La cytogénétique humaine

Année universitaire : 2020 - 2021 Dr. BOUDERBALA H.

INTRODUCTION

Cytogénétique : est l’étude des

chromosomes, de leur comportement et
des anomalies chromosomiques.

Elle est réalisée à l’aide de de techniques

dites conventionnelles (caryotype) et/ou de
cytogénétique moléculaire (Hybridation in
situ en fluorescence « FISH », analyse
chromosomique sur Puce à ADN « CGH
array »).
 Le caryotype
 Le terme caryotype désigne l’analyse numérique et structurale de l’ensemble des chromosomes d’une
cellule ou d’un individus .

 Selon l’indication, il peut être réalisé en :

 En anténatal : prélevement réalisé à partir des

villosités choriales (choriocentèse), liquide
amniotique (amniocentèse) ou du sang fœtal
(cordocentèse).

 En postnatal : à partir de biopsie cutanée (fibroblastes), de cellules de la moelle osseuse rouge hématogène et
le plus utilisé du sang veineux (les lymphocytes).
 Technique

• Prélèvement de sang veineux (des lymphocytes).

• Mise en culture dans un milieu contenant un agent mitogène la phytohémagglutinine (favorise la mitose et la division
cellulaire)
• Incubation 70 heures (temps nécessaire pour avoir assez de cellules en cours de division).
• Blocage des divisions en métaphase ( stade ou les chromosomes sont condensés au maximum ) par la colchicine (empêche
la polymérisation de la tubuline et donc la formation du fuseau mitotique. La mitose est bloquée au stade de métaphase .
• Réalisation d’un choc hypotonique à l’aide d’une solution diluée de Kcl (provoque le gonflement et la lyse des lymphocyte
liberant ainsi les chromosomes métaphasiques).
• Fixation des chromosomes par un mélange acide acétique méthanol (carnoy)
• Etalement sur lame (en faisant tomber quelques gouttes de suspension cellulaire sur la lame, ce qui fait éclater les membranes
fragilisées, libérant ainsi les chromosomes qui restent toutefois groupés).
• Marquage des chromosomes (banding) et coloration des chromosomes.
• Lecture des lames au microscope ( photographie et classification en fonction de la taille, de IC et de la coloration des bandes)
 Techniques de marquages (Banding)

• Le marquage en bandes permet d’obtenir des bandes claires et sombres le long des chromosomes.
• Le profil de ces bandes est caractéristique pour un chromosome donné.
• Le caryotype standard comporte 300 à 400 bandes par génome haploïde.
• La taille d’une bande observée en microscopie optique est de l’ordre de 10 mégabases.

 Le marquage en bandes R (réverses) est obtenu par

 Les principaux types de marquage de bandes sont :
 Le marquage en bandes G est obtenu par digestion
enzymatique (trypsine) des chromosomes et suivi
d’une coloration au Giemsa.
Les lames sur lesquelles sont fixés les chromosomes sont
trempées dans de la trypsine; il y’a dénaturation de
certaines parties du chromosome qui deviennent presque
blanches alors que les parties non dénaturées restent
noires. les bandes sombres correspondent aux séquences
d’ADN riches en A-T pauvre en gènes actifs.
dénaturation thermique des chromosomes et suivi
d’une coloration au Giemsa.
Les bandes obtenues sont l’inverse de celles obtenues
avec la trypsine. Les bandes sombres correspondent aux
séquences d’ADN riches en G-C, riche en gènes actifs.
 Bandes C (coloration au sulfate de baryium)
permettent de visualiser l’hétérochromatine des
régions centromériques et du chromosome y.
 Bandes T (dénaturation thermique poussée)
permettent de visualiser les télomères.
Après dénaturation les chromosomes sont classés et analysés. Le classement des paires de
chromosomes aboutit au caryotype de l’individu dont il est possible de deduire la formule
chromosomique selon une nomenclature bien définie

Caryotype de sexe féminin Caryotype de sexe masculin

 Classification des chromosomes

 Les chromosomes sont classé selon :

 La taille
 L’indice centromérique : correspond au
rapport de la taille du bras court sur la
longueur totale du chromosome
 1 – Classement selon la taille

• Les chromosomes classés selon des tailles décroissantes.

• Ils sont répartis en 7 groupes :

Groupe A : 1,2,3

Groupe B : 4,5

Groupe C : 6 à12, X

Groupe D : 13,14,15

Groupe E : 16,17,18

Groupe F: 19, 20

Groupe G : 21, 22 et Y
2 – Selon l’indice centromérique

IC = 0,5

IC = 0,3

IC = 0 (13,14,15,21,22)
 Nomenclature
• Selon l’international system for human cytogenetic nomenclature (ISCN)
Il faut indiquer successivement, le nombre total de chromosomes ; suivi d’une virgule, les chromosomes sexuels ; une autre
virgule et l’anomalie chromosomique quand elle existe.

- Caryotype d’une femme normale: 46,XX

- Caryotype d’un homme normal: 46,XY

• Chaque bras chromosomique est divisé (selon sa taille) en 1 a 4 régions, chaque

région en bandes et sous bandes numerotées du centromère au télomère.

• Localisation précise sur le chromosome indiquée par :

 n° du chromosome
 bras (p ou q) 7q31.2 ; designe la deuxième sous bande
de la premiere bande de la région 3 du
 n° région
bras long du chromosome 7 et se
 n° bande prononce : Sept q trois – un point - deux.
 n° sous bande
ANOMALIES CHROMOSOMIQUES
Les anomalies chromosomiques peuvent être :

 Constitutionnelles ou acquises
• anomalie chromosomique survenue avant fécondation (méiotique) ou lors des premières divisions du zygote (mitotique)
• anomalie chromosomique apparue au cours de la vie (mitotique) et ne touchant qu’une partie des cellules => mosaïcisme

 Nombre ou structure
• nombre: caryotype toujours déséquilibré
• structure: caryotype équilibré ou déséquilibré

 Anomalies homogènes
• toutes les cellules présentent l’anomalie chromosomique

 Anomalies en mosaïque
• existence d’au moins 2 populations cellulaires à caryotype différent issues du même zygote , conséquence d’une non-
disjonction mitotique (post-zygotique)
ANOMALIES CHROMOSOMIQUES DE NOMBRE
POLYPLOÏDIES
 Nombre anormal de lot haploïde (N) de chromosomes
 N’est pas viable chez l’espèce humaine (fausses couches spontanées),
exceptionnellement en mosaïque.
 Triploïdie (69 chromosomes = 3 x 23)
- la plus fréquente des polyploïdies
- mécanisme: anomalie de la fécondation (digynie ou diandrie)
Diandrie, le lot de chromosome surnuméraire est d’origine paternelle
Digynie, le lot de chromosome surnuméraire est d’origine maternelle

 Tétraploïdie (92 chromosomes = 4 x 23) Triploïdie

69 chromosomes
- mécanisme: anomalies dans les premières mitoses
ANEUPLOÏDIES
 Type d’anomalie chromosomique les plus fréquentes

 Une seule paire chromosomique impliquée (parfois deux) : formule chromosomique 2N+/-1; 2N+/-2

 Résultent d’erreurs de ségrégation méiotique ou mitotique (non disjonction)

 Erreurs méiotiques => aneuploïdie homogène  Erreurs mitotiques => aneuploïdie en mosaïque

 non disjonction chromosomique  non disjonction chromosomique

 séparation prématurée des chromatides sœurs  retardement anaphasique

 Aboutissent à la perte d’un chromosome (gamète nullosomique) ce qui entraine une monosomie (45 chr.), ou à un
gain d’un chromosome (gamète disomique) entrainant une trisomie (47 chr.).

 Les paires chromosomiques impliqués peuvent être autosomiques ou gonosomiques

 Autosomes  Gonosomes
 trisomies autosomiques: 21;13;18; 8; 9  trisomies gonosomiques: 47,XXY; 47,XXX; 47,XYY
 monosomies autosomiques non viables  monosomie gonosomique: 45,X
 Mécanismes impliqués
1. Anomalies mitotiques - Aneuploïdies en mosaïque
Non disjonction chromosomique Retardement anaphasique

Le retardement anaphasique se
produit lorsque les chromatides
sœurs ne se séparent pas
correctement en raison d'une
formation incorrecte du fuseau)
2. Anomalies méiotiques – Aneuploïdies homogènes

 Non disjonction chromosomique

 Séparation prématurée des chromatides sœurs en MI

Séparation prématurée des chromatides

sœurs conduisant une chromatide à migrer
avec un chromosome homologue
 Exemples d’aneuploïdies des autosomes les plus fréquentes
La trisomie 13 ou syndrome de Patau La trisomie 18 ou syndrome d’Edward La trisomie 21 ou syndrome de Down

47,XX,+13 47,XY,+18 47,XY,+21

 Exemples d’aneuploïdies des gonosomes les plus fréquentes

Syndrome de Klinefelter Syndrome triple X / Super femelle Syndrome double Y / syndrome de Jacob
(47,XXY ) (47,XXX) (47,XYY)
Exemple d’aneuploïdie des gonosomes la plus fréquente

Syndrome de Turner
(45,X)
ANOMALIES CHROMOSOMIQUES DE STRUCTURE
 Généralités

• Une anomalie de structure est un événement méiotique qui survient lorsque les molécules d’ADN de deux chromosomes
sont cassées puis réassociées, formant alors un arrangement inhabituel.

• La plupart de ces modifications se produisent durant la phase S et sont la manifestation d’erreurs de réparation ou de la
réplication des molécules d’ADN.

• Toutes les paires chromosomiques sont concernées ; 1 ou plusieurs chromosomes (homologues ou non) peuvent être
impliqués.

• Peuvent survenir de novo ou être héritées.

• On parle d’anomalie de de structure :

 Equilibrée : si il n'y a ni perte ni gain de matériel génétique  Déséquilibrée: si il en résulte une délétion et/ou
(sans conséquences phénotypiques pour le sujet porteur, une duplication d'un fragment.
mais avec un risque de déséquilibre à la méiose).
 Principales anomalies de structure

Déséquilibrés Equilibrés

 Délétion  Remaniements interchromosomiques (> 2 chr.)

 Duplication
 Chromosome en Anneau  translocation robertsonnienne
 Isochromosome  translocation réciproque
 insertion interchromosomique

Note : beaucoup d'anomalies structurales sont létales pour  Remaniements intrachromosomiques (1 chr.)
la cellule. Parmi celles qui ne le sont pas et sont transmises,
les plus fréquentes sont les translocations, les délétions et  inversion paracentrique
les petites inversions.  inversion péricentrique
 insertion intrachromosomique
Note : les chromosomes remaniés sont souvent appelés
dérivés (der) et le dérivé porte le numéro du chromosome
dont il possède le centromère.
REMANIEMENTS CHROMOSOMIQUES DE
STRUCTURE
DÉSÉQUILIBRÉS
1. Délétion
 Perte d'un segment au sein d'un chromosome implique la perte des gènes
portés par ce segment ("monosomie" partielle).

 délétion de type terminal ou interstitiel

 Remaniement déséquilibré

 de novo ou malségrégation d’un remaniement chromosomique parental

équilibré (terminale)

 Noté del, suivi du numéro du chromosome dans une première

parenthèse, suivi dans une deuxième parenthèse des 2 points de cassure
indiquant la région délétée (délétion interstitielle).
2. Duplication

 Duplication d’un segment chromosomique in situ (1 ou plusieurs fois) sur le même chromosome.

 En tandem : le fragment dupliqué gardant la même orientation que le fragment original.

 En miroir: le fragment dupliqué prend une orientation inverse du fragment original.

 Remaniement déséquilibré.

 interstitielle

 de novo

 Noté dup, suivi du numéro du chromosome dans une

première parenthèse, suivi dans une deuxième parenthèse
des 2 points de cassure indiquant la région dupliquée.
3. Anneau
 Structure annulaire résultant de délétions plus ou moins étendues (souvent
peu importantes) aux deux extrémités d'un chromosome et recollement du
segment intermédiaire (par absence de télomères).

 Remaniement déséquilibré.

 Rarement transmis à la descendance (car un anneau est particulièrement

instable), donc le plus souvent de novo => mosaïcisme, duplication annulaire

 Phénotypiquement, le retentissement peut donc être celui d'une délétion,

mais aussi d'une duplication.

 Noté : r (ring), suivi du numéro du chromosome dans une parenthèse, suivi

éventuellement d'une deuxième parenthèse indiquant les points de cassure,
si ceux-ci sont localisables (ex: r(13)(p12q33)).
4. Isochromosome i(X)(p11)

 Un isochromosome est un chromosome anormal formé de deux bras longs ou de

deux bras courts d'un même chromosome avec perte de l’autre bras

 Il peut être monocentrique ou dicentrique selon le mécanisme de formation.

 Noté i suivi d'une parenthèse indiquant le numéro du chromosome impliqué et la

lettre du bras dupliqué (ex: i(17q) ou i(17)(q10): perte du bras p et duplication du idic(X)(p11)

bras q).

 L’isochromosome le plus souvent rencontré est l’isochromosome pour le bras

long de l’X qui constitue une variante cytogénétique du syndrome de Turner.
47,XY,i(X)(q10) 46,XX,i(21)(q10)
REMANIEMENTS CHROMOSOMIQUES DE
STRUCTURE
ÉQUILIBRÉS
1 - Translocation réciproque

 Echange, entre 2 chromosomes, d'une partie d'un de leurs bras.

 Tous les chromosomes peuvent être concernés par un tel réarrangement.

 Remaniement équilibré.

 Formule: 46 chromosomes

 Phénotype normal

 Noté : t, suivi d'une parenthèse indiquant les numéros des 2 chromosomes impliqués, séparés d'un point virgule;
une deuxième parenthèse indique les points de cassure sur chacun des 2 chromosomes.
 Chez les sujets porteurs de translocations, la formation des bivalents (lors de la méiose) ne peut pas s’effectuer
normalement et il y’a formation de tétravalent. Lors de la ségrégation différentes possibilités peuvent exister générant la
formation de gamètes normaux , équilibrés ou déséquilibrés.

 Il existe 3 grands types de ségrégation qui sont par ordre de fréquence :

 Les ségrégations de type 2 :2 : deux chromosomes sont transmis dans chaque gamète

 Les ségrégations de type 3 :1 : 3 chromosomes sont transmises dans un gamète alors qu’un seul est transmis dans l’autre.

 Les ségrégations de type 4 :0 : 4 chromosomes dans un gamète, 0 dans l’autre.

 Les ségrégations méiotiques de type alterne sont les plus fréquentes. Elles produisent des gamètes équilibrés ou normaux.

 Les ségrégations de type adjacent sont responsables de la formation de gamètes non équilibrés.
Translocation réciproque et méiose Quadrivalent (Tétravalent)

Ségrégation méiotique

Alterne Adjacente 1 Adjacente 2

Normal Equilibré déséquilibré déséquilibré déséquilibré déséquilibré

2. Translocation Robertsonienne

 Elles se produisent entre chromosomes acrocentriques du groupe D (13, 14 et 15) et du groupe G (21 et 22) par fusion
centrique ou, le plus souvent, par cassures dans les régions juxtacentromérique engendrant alors un chromosome
dicentrique (dic), possédant 2 centromères.

 L'un des 2 centromères est généralement inactivé, permettant au

chromosome remanié de se comporter comme un monocentrique, sans
problème de ségrégation à l'anaphase. Le chromosome remanié
comporte dans tous les cas les bras longs des 2 acrocentriques
concernés, alors que les bras courts sont généralement perdus.

 Le caryotype est pourtant dit équilibré, parce que la perte des bras
courts de 2 acrocentriques est sans retentissement phénotypique avec 45
chromosomes..

 Noté : rob, suivi d'une parenthèse indiquant le numéro de chaque chromosome suivi de la notation q (ex: rob (14q21q)).
45 chromosomes, mais pas de déséquilibre génomique
 Translocation Robertsonienne et méiose

Chr. 14 Chr. 21
Ex : Les translocations robertsoniennes
sont responsables de la majorité des
der (14;21)
formes familiales de trisomies 21 et 13. 1 2
rob(14;21)(q10;q10)

Gamètes Zygote Conséquences Génération suivante

3 4

1 : normal normal pas de risque particulier

2 : équilibré équilibré risque de déséquilibre 5 6
3 : disomie 21 trisomie 21
4 : nullosomie 21 monosomie 21 FCS
5 : disomie 14 trisomie 14 FCS
6 : nullosomie 14 monosomie 14 FCS
3 - Inversions

 Les inversions sont dues à deux cassures sur le même chromosome, suivies de recollement après inversion du segment
intermédiaire.
 Le porteur a un phénotype normal

 Notée inv, suivi du numéro du chromosome dans une parenthèse, suivi d'une autre parenthèse
indiquant les points de cassure. ex: inv(9) (p11q13).

 Elles sont dites péricentriques si le centromère est compris dans le segment intermédiaire

• indice centromérique possiblement modifié

• peut provoquer des fausses couches spontanées, parfois une stérilité chez l'homme

 Elles sont dites paracentriques si les deux cassures se sont produites sur le même
bras chromosomique
• indice centromérique conservé

• les plus fréquemment rencontrées sont les inv para du 3, du 7 ou du 14.

4 - Insertions

 Les insertions se traduisent par le transfert d'un segment intercalaire

qui se réinsère à un autre endroit, soit sur le même chromosome, soit
sur un autre chromosome. Ils résultent d'un mécanisme à 3 cassures,
2 sur le chromosome donneur et 1 sur le chromosome receveur.

 Phénotype normal

 Noté ins, suivi d'une parenthèse indiquant le numéro du chromosome qui reçoit l'insertion, suivie éventuellement d'un
point virgule indiquant le numéro du chromosome donneur du segment (si ce chromosome n'est pas le même que celui qui
reçoit), suivi d'une deuxième parenthèse indiquant le point d'insertion suivi d'un point virgule seulement si le chromosome
donneur est différent, suivi des points de cassure du fragment.

Ex : ins(2)(p13q31q34) et ins(5;2)(p12;q31q34): le fragment q31q34 d'un chromosome 2 est inséré respectivement en p13
du même chromosome 2, et sur un chromosome 5 en p12.

 Le segment inséré peut conserver son orientation par rapport au centromère (directe « (dir ins) » ou prendre une
orientation inverse « (inv ins) ».
 Quand doit-on faire un examen de caryotype ?

• D’une façon générale dans les pathologies cancéreuses des cellules du sang
• Chez le fœtus (diagnostic prénatal) : quand nous somme dans le cas de couple ayant déjà eu un enfant porteur
d’une anomalie chromosomique ou anomalie chromosomique portée par l’un des deux parents ou signe d’appel
échographique..etc.
• Chez le nouveau né : qui présente un petit poids de naissance ou ambigüité sexuelle..etc.
• Chez l’enfant : qui présente un retard staturo-pondéral ou retard psycho-moteur : retard des acquisitions motrices
ou de langage.
• Chez l’adolescent : Retard de croissance
• Chez l’adulte : Fausses couches à répétition, stérilité, hypofécondité avec anomalies du spermogramme,
aménorrhée primaire ou secondaire, antécédents familiaux d’anomalies chromosomiques, couple devant bénéficier
d’une fécondation in vitro.
Les Techniques de Cytogénétique
Conventionnelles
&
Moléculaires
 Caryotype classique
70h
À 37°C

2h
À 37°C

Choc hypotonique Fixation

Acide acétique
KCL 0,75 M : 20mn
Méthanol
20mn

Mise en culture Etalement sur

de l’échantillon lame

Observation Coloration
microscopique au Giemsa
 Observation microscopique

Objectif X 10 Objectif X 100

 Caryotype à haute résolution
• Analyse fine du caryotype par l’étude, après coloration en
bandes G ou R, de cellules en prométaphase (stade dans
lequel le chromosome est moins condensé qu’en
métaphase).

• La déspiralisation aboutit à une augmentation du nombre

de bandes (de 300 bandes à un système de prés de 1000
bandes par lot haploïde) et par conséquent une
augmentation de la résolution, ce qui permet la détection
de microdélétions qui n’apparaissent pas sur un
caryotype classique.

Limites

o résolution maximale de 4 – 5Mb (1 gène / 0,15 Mb, 1- 30 /5Mb)

o morphologie en noir et blanc…
Chromosome 7 (en Bande G)
Les Techniques de Cytogénétique
Conventionnelles
&
Moléculaires
INTRODUCTION

L’introduction des techniques de cytogénétique moléculaire, hybridation in situ et hybridation

génomique comparative sur puces à ADN (microarray CGH en anglais) a permis la détection de
pertes ou de gains cliniquement significatifs répartis sur l’ensemble du génome
  FISH : Fluorescence In Situ Hybridization
 Hybridation in situ en fluorescence repose du
les propriété de complémentarité de l’ADN.

Elle consiste en l'hybridation de sonde marquée

(spécifique de la séquence d'ADN) sur des lames de
préparations cytogénétiques de cellules métaphasiques
ou interphasiques et sa révélation par fluorescence.

 Différents types de sondes utilisés

 Peintures
• Totales : une paire de chromosomes
• Partielles : Seulement une partie (ex: un bras p)

 Spécifiques
• d’un locus
• de plusieurs locus (télomères, centromères)
 Peintures chromosomiques : confirmation du diagnostic établi par les bandes
 Caryotype en multifluorescence (m-FISH ou SKY) « Spectral Karyotyping »

La FISH offre la possibilité d'étudier plusieurs loci

simultanément lors d’une seule hybridation. Il suffit pour
cela d'hybrider des sondes marquées avec des
fluorochromes différents dont les spectres d'excitation et
d'émission ne se chevauchent pas.
 Diagnostic sur noyaux en interphases

La cytogénétique moléculaire peut s’appliquer

également sur des noyaux interphasiques pour
détecter des anomalies de nombre.
La FISH permet de :
 Préciser les anomalies détectées au caryotype
 Détecter des microremaniements ( taille inferieure à 5Mb)
 D’étudier des anomalies chromosomiques dans les noyaux

Limites
o Etudes sont très ciblées
o Non globale du génome
 La CGH sur Chromosome : L’ Hybridation Génomique Comparative

Le principe est de comparer le nombre de molécules d’une même quantité d’ADN de deux individus en les
marquant chacune par un fluorochrome différent puis en les hybridant ensemble sur des métaphases d’un
témoin. Après l’étape d’hybridation, les signaux générés par les deux fluorochromes sont numérisés et un
rapport de leur intensité respective – patient sur témoin (reflétant le rapport du nombre de molécule d’ADN du
patient par rapport à celle du témoin) - est établi au niveau des bandes de chacune des paires chromosomiques.

Le ratio d’intensité des deux fluorochromes au niveau d’une bande aura une valeur théorique proche de 1 si le
nombre de molécules des deux génomes est identique au niveau de la bande observée. En cas de délétion, ce
rapport théorique sera de 0,5 et de 1,5 en cas de trisomie
 La CGH sur Chromosome : L’ Hybridation Génomique Comparative
Limites

o La CGH sur métaphases, ne détecte que des déséquilibres génomiques.

Les anomalies chromosomiques équilibrées et les anomalies en faible
mosaïque ne sont pas mis en évidence.

o La résolution de la CGH sur métaphases reste celle de la bande

chromosomique (5–10 Mb), car le ratio d’intensité des
fluorochromes est établi au niveau de chaque bande chromosomique.
La CGH Microarray: Analyse chromosomique sur puce à ADN
À la fin des années 90, ces auteurs démontrent qu’il est possible d’effectuer une CGH sur des fragments d’ADN fixés
sur des lames de verre. Très rapidement, avec le séquençage du génome, il fut possible de fixer sur ces lames, des
séquences génomiques, appelées « sondes », représentant une partie plus ou moins importante du génome. Ces lames
furent appelées « puce à ADN » ou microarray.

Comme pour la CGH sur métaphases, une même quantité d’ADN témoin et d’ADN patient marquée par deux
fluorochromes différents (ce mélange est appelé « cible ») sont déposées sur la lame. Le rapport d’intensité de
fluorescence est calculé au niveau de chaque fragment d’ADN fixé (appelé « sonde »). Un traitement statistique des
données est ensuite réalisé grâce à des logiciels dédiés. Les résultats sont donnés sous forme graphique où un « point »
correspond à la valeur du ratio d’intensité de fluorescence au niveau d’une sonde. L’ensemble des « points » est placé sur
un idéogramme pour chaque chromosome.

À la différence de la CGH sur métaphases, l’existence d’un déséquilibre génomique sera objectivée par une déviation du
ratio d’intensité de fluorescence non plus au niveau d’une bande chromosomique, mais au niveau des sondes fixées sur la
lame. De leur nombre et de leur localisation sur le génome dépendra la résolution de la puce utilisée.
MERCI POUR VOTRE

ATTENTION

Contact : h.s.bouderbala@gmail.com