelques gouttes de butanol. .664 4.8) 7% Acryl/Bis (ml) Eau (ml) Tris-HCl 1.5mM pH 8.02 2. leur pH et leur concentration en ions.1 10 50 5 0.5 15 % 5 2.Avant que les gels ne polymérisent. Dès ce moment. 50kDa.8475 2.5 50 5 0. 20kDa. a) pour cela. déposer sur leur sommet. But : Le but de cette manipulation est de déterminer la masse moléculaire de protéines inconnues à l’aide d’une électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS et de déterminer si celle-ci est constituée de plusieurs sous unités reliées par des ponts disulfures.1 10 .1 10 50 5 0. 15kDa.66 2.1 10 50 5 0. 37kDa. 75kDa. très prudemment.375mM Tris-HCl.68 2.1 10 50 5 0. le gel de concentration a pour effet de concentrer les différents échantillons de façon à augmenter la résolution de séparation électrophorétique.014 2.33 4. 100kDa.5 8% 2.5 12 % 4 3.5 9% 2.5 11 % 3.1 10 50 5 0.35 2. b) A partir de cette droite d’étalonnage. Ces deux gels diffèrent par leur concentration en acrylamide.1 10 50 5 0.68 2. Le gel de séparation est utilisé pour séparer les différents constituants des échantillons en fonction de leur masse. gel de séparation : (0. . Tableau cidessus) dans 1 petit erlenmeyer.Mélanger les différentes solutions correspondant au gel de séparation 12% (cf. vous établirez un étalonnage du gel à l’aide d’un mélange protéique constitué de différents référents dont les masses respectives sont connues (250kDa.5 14 % 4..348 2.997 4.1 10 50 5 0.35 2.4975 4. 25kDa.8 (ml) Persulfate (µl) Temed (µl) SDS (ml) Volume total pour 2 mini gels (ml) 2.1 10 50 5 0.5 10 % 3.66 3.331 5. Préparation des gels : Les gels que vous allez préparer sont constitués de deux parties distinctes : un gel dit de « concentration » et un gel dit de « séparation ». Comme le nom l’indique.681 2.33 3. vous déterminerez la masse moléculaire des protéines inconnues. il faut procéder très rapidement pour couler la solution ainsi préparée entre deux plaques de verre. pH 8.5 7.5 % 2.1 10 50 5 0. 10kDa). .Bien homogénéiser.02 2. 150kDa.5 13 % 4. 2.

Couler de la même manière.2 g Quelques grains 12 µl 4. Avant polymérisation du gel.8 (ml) Persulfate (µl) Temed (µl) SDS (ml) Volume total pour 2 mini gels (ml) 3.échantillon inconnu n°1 + tampon échantillon sans réducteur .échantillon inconnu n°2 + tampon échantillon avec réducteurs Remarque : composition du tampon échantillon (concentré 4X) Eau distillée Tris-HCl 0.échantillon inconnu n°2 + tampon échantillon sans réducteurs .5mM pH 6.8 glycérol SDS 0. pH 6. le gel de concentration. Préparation des échantillons : Préparer les tubes eppendorfs suivants : .. Avant leur emploi.1 10 Acryl/Bis (ml) Eau (ml) Tris-HCl 0. gel de concentration : (0.02 2. Ce peigne a pour but de former des créneaux : endroits où se déposeront les différents échantillons.5mM pH 6.05% bleu de bromophénol Réducteurs : Mercaptoéthanol 3 ml 15 ml 12 ml 1. Electrophorèse : .Les gels sont polymérisés après 40 minutes environ.5 50 10 0.8) 4% 1.19 .échantillon inconnu n°1 + tampon échantillon avec réducteur . éliminer la couche de butanol en les rinçant avec de l’eau distillée. placer le peigne en évitant la formation de bulle.125mM Tris-HCl.33 6.

Après l’électrophorèse. . . TRES PRUDEMMENT. 5.01% (w/v). ces gels sont hautement fragiles et cassent facilement.. .Réaliser l’électrophorèse sous courant constant de 20mA/gel.3. .5 ml 132.5mM pH 8. les échantillons au sommet des gels.Mesurer la longueur du gel .5 ml Les gels sont recouverts de solution colorante pendant 1 heure. Attention. .2mM. Eliminer soigneusement toutes les bulles d’air éventuelles.Déposer.Remplir les deux compartiments de l’appareil à l’aide du même tampon. le colorant de référence (contenu dans le tampon échantillon) parcourt les ¾ du gel en 1 heure environ. retirer les gels. En conséquence. Coloration et décoloration : solution de coloration : Bleu de coomassie R-250 Méthanol Acide acétique Eau distillée 60 mg 100 ml 17. SDS 0. Dans ces conditions.Recouvrir dans l’appareil. les gels à l’aide du tampon d’électrophorèse (Tris-HCl 2. les manipuler avec prudence.Raccorder les électrodes au générateur.20 - . glycine 19.

21 . les gels sont retirés de la solution colorante. puis placés dans une solution de décoloration.Dénombrer le nombre de bandes protéiques constituant l’échantillon de référence (marqueur de masse moléculaire).5 ml . Si oui. .Déduire à partir de ce graphique. rincés à l’eau distillée.5 ml 112. déterminer la masse moléculaire de chacune des différentes sous unités.. la masse moléculaire des protéines inconnues et déterminer si celles-ci sont constituées de plusieurs sous unités. Tracer la meilleure droite passant par ces points. ainsi que les différents échantillons et mesurer leur migration relative (Mr) définie par la relation suivante : Mr = (P/l) * (L/C) P = distance parcourue par la protéine (mm) l = longueur du gel après décoloration (mm) L = longueur du gel avant décoloration (mm) C = distance parcourue par le colorant de référence (mm) . Après coloration.Porter en graphique le logarithme de la masse moléculaire (pour les référents) en fonction de leur migration relative. Les laisser dans cette solution jusqu’à décoloration complète (en dehors des zones protéiques). solution de décoloration : Méthanol Acide acétique Eau distillée 125 ml 12.

Principe de la filtration moléculaire : La filtration moléculaire sur gel est un procédé qui permet de séparer des molécules en fonction de leur taille (masse).22 - Purification des protéines Purification des protéines : Séparation des protéines par filtration moléculaire : Parmi toutes les méthodes chromatographiques permettant la purification des protéines. Les gels utilisés sont constitués de particules insolubles mais solvatées (se présentant sous formes de perle) formant un réseau tridimensionnel.. Le degré de réticulation détermine les . la filtration moléculaire sur gel (ou chromatographie d’exclusion) occupe une place déterminante.

Ce phénomène d’équilibre. Elles sortent donc les dernières. répété tout au long de la colonne. Les molécules sont donc éluées dans l’ordre des masses moléculaires décroissant. en fonction de leur taille et de leur forme.. . elles pénètrent d'autant moins qu'elles sont plus grosses.23 dimensions des mailles du réseau et par conséquent l’accessibilité de ce dernier aux molécules de solutés que l’on souhaite séparer. De manière générale : .Les molécules de taille intermédiaire pénètrent dans les billes. Chaque type de molécule sera caractérisé. Une substance dissoute dans un solvant. Le volume total (V) d’une colonne comportant du gel est égal à la somme du volume de tampon extérieur aux grains de gel (V0). explique l’action de tamis moléculaire. il s’établit un équilibre entre les deux phases (phase mobile et phase stationnaire). Elles sortent les premières. Les molécules situées dans le gel ne sont plus entraînées par le flux et sont retardées. . est appliquée sur une colonne contenant un gel : ses molécules se distribuent d’abord librement dans la phase mobile (solvant).Les molécules de taille supérieure à celle des pores des billes sont totalement exclues du gel et ne se répartissent que dans le volume extérieur aux billes. si elles sont suffisamment petites pour avoir accès aux pores du gel. pour un gel de réticulation donnée. Elution Le principe de la filtration moléculaire sur gel est basé sur la capacité des molécules à pénétrer dans les pores de la phase stationnaire constituée par le gel. à un volume d'élution Vt ou volume total des liquides de la colonne. et elles sont éluées dans l'ordre des masses molaires décroissantes.Les molécules de taille inférieure à celle des pores des billes peuvent pénétrer librement dans les billes et se répartissent dans l'ensemble des liquides de la colonne (volume de liquide à l'intérieur des billes (phase stationnaire) + volume de liquide à l'extérieur des billes (phase mobile)). du volume à l’intérieur des grains de gel (Vi) et du volume du gel lui-même (Vg) : . c'est-à-dire dans la phase mobile (solvant). par un coefficient de distribution Kd. à un volume d'élution Vo appelé volume mort de la colonne.

- - Deux substances de masses moléculaires différentes auront. des coefficients de distribution Kd’ et Kd". citons :     le Sephadex G formé à partir d’un hydrate de carbone de haut poids moléculaire : le dextrane le Biogel P. Parmi un grand nombre de gels que l’on peut trouver commercialement. Les volumes d’élution de ces deux substances diffèreront d’une quantité Vs définie par l’équation : Vs = Ve’-Ve" = (Vo + Kd’ x Vi) . Biogels A) formés généralement à partir de polysaccharides Les gels mixtes formés de polyacrylamide et de polysaccharides copolymérisés (Ultrogel et Sephacryl). Pour les petites molécules qui pénètrent totalement : Kd = 1 (diffusion libre dans la phase stationnaire).. Il existe des gels de type organophiles dont les plus courant sont à base de polystyrène ponté. L’ensemble de ces gels est de type hydrophile. Donc il faut que V échantillon < (Kd’ . Il correspond au volume de liquide nécessaire pour éluer une substance à travers une colonne quand les molécules sont complètement exclues du gel. vis-à-vis d’un type de gel déterminé. le volume de l’échantillon ne doit pas être supérieur à Vs. Vi peut être calculé à partir du poids sec du gel (a) et du coefficient de rétention d’eau (Wr) : Vi = a x Wr Le volume d’élution d’une substance (Ve) dépend du volume extérieur au gel (Vo) et du coefficient de distribution Kd : Ve = Vo + Kd x Vi Donc Kd = (Ve-Vo)/Vi = (Ve-Vo)/(axWr) Pour les grosses molécules qui ne peuvent pénétrer dans la phase stationnaire : Kd = 0 (molécules totalement exclues du gel).24 - V = Vo + Vi + Vg Vo est également appelé volume mort. formé de polyacrylamide Les gels d’agarose (Sepharose. .Kd") x Vi Pour séparer complètement deux substances.Kd") x Vi.(Vo + Kd" x Vi) Vs = (Kd’ .

préparé par réticulation du dextran à l’aide de l’épichlorhydrine CH3.5 4-6 1500-30000 9-11 3000-70000 4000-100000 5000-150000 5000-250000 12-15 15-20 20-30 30-40 A chaque type de Sephadex est associé un domaine de fractionnement. Les chaînes de polymères sont reliées les unes aux autres par des ponts de type éther glycérate -O-CH2-CH-CH2-OOH Le grand nombre de groupements hydroxyles (-OH) confère au gel un caractère hydrophile. le plus couramment utilisé. Les molécules ayant un poids moléculaire supérieur à cette limite .. le Sephadex gonfle très facilement dans l’eau et les solutions d’électrolytes.5-3. Les gels de Sephadex diffèrent entre eux par leur degré de réticulation.25 Nous nous intéresserons lors de ce TP.CH-CH2-Cl. au gel de Sephadex . La limite supérieure de ce domaine est appelée limite d’exclusion. Types et qualité de Sephadex Sephadex G-10 Sephadex G-15 Sephadex G-25 Coarse Medium Fine Superfine Sephadex G-50 Coarse Medium Fine Superfine Sephadex G-75 Sephadex G-100 Sephadex G-150 Sephadex G-200 Diamètres des grains (µm) 40-120 40-120 100-300 50-150 20-80 10-40 100-300 50-150 20-80 10-40 10-40 10-40 10-40 10-40 Domaine de fractionnement (Daltons) -700 -1500 1000-5000 Volume de gel en ml/g de Séphadex sec 2-3 2. En conséquence. Le Sephadex est un gel formé de perles. Cet intervalle de poids moléculaire correspond à la zone de séparation.

à l’état sec. . il commence à caraméliser. la préparation de la colonne doit être exécutée avec soin. puis versé la suspension de Sephadex (robinet fermé). il faut choisir le gel le mieux adapté. Du Sephadex est dès lors ajouté pour compléter la colonne. En présence d’acide fort. N. Quand les grains ont sédimentés sur une hauteur de quelques cm.B : Il faut surtout éviter que le gel ne vienne jamais à sec. si l'on connaît la masse molaire de la molécule que l'on veut séparer d'un mélange par cette technique. les solvants organiques. celui dont le domaine de fractionnement. homogénéiser la surface du gel sur une profondeur de quelques cm (à l’aide d’une pipette pasteur). Par contre. les chaînes glycosidiques de la matrice sont hydrolysées. Stabilité physique : Le Sephadex peut être stérilisé soit à l’état sec soit à l’état humide à pH neutre par autoclave à 120°C. on ouvre le robinet et on fait couler goutte à goutte. Ainsi.   Faire gonfler le Sephadex au minimum une nuit dans le tampon choisi (calculer la quantité nécessaire pour le volume de la colonne d’après le tableau de la page 25). juste avant de rajouter du Sephadex. Manipulation : Préparation d’une colonne de Sephadex : Pour obtenir une bonne séparation des constituants d’un mélange. c'est-à-dire la gamme des masses molaires pour lesquelles il y a diffusion partielle ou totale. englobe la masse molaire de la molécule à purifier. chauffé à plus de 120°C.. Remplir ensuite la colonne au 2/3 à l’aide du tampon. Stabilité chimique : Le Sephadex est insoluble dans la plupart des solvants.26 sont totalement exclues du gel et sont éluées dans un volume appelé volume mort. Pour obtenir un remplissage de la colonne homogène. les solutions alcalines et faiblement acides. Celles qui ont un poids moléculaire plus petit que la limite inférieure du domaine de fractionnement sont éluées dans un volume sensiblement égal au volume du gel. Il est stable dans l’eau. les solutions salines.

La manière dont l’échantillon est déposé est très importante.27 - NaCl 0. On remplit ensuite complètement de tampon la colonne et on la relie au réservoir.9% Application de l’échantillon :      But : Aspirer (au moyen d’une pipette pasteur) la plus grande partie du liquide se trouvant au dessus de la surface du gel (robinet fermé) Ouvrir le robinet légèrement et lorsque le reste du liquide a disparu dans le gel. (ATTENTION jamais à sec !!!) fermer le robinet Déposer ensuite délicatement et uniformément l’échantillon le long de la colonne avec un mouvement rotatif juste au-dessus de la surface du gel (éviter de perturber la surface du gel). C’est le début de l’élution. Séparer 3 substances de poids moléculaires différents sur deux types de Sephadex G : un Sephadex G100 et un Sephadex G25.000. déposer de la même manière quelques ml de tampon. C’est un polysaccharide d’un poids moléculaire moyen d’environ 2.000 daltons sur lequel .9% Sephadex Sephadex NaCl 0. chaque groupe a à sa disposition le matériel suivant : 1) Un mélange constitué de :  un polymère de haut poids moléculaire : le « blue dextran 2000 ». Pour cela. Dès que l’échantillon a pénétré dans le gel. c'est-à-dire que la fraction recueillie dès cet instant portera le n°1. Faire pénétrer l’échantillon en ouvrant le robinet..

Sa concentration est de ± 5mg/ml. soit en jouant sur la hauteur du réservoir à NaCl 0. 4) Du matériel nécessaire pour la chromatographie (bouchons.9%. Pour cela suivre les instructions données précédemment. K3 Fe(CN)6 composé jaune d’un poids moléculaire de 329 daltons. 3) Une colonne de G25 conditionnée en NaCl 0. Sa concentration est de ± 2mg/ml.9%.9% de manière à avoir un débit de ± 15 ml/h.   2) Une colonne de G100 conditionnée en NaCl 0.28 est couplé un chromophore polycyclique donnant une couleur bleue. une protéine globulaire (rouge) d’un poids moléculaire de 65000 daltons. tuyau. Observer les séparations au niveau des différents types de Sephadex. Résultats :   Observer les séparations. L’hémoglobine (Hb). La concentration en Blue dextran 2000 est de ± 2mg/ml.…) Manipulation : Chromatographier ± 500µl de la solution décrite ci-dessus sur les colonnes de Sephadex. pipette. Tracer une courbe étalon à partir des données obtenues pour la colonne G100 .. pinces seringues. Eluer avec du NaCl 0. Régler le débit soit au moyen de la pince. Le Ferrycianide de potassium (FP). Interpréter les résultats obtenus à la lumière des notions théoriques développées précédemment.9%.

29 - Extraction et dénaturation de l’ADN ..

homogénéiser en agitant fortement et centrifuger à nouveau 10 minutes 5) renouveler l’opération une troisième fois 6) récupérer le culot et homogénéiser 3 minutes dans un récipient contenant 200ml de NaCl 0. et y ajouter 40ml de tampon glacé. Le thymus de veau (connu sous le terme « ris de veau » dans le commerce) est constitué de cellules jeunes dont le rapport nucléocytoplasmique est élevé.. 1. Dans notre cas. protamines) par dénaturation des protéines (traitement par un détergent. Il est situé à la base du cou. Déjà étendu chez le nouveau-né. Il s’agit d’une glande bilobée qui ne joue un rôle important que pendant les premières années de la vie. il est presque entièrement remplacé par une masse de tissu conjonctif et adipeux. il s’atrophie graduellement.09% glacé .2 Méthode d’extraction : Par groupe de 2 étudiants : 1) couper 10g de thymus de veau (1g d’ADN) en petits morceaux 2) homogénéiser au mixer 3 minutes dans 40ml du tampon glacé suivant : NaCl 0. il se développe pendant l’enfance.30 - Extraction et dénaturation de l’ADN : L'ADN peut être extrait et purifié à partir de n'importe quel type de cellules nucléées. qui semblent jouer un rôle essentiel dans le développement des lymphocytes T et dans l’établissement de la réponse immunitaire. Séparation de l’ADN des autres macromolécules par précipitation à l’alcool et extraction en présence de sels. Dissociation du complexe ADN-protéines (histones. 1. en arrière du sternum. le SDS) . période au cours de laquelle il est le plus actif. Il cesse de croître à l’adolescence. après quoi.9% . dont la thrompoïétine et la thymosine. Chez la personne âgée.01M 3) centrifuger à froid à 5000t/min pendant 10 minutes dans un tube à centrifuger 4) récupérer le culot. le thymus de veau. nous utiliserons.1 Principe d’extraction : Les étapes d’isolement de l’ADN sont : Libération de l’ADN sous une forme soluble par destruction des membranes cellulaires et nucléaires . Les cellules épithéliales du thymus sécrètent principalement une famille d’hormones peptidiques.Citrate de Na 0.

préalablement purifié à partir du thymus de veau en augmentant graduellement la température. Dénaturation de l’ADN par variation de la température : Les deux brins antiparallèles d'ADN sont toujours étroitement reliés entre eux par des liaisons hydrogène formées entre les bases complémentaires A-T et G-C. Lorsque l'énergie thermique apportée par une augmentation de la température. 1. il faut faire attention à ne pas altérer l’ADN : éviter les pH extrêmes. Ce sont les appariements A-T qui se séparent les premiers .3 Dénaturation de l’ADN purifié : La dénaturation de l’ADN est possible par variation du pH. remettre l’ADN en solution dans 100ml d’une solution de NaCl 150mM.31 7) ajouter en agitant (agitateur magnétique) 18ml d’une solution Sodium Dodécyl Sulfate (SDS) 5% dans de l’éthanol 45% 8) agiter lentement 1heure à température ambiante 9) ajouter ensuite 13g de NaCl solide et agiter 10 minutes 10) filtrer sur étamine (récupérer le filtrat dans un bécher) 11) ajouter lentement 200ml d’alcool dénaturé en tournant délicatement à la main avec une baguette de verre Remarques : Pendant les manipulations d’extraction. les 2 brins d’ADN se séparent pour se retrouver sous forme d’ADN monobrin. nous allons dénaturer l’ADN. citrate de sodium 15mM. les températures élevées.. 12) Une fois la purification terminée. Dans ces conditions. les faibles forces ioniques. est suffisante les liaisons H interbrins rompent. de la température ou de la concentration en sels. Dans notre cas.

celle-ci augmente au cours du désappariement. c’est ce qu’on appelle l’effet hyperchrome. la température pour laquelle 50% des molécules d'ADN sont désappariées (i. .. La séparation des 2 brins d’ADN s’accompagne d’un changement des propriétés de la solution (la viscosité diminue) et a lieu dans un intervalle de température étroit. On nomme « température de fusion » Tm (melting temperature). En effet. qu'un ADN de même taille composé d'appariements A-T (2 liens H). La dénaturation de l’ADN peut être suivie par mesure de la DO260nm en fonction de la température. La dénaturation de l’ADN peut être mise en évidence par mesure de la densité optique à 260nm.e. Ainsi une molécule d'ADN double brin composée uniquement d'appariements G-C (3 liens H) nécessitera plus d'énergie pour être dénaturée sous la forme de molécules simple-brins. sous forme simple brin).32 au cours de la montée de la température car ils ne possèdent que deux liaisons hydrogènes contrairement aux appariements G-C qui en possèdent trois.

avec un thermomètre dedans afin de contrôler sa température. le % de GC contenu dans votre ADN en vous rapportant à la figure présentée cidessus. de la salinité du milieu ainsi que de divers facteurs correctifs. . diluer votre solution d’ADN purifié pour arriver à cette valeur de départ. tels que la présence de structures secondaires intra ou extra moléculaires (repliement de l'ADN sur lui-même.33 - Plusieurs formules empiriques permettent de calculer la valeur de la température de fusion. vous allez déterminer la Tm et le contenu en GC de votre ADN purifié.. Déterminer ensuite grâce à cette valeur. Prélever 1ml de votre solution à chaque saut de température de 5°C et mesurer la densité optique de celui-ci à 260nm. Elles tiennent compte du pourcentage de base (G+C). Veuillez à bien homogénéiser votre solution en la mélangeant continuellement. la Tm de votre ADN purifié. Si ce n’est pas le cas. l’évolution de la DO260nm en fonction de la température et déterminer sur ce graphe. Dans cette partie de la manipulation. votre solution d’ADN purifié est placée dans un bain marie à 90°C. Porter en graphique. Remarques :   Prendre une mesure de la DO260nm avant toute élévation de la température (ADN sous forme double brins) Il faut que celle-ci avoisine une valeur de 0. Pour ce faire.2 (soit 10µg/ml). formation d'appariements entre deux brins).

34 - Analyses des lipides du tissu adipeux et de la cervelle ..

sont des esters d’acides gras (R1. les phospholipides. Ils servent de protection et d’isolation à ces organes mais sont également une réserve d’énergie pour l’organisme. Les phospholipides diffèrent les uns des autres par le type d'acides gras rattachés au glycérol.. Liaison ester CH2 – O – CO – R1 CH – O – CO – R2 CH2 – O – CO – R3 Squelette glycérol Groupement Acyle Les triglycérides se retrouvent principalement au niveau du tissu adipeux sous cutané et entourant certains organes. les stéroïdes et une certain nombre d’autres substances lipoïdes. comme dans les huiles.P – O -. Le groupe des lipides est diversifié et comprend les graisses neutres. Les phospholipides : Les phospholipides ou glycérophospholipides. les lipides peuvent être à l'état solide.35 - Analyses des lipides du tissu adipeux et de la cervelle : Introduction Les lipides constituent la matière grasse des êtres vivants. Ils sont dits « simple » lorsque les 3 acides gras sont identiques et « mixtes » lorsqu’ils contiennent 2 ou 3 acides gras différents. comme dans les cires. aussi appelées triglycérides ou triacylglycérols.O -. R3) et de glycérol. Généralement. sont des triglycérides modifiés ayant un groupement contenant du phosphate et deux chaînes d’acides gras au lieu de trois. un des deux acides gras est saturé et l'autre ne l'est pas. Ils diffèrent aussi par différents groupements chimiques qui peuvent se rattacher au groupement phosphate.Sérine Inositol O O Tête hydrophyle . ou liquide. A température ambiante. Ce sont de petites molécules hydrophobes ou amphipathiques principalement constituées de carbone. Liaison ester CH2 – O – CO – R1 CH – O – CO – R2 Groupement Acyle CH2 Squelette glycérol Ethanolamine Choline – O – CO -. d’hydrogène et d’oxygène et ayant une densité inférieure à celle de l'eau. R2. Les graisses neutres : Les graisses neutres.

Le cholestérol est également un précurseur de nombreuses molécules :     la vitamine D3 qui intervient dans la calcification des os. . cortisone et aldostérone. Sérine Inositol Les stéroïdes : Les stéroïdes ont une structure très différente des graisses.OH CH3 |+ CH3 – N . il contribue à leur stabilité et au maintien de leurs structures en s'intercalant entre les phospholipides. Les stéroïdes le plus courant pour l’être humain est le cholestérol. Les glycérophospholipides sont les principaux constituants des membranes cellulaires et sont abondants dans le tissu nerveux. Le cholestérol est un composant majeur des membranes cellulaires. les hormones stéroïdes : cortisol.36 Le tableau ci-après présente les différents groupements chimiques pouvant se lier au groupement phosphate : Ethanolamine Choline NH2 – CH2 – CH2 .CH2 – CH2 . œstrogène et testostérone les acides biliaires.OH | CH3 NH2 – CH2 – CH – OH | COOH OH OH OH OH OH OH Les glycérophospholipides sont amphiphiles comportant à la fois une caractères hydrophile et hydrophobe..…. les hormones stéroïdes sexuelles : progestérone.

nous allons analyser deux tissus riches en lipides. nous allons préparer des extraits dont nous séparerons les trois principales classes de lipides : les graisses neutres ou triacylglycérols.4g 100ml Solution KOH dans l’alcool Solution KOH saturée Alcool dénaturé Alcool éthylique H2Od CdCl2 1/2H2O H2Od Alcool dénaturé Chloroforme Méthanol Acide acétique H2Od Alcool éthylique (alcool dénaturé) 50% Chlorure de cadmium (solution saturée dans l’alcool éthylique) Solvant chromatographie (65 : 25 : 1 : 4) Chlorure de calcium 2M CaCl2 H2Od Ether diéthylique 200ml ..6ml 450ml 260ml 100ml 4ml 16ml 29. les phospholipides et le cholestérol. Matériel : (pour 10 groupes) Solvant chloroforme/méthanol (1 :2) Chloroforme Méthanol 300ml 600ml Lard Cervelle Solution de KOH saturée (dans une bouteille en plastique) KOH H2Od 50g 45ml 20ml 180ml 300ml 300ml 28g 19. A partir de ces tissus.37 Autres substances lipoïdes : Manipulations : Le but de la manipulation est de passer en revue les principaux lipides des mammifères. A. sur base de leur solubilité dans divers milieux. à savoir le lard et la cervelle. A cette fin.

commencer à préparer les chromatographies (exercice II). Séparation des savons et du cholestérol : (l’assistant le fait pour tout le monde) Après refroidissement. sont très inflammables. verser cette solution dans un tube à centrifuger marqué lard ou cervelle selon le cas. Il est donc interdit d’allumer une flamme à proximité de ceux-ci. on laisse s’écouler la phase aqueuse. Laisser évaporer pour voir les savons se déposer sous forme de masse visqueuse dans le fond du bécher. spécialement l’éther et l’éther de pétrole. Transvaser le tout dans une ampoule à décanter et ajouter 10ml d’éther de pétrole. B. Après refroidissement. L’éther de pétrole est recueilli dans un bécher sec marqué. Centrifuger quelques minutes et comparer l’importance des précipités obtenus dans chacun des tubes. Après séparation des deux phases. Exercice I : Séparation des 3 groupes de lipides : Dans un bécher marqué lard ou cervelle. et est laissé sous la hotte jusqu’à évaporation. tandis que les savons restent dans la phase aqueuse. Il consiste en un broyage mécanique du tissu dans un mélange chloroforme : méthanol (1 : 2). 3. dissoudre le résidu du bécher « cervelle » à l’aide de 7ml d’alcool à 50%.38 Acétone Ninhydrine Ninhydrine Butanol 300ml 25mg 50ml Ether de pétrole Molybdenum blue 200ml !!!! Remarque importante : les solvants organiques. Chauffer jusqu’à évaporation (SOUS HOTTE !!!!!). pipeter 20ml de l’extrait correspondant. Le cholestérol cristallise en aiguille. Les résidus insolubles sont ensuite éliminés par filtration. 2. 1. L’analyse des lipides de ces deux tissus se fait en parallèle. Evaporer sur la paque électrique jusqu’à élimination complète du solvant (SOUS HOTTE !!!!!). Ajouter 6ml de la solution KOH-alcool et mélanger. Préparation des extraits de lard et de cervelle : L’extrait de lard et de cervelle est réalisé avec l’assistant (45g de tissu / 300ml de solvant). Pendant l’évaporation. dissoudre le résidu de l’évaporation dans 2ml d’éther. Par agitation. Saponification des graisses neutres : Le surnageant de la centrifugation contient les graisses neutres et le cholestérol. le cholestérol est extrait dans cette phase organique. C. Les graisses sont saponifiées. Les acides gras libérés sont présents sous formes de sels de potassium (savons). Décanter ce surnageant dans un bécher marqué lard ou cervelle selon le cas. Précipitation des phospholipides : Les phospholipides et spécialement leurs sels de cadmium sont insolubles dans un mélange acétone : éther (3 :1).. Ajouter 5 gouttes de la solution de CdCl2 et 6ml d’acétone. .

Exercice II : Chromatographie sur couche mince : La chromatographie sur couche mince se réalise sur des plaques de verre recouvertes d’une mince couche de silice. ou acide silicilique amorphe.H2O. il rencontre l'échantillon et l'entraîne.. celle-ci est retirée de la cuve et le solvant est évaporé. Séparer ces 20ml en deux tubes contenant 10ml chacun. Cette technique est basée sur les différences d’affinité des substances à l’égard de deux phases : la phase stationnaire fixée sur une plaque de verre (la silice) et la phase mobile (solvant ou un mélange de solvants) qui progresse le long de la phase stationnaire. Une fois la migration terminée. le chromatogramme. peut-être révélé de différentes manières. La solution de savon peut être assez visqueuse lorsque ceux-ci sont abondants. Les différentes substances constituant l'échantillon migrent à différentes vitesses selon qu'elles interagissent plus ou moins fortement avec la silice. Plaque de chromatographie . 4. généralement quand le front de solvant (éluant) est presque arrivé en haut de la plaque à chromatographie. La plaque de chromatographie est ensuite trempée dans un solvant (éluant) et placée dans un récipient fermé. Cet échantillon est adsorbé par la silice . renfermant 13% de CaSO4. Bien observer le phénomène. Une petite quantité de la ou des solutions à analyser est déposée sur le bord d'une plaque de chromatographie. Les sels d’acides gras précipitent. Agiter vigoureusement. goutte à goutte. Il s’agit d’une méthode physique de séparation des différents constituants d’un mélange.39 Remarque : A la fin des manipulations. Pendant que le solvant (éluant) monte le long de la plaque à chromatographie par capillarité. Agiter vigoureusement et éliminer le liquide à l’évier. rincer l’ampoule à décanter avec une dizaine de ml de la solution alcool à 50%. Ajouter. Mélanger. D. ce qui signifie que les molécules interagissent avec cette dernière et qu'elles auront tendance à rester au même endroit. Précipitation des savons calciques : Reprendre le résidu du bécher « lard » à l’aide de 20ml d’eau. Par la suite le résultat de la migration. 10 gouttes de la solution de CaCl2 2M à l’un des deux tubes et 10 gouttes d’acide acétique à l’autre.

) – acide acétique (1vol) – eau (4vol)) qui assure une migration complète des lipides neutres et une rétention partielle des lipides polaires et surtout chargés. Préparation des plaques : Préparer une plaque de chromatographie en prenant comme modèle le dessin suivant : A l’aide d’un crayon fin. L C Gel de séparation 1 3 5 1 3 5 Gel de concentration L’application des échantillons est une opération délicate : attendre la démonstration par l’assistant. Laisser sécher. 2.40 - 1. Recommencer à côté en appliquant 3 gouttes puis 5. dans une pointe de pipette pasteur. (!!!!! ne pas appuyer trop fort avec la pointe du crayon). à l’endroit prévu sur la plaque. continuez l’exercice I. tracer dans le gel de silice. par simple contact. Un petit volume de l’échantillon à analyser est prélevé par capillarité. Noter également les initiales de votre groupe dans un coin. Il est appliqué délicatement.. Le diamètre de la tâche formée ne peut pas excéder 4 à 5 mm. Chromatographie : La plaque. noter L ou C pour lard ou cervelle respectivement. Procéder de manière similaire pour chacun des échantillons (lard ou cervelle). laisser bien sécher avant l’application des gouttes successives. une fois préparée est disposée dans une cuve (les bords correspondant aux tâches trempent dans le solvant). Pendant la migration. Le liquide diffuse dans le gel à partir du point de contact. Laisser migrer le solvant jusqu’au moment où il atteint la ligne transversale. Révélations : (réalisées par l’assistant) . 3. Fermer la cuve hermétiquement. une ligne divisant la plaque de chromatographie en deux parties égales. Le solvant utilisé pour la chromatographie est constitué d’un mélange acide (chloroforme (65vol) – méthanol (25vol. Le solvant monte dans le gel par capillarité (chromatographie ascendante).

certains groupes appliqueront la première et d’autres groupes la deuxième. Placer la plaque de chromatographie sur le support approprié dans la hotte. l’iode se désorbe à l’air libre. et on laisse sécher. colorer les tâches qui ont réagis à ce test.. 6.  Ninhydrine : certains phospholipides portent une fonction NH2 libre que l’on peut révéler à la ninhydrine.  vapeur d’iode : la vapeur d’iode a la propriété de s’adsorber au niveau des différents lipides séparés. par ordre croissant. des principaux lipides d’intérêt biologique : 1. Les tâches de lipides apparaissent après quelques minutes. En présence de phosphore. les lipides neutres et cholestérol glycolipides phosphatidyléthanolamine phosphatidylcholine phosphatydylsérine sphingomyéline . Placer la plaque de chromatographie sur le support approprié dans la hotte. En effet. sans toucher la couche de gel. il se forme un complexe phosphomolybdique qui est réduit en phosphomolybdyle bleu. Lorsque l’iode est sublimé. 3. 4. Compléter à nouveau le chromatogramme.41 - On enlève la plaque de la cuve. Ces deux dernières méthodes de révélations n’étant pas applicables en même temps sur une même plaque de chromatographie. Sur le chromatogramme déjà réalisé. 5. Pulvériser prudemment et de façon homogène la solution de molybdène bleu (le liquide est très acide). Ceux-ci apparaissent alors sous forme de tâches jaunes brunes. Des tâches colorées apparaissent. appliquer le second révélateur.  Réactif du phosphore : ce réactif contient du molybdate et un réducteur. Pulvériser de façon homogène la solution de ninhydrine et mettre la plaque de chromatographie à l’étuve quelques instants. L’ensemble de ces méthodes permet la détection. Les résultats seront donc mis en commun afin d’identifier les différentes tâches révélées sur la plaques de chromatographie que ce soit pour l’extrait lard ou pour l’extrait cervelle. Trois révélations différentes sont appliquées à cette chromatographie. 2. Seuls les phospholipides réagissent. Cette adsorption est réversible. Sortir la plaque et dessiner le chromatogramme sur la plaque à chromatographie à l’aide d’un crayon fin. Placer votre plaque à chromatographie dans une cuve contenant des paillettes d’iode.

42 - Caractérisation des sucres ..

les autres carbones étant porteur d'une fonction alcool primaire ou secondaire selon la position.…) et métabolique important. . en milieu alcalin. néanmoins. ils ont un rôle énergétique (production d’énergie. Les tetroses possèdent 4 carbones : érythrose. thréose. glycéraldéhyde . formés d’une seule sous unité (le glucose par exemple) les disaccharides. au niveau extracellulaire. formés de 3 unités ou plus les polysaccharides. réserve sous forme de cellulose chez les végétaux et sous forme de glycogène chez les animaux. en Cu+ (précipité rouge brique). Le rôle des glucides est multiple. Tout d’abord. formés de plus de 10 unités ou plus Les monosaccharides : Les monosaccharides possèdent tous une fonction carbonyle :  Aldéhyde pour les aldoses (exemple : glucose) qui sont composés d'une chaîne d'alcools secondaires ayant à une extrémité un alcool primaire et un aldéhyde à l'autre extrémité. Cétone pour les cétoses (exemple : fructose)..43 - Caractérisation des sucres : Les glucides sont les biomolécules les plus abondantes de la terre. En effet. érythrulose.  Ils sont caractérisés par leur nombre de carbone : formule générale : Cn(H2O)n Les trioses possèdent 3 carbones : dihydroxyacétone. la majeure partie des glucides est apportée par l’alimentation et est d’origine végétale . la photosynthèse synthétise. Ce groupement aldéhyde ou cétone leur confère un caractère réducteur. les glucides peuvent également être synthétisés à partir de molécules non glucidiques. à partir du gaz carbonique et de l’eau. formés de deux sous unités (le saccharose par exemple = glucose + fructose) les oligosaccharides. le glucose qui est stocké sous forme d’amidon ou transformé en cellulose. soutenant et protégeant les structures biologiques. Exemples :  la cellulose de la paroi cellulaire végétale  la chitine des exosquelettes d’insectes et de crustacés Au niveau intracellulaire. Les glucides sont constitués d’une ou de plusieurs unités aldéhydiques ou cétoniques polyhydroxylées. le glucose va réduire le Cu2+ (bleu) de la liqueur de Fehling. ils jouent un rôle structural important. Chez les végétaux. On classe les glucides de la manière suivante :     les monosaccharides. Chez les animaux.

La fonction aldéhydique est oxydée en fonction acide carboxylique. talose. . ribulose. L'une des fonctions alcool primaire peut être oxydée en fonction acide carboxylique. le saccharose (-D-glucopyranosyl(12)-Dfructofuranose). mannose. sorbose. tagatose. idose.44 Les pentoses possèdent 5 carbones : ribose. Les hexoses possèdent 6 carbones : allose. arabinose. psicose. glucose.. altrose. . le lactose (-D-galactopyranosyl(14)-D-glucopyranose). galactose.. gulose.. Par exemple : le maltose (-Dglucopyranosyl(14)-D-glucopyranose). xylose. sedoheptulose. lyxose. xylulose. Les heptoses possèdent 7 carbones . Dihydroxyacétone Les disaccharides : Ribose Galactose Fructose Glucose Ils sont constitués de 2 oses liés par une liaison osidique. Saccharose Maltose Lactose Les saccharides simples et les disaccharides ayant de libre leur carbone hémiacétalique sont réducteurs de par leur fonction aldéhyde. fructose.

45 Les disaccharides non réducteurs sont ceux dont aucun carbone hémiacétalique n'est libre. Il est exploité dans l'industrie pour ses propriétés d'épaississant et de gélifiant. L'amidon est insoluble dans l'eau froide.. ce qui a pour conséquence la transformation de l'amylose en molécules de maltose (disaccharides de α-glucose). Ces enzymes sont présentes dans la salive. En le traitant par l'eau chaude. Le glycogène Au niveau de sa structure. on obtient l'empois d’amidon. ainsi que dans le suc pancréatique. il est pratiquement identique à l'amidon. L'alpha-amylase est spécifique des liens α(1-4) glycosidiques. …) au même titre que le glycogène chez les animaux. amylose ramifié par une liaison α(1→6) environ toutes les 20 unités de glucose. il possède plus de ramifications que ce dernier (ramification environ toutes les 10 unités de glucose). les racines. Les chaînes sont soit linéaires soit ramifiées. L’amidon peut-être mis en évidence par le lugol (eau iodée) qui conduit à une coloration noire caractéristique (réaction entre l'amylose et l'iode). Il se dissocie en glucose assimilable sous l'action d'enzymes. Toutefois. α(1→4) α(1→6) L'amylose s'organise en une hélice droite à six glucoses par tour. molécule formée d'environ 600 molécules de glucose chaînées linéairement par une liaison α(1→4) L'amylopectine. Les polysaccharides : Association d'un très grand nombre de molécules liées par des liaisons O-glycosidiques. tout le . C'est un polysaccharide (C6H10O5)n constitué de deux composés :   L'amylose. L'amidon L'amidon est un glucide de réserve utilisé par les végétaux supérieurs pour stocker de l'énergie (dans les graines. il est mis en jeu dans la liaison osidique. les amylases.

Dans ce cas.. La β-amylase hydrolyse les liaisons osidiques à partir des extrémités. L'hydrolyse du lien osidique peut également être enzymatique. La cellulose La principale molécule structurelle des plantes est la cellulose. dont la structure lui confère ses propriétés mécaniques telles qu'observées chez les plantes. . La cellulose est un polymère de glucose liés par une liaison β(1→4). Elle peut être réalisée en présence d'acide chlorhydrique. tandis que le papier et le coton sont de la cellulose presque pure. elle est spécifique et réalisée par des hydrolases. elle n'est alors pas spécifique et elle conduit à la formation de plus petites sous unités : les monosaccharides.    la β-glucosidase hydrolyse les liaisons osidiques mettant en jeu un glucose dont l'OH hémiacétalique est en position β . Le bois est en partie composé de cellulose. L'α-amylase rompt les liaisons osidiques à l'intérieur de la chaîne d'amylose . C'est la substance de réserve glucidique des animaux. C'est une molécule très longue et rigide.46 reste de la structure est identique à l'amidon. Le lien osidique L'hydrolyse du lien osidique peut être chimique.

(* : En milieu alcalin.47g de CuSO4. mais encore plus si on chauffe. l’hydroxyde cuivrique est déshydraté par la réaction suivante : Cu(OH)2 → H2O + CuO Noir insoluble . le test à la liqueur de Fehling met en évidence la présence des glucides (aldose ou cétose*) par l’action réductrice d’une solution de sel cuivrique.3g de tartrate sodico-potassique (KNaC4H4O6. le NaOH réagit avec le CuSO4 par la réaction suivante : CuSO4 + 2NaOH → Na2SO4 + Cu(OH)2 Bleu insoluble Puis. si ce dernier n’est pas présent. déjà à température ambiante..47 - Manipulations : Tests de la mise en évidence des glucides : 1) Test à la liqueur de Fehling : La réaction de Fehling est une réaction caractéristique des aldéhydes. le cuivre présent dans le complexe bleu est réduit et précipite sous forme d’oxyde cuivreux Cu2O de couleur jaune rouge.4H2O) et 5g de NaOH en pastille dans H2Od et amener le volume de la solution à 50ml Les solutions A et B sont mélangées à volumes égaux au moment de l’utilisation pour le test. Ainsi. la solution de Fehling (ou liqueur de Fehling) est un complexe basique d’ions cuivriques par les ions tartrates. En effet. Remarque : Il est indispensable d’ajouter le tartrate sodico-potassique afin que le cuivre reste en solution sous forme de complexe bleu soluble. ajouter 3 gouttes de H2SO4 concentré et compléter à 50ml avec de l’eau distillée Solution B : dissoudre avec précaution 17.) Pour l'essentiel. le cétose est isomérisé en aldose et se comporte donc comme un sucre réducteur.5H2O. Préparation de la liqueur de Fehling :   Solution A : 3. Au cours de la réaction. le cuivre oxyde l'aldéhyde pour donner un acide selon la réaction bilan d'oxydo-réduction générale : R-CHO + 2Cu(OH)2 → RCOOH + Cu2O(s) + 2H2O En présence de sucres réducteurs.

Il met donc en évidence la présence des glucides (aldose ou cétose*). Test de Fehling : Répartir dans 5 tubes à essai 1ml de la solution A et 1ml de la solution B Dans chaque tube.5ml) NH4 OH 10% en agitant fréquemment le tube jusqu'à dissolution du précipité (3ml de NH4OH devraient suffire) Compléter à 10ml avec H2O Test de Tollens : Répartir dans 4 tubes à essai 1ml de réactif de Tollens Dans chaque tube. (* : En milieu alcalin. Cette hydrolyse se réalise en plusieurs étapes : . le cétose est isomérisé en aldose et se comporte donc comme un sucre réducteur. amidon 5%. on ajoute le tartrate sodicopotassique. Indiquer les tubes où la réaction est positive et expliquer les différents résultats obtenus. Au cours de la réaction l'ion argent I oxyde l'aldéhyde pour donner un acide selon la réaction bilan d’oxydo-réduction générale : R-CHO + 2Ag(NH3)2OH + NaOH → RCOONa + 2Ag + 2H2O + 4NH3 Un dépôt d’argent se forme alors sur les parois du tube évoquant un miroir. sucrose 5% (w/v) et sucrose 5% (w/v) acidifié de 4 gouttes d’HCl concentré. Préparation du réactif de Tollens : Préparer une solution de 2ml d’AgNO3 5% Ajouter 1ml de NaOH 10% pour précipiter Ag2O Ajouter par petites portions (environ 0.. glucose 5%(w/v). ce qui confère à ce test le nom de « test du miroir d'argent ». ajouter respectivement 1ml de fructose 5% (w/v). si avant d’ajouter NaOH à CuSO4 en solution. le cuivre restera en solution sous forme de complexe bleu soluble.48 Par contre. ajouter respectivement 1ml de fructose 5% (w/v). Hydrolyse de l’amidon par les α-amylases: L’étudie de l’hydrolyse de l’amidon par les α-amylases salivaires consiste en une analyse des produits formés au cours du temps.) - Pour l'essentiel la solution de Tollens est un complexe de nitrate d'argent en solution ammoniacale. glucose 5% (w/v). 2) Test de Tollens : La réaction de Tollens est une réaction caractéristique des aldéhydes. Placer les tubes dans un bain-marie à 100°C pendant 5 minutes Indiquer les tubes où la réaction est positive et expliquer les différents résultats obtenus. amidon 5% (w/v) et sucrose 5% (w/v).

4 à 0. glycogène) en formant vraisemblablement une structure de coordination résultant de sa fixation entre les chaînes adoptant une conformation hélicoïdale. le test à la liqueur de Fehling d’une part et le test de l’iode d’autre part. La molécule présentant le plus grand nombre de branchement étant l’amidon. l'accepteur final des électrons provenant des cofacteurs réduits NADH. 30 et 60 minutes et stopper la réaction en plongeant le tube dans un bac de glace. La fermentation ne nécessite pas de dioxygène.4g d’empois d’amidon dans 10ml d’H2Od. elle. La couleur du complexe formé dépend de la longueur entre branchements du polysaccharide considéré. de l'oxygène (milieu aérobie). celui-ci devrait réagir fortement avec l’iode. l’hydrolyse de l’amidon. Laisser refroidir dans la glace. Elle se distingue. Lors de la respiration. levures) vivant de manière permanente ou occasionnelle dans des milieux dépourvus d'oxygène.49 Amidon soluble → dextrines de longueurs variables → maltose Afin de mettre en évidence. de la respiration cellulaire. les électrons sont transférés à des composés des voies métaboliques. Mode opératoire : Mélanger 0. La . Bien mélanger. deux tests vont être réalisés. - - Métabolisme du glucose chez la levure : La fermentation alcoolique est une réaction biochimique consistant à libérer de l'énergie à partir de sucre (du glucose la plupart du temps). 15. Amener à 40ml avec H2O. Test de l’iode pour les polysaccharides : L’iode se complexe avec les polysaccharides (amidon. C6H12O6 + 2 ADP + 2 Pi → 2 C2H5OH + 2 CO2 + 2 ATP La fermentation alcoolique est réalisée par de nombreux organismes (bactéries. 2. tels que le pyruvate entraînant la formation d’éthanol. Quand l’amidon est refroidi.. Pour ce faire. alors que dans le cas de la fermentation.5ml de salive Répartir le mélange dans 6 tubes à essai (solution bien homogène) et les placer dans un bain-marie à 37°C Sortir un tube à la fois après 0. Cette réaction devrait ensuite diminuer graduellement en fonction de la digestion de l’amidon par les α-amylases. elle peut donc avoir lieu en milieu anaérobie. prélever 2ml du tube à essai puis leurs ajouter 2ml H2O et 1 goutte de réactif à l’iode (lugol = 5g I2 + 1g KI + 100ml H2O) Effectuer ensuite un test à la liqueur de Fehling comme expliqué précédemment sur 1ml d’échantillon. ajouter 0. par son faible rendement énergétique. Observer et expliquer les différents résultats obtenus. Verser cette suspension dans 20ml d’H2O bouillante. Effectuer immédiatement le test de l’iode. H+ sont transférés à l'oxygène. Laisser bouillir 2 minutes. 5. qui nécessite.

placer les différentes solutions comme indiqué dans le tableau ci après : Fiole n° 1 (contrôle) Compartiment extérieur : Suspension de levure H2O Solution de glucose 20mg/ml Solution de glucose 40mg/ml Compartiment intérieur : Solution de NaOH 3M 1. b) fermentation du glucose : Dans 3 fioles coniques avec un compartiment central.6ml Fiole n° 2 1. lors du titrage de NaOH restant. et donc de ne pas provoquer une libération du CO2 produit. … reprendre le culot de levure dans 5ml H2Od. nous ajouterons dans le système du BaCl2. Le meilleur milieu de température est à 35°C-40°C. La réaction suivante va alors avoir lieu : 1 glucose → 2 pyruvate → 2CO2 + 2 éthanol En intégrant dans notre système une quantité connue de NaOH. Na2CO3 + BaCl2 → BaCO3 + 2 NaCl Mode opératoire : a) préparation de la levure : peser 4g de levure par groupe placer la levure dans un tube à centrifuger la suspendre dans 10ml H2Od. Ceci peut-être réaliser par mesure du CO2 produit au cours de la fermentation. Ceci constitue la suspension de levure.6ml Fermer les 3 fioles avec 2 feuilles de parafilm afin que le système soit bien hermétique . amenant à la production d’un précipité de BaCO3. centrifuger. porter le volume à 40ml centrifuger 5 minutes (centrifugeuse de table).5ml 0. Le but de l’expérience est d’observer le métabolisme du glucose chez la levure et donc sa consommation.6ml Fiole n° 3 1.5ml 2.5ml 0.5ml 2..5ml 0. dans un système hermétique.5ml 2. nous allons pouvoir par la suite titrer la quantité restante de celui-ci après un temps donné puisque ce dernier va réagir avec le CO2 produit de la manière suivante : CO2 + 2 NaOH → Na2CO3 + H2O Afin de ne pas renverser la réaction. décanter et jeter le surnageant laver une deuxième fois la levure de la même manière.50 propriété de certaines levures à transformer le sucre en éthanol est utilisée par l'homme dans la production de boissons alcoolisées et pour la fabrication du pain. nous allons mettre en présence des levures avec différentes concentrations de glucose. Pour ce faire.

5ml NaOH 3M normalement.51 Incuber les fioles 45 minutes à 25°C (étuve). .3M *Remarque : réaliser au préalable un titrage test afin de connaître quelle est la quantité maximum de HCl qu’il faut pour neutraliser 0. Grâce aux différents volumes de titration obtenus pour les 3 fioles. 2ml de BaCl2 1M + 1ml H2Od + 3 gouttes de phénophtaléine + 0. agiter très délicatement de temps en temps Au terme des 45 minutes. Pour ce faire.. Pour ce faire réaliser la même opération mais placer dans votre bécher du NaOH frais (n’ayant fixer aucune molécule de CO2). ajouter dans un bécher. Titrer le tout avec 10ml de HCl 0. injecter à travers le parafilm 1ml de TCA 20% dans le compartiment extérieur des 3 fioles pour stopper la fermentation Refermer avec une nouvelle feuille de parafilm Incuber 15 minutes à 25°C (étuve) Titrer le CO2 produit par la fermentation*. vous pouvez à présent calculer combien de molécules de glucose ont été consommées et quels sont les rendements observés dans chaque cas.5ml du NaOH de votre fiole conique.

52 - ..

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