Master 1 Microbiologie appliquée

ANALYSES
MICROBIOLOGIQUES
 Contenu de la matière 
 Chapitre 1 : Introduction
 Chapitre 2 : Prélèvement, préparation des échantillons et transport
 Cas des aliments solides;
 Cas des liquides alimentaires;
 Echantillonnage en surface;
 Techniques de dilution.
 Chapitre 3 : Les techniques classiques de numération
Numération microscopique;
Numération en milieu solide;
Numération en milieu liquide.
Chapitre 4 : Méthodes d’évaluation des différentes microflores
 La microflore aérobie mésophile totale;
 Les indices de contamination fécale;
 Les microorganismes pathogènes.
 Chapitre 2 : Prélèvement, transport et préparation des
échantillons

1. Pratiques aseptisées

 La particularité des analyses microbiologiques est la nécessité absolue de travailler en

totale asepsie.
 Ce, afin d’avoir l’assurance que les microorganismes comptabilisés ou identifiés par l’analyse
proviennent effectivement et à 100 % de l’échantillon.

 Tous les contenants, matériels, supports doivent être désinfectés ;

 Les mains nettoyées avec un produit antiseptique,
 La paillasse (table de laboratoire) désinfectée à l’alcool à 70°,
 Le matériel métallique passé à la flamme,
 La verrerie autoclavée ;
 La moindre inattention ou maladresse conduit à la contamination
 de l’échantillon
 ou des supports
 ou encore des réactifs
par les microbes de l’air, ou des mains, ou du matériel ou encore des
contenants utilisés.
Ce qui fausse définitif tous les résultats de l’étude en cours.

 Connaissant le temps d’incubation

 d’une levure (2 à 5 jours),
 celui d’une bactérie lactique (2 semaines),
on a tout intérêt à ne pas devoir recommencer les tests
microbiologiques.
2. Installation spécifiques
Le laboratoire de microbiologie doit se doter d’équipements spécifiques tels
que :
• Une hotte à flux laminaire, pour aseptiser l’air contenu sous la hotte
et un bec Bunsen, pour désinfecter le matériel métallique, on fait rougir le métal à
la flamme ;
l’ensemble permet de manipuler en asepsie, pour éviter la contamination par des
germes contenus dans l’air ou sur le matériel.

•Une étuve, c’est-à-dire une armoire thermorégulée, permet de placer les

échantillons tests à des températures qui favorisent la croissance des
microorganismes étudiés ; on parle d’incubation.

• Un autoclave permet de désinfecter le matériel utilisé mais aussi tous les

supports et les milieux de culture que l’on se destine à jeter.
Particularités du laboratoire de microbiologie
Hotte à flux laminaire qui génère un aire purifié en particuliers
avec bec Bunsen, pour manipulation sous ambiance stérile.

Etuve pour la mise en culture ( incubation)

Exemples de résultats de mise en culture, sur gélose coulée en boite de
Petri, après séjour en étuve.
1. Culture pure: la culture est homogène, les colonies sont identiques.
2. Diagnostic d’hygiène: la culture est hétérogène, les colonies sont
d’aspect différent les unes aux autres.
Chaque colonies peut ensuite être étudiée morphologiquement à l’œil nu,
puis en microscope, puis subir des tests biochimiques.
L’ensemble des résultats donne une clé d’identification qui permet de
retrouver le genre et l’espèce du germe.

Autoclave permettant d’assurer la stérilisation du matériel

ou des milieux de culture
 3. Prélèvement et préparation de l’échantillon en condition stérile

L’échantillonnage destiné à une analyse microbiologique intervenir une précaution

supplémentaire par rapport au prélèvement destiné à un contrôle physico-chimique.
Celle d’être réalisé en conditions stériles :
– Flacon stérile, rempli sans toucher l’échantillon avec les mains ni un quelconque
matériel (entonnoir, pipette…) à moins d’avoir été désinfecté ;
– Bouchon stérile ;
– flambage du col de la bouteille.
Après le prélèvement, maintien de l’asepsie :
– Interdiction stricte d’ouvrir le flacon jusqu’à l’analyse ;
– Ouverture de l’échantillon seulement sous hotte à flux laminaire ou à proximité
directe de la flamme bleue du bec Bunsen;
- Aucune culture microbienne, en tube ou en boîte de Pétri, ne doit être ouverte à l’air
libre.
– Pour les prélèvements réalisés sur une chaîne technologique, prélever au niveau de
chacun des équipements de façon à diagnostiquer toute source de contamination possible.
• En réaliser des techniques de comptage ou d’identification, il faut
quelquefois intervenir sur l’échantillon afin d’adapter le taux présumé
(prévu) de sa population microbienne :

 Si la population est très élevée, il faut diluer l’échantillon.

Il s’agit alors d’une dilution similaire à celles que l’on réalise en chimie.
 Inversement, pour les milieux assez pauvres en germes,
il faut concentrer les germes par filtration de l’échantillon.

1- Population est très élevée:

Ces dilutions s’effectue en conditions stériles :
 Matériel et eau distillée stériles.
 La dilution requise est une dilution au cinquième (1/5), au dixième
(1/10), centième (1/100), voire au millième (1/1 000).
 Dilution d’un échantillon avant un contrôle microbiologique
Cas d’une population
microbienne élevée

Echantillon liquide Facteur de dilution:10

Facteur de dilution:100
Facteur de dilution:1000

Conseils pratiques:
 Réaliser les dilutions en série ( de 10-1 à 10-3) car on ne peut pas précisément prévoir la dilution qui sera la plus
adaptée.
 Changer la pipette à chaque dilution (si elle n’est pas suffisamment rincée , la dilution sera faussée)
 Eau distillée QSP(quantité suffisante pour) 100ml = signifie qu’il faut compléter jusqu’au 100ml avec de l’eau
distillée stérile (après avoir introduit les 10ml de la solution à diluer)
 Bien homogénéiser avant chaque prélèvement de 10ml d’échantillon
 Le facteur de dilution (FD) multiplie le résultat de la population trouvée dans 1ml d’échantillon dilué de façon
à l’exprimer pour 1ml de l’échantillon de départ (non dilué)
Remarque: on peut avoir besoin d’autres dilutions.
 Suspension mère et
dilution décimales 

Exemple:
Si l’on trouve 9.105 levures/ml à la
dilution de 10-3 (dilution 10-3 = dilution ai
1/1000, facteur de dilution =1000)
Alors , le résultat final est 9 .105 x 1000 =
9. 105. 103= 9 .108.
Sait 9. 108 levures/ml dans l’échantillon
prélevé
 2- Milieux assez pauvres en germes:
 Inversement, pour les milieux assez pauvres en germes,
 il faut concentrer les germes par filtration de l’échantillon.
 On procède alors à une filtration sous vide sur membrane de 0,45 µ;
cette porosité est choisie de façon à retenir tous les germes, levures
ou bactéries, sur la membrane filtrante.
Dans ce cas, le contrôle microbiologique qui suit ne porte plus sur
l’échantillon lui-même, puisqu’il a été dépourvu de tous ses germes par la
filtration.
Mais sur la membrane de filtration qui a retenu les éventuels
microorganismes à sa surface.

 Il faut, de ce fait, la manipuler de façon stérile : elle doit être posée et

retirée avec une pince stérilisée, réaliser toutes les opérations sous hotte à
flux laminaire, stériliser tout matériel au contact de la membrane.
Filtration d’un échantillon sur membrane stérilisante (filtration sous
vide sur membrane stérilisante (0,45µm)
Fin de filtration : démontage du support de la membrane filtrante et
récupération de la membrane porteuse des microorganismes déposés tout
au long de la filtration.
Manipulation de la membrane de filtration à la pince (stérile) sous la
hotte à flux laminaire (ambiance stérile)
Après filtration: mise en culture des germes retenus sur la membrane filtrante.
 La membrane est déposée sur un milieu de culture (choisi en fonction de la
recherche souhaitée) pour permettre aux quelques germes retenus de se
multiplier ( en étuve).
 Cette multiplication cellulaire donne lieu à la formation de petits amas
appelés colonie :
chaque cellule (invisible à l’œil nu) forme une seule colonie (visible à l’œil nu)
 3.1. Prélèvement de produits liquides

• La technique varie avec le produit, le volume et la forme du

contenant.
• Il faut toujours s’assurer de la parfaite homogénéisation du
liquide (agitateurs) avant de prélever à la pipette le volume
nécessaire à l’analyse.
 3.2. Prélèvement de produits solides

• Selon le produit, le prélèvement sera effectué au scalpel, à la sonde

(fromages et produits mous) ou à la pipette harpon.
• La surface est souvent éliminée avant de procéder au prélèvement.

Si le produit est hétérogène (plats cuisinés, conserves etc.) il faut s’assurer

de la bonne représentativité du prélèvement.
 3.3. Prélèvement en surface

 1- Ecouvillonnage
 Un écouvillon de coton hydrophile est immergé dans une solution stérile de Ringer au ¼
ou dans un bouillon tryptone-sel additionné de Tween (0,5°/°°).
 Le prélèvement est effectué par frottement sur la surface du produit ; l’écouvillon est
alors immergé dans 10 ml de Ringer au 1/4 ou 10 ml de bouillon tryptone-sel.
 L’analyse est réalisée à partir de la suspension ainsi obtenue.
 3.3. Prélèvement en surface

 2- Rinçage:
 Cette méthode est utilisée dans le cas de récipients ou de
tuyauteries;
 Un volume connu de solution stérile est introduit dans le
matériel à analyser.
 Après agitation, le liquide est récupéré et soumis à l’analyse.
 3.3. Prélèvement en surface

 3- Méthode des empreintes :

 Un ruban adhésif préalablement stérilisé par les UV est appliqué sur

la surface à étudier.
 Après quelques secondes de contact il est retiré et appliqué sur la
surface d’un milieu gélosé approprié.
 Après quelques heures de contact à la température d’incubation
désirée il est retiré
 et la boîte est incubée jusqu’à apparition des colonies.
4. Traitement de l’échantillon

4.1. Transfert de l’échantillon au laboratoire

 Quand le prélèvement aseptique a été réalisé il faut identifier immédiatement le produit avec
 une étiquette ou une référence.
 Il est souhaitable de ne pas utiliser de crayons feutres sur des films plastiques
(PVC :Matière plastique (chlorure de polyvinyle) utilisée en minces épaisseurs. )
car l’encre peut pénétrer et perturber l’analyse.
 Noter - la température initiale,
- l’heure du prélèvement,
- la date
- et la température de transport.
 Amener alors les échantillons le plus rapidement possible au laboratoire en maintenant les
conditions initiales dans lesquelles se trouvait le produit.
 L’analyse devrait être réalisée dans l’heure qui suit le prélèvement.
 Dès réception au laboratoire l’échantillon accompagné de sa fiche signalétique est enregistré
(nature, date, heure, provenance du prélèvement, nom du préleveur, analyses demandées,
autres indications utiles).
 4.1. Transfert de l’échantillon au laboratoire

LA SUITE

 Si l’échantillon doit être transporté il faut réduire au maximum le délai avant

l’analyse.
 Il est souvent nécessaire de réfrigérer (mais non congeler) le produit au cours
de son transport;
certains germes fragiles peuvent disparaître au cours de cette réfrigération.
 Si un produit est déshydraté ou en conserve il ne doit pas être réfrigéré.
 4.1. Transfert de l’échantillon au laboratoire LA SUITE

 Pour un produit congelé s’assurer il faut qu’il n’y ait pas de

décongélation pendant le transport
(ce produit peut être gardé pendant 1 mois avant d’être analysé).
 Les dispositions relatives à l’analyse des produits congelés sont
indiquées dans le JO.
La congélation d’un produit provoque une diminution plus ou moins
importante du nombre de germes qu’il contient.
 Il faut contrôler à ce que la température du produit prélevé soit au
moins égale à -18°C, transporter le produit à cette température et
décongeler à l’air ambiant à température voisine de 20°C pendant un
temps inférieur à 3 heures, temps suffisant pour atteindre une texture
qui permette le prélèvement.
 4.2. Préparation de l’échantillon

Quelle que soit la nature initiale du produit, l’analyse microbiologique s’effectue

toujours à partir d’une suspension.
Après ouverture aseptique, l’échantillon sera “homogénéisé” (liquide) ou broyé dans
un volume connu de diluant stérile (solide) ce qui constitue en fait la première dilution.
 Pour les produits liquides (ou semi-liquides) une agitation manuelle vigoureuse en
présence de billes de verre permet d’obtenir une homogénéité satisfaisante.
 Pour les produits solides diverses techniques de “broyage” sont utilisables :
1) broyage manuel en présence de sable stérile ou de billes de
verre (mortier)
2) broyage mécanique
 4.3. Les diluants

Au cours de la préparation des échantillons (et des dilutions) les microorganismes

peuvent être inhibés ou même altérés par le changement du milieu lié à
l’addition de diluant (changement de pH mais surtout de force ionique).
 L’effet bactéricide de certains diluants est connu:
 ainsi Staphylococcus aureus est “tué” en quelques heures dans de
l’eau distillée de même que la plupart des entérobactéries (E.coli);
 il en est de même pour Streptococcus pyogenes dans du sérum
physiologique ou dans du Ringer au ¼
 et pour Escherichia coli dans de l’eau salée à 8,5‰.
Actuellement il paraît souhaitable, sauf indication afférente à un type donné
d’aliment, de réaliser les préparations et les dilutions des échantillons à analyser
dans une solution de tryptone sel.
• En absence d’information le choix se fera en fonction de la composition du produit à
analyser: si le produit est riche en protéine et en minéraux,
Ringer ou eau physiologique suffisent et même une solution de phosphate à 2 % et pH 7,4
 dans le cas des fromages frais, crèmes fraîches et caséinates.

 Tous ces diluants sont stérilisés à 121°C pendant 20 minutes.

 Il faut noter que les milieu tryptone-sel et eau peptonée tamponnée permettent, dans
des conditions particulières (température, temps), de réaliser une revivification.
 L’eau peptonée tamponnée est utilisée avec certains produits acides au fort pouvoir
tampon comme les yaourts.
 4.4. La revivification
Les micro-organismes sont souvent “endommagés” mais non tués
 au cours des traitements technologiques (déshydratation, chaleur, froid
etc.) appliqués aux produits alimentaires
 ou par suite de leur vieillissement.
Ces altérations se reflètent dans certaines de leurs propriétés physiologiques en
particulier au niveau
 de leur phase de latence qui est augmentée
 ou de leurs besoins nutritionnels
 ou encore quant à leur sensibilité aux conditions de milieu défavorables
(pH, sels biliaires, colorants, sels etc.).
En général ces altérations sont réversibles et après leur disparition les bactéries
récupèrent leurs propriétés initiales,
en particulier au niveau de leur croissance ou de leur pouvoir pathogène.
 4.4. La revivification LA SUITE

 La nécessité de faciliter le “rétablissement” des cellules ayant subi des

altérations sub-létales,
c’est- à-dire leur “réanimation” ou encore leur revivification, s’impose
avant de les soumettre à des milieux sélectifs.
 En effet, la présence de cellules endommagées peut entraîner
 des variations dans les numérations
 ou porter à croire qu’il n’y a pas ou peu de germes
et donc pas ou aucun risque pour le consommateur.
Ceci est particulièrement important quand il s’agit de déterminer si des
micro-organismes pathogènes ou indicateurs sont présents ou non.
 La revivification en milieu liquide

 La revivification peut être réalisée dès la première étape de l’analyse au

cours de laquelle le produit est additionné de diluant.
 Il suffit alors de choisir un diluant de composition favorable et d’incuber le
tout à la température optimale de croissance du germe à rechercher pendant
un temps qui variera en fonction du type d’analyse réalisé,
 temps qui est le plus souvent voisin du temps de latence du germe
“normal”.
 Si la durée de revivification est supérieure au temps de latence, il se
produira une multiplication des germes non altérés
 ce qui conduira, selon les techniques de numération utilisées par la
suite, à une surévaluation du nombre de germes.
Après cette phase préalable de revivification la numération est réalisable soit en
milieu liquide soit en milieu solide.
Dans les épreuves du type présence ou absence, la revivification est obtenue par un pré-
enrichissement dans un milieu favorable (ex. recherche des Salmonella ).
La durée d’incubation peut être relativement longue car la multiplication des germes à
rechercher est dans ce cas très souhaitable
Dans le cas où la numération des germes doit être réalisée deux autres méthodes sont
encore envisageables :
- Quand la numération est effectuée en milieu liquide, le revivification est réalisable
dans des milieux non sélectifs ensemencés à partir des différentes dilutions.
- C’est à partir de ces milieux que sont ensuite ensemencés les milieux sélectifs (de
tube à tube)
 La revivification en milieu solide
Quand la numération est effectuée sur milieu solide,
 la revivification peut être obtenue par une pré-culture sur une gélose non sélective
favorable avec un temps d’incubation supérieur au temps de latence,
mais ne permettant pas la formation de colonies macroscopiques visibles.
Après revivification, la surface de la gélose est recouverte de gélose
sélective
 Quand la numération est réalisée après filtration sur membrane,
 la membrane sur laquelle se trouvent les germes
 d’abord la membrane est placée à la surface d’un milieu de revivification
pendant un temps permettant éventuellement plusieurs divisions cellulaires
normales
 puis le filtre est placé à la surface d’un milieu sélectif.

A titre d’exemple, les conditions optimales de revivification par cette

méthode de germes « stressés » sont les suivantes:
 5. Techniques de dilution
 Elles nécessitent la présence de nombreux tubes à essais contenant le plus souvent 9 ml de
diluant stérile et de nombreuses pipettes stériles de 1 et 10 ml.
 Les pipettes peuvent être remplacées par des systèmes de pipetage automatique munis de
cônes à usage unique.
 Toutes les manipulations sont à effectuer avec toutes les précautions d’asepsie exigées en
microbiologie.
 L’introduction éventuelle d’un contaminant ou la contamination de l’opérateur doivent
ne jamais se produire.
 Le récipient contenant le liquide à diluer est agité manuellement avec précaution pour
éviter les projections pendant une dizaine de secondes.
 On prélève stérilement 1 ml de ce liquide que l’on introduit dans un tube contenant 9 ml
de diluant stérile.
 Le tube est agité par des mouvements de rotation ou au moyen d’un Vortex.
 On obtient ainsi une dilution au 1/10.
 Avec une nouvelle pipette de 1 ml on prélève 1 ml de cette dilution que l’on introduit dans
un nouveau tube de diluant de 9 ml ;
 on obtient une dilution au 1/100 et ainsi de suite jusqu’au niveau de dilution recherché.