COLORATIONS

CONFECTION DE FROTTIS
- Etalement du produit pathologique aussi mince que possible,
- Séchage à l’air ou sur une platine chauffante,
- Fixation à l’alcool : recouvrir le frottis de quelques gouttes d’alcool à 95° et
flamber 2 à 3 secondes.

COLORATIONS

1 - Gram

Coloration de base

- Recouvrir le frottis de cristal violet : 1 mn,

- Recouvrir d’une solution de lugol : 1 mn,
- Egoutter – laver à l’eau du robinet,
- Décolorer à l’alcool à 95° : temps délicat – incliner la lame et observer la couleur
de l’alcool à la partie inférieure du frottis : d’abord violet, il coule ensuite incolore
– laver alors rapidement à l’eau,
- Recouvrir la lame d’eau,
- Ajouter la fushine : 1 mn,
- Laver – sécher,
- Observer à l’immersion – objectif 100

Résultats :

Bactéries Gram + : colorées en violet par le cristal violet

Bactéries Gram - : l’alcool a pénétré dans la paroi bactérienne et a enlevé le cristal
violet
 Les bactéries sont colorées en rose par la fushine

2 – Bleu de Méthylène (B.M.)

- Recouvrir le frottis de B.M. : 1 mn,
- Laver à l’eau,
- sécher

Résultats : Cellules et bactéries sont colorées en bleu.

 3 – Ziehl Neelsen

Coloration des Mycobactéries

. Coloration à chaud

- Fushine phéniquée (ou solution de Kinyoun) : 5-10 mn – soit sur une platine
chauffante, soit lame chauffée à l’aide d’un porte coton imbibé d’alcool et
enflammé,
- Laver à l’eau,
- Décolorer à l’acide sulfurique ou nitrique au ¼ pendant 2 mn – laver – puis
recouvrir d’alcool à 95° pendant 3 mn,
- Laver,
- B.M. : 30 secondes,
- Laver - sécher

. Coloration à froid

Même technique, mais sans chauffer. On peut allonger le 1 er temps (cf également
annexe).

Résultats : la propriété fondamentale des mycobactéries est leur acido-alcoolo-

résistance mise en évidence par la coloration de Z.N. les mycobactéries apparaissent comme
des bâtonnets rouges sur un fond bleu.

4 – Coloration de Vago
Utilisée pour la coloration des Tréponèmes, Borrelia et Leptospires.

- Sécher le frottis, mais pas de fixation à l’alcool,

- Fixer 15 mn par une solution de mercurochrome à 2%,
- Laver,
- Colorer par le violet de méthyle à 2% : 15 mn,
- Laver – sécher.

Résultats : les spirochètes apparaissent violet clair sur fond rosé.

 PRINCIPES DE L’IDENTIFICATION BACTERIENNE

CULTURE
Après coloration (Gram), le produit pathologique est ensemencé sur différents milieux
de culture.
Les milieux de culture doivent contenir des éléments nutritifs nécessaires au plus
grand nombre de bactéries : N2, C, facteurs de croissance…
La culture se fait à 37°C, à pH 7 en général, pH 8 à 9 pour Vibrio choléra;
parallèlement sur milieux liquides et gélosés.

. Bouillons nutritifs
ex : - Bouillon VF (viande-foie-glucose) : permet la pousse de la plupart des
bactéries. La pousse se manifeste par un léger trouble.
- Milieu de Rosenow pour les bactéries anaérobies (mélange cœur + cervelle).
On coule de la paraffine à la surface pour créer l’anaérobiose.

. Géloses
Solidifiées par un gel d’agar : en raison de la viscosité, les bactéries se multiplient en
restant au contact les unes des autres et donnent ainsi naissance à des colonies bactériennes :
ces colonies constituent un clône cellulaire formé de cellules issues d’une même cellule
parentale : c’est à partir d’une colonie que l’on fera l’identification bactérienne et
l’antibiogramme.

Il existe de nombreuses géloses nutritives, sélectives ou non. Les géloses sélectives

contiennent des inhibiteurs de certaines bactéries ; elles sont utiles pour les prélèvements
plurimicrobiens. De plus, beaucoup de géloses contiennent un sucre et un indicateur de pH,
servant à l’orientation diagnostique.

Ex : Gélose SS (Salmonelles, shigelles) – elle contient des inhibiteurs de la pousse des

cocci Gram + : vert brillant – sels biliaires + lactose et indicateur de pH = rouge neutre.

Gélose de Chapman : milieux sélectif pour staphylocoques, contient du NaCl à 7,5%,

concentration que seuls les staphylocoques tolèrent + mannitol et rouge de phénol.
 IDENTIFICATION

1 – Elle se fait par l’étude du biotype :

- Etude du mode respiratoire : bactéries aérobies strictes, aéro-anaérobies, anaérobie

strictes, anaérobies tolérantes.
- Etude des enzymes intervenant dans le métabolisme de l’O2.

Ex : . Catalase
H2O2 H2O + ½ O2

. Cytochrome oxydase
Mise en évidence par une solution de paraphénylène diamine :
sous l’action de l’enzyme, il est oxydé en un dérivé rose foncé

- Utilisation des glucides : étudiée en présence de différents glucides et d’un indicateur

de pH.
- Métabolisme protidique :

Ex : . Gélatine liquéfiée par une gélatinasse,

. Urée hydrolysée par une uréase, en présence d’un indicateur de pH.

SEROTYPIE
C’est l’étude antigénique de la bactérie qui permet de différencier des types bactériens
à l’intérieur d’une même espèce.

Les antigènes étudiés sont :

. Ag. Capsulaire : polysaccharidique ex : Streptococcus
pneumoniae
. Ag. Somatique : glucidolipidoprotéique ex : salmonelles - shigelles
. Ag flagellaire : protéique ex : salmonelles

DEROULEMENT DE L’IDENTIFICATION

J1 : Produit pathologique : . Gram

. Culture en bouillon et isolement sur différents
milieux gélosés 24 h à 37°C

J2 : Observation des colonies . Gram

Mise en route de l’étude du biotype et de l’antibiogramme
Eventuellement, repiquage des bouillons sur géloses.

J3 : Lecture des galeries d’identification et de l’ABG.

Eventuellement sérotypie