VALORACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE EXTRACTOS Y FRACCIONES OBTENIDAS DEL Divi Divi (Caesalpina spinosa.

CLAUDIA DELGADO DELGADILLO LUISA MARGARITA PLATA CUADROS

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE BARCELONA DIPLOMATURA DE POSTGRADO MEDICINA ANTI ENVEJECIMIENTO BARCELONA JULIO 2011

TABLA DE CONTENIDO Pag.

1. INTRODUCCIN ........................................................................................................... 5 2. MARCO TERICO ........................................................................................................ 7 2.1. ANTIOXIDANTES NATURALES ................................................................................. 7 2.1.2 .Clasificacin Qumica .............................................................................................. 7 2.1.3 Funcionamiento Inhibidores ................................................................................... 9 2.1.4. Accin y Aplicacin ................................................................................................ 10 2.1.5. Mtodo del DPPH .................................................................................................. 11 2.2. GENERALIDADES SOBRE EL ESTRS OXIDATIVO; ANTIOXIDANTES ............... 13 2.2.1 La defensa antioxidante y su relacin con diferentes enfermedades....................... 14 2.3. IMPORTANCIA DE LOS ANTIOXIDANTES DIETARIOS EN LA DISMINUCIN DEL ESTRS OXIDATIVO ...................................................................................................... 15 2.4. ACCIN ANTIOXIDANTE DE LOS FLAVONOIDES................................................. 17 2.5. FLAVONOIDES Y CARCINOGNESIS .................................................................... 19 2.6. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LA CESALPINIA................................................... 20 2.7.DIVIDIVI (CAESALPINIA SPINOSA), GENERALIDADES.......................................... 20 2.7.1 Distribucin geogrfica del Dividivi (Caesalpinia Spinosa ....................................... 21 2.7.2 Descripcin botnica............................................................................................... 21 2.7.3. Composicin qumica ............................................................................................. 22 2.7.4 Actividades reportadas .......................................................................................... 25 2.8. TANINOS VS. CNCER ........................................................................................... 27 2.8.1 Capacidad protectora de cybopogon citratus (dc) stapf ante el dao gentico inducido por estrs oxidativo ........................................................................................... 30 2.9. ACTIVIDAD CAPTADORA DE RADICALES LIBRES Y CITOTOXICIDAD DE PLANTAS COLOMBIANAS DE LA FAMILIA ANNONACEAE .......................................... 31 3. METODOLOGA .......................................................................................................... 33 3.1 OBJETIVO GENERAL ............................................................................................... 33 3.2 OBJETIVO ESPECFICOS ........................................................................................ 33 4. MATERIALES Y MTODOS ........................................................................................ 34 4.1 OBTENCIN DE LOS EXTRACTOS Y FRACCIONES ............................................. 34 CONCLUSIONES PRELIMINARES 37 BIBLIOGRAFA ................................................................................................................ 38

LISTA DE FIGURAS Pag. Figura 1 Oxidacin de hidroquinona Figura 2 Oxidacin d p-aminofenol Figura 3 Oxidacin de , ditiodipropionico Figura 4 Actividad antioxidante Figura 5 Planta de Dividivi Figura 6 Radicales que conforman las estructuras presentes en C.spinosa Figura 7 Estructura propuesta para el cido pentagaloil quinico para C. spinosa Figura 8 Estructuras tpicas de taninos hidrolizables y condensados 8 8 9 12 22 24 25 28

LISTA DE TABLAS Pag. Tabla 1 Composicin de Taninos presentes en Caesalpinia Tabla 2 Compuestos qumicos presentes en Caesalpinia Spinosa Tabla 3 Actividad anticarcinognica de algunos taninos 23 24 28

1. INTRODUCCIN

La medicina ha progresado espectacularmente en el diagnstico y tratamiento de muchas enfermedades, ofreciendo una mayor esperanza de vida. Como resultado de este aumento en la expectativa de vida enfermedades como las cardiovasculares, reumtica, cnceres, demencia senil son cada vez ms frecuentes. Este inconveniente revela que no todo consiste en alargar la vida, sino que es preciso aadir salud y bienestar a los aos, lograr sumar aos sin restar calidad de vida. ste es el objetivo de la medicina del bienestar o anti envejecimiento, ofrecer vivir ms y mejor. A diferencia de las otras condiciones, el envejecimiento afecta a todos los hombres y mujeres del planeta. El envejecimiento es la suma de las alteraciones estructurales celulares y degeneracin de los rganos aparentemente inevitables que ocurren con el paso del tiempo aumentando el riesgo de enfermedad y por lo tanto de muerte. El Dr. Denham Harman, el padre de la teora de los radicales libres, ha definido el envejecimiento como la probabilidad aumentada de muerte cuando aumentan la edad y los cambios fisiolgicos adversos de un organismo, el medio interno celular se altera, las funciones y la estructura de las clulas comienzan a perderse, dejan de aprovechar los nutrientes necesarios de manera adecuada, la capacidad de mantenerse y regenerarse es sobrepasada por los procesos nocivos, conduciendo al envejecimiento de los rganos1. El envejecimiento biolgico est ligado a procesos de oxidacin a nivel molecular originados por la produccin de radicales libres que son tomos o molculas inestables, altamente reactivos que atacan los enlaces de protenas de los tejidos, los fosfolpidos poliinsaturados de las membranas celulares, los carbohidratos, y los cidos nucleicos de las clulas. Al actuar, activan una reaccin en cadena que podra incluso llevar a la muerte celular. La adopcin de una serie de hbitos de vida que minimicen la produccin de estos radicales libres y su neutralizacin mediante tratamientos dietticos y/o farmacolgicos (los denominados antioxidantes) prevendrn y aminorarn los daos producidos en nuestro organismo por esta excesiva oxidacin tanto a nivel celular como a nivel molecular, en protenas, lpidos y ADN. Y en esto se basa, fundamentalmente, la medicina anti envejecimiento: contrarrestar, con una deteccin precoz, el envejecimiento celular, para poder prevenir y corregir

HARMAN Denham, MD, Ph.D.: la investigacin pionera de envejecimiento de cinco dcadas. Salud. Universidad de Nebraska en Omaha. 2003., p. 23

enfermedades, consigue frenar este deterioro vital con tratamientos que disminuyen la produccin de radicales libres. En la actualidad se estn realizando numerosas investigaciones en busca de antioxidantes naturales con la finalidad de ser usados en la industria de alimentos, cosmticos y en la atencin de la salud para prevenir, aliviar y/o curar procesos degenerativos, como consecuencia de la presencia de radicales libres en nuestro organismo. La regin andina y amaznica del pas posee, muchas especies vegetales con reconocida actividad benfica para la salud, gracias a la riqueza en cuanto a la Biodiversidad de la Flora Colombiana y en general de nuestro continente. En el afn de contribuir a la bsqueda de fuentes de antioxidantes naturales se seleccionaron plantas procedentes de estas regiones con el objetivo de determinar las especies vegetales que presentan mayor actividad antioxidante es as como el estudio y la caracterizacin de los efectos farmacolgicos de los extractos de plantas basados en el conocimiento popular, constituye un tema de inters actual en la comunidad cientfica internacional. La medicina tradicional ha sido clsicamente considerada como la medicina de nuestros antepasados, las plantas han sido utilizadas como medicina por cientos de aos. El conocimiento popular con respecto a la actividad farmacolgica de las plantas ha sido la base del descubrimiento de medicamentos ampliamente utilizados en el presente; el uso de plantas en la medicina ha involucrado el aislamiento de componentes activos, comenzando con el aislamiento de la morfina a partir del opio a comienzos del siglo XIX. El descubrimiento de plantas medicinales involucra diversos campos, comenzando con la botnica, etnobotnica y etnofarmacologa, saberes que colectan e identifican las plantas de inters. El reto del pas y de las autoras en particular es el de participar en el fortalecimiento de una comunidad cientfica que busque adaptar los avances de una tecnologa y de la ciencia al estudio de nuestros problemas y con ello favorecer el control de nuestros recursos y la evaluacin de las posibilidades de explotarlos en forma racional, sostenible y en beneficio del pas y de los pacientes. Teniendo en cuenta lo anterior, el objetivo principal del presente trabajo fue evaluar el efecto antioxidante de los extractos y fracciones de Dividivi Caesalpina spinosa mediante una revisin bibliogrfica y en una segunda fase obtener de manera biodirigida extractos y fracciones para ser analizados desde el punto de vista fitoquimico y evidenciar aquel con ms actividad antioxidante.

2. MARCO TERICO

2.1. ANTIOXIDANTES NATURALES

Los antioxidantes estn universalmente distribuidos en el mundo vegetal y animal desempeando un papel importante y esencial en la regulacin de los procesos metablicos en todos los seres vivos. se encuentran tocoferoles que son antioxidantes de tipo fenlico, en pequesimas cantidades en las grasas animales en cantidades que oscilan entre 0.02 y 0.10% en casi todos los aceites vegetales. Hay tambin antioxidantes peculiares de ciertos aceites, como el gosipol en el aceite bruto de la semilla del algodn, por otro lado estn los antioxidantes del caucho bruto los cuales son de dos grupos fenlicos y amino aromticos2. Algunos productos contienen una concentracin de antioxidantes naturales suficientes para ser tiles industrialmente como preservativos entre ellos estn las resinas de guayaco, benju y otras resinas y gomorresinas vegetales, taninos, destilados de la madera dura y destilados de aceites vegetales. Los antioxidantes naturales se han preferido desde hace largo tiempo para proteger alimentos, puesto que, en general su toxicidad es pequea, mientras que los sintticos se usan en la industria del caucho, del petrleo y en una multitud de aplicaciones que tienen estos productos. Algunos antioxidantes usados en la gasolina y caucho se han adaptado con gran xito a los alimentos despus de haberse encontrado que su toxicidad es pequea o absolutamente nula en animales de ensayo y en el hombre3.

2.1.2 .Clasificacin Qumica. En general los antioxidantes son de carcter fenlico o amnico, aunque en algunos casos se usan compuestos con azufre: Compuestos Fenlicos: Son una de las clases de antioxidantes ms importantes de antioxidantes, la hidroquinona es un ejemplo de ellos, esto debido a que se oxida reversiblemente a quinona.

RAYMOND E. Kirk, DONALD F. Othmer Enciclopedia de tecnologa qumica, Tomo II, Primera edicin, Unin topogrfica editorial hispano-americana, Mxico. UTEHA, 1961. 234 p. 3 Ibid., p. 45

Figura 1 Oxidacin de hidroquinona

Fuente: Raymond, E., Donald, F., 1961

Solo son antioxidantes eficaces los polifenoles que tienen dos hidroxilos en posicin orto (o) o para (p). Los compuestos meta (m), que no pueden experimentar la transformacin hidroquinona-quinona, son casi inertes. As, el catecol es un oxidante potente, mientras que el resorcinol no lo es; tampoco lo es el fenol puesto que solo tiene un grupo hidroxilo. Sin embargo los bencenos sustituidos, los compuestos aromticos que contiene ms de un anillo bencnico y los compuestos heterocclicos pueden ser antioxidantes aunque no contengan dos hidroxilos en el ncleo de la molcula, su estructura es comparable a la de los compuestos hidroxilados o- y p- que tienen una configuracin electrnica semejante. Los compuestos de hidroxibenceno pierden su propiedad antioxidante cuando est completamente sustituido el anillo, sin embargo, la sustitucin limitada en el anillo bencnico no perjudica la actividad de algunos compuestos. Por otro lado los compuestos amnicos aromticos antioxidantes son en general, semejantes a los antioxidantes fenlicos, a excepcin que los hidroxilos libres en el ncleo bencnico estn reemplazados totales o parcialmente por aminos, un ejemplo de este grupo es el p-aminofenol que se oxida para dar una quinonimina de manera similar a la hidroquinona, as: Figura 2 Oxidacin d p-aminofenol

Fuente: Raymond, E., Donald, F., 1961

En los que respecta estas dos clases de antioxidantes aromticos, puede decirse que la actividad antioxidante reside principalmente en el ncleo bencnico o- psustituido, y que no puede aumentarse mucho ms por una construccin ms grande de la molcula. 8

Compuestos orgnicos de Azufre: Una tercera clase de antioxidantes potentes son ciertos compuestos orgnicos azufrados, como el cido , -ditiodipropionico en la cual la oxidacin puede suponerse que se produce de la siguiente forma: Figura 3 Oxidacin de , - ditiodipropionico

Fuente: Raymond, E., Donald, F., 1961

Entre los diversos compuestos que se han utilizados como antioxidantes materias no saturadas como aceites, figuran: mono-, di- y trietanolaminas, aminas de azucares y sus derivados, cidos carboxlicos aldehdos compuestos de cianamida y aminocidos alifticos. 2.1.3 Funcionamiento Inhibidores. La auto-oxidacin de molculas orgnicas en fase lquida o en solucin es un proceso en cadena mediante un radical. La iniciacin de la reaccin requiere de la produccin de un radical libre, ya sea por ataque directo del oxgeno, fotoqumicamente o por un agente agregado. La reaccin en cadena comprende tres pasos: iniciacin, propagacin y terminacin, que puede representarse por las siguientes ecuaciones R-H+ iniciador _____ Radical libre R R- +O2___________ROOROO- +R-H_______ROO + RR- + R___________Productos inertes. R-+ ROO___ _____Productos inertes. ROO-+ ROO ____ ___Productos inertes. En donde RH= hidrocarburo, aldehdo, etc. Las reacciones que forman ROO- y ROOH tienden a autoperpetuarse y son los pasos de propagacin de la autooxidacin. Los antioxidantes reaccionan con los radicales libres continuadores de la cadena para formar productos inertes en uno de los pasos de terminacin. Los radicales de perxido ROO- prevalecen posiblemente en este paso terminal, puesto que los radicales libres hidrocarbonatos reaccionan muy fcilmente con oxgeno molecular.

En general, los antioxidantes dan fin a las reacciones de oxidacin en cadena en las formas siguientes: por donacin de un electrn a un radical de perxido, por donacin de un tomo de hidrogeno a un radical de perxido, por adicin a un radical de perxido antes o despus de oxidarse parcialmente y por otro medios donde es posible que intervengan radicales de hidrocarburos en vez de radicales de perxido, sin embargo, estos no se han determinados an. Esto puede generalizarse en varios modos de funcionamiento, unos beneficiosos y otros perjudiciales; el ataque directo del oxgeno sobre el antioxidante puede producir radicales que inicien cadenas de oxidacin, la iniciacin por este medio parece ser ms importante con aminas que con fenoles. El antioxidante puede participar en el paso de propagacin por un mecanismo de transferencia de cadena; las aminas parece ser ms propensas que los fenoles a esto, sin embargo los fenoles son ms activos que las aminas para retardar la oxidacin mediante un mecanismo de interrupcin de la cadena4. Destructores de Perxidos: Otro mecanismo para proteger un sistema contra la oxidacin es la descomposicin cataltica del hidroperxido inicialmente presente en el sistema o formado posiblemente como resultado del ataque directo del oxgeno sobre el sustrato o el inhibidor. Un carcter importante de este proceso de descomposicin es que los productos estables primario no son radicales libres; esto excluye naturalmente que la descomposicin de lo perxido pueda ser debida a metales como cobre, cobalto o hierro. Los compuestos de azufre son los ms efectivos destructores de perxidos, los inhibidores de radicales libres en ausencia relativa de perxidos confieren en general estabilidad por un cierto tiempo que esta aproximadamente en razn directa a su concentracin, mientras que los destructores de perxidos ms de la concentracin.

2.1.4. Accin y Aplicacin. Los radicales libres son protagonistas de numerosas enfermedades que provocan reacciones en cadena, estas reacciones solo son eliminadas por la accin de otras molculas, en estos procesos txicos en el organismo, los llamados sistemas antioxidantes defensivos. En estudios realizados por Ramos, E.; Castaeda, B.; y Ibaez, L. (2008). Se ha demostrado que el organismo posee un nmero de mecanismos a travs de los cuales produce y a la vez limita la produccin de especies reactivas de oxgeno. Un exceso de radicales libres suele iniciar el dao de la pared vascular y en este proceso se encuentra implicado el colesterol LDL; se ha demostrado en la

MATILL HA (1987). Antioxidants. Annu Rev Biochem 16: 177178.

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incidencia de enfermedades cardiovasculares con suplementos individuales de antioxidantes5. Las especies oxignicas reactivas producen diversas acciones sobre el metabolismo de los principios inmediatos, que pueden ser el origen del dao celular. Actan sobre los lpidos poliinsaturados de las membranas celulares, produciendo prdida de fluidez y lisis celular como consecuencia de la peroxidacin lipdica (PL); sobre los glcidos, alterando las funciones celulares tales como las asociadas con la actividad de las interleuquinas y la formacin de prostaglandinas, hormonas y neurotransmisores; sobre las protenas produciendo inactivacin y desnaturalizacin; sobre los cidos nucleicos mediante la modificacin de bases produciendo mutagnesis y carcinognesis. En la actualidad son muchos los procesos relacionados con la produccin de radicales libres como son: mutagnesis, transformacin celular, cncer, arteriosclerosis, infarto de miocardio, procesos de isquemia/reperfusin, diabetes, asfixia de neonato, enfermedades inflamatorias, trastornos del sistema nervioso central, envejecimiento, entre otros. Adems, un creciente nmero de estudios soportan la teora que el estrs oxidativo est envuelto en la progresin de VIH 6; tambin ha sido asociado a la patognesis de muchas enfermedades humanas, es por ello que el uso de antioxidantes en farmacologa es estudiado de forma intensiva, particularmente como tratamiento para accidentes cerebrovasculares y enfermedades neurodegenerativas. Los antioxidantes encuentran muchos usos y aplicaciones; entre los productos estabilizados se encuentran preparados para evitar el eritema solar, aceite de corte, materiales de empaque, formulas anticorrosivos, piensos, soluciones para ondular el cabello, caroteno, concentrados vitamnicos, forrajes, jabones, insecticidas, polmeros, plastificantes, aceites para trasformadores, aceites para turbinas, combustibles industriales y de motores, productos de caucho fabricados con caucho natural y caucho sinttico, parafina, intermediarios de colorantes, aceites esenciales, hortalizas, verduras y frutas rebanadas, envoltura de gelatina para carnes entre otros muchos.

2.1.5. Mtodo del DPPH. Los mtodos de medicin de la actividad antioxidante muestran extrema diversidad; muchos procedimientos usan una acelerada oxidacin involucrando un iniciador para manipular una o ms variables en el sistema de prueba; tales iniciadores incluyen adicin de un metal de transicin
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RAMOS, E.; CASTAEDA, B.; IBAEZ, L. (2008). Evaluacin de la capacidad antioxidante de plantas medicinales peruanas nativas e introducidas. Revista acadmica Per salud. 15 (1), 42-46. 6 KOLEVA, I., VAN BEEK, T., LINSSEN, J., Groot, A., Y EVSTATIEVA, L. (2002). Proyeccin de las plantas y la actividad antioxidante de los extractos: un estudio comparativo de tres mtodos de prueba. Fitoqumica . p. 8-17.

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como catalizador, exposicin a la luz para promover oxidacin fotosensitizada por oxgeno singlete, y fuentes de radicales libres. Por otra parte segn Mosquera, O., Nio, J., Correa, Y., Buitrago, D., (2005). La evaluacin de actividad antioxidante a travs de fuentes generadoras de radicales libres en el sistema de prueba, asume que la oxidacin es inhibida en un alto porcentaje por la captura de estos; por tanto se enfoca en monitorear la capacidad de aditivos y extractos para la captura de radicales o la inhibicin de su formacin. Este es el principio de los mtodos ms modernos de ensayo DPPH (1,1-difenil-2picrilhidrazilo)7. Figura 4 Actividad antioxidante

Fuente: MOSQUERA, O., NIO, J., CORREA, Y., BUITRAGO, D., (2005). Estandarizacin del mtodo de captura de radicales libres para la evaluacin de la actividad antioxidante de extractos vegetales.

El fundamento del mtodo desarrollado por Brand-Willams DPPH, consiste en que este radical tiene un electrn desapareado y es de color azul-violeta, decolorndose hacia amarillo plido por la reaccin de la presencia de una sustancia antioxidante, siendo medida espectrofotomtricamente a 517 nm. Por diferencia de absorbancia se determina el porcentaje de captacin de radical libre DPPH a una concentracin de 20 mg/L8. La solucin del radical libre 1,1-difenil-2-picril-hidrazilo (DPPH*) en metanol se almacena a 0 C, en recipiente mbar recubierto con papel aluminio para mayor proteccin contra luz. Se realiza seguimiento a las reacciones del extracto con la

MOSQUERA, O., NIO, J., CORREA, Y., BUITRAGO, D., (2005). Estandarizacin del mtodo de captura de radicales libres para la evaluacin de la actividad antioxidante de extractos vegetales. Scientia et Technica Ao XI, No 27, Abril 2005. Pag 231-234. 8 CASTAEDA, Benjamn, IBEZ Vsquez, Lucy A. Evaluacin de la capacidad antioxidante de plantas medicinales peruanas nativas e introducidas. Rev Acad Peru, Salud. 15(1), 2008

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solucin de trabajo del radical libre DPPH, a travs de la tcnica fotometra visible9. 2.2. GENERALIDADES SOBRE EL ESTRS OXIDATIVO; ANTIOXIDANTES

Segn estudios realizados por Martnez Coyuela (1995).Los radicales libres de oxgeno causan dao oxidativo y este se ha visto implicado en la etiologa o patologa de ms de cien enfermedades diferentes, entre las que se encuentran distintos tipos de cncer, enfermedades cardacas y vasculares, diabetes y desrdenes neurovegetativos10. Un radical libre es cualquier molcula que contiene uno o ms electrones no pareados 11 . En las clulas aerbicas existen diversas vas que conducen a la produccin de radicales libres derivados del oxgeno. Las fuentes principales son las enzimas asociadas al metabolismo del cido araquidnico, como la cicloxigenasa, la lipoxigenasa y la citocromo P-450. La presencia y ubicuidad de enzimas (superxido dismutasa, catalasa y peroxidasas) que eliminan productos secundarios de la va univalente en las clulas aerbicas sugieren que los aniones superxidos y el perxido de hidrgeno son productos secundarios importantes del metabolismo oxidativo. Las especies de oxgeno reactivo pueden lesionar macromolculas como el ADN, los hidratos de carbono y las protenas. Estas especies de oxgeno citotxico pueden clasificarse en 2 tipos: a) Los radicales libres, como el radical superxido (O 2) y el radical hidroxilo (OH) y b) las especies de oxgeno no radicales, como el perxido de hidrgeno (H2O2), el oxgeno singlete (O1), que resulta una especie muy txica, el peroxinitrito (ONOO) y el cido hipocloroso (HOCL)12. Los radicales inestables atacan componentes celulares causando dao sobre los lpidos, protenas y ADN, los cuales pueden iniciar una cadena de eventos que dan como resultado lesin celular. Estos procesos reductivos son acelerados por la presencia de metales de transicin como el Fe y el Cu y enzimas especficas, como las monoxigenasas y ciertas oxidasas13.

MOLYNEUX, P. (2004). The use of the stable free radical diphenylpicrilhydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity. Songklanakarin J. Sci. Technol., volmen 26 Nmero 2. Pg. 211-219 10 MARTNEZ Coyuela M. Oxygen free radicals and human diseases. Biochemic 1995;77,147-61. 11 Ibid., p 63. 12 ALDERSHVILE J, Ambrosio G, Bays de Luna A, Badimon L, Bertrand ME, Cleand J, et al (1998) Estrs oxidativo (especies de oxgeno reactivo), patologa cardiovascular (Parte I) Eur Cardiol J 1998;3(72): 13 SAHNOUN Z, JAMOUSSIE K, ZEGAL Km. Free radicals and antioxidants:human physiology and therapeutic aspects. Therapics 1997;52(4):251-70.

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Los radicales libres se producen continuamente en el organismo por medio de reacciones bioqumicas de oxidacin-reduccin con oxgeno (REDOX), que tienen lugar por el metabolismo normal de las clulas, por los fagocitos, en una reaccin inflamatoria controlada y tambin en ocasiones, como respuesta a la exposicin de radiaciones ionizantes, rayos ultravioletas, contaminacin ambiental, humo de cigarrillos, hiperxia y exceso de ejercicio e isquemia.

2.2.1 La defensa antioxidante y su relacin con diferentes enfermedades. Los radicales libres son protagonistas de numerosas enfermedades que provocan reacciones en cadena; estas reacciones solo son eliminadas por la accin de otras molculas que se oponen a este proceso txico en el organismo, los llamados sistemas antioxidantes defensivos. Un primer grupo trabaja sobre la cadena del radical inhibiendo los mecanismos de activacin, un segundo grupo neutraliza la accin de los radicales libres ya formados, por tanto detiene la cadena de propagacin. En este grupo pueden encontrarse enzimas detoxificadoras notables como la su-perxido dismutasa y la catalasa, que producen peroxidasas particularmente importantes como la glutatin peroxidasa14. Las enzimas utilizan en su mayora elementos trazas como cofactores para sus reacciones. Muchas de estas molculas las podemos encontrar en la fase lipdica, otras por el contrario son lipofbicas. El sistema antioxidante protege a los tejidos de los efectos de los radicales libres. Los antioxidantes se clasifican en primarios, secundarios y terciarios, en dependencia de su funcin. En el primer grupo, los enzimticos, se encuentran fermentos que protegen al organismo contra la formacin de nuevos radicales libres, entre los que se encuentran: Superxido dismutasa (SOD) que transforma el oxgeno en perxido de hidrgeno. Glutatin peroxidasa (GPX) que convierte el perxido de hidrgeno y los perxidos lipdicos en molculas inofensivas antes de que puedan formar radicales libres. Protenas de unin a metales (GR) que frenan la disponibilidad del Fe, necesario para la formacin del radical OH. En el segundo grupo de antioxidantes, los secundarios no enzimticos hay 2 subgrupos:

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SAHNOUN Z, Jamoussie K, Zegal KM. Free radicals and antioxidants:human physiology and therapeutic aspects. Therapics 1997;52(4):251-70.

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 Antioxidantes hidroflicos: entre los que se encuentran la vitamina C, (ascorbato), cido rico, bilirrubina y albmina. Antioxidantes lipoflicos: entre los que se encuentran la vitamina E (alfatocoferol), carotenoides y las ubiquinonas. Dentro de los antioxidantes terciarios, encargados de reparar bio molculas daadas por los radicales libres se incluyen las proteasas reparadoras de ADN y la metionina sulfxido reductasa. Segn Cespedes-Cabrera, (2000). La defensa antioxidante, enzimtica y no enzimtica protege al organismo contra el dao oxidativo, pero no con el 100 % de eficiencia15. 2.3. IMPORTANCIA DE LOS ANTIOXIDANTES DISMINUCIN DEL ESTRS OXIDATIVO DIETARIOS EN LA

Los antioxidantes obtenidos a travs de la dieta, pueden actuar de dos formas: primero, previniendo la generacin excesiva de radicales libres, evitando as que se produzca el dao celular por efecto del estrs oxidativo. Y segundo, despus de que se ha producido el dao, los antioxidantes pueden controlar los niveles de radicales libres evitando que el dao contine avanzando y con ello algunos sntomas de las enfermedades producidas por el efecto del estrs oxidativo pueden disminuir (Nuttall, et al., 1999; Uttara, et al., 2009). El dao oxidativo puede ser prevenido por molculas antioxidantes, las cuales son capaces de donar electrones para estabilizar a los radicales libres y neutralizar sus efectos dainos, stas pueden ser de origen endgeno (sintetizados por el organismo) y exgeno (provenientes de fuentes externas) (Uttara, et al., 2009). Entre los antioxidantes endgenos, se encuentran: la superxido dismutasa (SOD) que cataliza la dismutacin del O2- para dar origen al H2o2 (Markesbery, 1997),cido tiico o lipoico, los cofactores (cobre, zinc manganeso, hierro y selenio) que son necesarios para la actividad del sistema enzimtico endgeno y la coenzima Q, (Halliwell, 1996; Mohseni Salehi Monfared SS, et al., 2009; Venereo, 2002). Algunos reportes muestran a la terapia antioxidante como una alternativa para prevenir y contrarrestar a las diversas enfermedades asociadas al estrs oxidativo, manteniendo el balance entre la formacin y neutralizacin de los radicales libres (Nutall et al., 1999; Mohseni Salehi Monfared SS, et al., 2009).
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CSPEDES Cabrera Teresita, SNCHEZ Serrano Daniel. Algunos aspectos sobre el estrs oxidativo, el estado antioxidante y la terapia de suplementacin. Rev Cubana Cardiol 2000;14(1):55-60

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Segn (Nuttall, et al., 1999; Uttara, et al., 2009), los antioxidantes obtenidos a travs de la dieta, pueden actuar de dos formas: primero, previniendo la generacin excesiva de radicales libres, evitando as que se produzca el dao celular por efecto del estrs oxidativo. Y segundo, despus de que se ha producido el dao, los antioxidantes pueden controlar los niveles de radicales libres evitando que el dao contine avanzando y con ello algunos sntomas de las enfermedades producidas por el efecto del estrs oxidativo pueden disminuir16. Los efectos nocivos del estrs oxidativo, sobre la salud humana, pueden ser reducidos a travs de la ingesta de antioxidantes dietarios, presentes en diversos alimentos, principalmente las frutas y verduras. Logrando adems un aumento en la esperanza y calidad de vida de las personas. El H2o2 es descompuesto en oxgeno y agua por la catalasa (CT), mediante la siguiente reaccin17 (Agudo, et al., 2007; Murray, et al., 1994; Perl- Treves y Perl, 2002): 2H O2H O + O 2222 La glutatin peroxidasa (GHX), dependiente de selenio que cataliza la reduccin del H2o2 (Cisneros, et al., 1997; Halliwell, 1996). La glutatin (GHS), quien contribuye con la GHX, para reducir el H2o2 a agua (Elejalde, 2001), as mismo neutra- liza al OH cedindole un electrn. Adems recicla antioxidantes como la vitamina C, reducindolos para que puedan continuar neutralizando a los RL (Guido y Aalt, 1983). Por otra parte, los antioxidantes exgenos se encuentran en los alimentos naturales (Tabla i), entre estos estn las vitaminas A, E y C, los b-carotenos, lutena, flavonoides, licopenos, el cido tiico o lipoico, los cofactores (cobre, zinc manganeso, hierro y selenio) que son necesarios para la actividad del sistema enzimtico end- geno y la coenzima Q, (Halliwell, 1996; Mohseni Salehi Monfared SS, et al., 2009; Venereo, 2002). Algunos reportes muestran a la terapia antioxi- dante como una alternativa para prevenir y contrarrestar a las diversas enfermedades asociadas al estrs oxidativo, manteniendo el balance entre la formacin y neutralizacin de los radicales libres (Nutall et al., 1999; Mohseni Salehi Monfared SS, et al., 2009).

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NUTALL, S. L, KENDALL M. J. Antioxidant therapy and the prevention of crdiovacular disease quarterly. Journal of medicine. 1999 p. 239-244 17 AGUDO Cabrera, L. Amiano, P. ARDANAZ, E. BARRICARTE, A. BERENGUER, T. CHIRLAQUE, M.D. DO RRONSORO, M. LARRAAGA, N. MARTNEZ, C. NAVARRO, C. QUIRS, J.R. SNCHEZ, M.J. TORMO, M.J. GONZLEZ, C.pean Prospective Investigation into Cancer and American Journal Clinical Nutrition. 2007 85 -6

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2.4. ACCIN ANTIOXIDANTE DE LOS FLAVONOIDES

La capacidad de los polifenoles vegetales para actuar como antioxidantes en los sistemas biolgicos fue ya reconocida en los aos treinta; sin embargo, el mecanismo antioxidante fue ignorado en gran medida hasta hace poco tiempo. El creciente inters en los flavonoides se debe a la apreciacin de su amplia actividad farmacolgica. Pueden unirse a los polmeros biolgicos, tales como enzimas, transportadores de hormonas, y ADN; quelar iones metlicos transitorios, tales como Fe2+, Cu2+, Zn2+, catalizar el transporte de electrones, y depurar radicales libres. Debido a este hecho se han descrito efectos protectores en patologas tales como diabetes mellitus, cncer, cardiopatas, infecciones vricas, lcera estomacal y duodenal, e inflamaciones. Otras actividades que merecen ser destacadas son sus acciones antivirales y anti alrgicas, as como sus propiedades anti-trombtica y antiinflamatoria. Los criterios qumicos para establecer la capacidad antioxidante de los flavonoides, son: Presencia de estructura O-dihidroxi en el anillo B; que confiere una mayor estabilidad a la forma radi- cal y participa en la deslocalizacin de los electrones. Doble ligadura, en conjuncin con la funcin 4- oxo del anillo C41-42. Grupos3-y5-OHconfuncin4-oxoenlosani- llos A y C necesarios para ejercer el mximo poten- cial antioxidante. Siguiendo estos criterios, el flavonoide quercitina es el que mejor rene los requisitos para ejercer una efectiva funcin antioxidante. Su capacidad antioxidante medida como Trolox es de 4,7 mM, lo que resulta 5 veces mayor al demostrado por las vitaminas E y C y tiene una hidrosolubilidad similar a la de la vitamina E. La funcin antioxidante de la quercitina muestra efectos sinrgicos con la vitamina C. El cido ascrbico reduce la oxidacin de la quercitina, de manera tal que combinado con ella permite al flavonoide mantener sus funciones antioxidantes durante ms tiempo. Por otra parte, la quercitina protege de la oxidacin a la vitamina E, con lo cual tambin presenta efectos sinergizantes. As, se ha demostrado que el flavonoide inhibe la fotooxidacin de la vitamina E en la membrana celular de las clulas sanguneas en presencia de hematoporfirina como fotosensibilizador18.

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BORS W, Heller W, Christa M y cols. Flavonoids as antioxidants: determination of radical-scavenging efficiencies. Methods Enzymol, 1990, 186:343-355.

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Los flavonoides retiran oxgeno reactivo especialmente en forma de aniones superxidos, radicales hidroxilos, perxidos lipdicos o hidroperxidos. De esta manera bloquean la accin deletrea de dichas sustancias sobre las clulas. Sus efectos citoprotectores son, por ejemplo, bien patentes en fibroblastos de la piel humana, queratinocitos, clulas endoteliales y ganglios sensoriales cultivados en presencia de sulfoxina-butionina, un inhibidor irreversible de la glutatin sintetasa. Diversos flavonoides han mostrado su eficiencia para eliminar los procesos de peroxidacin lipdica del cido linolico o de los fosfolpidos de las membranas, la peroxidacin de los glbulos rojos o la autooxidacin de los homogeneizados de cerebro. Asimismo, se ha comprobado su potente capacidad de inhibir in vitro la oxidacin de las lipoprotenas de baja densidad (LDL) por los macrfagos y reducir la citotoxicidad de las LDL oxidadas46, 47. De hecho, las poblaciones que consumen productos ricos en flavonoides estadsticamente presentan menores riesgos de afecciones cardiovasculares. En estudios epidemiolgicos se ha demostrado que con el consumo incrementado de frutas y vegetales se experimenta una reduccin del 50% en el riesgo de cnceres digestivos y de las vas respiratorias. As, la gensteina bloquea el desarrollo de tumores al prevenir la formacin de nuevos vasos impidiendo con ello la llegada del oxgeno y nutrientes a las clulas neo tumorales. Tambin modula la reaccin de los estrgenos ligndose a sus receptores con lo que disminuye el riesgo de cncer de mama. De hecho, se ha puesto de manifiesto que diversos flavonoides pueden inhibir monooxigenasas dependientes del citocromo P-450, lo que indicara un papel potencial en la regulacin de la activacin de carcingenos y que chalconas y flavononas en concreto son inductoras de las quinonas reductasas y podran tener un papel preventivo en la progresin de los hepatomas19. Los flavonoides protoantociandicos pueden ser absorbidos por las membranas celulares y protegerlas de la accin de los radicales libres. Tienen la ventaja de ser liposolubles e hidrosoluble. Por eso, en contraste con otros antioxidantes que no poseen esa doble cualidad, son capaces de atravesar la barrera hemto enceflica y pueden proteger a las clulas cerebrales, que son muy sensibles a las lesiones producidas por los radicales libres. Adems combaten la inflamacin y las alergias y aumentan la efectividad de las clulas natural killer del sistema inmunolgico20. La capacidad antioxidante de los flavonoides depende, entre otros factores, de su capacidad de eliminar el hierro, y de hecho se ha comprobado recientemente en clulas U937 tratadas con el agente txico terbutilhidroperxido
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http://www.arbolmaguey.com/es/producto/contenido-y-beneficios/compuestos-fenolicos-y-flavonoides Consulta realizada 15 de Junio de 2011 20 PALOU A y SERRA F. 2000. Perspectivas europeas sobre alimentos funcionales. Alimentacin, Nutricin y Salud. 7 (3): 76-9 Zeisel S. 1999. Regulation of "nutraceuticals". Science 285: 1853-1855.

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que aun a muy bajas concentraciones son capaces de evitar la rotura y la oxidacin del ADN y que una parte importante de su potente accin protectora est relacionada directamente con su lipofilicidad21. 2.5. FLAVONOIDES Y CARCINOGNESIS

Un nmero creciente de sustancias naturales se han identificado como moduladoras del proceso de carcinognesis; entre ellas se encuentran los flavonoides que han demostrado poseer efectos antimutagnicos y anticarcinognicos. Diversos datos experimentales han demostrado la accin anti proliferativa y anti- carcinognica, as como el papel de agente quimio preventivo de los flavonoides22. Entre los numerosos fenmenos que tienen lugar durante el proceso carcinognico y que ofrecen opcin para la modulacin mediante factores externos, se encuentran la formacin de metabolitos carcingenos, que se forman por la accin de enzimas citoslicas y microsmicas. Estas enzimas controlan este paso crtico en el proceso carcingeno. Estudios in vivo e in vitro han demostrado que los flavonoides pueden modular su actividad. En experimentos in vitro se ha confirmado el papel protector de la quercitina, la cual ejerce efectos de inhibicin frente a clulas cancergenas en humanos: en colon, glndula mamaria y ova- rio, en regin gastrointestinal y en la leucemia. Una posible explicacin a estos efectos anticancergenos podra derivarse del incremento que algunos flavonoides producen en las concentraciones intra celulares de glutatin a travs de la regulacin de la expresin de la enzima limitante en su sntesis. Asimismo, en lo que respecta a la prevencin del cncer de mama, podra deberse a su potente capacidad de inhibir la actividad de la aromatasa evitando de esta forma la conversin de andrgenos en estrgenos. No obstante, los flavonoides no constituyen un grupo homogneo de compuestos y las mismas propiedades que caracterizan su actividad antioxidante, determinan que puedan presentar efectos pro-oxidantes. Los mecanismos moleculares que determinan la actividad de los flavonoides en ese sentido, se basan en la formacin de un radical aroxilo lbil o de un complejo flavonoide hierro redox lbil. En el primer caso, la autooxidacin del radical aroxilo genera anin superxido (0 -) que, siguiendo la secuencia conocida, genera el daino radical hidroxilo (HO.). Estos mecanismos pueden constituir la base de las acciones mutagnicas y citotxicas descritas para algunos flavonoides.
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AMERICAN DIETETIC ASSOCIATION. Position of the American Dietetic Association: Functional Foods. J. Am. Diet. Assoc.1999: 1278-1285. 22 BORS W, Heller W, Christa M y cols. Flavonoids as antioxidants: determination of radical-scavenging efficiencies. Methods Enzymol, 1990, 186:343-355.

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Debe destacarse que las propiedades pro-oxidantes y mutagnicas de los flavonoides se hallan unidas a la accin de eliminar radicales libres que tienen estos compuestos. Sin embargo, lo que determina el carcter antioxidante o prooxidante de esta reaccin inicial es, como ya se mencion previamente, la estabilidad/labilidad redox del compuesto radical formado a partir del flavonoide original. La autotooxidacin del radical aroxilo o la formacin de compuestos ternarios entre el ADN, el cobre y los flavonoides, son posibles explicaciones de la mutagenicidad mediada por los flavonoides.(Yoshida M, Sakai T y Hosokawa N ). 2.6. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LA CESALPINIA

En los ltimos aos la atencin se ha enfocado en el rol de la bio transformacin de molculas en metabolitos altamente activos los cuales inician toxicidad celular. Muchos componentes incluyendo drogas tiles en la clnica pueden causar dao celular, mediante la activacin celular de especies altamente reactivas qumicamente como son los radicales libres, carbonos y nitratos CCl4 han sido probablemente estudiados ms exhaustivamente bioqumicamente y patolgicamente ms que cualquier otra hpato toxina. Estos radicales tricomertilos mostraron ser altamente reactivos, capaces de atacar lpidos microsomales llevndolos a peroxidacin. Esto convalida procesos bioqumicos secundarios los cuales en ltimas la causa del desarrollo de un panorama de consecuencias patolgicas del metabolismo de CCi4 (Wei, 1998). Caesalpinia digyna es tradicionalmente utilizada para el tratamiento de la diabetes y de enfermedades de origen inflamatorio, los radicales libres ROS son la causa de estas enfermedades free radical y lo antioxidantes de naturaleza CDM comprobados en este estudio pueden tal vez en parte contribuir a esta actividad. El estudio tambin arroja pruebas y usos etno mdicos y su relacin con la etno farmacologa de estas especies. En conclusin el presente estudio revela claramente que los CDM tiene potentes in vitro radicales libres y muestra una actividad antioxidante inhibiendo la peroxidacin y aumentando los niveles de las enzimas antioxidantes tales como SOD y CAT in CCl4, se continan realizando estudios que nos lleven a aislar la fraccin indicada que contenga el principio activo responsable de esta accin antioxidante.. (Antioxidant activity of Caesalpinia digyna root, 26 June 2007) 2.7.DIVIDIVI (CAESALPINIA SPINOSA), GENERALIDADES

A continuacin se presentan las caractersticas del Dividivi (Caesalpinia Spinosa)

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 Droga o parte utilizada: frutos deshidratados y pulverizados deCaesalpinia spinosa (Molina) Kuntze. Nombre cientfico actualizado: Caesalpinia spinosa (Molina) Kuntze Sinnimos: Tara victoria Molina, Poinciana spinosa Molina, Tara spinosa (Molina) Britton & Rose. Clasificacin taxonmica (Cronquist, 1981). Reino: Vegetal Subreino: Spermatophyta Divisin o phyllum: Magnoliophyta Clase: Magnoliopsida (dicotiledneas) Sub clase Rosidae Orden: Fabales Familia: Caesalpiniaceae Gnero: Caesalpinia Especie: Caesalpinia spinosa (Molina) Kuntze.

2.7.1 Distribucin geogrfica del Dividivi (Caesalpinia Spinosa). En Colombia est presente en climas fros (18-24 C) y bosque seco premontano (bs-PM), con un promedio anual de lluvias de 500 a 1.000 mm. y pertenece a la subregin o provincia de humedad Subhmedo. (Espinal, 1972).

2.7.2 Descripcin botnica. Arbolito de 3-5 m., o rbol hasta de 10 m. de alto, muy ramificado casi desde la base, espinas fuertes, agudas, rojizas de 4 mm. de largo hojas 8-pinnadas, 9-13 cm. de largo, ssiles, raquis leoso puberulento, rojizo, con espinas a cada lado de la insercin de las pinnas, 2mm. de largo; pinnas oblongo- elpticas, glabras, brillantes con el nervio medio muy pronunciado, pice redondeado, marginado, base decidua 2.5-3.6 mm. de largo, 1-1.5 cm. de ancho; inflorescencia racimosa, 16 cm. de largo, con muchas flores vistosas, primeramente amarillas luego toman un color rojizo; cliz tubular pubrulo con los segmentos obtusos cortamente aserrados, 3 mm. de largo; pedicelos puberulentos 21

5 mm. de largo, articulados; ptalos con filamento pubescente, pistilo ms largo que los estambres; fruto oblongo ligeramente falciforme, indehiscente, membranoso con exocarpo amarillo rojizo, liso, mesocarpo esponjoso arenoso (muy rico en protenas) 4-6 semillas, aovadas, con el funculo hendido, linear, testa dura de cloro marrn, 13 mm. de largo, 8 mm. de ancho con el arilo dulce (Garca Barriga, H. 1975). Figura 5 Planta de Dividivi

Fuente: www.backyardnature.net

Tal como se puede observar en la figura anterior la planta presenta la siguiente conformacin fisiolgica: Oblonga: rganos (hojas, frutos, etc.) de forma alargada, la base ms ancha que el pice, generalmente agudo. Falciforme: en forma de media luna. Indehiscente: no abre (para expulsar o dejar expuestas las semillas) en la madurez. Exocarpo: tejido o capa externa del fruto. Mesocarpo: tejido interno medio correspondiente a la pulpa de los frutos carnosos. Aovadas: en forma de huevo, ovoide. Funculo: filamento que une la placenta del fruto a las semillas Arilo: excrescencia o tejido jugoso que se adhiere a las semillas como p. e. en el fruto de la curaba.

2.7.3. Composicin qumica. La mayora de los autores reportan la presencia de taninos en los frutos de Caesalpinia spinosa (Garca Barriga, Glasby). Galvez y col

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en 1997 encontraron por el mtodo de Hide-powder (mtodo basado en la afinidad que tienen los taninos por las protenas) que los frutos de sta especie contienen un 59.7% de taninos. Por otra parte, por el mtodo de Stiasny (mtodo que se basa en la capacidad que tienen los compuestos con estructuras tipo flavonoides de reaccionar con el formaldehdo) encontraron un contenido de taninos igual a 25.5%. Adicionalmente, por mtodos espectrofotomtricos, hallaron el contenido de galotaninos y elagitaninos. El resumen de estos resultados se muestra en la tabla 1. Tabla 1 Composicin de Taninos presentes en Caesalpinia

Fuente Analytical Studies on Tara Tannins, Galvez et al (1997 )

En siguiente tabla figura se enumeran los compuestos qumicos, especificando los radicales que conforman su estructura (Rn) y la masa molecular (M), reportada por Clifford y Col en el 2007.

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Tabla 2 Compuestos qumicos presentes en Caesalpinia Spinosa

Figura 6 Radicales que conforman las estructuras presentes en C.spinosa

Por otra parte, es importante destacar que Parr y Col reportaron la presencia de un cido pentagaloil quinico y propusieron la siguiente estructura qumica con una figura:

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Figura 7 Estructura propuesta para el cido pentagaloil quinico para C. spinosa

2.7.4 Actividades reportadas. Se ha reportado que el extracto etanlico de los frutos de C. spinosa presenta actividad antimicrobiana tanto en bacterias gram positivas como gram negativas. Entre las bacterias gram positivas se encuentran Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis y Staphylococcus epidermidis y frente a las gram negativas Bacteroides fragilis. (Kloucek, 2005). De igual forma, en la especie Caesalpinia mimosoides se han obtenido algunas fracciones con actividad antimicrobiana. (Chanwitheesuk, 2007). Adicionalmente, est misma actividad tambin ha sido demostrada para cuatro galatos del cido qunico aislados del dividivi, y se demostr que estos compuestos intensificaron la susceptibilidad del Staphylococcus aureus a la oxacilina. (Kondo, 2006). De acuerdo con Gali-Muhtasib y col (2000), taninos hidrolizables extrados de los frutos de C. spinosa disminuyeron significativamente los marcadores bioqumicos asociados a cncer de piel inducido por radiacin UV-B. Tambin se ha reportado actividad antitumoral del cido glico y del metil- galato aislados de Caesalpinia ferrea (Nakamura, 2002).

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Un gran nmero de propiedades han sido descritas para el cido glico: antioxidante, antialrgico, antimutagnico, anticarcinognico y antiinflamatorio. (Gandhi, 2005) Serrano y col en 1998, encontraron que el cido glico y sus derivados (metil, propil, octil y lauril esteres) inducen apoptosis en diversas lneas celulares tumorales dentro de las cuales se mencionan diferentes tipos de leucemias, linfomas y mielomas. Adicionalmente, se ha reportado actividad importante para los metil, propil y octil esteres del cido glico, sobre la lnea celular tumoral HeLa (Adenocarcinoma de crvix humano) y su relacin estructuraactividad (Fiuza, 2004). 17 Estudios encaminados a determinar la actividad antitumoral del cido glico y sus derivados (esteres) han demostrado su efecto citotxico sobre la lnea celular tumoral L1210 (Leucemia) segn ensayos de MTT e induccin de apoptosis segn ensayos de fragmentacin del DNA en geles de agarosa. (Locatelli, 2008). Los cuales se enuncian a continuacin: BRUNETON, J. 1991. Elementos de fitoqumica y farmacognosia. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa. p.p. 177-184. CASCALES, M. 2003. Bases moleculares de la apoptosis. Real Acad Nal Farm. 69:36-59. CASTAEDA, D.M. 2006. Evaluacin de la actividad inductora de apoptosis de los extractos obtenidos a partir de Petiveria alliacea sobre lneas de clulas tumorales. Tesis de pregrado. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Bogot, Colombia. 83p. CHANG, H., Yang, X. 2000. Proteases for cell suicide: Functions and regulation of caspasas. Microbi Mole Biol Rew. 64:821-846. CHANWITHEESUK, A., Teerawutgulrag, A., Kilburn, J.D., Rakariyatham, N. 2007. Antimicrobial gallic acid from Caesalpinia mimosoides Lamk., Food Chemistry. 100: 1044-1048. CHUNG, K., Wong, T.Y., Wei, C., Huang, Y., Lin, y. 1998. Tannins and human health: A review, Critical reviews in food science and nutrition. Taylor & Francis. 38:6, 421-464. CLIFFORD, M.N., Stoupi, S., Kuhnert, N. 2007.Profiling and characterization by LC-MSn of the galloylquinic acids of green tea, tara tannin, and tannic acid. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55:2797-2807. COOPER, G. 2007. The cell: A molecular approach. Tercera edicin. Captulo 15: 631-667. CRONQUIST, Arthur. 1981. An integrated system of classification of flowering plants. The New York Botanical Garden, Columbia University Press. N. Y, USA. MOLINA Kuntze. VALORACIN DE LA ACTIVIDAD ANTITUMORAL DE EXTRACTOS Y FRACCIONES OBTENIDAS DE Caesalpinia spinosa SOBRE DIFERENTES LNEAS CELULARES TUMORALES POMBO Ospina Luis Miguel,trabajo de grado presentado como requisito para obtener el ttulo de MAGISTER EN CIENCIAS BIOLGICAS

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 Pontificia Universidad Javeriana Facultad de Ciencias Bsicas Programa de Postgrado Bogota D.C Junio De 2008 2.8. TANINOS VS. CNCER

Segn (Harborne, 1995) los taninos son compuestos fenlicos ampliamente distribuidos en plantas vasculares, su presencia en angiospermas esta asociada con materiales leosos23. Por definicin, estos compuestos tienen la capacidad de reaccionar con protenas, formando copolmeros insolubles en agua. Debido a esa propiedad, se utiliza en los procesos de curtiembre para obtener cueros a partir de pieles frescas. Por otra parte, segn (Bruneton, 1991), la combinacin entre los taninos y las macromolculas se establece, probablemente, por intermedio de enlaces por puente de hidrgeno entre los grupos fenlicos de los taninos y determinados lugares de las protenas y otros polmeros 24 . Qumicamente, existen dos tipos principales de taninos: taninos condensados y taninos hidrolizables. Ambos tipos de taninos son distribuidos desigualmente en el reino vegetal. Los taninos condensados estn presentes universalmente en helechos y gimnospermas y distribuidos entre las angiospermas, especialmente en rboles y arbustos. En contraste, la presencia de los taninos hidrolizables se limita a las plantas dicotiledneas (Harborne, 1995). Este tipo de taninos estn determinados de acuerdo con las siguientes caractersticas: diversidad estructural, los taninos hidrolizables se basan en la unidad estructural fundamental del cido glico y se encuentran en forma de esteres con la D-glucosa (galotaninos). Derivados del cido hidroxidifnico se conocen como elagitaninos; distribucin taxonmica, restringida a plantas leosas y herbceas dicotiledneas; acumulacin y almacenamiento, su presencia es caracterizada regularmente por acumulaciones substanciales de metablicos particulares en ciertos tejidos: por ejemplo se concentran en las hojas frescas de Rhus typhina y en las hojas jvenes de Camellia sinensis. Por otra parte, la estructura de los taninos condensados se basa en la unidad fundamental del flavan-3-ol (catequina) y existen como oligomeros (solubles en agua), conteniendo de dos a diez unidades de catequinas o como polmeros insolubles en agua (Haslam, 2007). En una revisin realizada por Chung y col en 1998, sobre taninos con actividad antitumoral, se encontr que los individuos japoneses que consumen t verde con alguna frecuencia, tienden a tener menor riesgo de sufrir cncer gstrico. El efecto inhibidor del t verde, rico en compuestos polifenlicos, ha sido bien estudiado. Se
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HARBORNE, J.B. 1995. An overview of antinutritional factors in higher plants. Edited by J.C. Caygill and I. Mueller-Harvey. Nottingham University Press, U.K. pp. 7-16. 24 BRUNETON, J. 1991. Elementos de Fitoqumica y de Farmacognosia. Acribia. Zaragoza, Espaa. 594 p.

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ha encontrado, in vivo, que extractos ricos en esos compuestos presentan actividad frente a diferentes tipos de tumores como esofgico, de coln, de pncreas, de hgado y duodenal, entre otros. As mismo, se ha demostrado que el cido tnico (galotanino), es inhibidor de la formacin de tumores, ya que disminuy el nmero de tumores por ratn y el porcentaje de ratones con tumores, empleando un modelo con DMBA (dimetilbenzantraceno) como promotor tumoral. Adems, ha reportado que la aplicacin tpica de cido tnico inhibi de manera dosis dependiente, la actividad ornitina descarboxilasa, actividad relacionada con la formacin de tumores en la epidermis de ratones donde los tumores fueron inducidos por TPA (12-Otetradecanoilforbol-13-acetato). De igual forma, se demostr que la aplicacin tpica del cido tnico inhibi la carcinognesis inducida por luz ultravioleta, en ratones BALB/cAnNTacfBR. En la tabla 3 se resume la actividad anticarcinognica de algunos taninos y fuentes de taninos. Tabla 3. Actividad anticarcinognica de algunos taninos

Figura 8 Estructuras tpicas de taninos hidrolizables y condensados

Fuente: Chung et. al. (1998)

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Yang y col en el 2000, encontraron que dos taninos hidrolizables (1-O-galoil castalagina y casuarinina) aislados del extracto de acetona al 70% de la planta Eugenia jambos, presentaron citotoxicidad frente a las lneas celulares tumorales HL-60 (leucemia humana) y SK-HEP-1 (adenocarcinoma humano). Mediante citometra de flujo demostraron la presencia de clulas apoptticas y una disminucin de la poblacin celular en la fase G2/M, principalmente en la lnea HL60. En el 2005, Pellegrina y col reportaron que una fraccin fenlica obtenida de semillas de Oenothera biennis compuesta en un 55% de cido glico, presentaba actividad antitumoral en diferentes lneas celulares tumorales como las K562 (eritroleucemia humana) y Molt3 (leucemia de clulas T). En estas clulas la fraccin induca apoptosis activando principalmente las caspasas 1 y 8 (Pellegrina et al, 2005), tal como se ha sido reportado previamente por otros autores. Adicionalmente, se ha demostrado que el cido glico induce muerte celular o detencin del ciclo celular en una amplia variedad de clulas tumorales por diferentes mecanismos dependiendo del tipo celular (Serrano et al, 1998). Trabajos recientes desarrollados por Larrosa y col en el 2006, donde compararon la actividad de 2 compuestos, un elagitanino llamado PUNI (promegranato punicalagino) y el cido elgico libre (AE), demostraron que el PUNI puede ser considerado un precursor apopttico tras la liberacin del AE, producto de la hidrlisis de este. El AE entra a las clulas y es metabolizado para producir diferentes derivados dimetil-cido elgico. El cido elgico provoca diferentes efectos sobre clulas Caco2 (cncer de colon humano), entre las que se incluyen una disminucin en la expresin de la ciclina A y B1 y una sobre-expresin de ciclina E con detencin del ciclo celular en la fase S e induccin de apoptosis va intrnseca a travs de la disminucin de Bcl-xL con liberacin de citocromo c al citosol y activacin de caspasa 9 y 3. Adicionalmente no se evidenci alteracin alguna en clulas de colon normal CCD-112CoN. (Larrosa et al, 2006). Como se mencion anteriormente, la metstasis es una de las principales caractersticas del cncer y es un proceso de mltiples pasos. Molculas claves en la regulacin e invasin de la metstasis son las metaloprotenasas (MMP). En los ltimos aos las MMPs han sido de gran inters para los investigadores debido a su funcin en el desarrollo, reproduccin e inflamacin de varias enfermedades. Es por esto que el grupo de Ho L y col, se ha interesado en estudiar el efecto de un polifenol llamado penta-O- galloyl-h-D-glucose (5GG). Este 5GG inhibi la invasin de clulas de melanoma in vitro, suprimiendo la activacin de factores de transcripcin como el AP-1 en el ncleo lo que conduce a una disminucin en la transcripcin de MMP-9 y en la traduccin de la misma. De igual forma el 5GG disminuye la adhesin de la fibronectina y laminina, colagenasa tipo IV y vitronectina. Estos resultados sugieren que el 5GG puede tener un importante papel en el tratamiento de la metstasis del cncer (Li-Lun Ho et al, 2002).

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2.8.1 Capacidad protectora de cybopogon citratus (dc) stapf ante el dao gentico inducido por estrs oxidativo. Se estudi el efecto protector de una decoccin de las hojas de la planta Cymbopogon citratus (DC.) Stapf. (caa santa o caa de limn) frente al dao gentico inducido por los agentes oxidantes H2O2 y etilnitrosourea (ENU). Se utiliz para ello un modelo experimental in vitro y otro in vivo: cultivo de clulas de ovario de Hamster chino (CHO) y el insecto Drosophila melanogaster, respectivamente. La capacidad de formar colonias de la lnea celular CHO, fue el indicador de toxicidad utilizado para evaluar 5 concentraciones (0,1; 1; 5; 10; 15 %) de la decoccin de caa santa, en tanto que el porcentaje de sobrevivencia de adultos se us para evaluar el efecto txico de 4 concentraciones de esta (5; 25; 50; 100 %) sobre las larvas mwh + / + flr3 de Drosophila melanogaster; en ambos casos los resulta- dos evidenciaron efectos txicos dependientes de las concentraciones utilizadas. Los estu- dios citofluorimtricos con diclorofluorescena-diacetato en clulas CHO permitieron demostrar la capacidad antioxidante de la decoccin de caa santa. Dosis no txicas de 0,1; 1 y 5 % produjeron reducciones significativas del estrs oxidativo causado por el H2O2. La genotoxicidad y antigenotoxicidad de diferentes concentraciones de la decoccin fueron evaluadas mediante los ensayos de aberraciones cromosmicas en clulas CHO y el SMART de alas de Drosophila melanogaster. Los resultados de actividad mutagnica obtenidos fueron negativos, en tanto que los correspondientes a la accin protectora de las concentra- ciones probadas reafirmaron la capacidad antioxidante mostrada por el extracto vegetal25. Descriptores DeCS: ESTRS OXIDATIVO; DAO DEL ADN; ANTIOXIDANTES/ uso teraputico; PLANTAS MEDICINALES/uso teraputico; MEDICINA HERBARIA; CRICETULUS/gentica; DROSOPHILA MELANOGASTER/gentica; MODELOS BIO- LGICOS26. Paralelo a la evaluacin del riesgo gentico al que el hombre est expuesto, las investigaciones actuales estn dirigidas a la bsqueda de agentes quimiopreventivos naturales,1 inocuos, baratos, y de preferencia, que provengan de fuentes dietticas accesibles al hombre. Muchos mutgenos y carcingenos conocidos actan a travs de mecanismos oxidativos que daan al ADN; consecuentemente, existen reportes de antioxidantes naturales capaces de minimizar los efectos de los compuestos genotxicos: vitaminas, minerales, fenoles y aceites esenciales, han demostrado efectos inhibitorios sobre la genotoxicidad, tanto en ensayos in vivo como in vitro 27.

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SNCHEZ-LAMAR ngel, FONSECA Gladys, BALUJA Ligia y BORGES Ernesto. Capacidad protectora de Cymbopogon citratus (DC.) Stapf. ante el dao gentico inducido por estrs oxidativo. 2001 - 11 p. 26 GREENBERG ER. A clinical trial of Beta carotene to prevent basal-cell and squamous-cell cancers of the skin. N Engl J Med 1990;323:789-95. 27 HARTMAN PE, Shankel DM. Antimutagens and anticarcinogens. Environ Mol Mutagen 1990;15:145-82.

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Una de las plantas medicinales ms utilizadas en Cuba, por sus mltiples usos teraputicos y por su sabor agradable como bebida, es la caa santa o caa de limn (Cymbopogon citratus [DC.] Stapf.) 28 . La decoccin de sus hojas no ha mostrado efectos txicos, genotxicos ni teratognicos en diferentes modelos biolgicos, en tanto que s ha evidenciado efecto protector frente al agente alquilante de nitrgenos metilmetanosulfonato (MMS)29. Por lo tanto, el presente trabajo tuvo como objetivo evaluar la capacidad antioxidante de la decoccin de caa santa y su efecto protector del ADN frente al dao inducido por el agente oxidante H2O2 y el agente alquilante de oxgenos, etilnitrosourea (ENU). La capacidad inhibitoria de la caa santa sobre la induccin de los eventos genticos medidos por el ensayo mosaico del ala de Drosophila melanogaster, especficamente de los eventos mutacionales, qued demostrada con la reduccin de los porcentajes de las frecuencias de manchas totales en los cotratamientos aplicados respecto al control positivo utilizado. ENU es un potente alquilante de tomos de oxgeno causante de lesiones mutagnicas, lo que concuerda en este experimento con frecuencias incrementadas de manchas simples en relacin con los controles negativos; por lo tanto, los porcentajes de reduccin de manchas simples y totales, obtenidos con los tratamientos respecto a ENU a las 2 concentraciones probadas, sugieren que la proteccin de la caa santa al ADN podra realizarse haciendo que las posiciones de oxgenos sean menos accesibles a la alquilacin por ENU, reaccin que por dems, debe involucrar una oxidacin- reduccin para la formacin de los aductos causantes de los eventos mutacionales30. Estos resultados ratifican y amplan las propiedades antigenotxicas de esta especie vegetal, que han sido reportadas por otros autores y permiten inferir que uno de los posibles mecanismos antigenotxicos de la caa santa est en relacin con su accin antioxidante 2.9. ACTIVIDAD CAPTADORA DE RADICALES LIBRES Y CITOTOXICIDAD DE PLANTAS COLOMBIANAS DE LA FAMILIA ANNONACEAE

La actividad captadora de radicales libres de 53 extractos de diferente polaridad pertenecientes a especies de la familia Annonaceae fue evaluada por el mtodo del DPPH (2,2-difenil-1-picryl hidra- zil). Se calcul el porcentaje de decoloracin del radical DPPH midiendo el cambio en la absorbancia a 517 nm; determinndose para cada extracto la EC50 (concentracin de extracto necesaria
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MIRANDA M. Programa nacional de plantas medicinales. Rev Cubana Farm 1995;30:95. TJIO JH, PUCK T. gentica de mamferos II clulas. Constitucin cromosmica de las clulas en cultivo de tejidos. J Exp Med 1958; 108:259-68. 30 SNCHEZ-LAMAR ngel. Op. Cit., Capacidad protectora de Cymbopogon citratus., p. 10 - 11

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para decolorar el ra- dical DPPH en un 50%)31. En general fueron ms activos los extractos metanlicos, indicando que los metabolitos con mayor actividad captadora de radicales libres presentan alta polaridad. Adicionalmente fue evaluada la citotoxicidad de los extractos sobre lneas celulares U-937 (promonocitos humanos) y se obtuvieron los respectivos valores de CL50 (Concentracin Letal 50). Algunos extractos con alto poder para es- tabilizar radicales libres mostraron menos citotoxicidad que los controles utilizados, hidroxitolueno butila- do (BHT) y silimarina32. El estudio logr comprobar que en las especies analizadas de la familia Annonaceae, los metabolitos con mayor actividad captadora de radicales libres son de carcter polar y que por su parte los agentes responsables de la citotoxicidad son, generalmente, no polares33. Por lo tanto, la utilizacin de alguna de estas plantas para un estudio que pretenda aislar sus componentes activos con potencial actividad antioxidante, puede partir de la preparacin de un extracto alcohlico de la parte area (tallos y hojas). De los 58 extractos evaluados 12 se consideran muy promisorios debido a su alta actividad captadora de radicales libres (EC50 menor de 50 ug/ml) comparados con los controles utilizados, de tal manera que se justifica su fraccionamiento con el fin de encontrar los metabolitos responsables del efecto o comprobar la existencia de un sinergismo entre ellos34. Los resultados obtenidos en el presente estudio hacen ver estos extractos como fuente de futuras investigaciones que amplen la evidencia en cuanto a su actividad antioxidante y vislumbren posibles aplicaciones. Se demostr, una vez ms, que la tcnica del DPPH es rpida, y que puede ser utilizada para la evaluacin de la actividad captadora de radicales libre en matrices complejas como los ex- tractos vegetales. La familia Anonceae, segn la literatura consultada, presenta importancia teraputica da- da su actividad biolgica relacionada principal- mente con acciones antiparasitarias y antitumorales 17-23. En el presente trabajo se evidencia adicionalmente en forma novedosa el potencial antioxidante de especies de esta familia, lo cual podra ser de gran importancia en la bsqueda de sustancias activas contra patologas causadas por radicales libres35.

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JIMENEZ, Nora. LONDOO,Julin. ARANGO Gabriel J. Actividad Captadora de Radicales Libres y Citotoxicidad de Plantas Colombianas de la Familia Annonaceae. Grupo de Investigacin en Sustancias Bioactivas, Facultad de Qumica Farmacutica, Universidad de Antioquia, Medelln, Colombia. 2005. 337 p. 32 Ibid., p. 340 33 PRYOR, W.A. & B. Frei (2004) Natural Antioxidants in Human Health and Disease; Ed. Academic press: Londres, pgs 1-62. 34 AMES, B N., M.K. Shigenaga & T.M. Hagwn (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 7915-22. 35 JIMENEZ, Nora. Actividad Captadora de Radicales Libres y Citotoxicidad de Plantas Colombianas de la Familia Annonaceae Op. Cit. P. 340.

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3. METODOLOGA

Desde el punto de vista metodolgico a continuacin se presenta el objetivo general y objetivos especficos de este estudio. 3.1 OBJETIVO GENERAL

Valorar la actividad antioxidante de extractos vegetales y fracciones obtenidas de Dividivi. Caesalpinia spinosa 3.2 OBJETIVO ESPECFICOS

Teniendo en cuenta el objetivo general a continuacin se desglosan los objetivos especficos: Analizar desde el punto de vista fitoqumico la fraccin que tenga ms actividad antioxidante. Establecer mediante una revisin bibliogrfica, los antecedentes relacionados con la actividad antioxidante de los polifenoles, en particular los del extracto de dividivi. Obtener, en una segunda fase de este trabajo, de manera bio-dirigida, extractos y fracciones para valorar su actividad antioxidante.

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4. MATERIALES Y MTODOS

4.1 OBTENCIN DE LOS EXTRACTOS Y FRACCIONES

Los frutos frescos de Caesalpinia spinosa sern recolectados en la poblacin de Villa de Leyva, Boyac, regin que se encuentra a una altura aproximada de 2.143 msnm, con una temperatura promedio de 18.1 C. El ejemplar botnico (Tallos, hojas, flores y frutos) ser identificado por el Bilogo y Botnico de la Fundacin Universitaria Juan N. Corpas, Antonio Meja, y determinado en el Herbario Nacional de Colombia. Para realizar la extraccin, aproximadamente 3 kilogramos de frutos frescos se sometern al proceso de secado en horno solar con conveccin natural a 35C. Posteriormente, los frutos secos sern molidos en un molino de bolas obtenindose as el material vegetal seco. Los frutos secos y molidos sern extrados con etanol al 96 % en un percolador con recirculado (2 veces al da) durante 10 das. El extracto ser llevado a sequedad en un evaporador rotatorio. El extracto seco se mezclar con silica gel con el fin de aumentar el rea de contacto y facilitar la obtencin de las fracciones con solventes de polaridad creciente. El exceso de humedad ser retirado en horno a 25C. Posteriormente, a la mezcla obtenida (extracto-Silica gel) se le har un proceso de extraccin slido-lquido con solventes de polaridad creciente: petrol (ter de petrleo), cloroformo, acetato de etilo, etanol y agua, obtenindose as las respectivas fracciones para efectuar los ensayos de actividad antioxidante y anlisis fitoqumico. Valoracin de la actividad antioxidante. Una vez culminadas las fases anteriores, los extractos y fracciones obtenidos sern sometidos a evaluacin de la actividad antioxidante por el mtodo del DPPH, siguiendo el protocolo de Afef Abdelwahed et al (2007), para lo cual se utilizarn alcuotas de solucin etanlica de cido glico y cido ascrbico empleados como control positivo en concentraciones de 0.3 a 100 g/mL usando un factor de dilucin de 1/10 entre cada concentracin36.
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ABDELWAHED, A., Bouhlel, I., Skandrani, I., et al (2007). Study of antimutagenic and antioxidant activities of Gallic acid and1,2,3,4,6-pentagalloylglucose from Pistacia lentiscus Confirmation by microarray expression profiling. Chemico-Biological Interactions. Edicin 165. pg. 113

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Todas las reacciones se desarrollarn en microplacas de 96 pozos protegidas de la luz a temperatura ambiente manejando una relacin de 1/6 de solucin de DPPH en etanol a una concentracin de 0.1mM y los extractos y fracciones a diferentes concentraciones hasta completar un volumen de 200 L. Se realizarn las lecturas en un intervalo de tiempo de 0 a 30 minutos, en un espectrmetro Labsystems Multiskan MCC/340, a una longitud de onda de 492 nm. Se emplear como control negativo, etanol para asegurar que este no interacciona con el DPPH. Las lecturas se realizarn por triplicado y los resultados sern expresados en porcentaje de inhibicin del DPPH, calculado por medio de la siguiente expresin:

Donde A Control es la absorbancia del DPPH, A Muestra es la absorbancia del extracto o fraccin a cada concentracin y tiempo. Con los datos obtenidos se calcular la concentracin inhibitoria 50 (IC50), parmetro importante para clasificar la potencia antioxidante de las muestras sometidas a estudio. El anlisis estadstico de los datos se har empleando el software GraphPad Prism, con el fin de calcular el rea bajo la curva, hacer una regresin lineal y aplicar la prueba de t student, y de sta manera determinar el grado de correlacin de los datos y evidenciar cul de los extractos analizados presenta mayor actividad antioxidante. Caracterizacin fitoqumica de los extractos y las fracciones Con el fin de determinar la presencia de algunos grupos importantes de metabolitos secundarios en las fracciones que presenten una mayor actividad, se desarrollar una marcha fitoqumica siguiendo las etapas descritas por Sanabria (1983)37. Pruebas de deteccin Alcaloides Siguiendo los procedimientos descritos Por Sanabria, se realizarn las pruebas de precipitacin de alcaloides empleando los siguientes reactivos: reactivo de Dragendorff, reactivo de Mayer, reactivo de Valser y el reactivo de Reineckato de amonio. Todas las pruebas se harn en medio cido, y los resultados sern tabularon de acuerdo con la abundancia de los precipitados formados como (+++),
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SANABRIA, A. 1983. Anlisis fitoqumico preliminar: Metodologa y su aplicacin en la evaluacin de 40 plantas de la familia compositae. Universidad Nacional. Bogot, Colombia. 113 p.

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(++), (+) o (-), teniendo en cuenta que cualquier turbidez apreciable es considerada prueba positiva. Triterpenoides A 1 Ml de los extractos y fracciones se le adicionarn algunas gotas del reactivo de Liebermann-Burchard y se evaluarn algunos cambios de coloracin, inmediatamente y a 5, 15, 30 y 45 minutos. Flavonoides Prueba de Shinoda: A 1 Ml de los extractos y fracciones se adicionarn gotas de HCl concentrado y un trozo de cinta de Mg. Se evaluar la formacin de coloracin roja durante diez minutos. Naftoquinonas y/o Antraquinonas A 5 Ml de de los extractos y fracciones se agregarn 5 Ml de agua oxigenada de 20 volmenes. La mezcla ser calentada sobre un bao de agua hirviendo durante 15 minutos. Posteriormente, se proceder a extraer con 5 Ml de benceno en un embudo de decantacin. Alrededor de 2 Ml de la capa bencnica sern agitados con 1ml de una solucin de hidrxido de sodio al 5% que contiene 2% de hidrxido de amonio. Cuando las naftoquinonas y/o antraquinonas estn presentes, la capa alcalina toma una coloracin que va del rosado al rojo intenso. Taninos y saponinas Para evaluar la presencia de este tipo de compuestos se harn pruebas de precipitacin con FeCl3, acetato de plomo y el reactivo de gelatina-sal. Para las saponinas se efectuarn las pruebas de hemlisis y de produccin de espuma.

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CONCLUSIONES PRELIMINARES

En esta investigacin se ha llevado a cabo la primera fase del estudio propuesto, la cual sirve de fundamento para la segunda fase y el desarrollo de las dos fases, estn encaminadas al anlisis de la actividad antioxidante de extractos vegetales y fracciones obtenidas de Dividivi. Caesalpinia spinosa desde el punto de vista fitoqumico, con base en una revisin bibliogrfica de los antecedentes relacionados con la actividad antioxidante de los polifenoles, en particular los del extracto de dividivi. Adems, en la segunda fase del trabajo propuesto, se obtendr de manera biodirigida, extractos y fracciones para valorar su actividad antioxidante.

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BIBLIOGRAFA

ABDELWAHED, A., Bouhlel, I., Skandrani, I., et al (2007). Study of antimutagenic and antioxidant activities of Gallic acid and1,2,3,4,6-pentagalloylglucose from Pistacia lentiscus Confirmation by microarray expression profiling. ChemicoBiological Interactions. Edicin 165. pg. 113 AGUDO Cabrera, L. Amiano, P. ARDANAZ, E. BARRICARTE, A. BERENGUER, T. CHIRLAQUE, M.D. DO RRONSORO, M. LARRAAGA, N. MARTNEZ, C. NAVARRO, C. QUIRS, J.R. SNCHEZ, M.J. TORMO, M.J. GONZLEZ, C.pean Prospective Investigation into Cancer and American Journal Clinical Nutrition. 2007 85 -6 ALDERSHVILE J, Ambrosio G, Bays de Luna A, Badimon L, Bertrand ME, Cleand J, et al (1998) Estrs oxidativo (especies de oxgeno reactivo), patologa cardiovascular (Parte I) Eur Cardiol J 1998;3(72): AMERICAN DIETETIC ASSOCIATION. Position of the American Dietetic Association: Functional Foods. J. Am. Diet. Assoc.1999: 1278-1285. AMES, B N., M.K. Shigenaga & T.M. Hagwn (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 7915-22. BORS W, Heller W, Christa M y cols. Flavonoids as antioxidants: determination of radical-scavenging efficiencies. Methods Enzymol, 1990, 186:343-355. BRUNETON, J. 1991. Elementos de Fitoqumica y de Farmacognosia. Acribia. Zaragoza, Espaa. 594 p. CASTAEDA, Benjamn, IBEZ Vsquez, Lucy A. Evaluacin de la capacidad antioxidante de plantas medicinales peruanas nativas e introducidas. Rev Acad Peru, Salud. 15(1), 2008 CSPEDES Cabrera Teresita, SNCHEZ Serrano Daniel. Algunos aspectos sobre el estrs oxidativo, el estado antioxidante y la terapia de suplementacin. Rev Cubana Cardiol 2000;14(1):55-60 GREENBERG ER. A clinical trial of Beta carotene to prevent basal-cell and squamous-cell cancers of the skin. N Engl J Med 1990;323:789-95. HARBORNE, J.B. 1995. An overview of antinutritional factors in higher plants. Edited by J.C. Caygill and I. Mueller-Harvey. Nottingham University Press, U.K. pp. 7-16. HARMAN Denham, MD, Ph.D.: la investigacin pionera de envejecimiento de cinco dcadas. Salud. Universidad de Nebraska en Omaha. 2003., p. 23 HARTMAN PE, Shankel DM. Antimutagens and anticarcinogens. Environ Mol Mutagen 1990;15:145-82. JIMENEZ, Nora. LONDOO,Julin. ARANGO Gabriel J. Actividad Captadora de Radicales Libres y Citotoxicidad de Plantas Colombianas de la Familia Annonaceae. Grupo de Investigacin en Sustancias Bioactivas, Facultad de

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