PRODUO DE CORANTES POR FUNGOS ENDOFTICOS ISOLADOS DAS ESPCIES Piper aduncum, Caesalpinia ferrea e Himatanthus sucuuba

Maria Auxiliadora Fernandes de MACDO1 Joo Vicente Braga de SOUZA2 Fbio MAGALHES3 RESUMO As indstrias que produzem corantes so fundamentais para a economia, por estarem associadas a outras indstrias que utilizam sua matria prima, como a de alimentos, cosmticos, txtil, construo, farmacutica e de diagnstico. Fungos filamentosos, especificamente fungos endofticos, so uma fonte alternativa de corantes naturais que podem ser produzidos em grandes quantidades, de forma padronizada e sem causar danos ambientais. Este estudo visa investigar a produo de corantes por fungos endofticos isolados de espcies de Piper aduncum, Caesalpinia ferrea e Himatanthus sucuuba. Especificamente: Especificamente: verificar, entre os isolados endofticos, quais eram os mais promissores para produo de corantes e investigar quais dos bioprocessos, em estado slido ou submerso, mais adequado para produo dos pigmentos. Dez fungos endofticos preservadas na Coleo Microbiana (CPCS), INPA, foram submetidos seleo, reativadas em placas de petri contendo meio BDA e Sabouraud Malte (14 dias), a fim de detectar a produo de pigmentos extracelulares. Dois microrganismos LU6 e H37 produziram pigmentao intensa extracelular em Sabouraud e Malte, foram submetidos aos bioprocessos em meio lquido (glutamato monossdico) e em meio slido (mandioca cozida). Foi realizada extrao lquido-lquido dos pigmentos com solventes: Butanol, Acetato de etila e Ciclohexano e sendo solveis em butanol e acetato de etila. As fraes foram caracterizadas por espectrofotometria visvel (340-700 nm). PALAVRAS CHAVE: Fungo Endoftico; Pigmentos; Caracterizao COLORANTS FOR PRODUCTION OF SPECIES ENDOPHYTIC FUNGI ISOLATED Piper aduncum, Caesalpinia ferrea and Himatanthus sucuuba ABSTRACT The industries that produce dyes are fundamental to the economy, to be associated with other industries that use its raw materials such as food, cosmetics, textile, construction, pharmaceuticals and diagnostics. Filamentous fungi, especially fungal endophytes, are an alternative source of natural dyes that can be produced in large quantities in a standardized manner and without causing environmental damage. This study aims to investigate the production of dyes by endophytic fungi isolated from Piper aduncum species, Caesalpinia
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Graduanda em Cincias Biolgicas Universidade Nilton Lins e-mail: mariaauxiliadora_macedo@hotmail.com

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Doutor do Instituto Nacional de Pesquisas da Amaznia Mestre da Universidade Nilton Lins

ferrea and Himatanthus sucuuba. Specifically: Check among the endophytic isolates, which were the most promising for the production of dyes and to investigate which of bioprocesses, solid state or submerged, is more suitable for production of pigments. Ten endophytic fungi preserved in the Microbial Collection (CPCS), INPA, were subjected to selection, reactivated in petri dishes containing PDA medium and Sabouraud Malt (14 days) in order to detect the production of extracellular pigments. Two microorganisms LU6 H37 and for producing extracellular intense pigmentation in Sabouraud and malt were subjected to bioprocesses in liquid medium (monosodium glutamate) and solid (boiled cassava). We performed liquidliquid extraction of the pigments with solvents: butanol, ethyl acetate and cyclohexane and soluble in butanol and ethyl acetate. The fractions were characterized by visible spectrophotometry (340-700 nm). Keywords: Endophytic Fungus; Pigments; Characterization INTRODUO A indstria de corantes muito importante economicamente. Ela est associada a vrias outras indstrias como a de alimentos, cosmticos, txtil, construo, farmacutica e de diagnstico. O uso de corantes , muitas vezes, o principal diferencial competitivo de aceitabilidade entre os produtos (Spears et al. 1988). No entanto, em vrios corantes sintticos tm sido observado potencial carcinognico, teratognico e poluidor (Fabre et al. 1993). Atualmente, a Unio Europia e os Estados Unidos da Amrica tm autorizado somente 43 e 30 corantes, respectivamente, que podem ser utilizados como aditivos em alimentos (European Parliament and Council Directive 94/36/EC, 1994; Code of Federal Regulations Title 21 US Food and Drug Administration, 2003), sendo os corantes autorizados de origem natural como: antocianinas, betaninas, cores de caramelo, carbo medicinalis, carmina, carotenides, clorofina, curcumina, riboflavina,etc. (Mapari et al. 2005). Apesar do desconhecimento pblico, a utilizao de corantes naturais apresenta desvantagens como dependncia de material para extrativismo e as variaes de rendimento na extrao de pigmentos. Um exemplo, o corante vermelho carmina extrado de um inseto fmea (cochineal) e para a produo de 100 g de carmina so necessrios 14000 insetos. Deve-se ainda comentar que vrios destes corantes naturais apresentam problemas de estabilidade e de processamento (Mapari et al. 2005). Portanto, esta situao gera um grande incentivo para identificao de caminhos alternativos para obteno dos corantes naturais como a aplicao das ferramentas biotecnolgicas e microrganismos.

Fungos filamentosos so importantes para as atividades humanas participando da produo de alimentos, produtos farmacuticos, produtos qumicos e na converso da biomassa na natureza (Hajjaj et al. 2000). Estes so uma fonte alternativa de corantes naturais que podem ser produzidos em grandes quantidades, de forma padronizada e sem causar danos ambientais. A recente autorizao da utilizao dos pigmentos produzidos por fungos em pases desenvolvidos tem fortalecido projetos de pesquisa com o objetivo de explorar a diversidade fngica. (Mapari et al. 2005) Os estudos para obteno de corantes a partir de fungos filamentosos requerem o uso apropriado de ferramentas quimiotaxonmicas e do conhecimento prvio dos metablitos fngicos. Trabalhos de screening so necessrios para obteno de corantes naturais conhecidos e ainda de novos corantes, sendo que, os fungos devem passar por uma prseleo para produo de pigmentos e uma retirada das linhagens patognicas ou produtoras de toxinas. Os microrganismos denominados endofticos habitam o interior dos vegetais superiores aparentemente sem lhes causar doena (Petrini, 1991). Estudos sobre a potencialidade dos microrganismos endofticos, principalmente os relacionados descoberta de novas substncias, mostram-se relevantes tanto para uso no controle biolgico de doenas e pragas, como para aplicao no setor qumico/bioqumico ou indstria farmacutica (Stierle et al. 1995; Azevedo, 1998; Azevedo et al. 2000; Stamford et al. 2001; Suto et al. 2002; Strobel, 2003). Apesar de vrios estudos relacionados produo de metablitos importantes, poucos ou nenhum foram realizados para a obteno de pigmentos naturais. Fungos produtores de pigmentos devem ser submetidos a bioprocessos com o objetivo de avaliar a viabilidade econmica das linhagens (Mapari et al. 2005) A maior parte de conhecimento acumulado sobre a produo de pigmentos por microrganismos foi obtida com bioprocessos realizados com o gnero Monascus. Os vrios trabalhos realizados com Monascus culminam em fermentaes slidas, submersas e at mesmo bioprocessos submersos com uso de miclio imobilizado (Hamdi et al. 1996; Fenice et al. 2000; Silveira et al. 2008).

Tradicionalmente, este gnero cultivado em meio slido composto por substratos amilceos como po e arroz. O mtodo clssico chins consiste em inocular arroz cozido com o microrganismo e incubar com temperatura e aerao controlada por 20 dias (Johns e Stuart, 1991). Contemporaneamente, Pattanagul et al. (2008) produziram altas concentraes de pigmentos e baixas concentraes de toxina (citronina) utilizando Monascus purpureus em bioprocesso em estado slido, umidade de 83,51% e pH de 6,54. Experimentos em meio lquido com Monascus foram conduzidos com o objetivo de obter os pigmentos de forma extracelular e com maior facilidade de purificao. No entanto, vrias etapas precisaram ser vencidas como a determinao das Fontes de carbono e nitrognio mais adequadas e das condies de cultivo. Hajjaj et al. (2000) estudaram a influncia das condies de bioprocesso em fermentao submersa conduzida com glicose e glutamato como fontes de carbono e nitrognio, respectivamente. Este estudo versa sobre vrios metablitos produzidos, inclusive intermedirios do metabolismo primrio e a relao da produo destes com as condies de cultivo demonstrando assim a profundidade do conhecimento sobre o metabolismo do gnero Monascus. Para avaliar o potencial industrial do corante natural produzido necessrio caracteriz-lo e identific-lo. O objetivo do presente estudo foi investigar a produo de corantes por fungos endofticos isolados das espcies Piper aduncum, Caesalpinia ferrea e Himatanthus sucuuba. Especificamente: a) verificar, entre os isolados endofticos, quais eram os mais promissores para produo de corantes e b) investigar quais dos bioprocessos, em estado slido ou submerso, mais adequado para produo dos pigmentos. MATERIAL E MTODOS Este estudo foi realizado com fungos endofticos que foram isolados das espcies, Piper aduncum, Caesalpinia ferrea e Himatanthus sucuuba, durante os estudos realizados por Carvalho, (2005), Lima, (2007) e Oliveira, (2008), respectivamente. As culturas destes esto sendo preservadas sob leo mineral na coleo de microrganismos dos Laboratrios de Microbiologia da CPCS Instituto Nacional de Pesquisa da Amaznia.

Procedimentos Seleo de produtores de pigmentos As culturas de fungos endofticos (10 culturas) das espcies, Piper aduncum, Caesalpinia ferrea e Himatanthus sucuuba, foram selecionadas da coleo de microrganismos da CPCS-INPA. A reativao das culturas foi realizada como descrito por Lacaz et al. (2001). Um fragmento da cultura mantida sob leo mineral foi transferido para placas de petri contendo os meios BDA, Sabouraud e Malte, em seguida, as placas foram incubadas a temperatura ambiente. A avaliao quanto a produo dos corantes foi realizada como descrito por Mapari et al. (2005), durante 14 dias as culturas foram diariamente observadas a fim de detectar a produo de pigmentos extracelulares pelo meio de crescimento. Os dois isolados H37 (Himatanthus sucuuba) e LU6 (Caesalpinia ferrea) que produziram pigmentao mais intensa em meio de cultura Sabouraud e Malte, foram selecionados para os bioprocessos. Bioprocessos para produo de pigmentos O bioprocesso em meio lquido foi realizado como descrito por Hajjaj et al. (2000). 108 clulas dos isolados foram transferidas para erlenmeyers de 125 mL contendo 30 mL de meio (glicose 20 g/L; glutamato monossdico 5 g/L; K2HPO4 5 g/L; KH2PO4 5 g/L; CaCl2, 0,1 g/L; MgSO4. 7H2O 0.5 g/L; FeSO4. 7H2O 0,01 g/L; ZnSO4. 7H2O 0,01 g/L e MnSO4. H2O 0,03 g/L). Estes cultivos foro incubados sob agitao orbital de 100 rpm, temperatura de 25 oC, por um perodo de 14 dias. O bioprocesso em meio slido foi realizado como descrito por Babitha et al. (2007). Os experimentos foram conduzidos em Erlenmeyers de 125 mL contendo 10g de substrato (mandioca cozida (Manihot esculenta) com umidade de 60%) inoculado com 108 clulas dos isolados. Estes cultivos foram incubados a temperatura de 25
o

C e pelo perodo de 14 dias. A extrao do pigmento do meio de cultivo foi realizado como

descrito por Pattanagul et al. (2008). 1 g do fermentado no estado slido ou 5 mL de meio submerso foi transferido para um Erlenmeyer contendo 5 mL de butanol e agitado a 200 rpm por 2 horas (Este procedimentos foi repetido com os solventes acetato de etila e ciclohexano). Aps este perodo a mistura foi centrifugada (3000 rpm por 15 minutos) e as fraes foram submetidas a caracterizao por espectrofotometria do UV/VIS (340-700 nm).
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RESULTADOS E DISCUSSO Dez fungos endofticos foram selecionados para ensaios de produo de pigmentos. Estes foram selecionados na coleo pois apresentavam produo de pigmentos nos meios de culturas utilizados para o sua conservao. Quatro destes haviam sido isolados de Piper aduncum, cinco isolados de Himatanthus sucuuba e um isolado de Caesalpinia ferrea. Cinco isolados puderam ser identificados em nvel taxonmico de gnero como Fusarium sp. Com a finalidade de verificar a produo de pigmentos, os isolados foram submetidos ao ensaio de crescimento em diferentes meios de cultura: gar BDA, Sabouraud e Malte. O Quadro 1 apresenta os resultados desta investigao. Quadro 1 Caractersticas dos pigmentos extracelulares em diferentes meios de cultura slido.

Isolado

gar BDA

Sabouraud

Malte

Piper aduncum G10 G15 P73 P79 Amarelo Amarelo claro Amarelo claro Marrom claro Amarelo Amarelo claro Amarelo escuro Amarelo laranja Pouco pig. amarelo Amarelo claro Amarelo claro

com Laranja escuro

Himatanthus sucuuba H37 Amarelo Laranja claro Amarelo escuro

Caesalpinia ferrea LU6 Amarelo Amarelo claro Amarelo escuro

Entre os dez isolados selecionados, seis apresentaram produo de pigmentos extracelular nos meios de cultura. Entre estes, quatro isolados de Piper aduncum (G10, G15,
6

P73, P79), um isolado de Himatanthus sucuuba (H37) e um isolado de Caesalpinia ferrea (LU6). Os isolados produziram pigmentao mais acentuada no meio Sabouraud e Malte, nestes meios foram produzidos pigmentos de cor amarela e laranja. Para realizao dos bioprocessos em meio lquido e meio slido foram utilizados os isolados Fusarium H37 e Fusarium LU6, estes produziram as pigmentaes mais intensas em meio slido. Fusarium spp. so conhecidos como produtores de pigmento amarelo em meio Agar glucosado de sabouraud (Pontn et al. 2002). A Figura 1 apresenta fotos dos bioprocessos em que foram produzidos pigmentos. Os isolados LU6 (Caesalpinia ferrea) e H37 (Himatanthus sucuuba) produziram pigmentos vermelhos, no bioprocesso em estado lquido , Glutamato monossdico em prvios estudos foi considerado como fonte de nitrognio adequada para a produo de pigmentos vermelhos e amarelos (Babitha et al. 2007). Os pigmentos do isolado LU6 foram solveis em butanol (cor amarelo escuro), no acetato de etila, ( amarelo claro) e foram insolveis no ciclohexano. Os pigmentos do isolado H37 foram solveis em butanol (cor vermelho escuro), acetato de etila ( vermelho claro) e insolveis no ciclohexano. No bioprocesso em estado slido (mandioca cozida) apenas o isolado H37 (Himatanthus sucuuba) produziu a pigmentao, essa foi solvel em butanol (cor rosa claro) no acetato de etila (amarelo claro) e no ciclohexano insolvel. A partir dos dados obtidos, o bioprocesso em estado lquido demonstrou-se mais adequado para a produo de pigmentos. No entanto, vrios resduos agroindustriais, tais como farelo de arroz, farelo de trigo, mandioca, tm sido explorados para a produo de pigmento (Babitha et al. 2007), sendo necessrios mais estudos.

Figura 1- Fotos dos bioprocessos em que foram produzidos pigmentos. a) Bioprocesso em meio lquido Isolado LU6, b) Bioprocesso em meio lquido Isolado H37, c) Bioprocesso em meio slido Isolado H37.

Fonte: MACDO, 2011

A Figura 2 apresenta o espectro do visvel (340-700 nm) dos pigmentos produzidos em meio lquido pelos isolados LU6 e H37. Os pigmento dos isolados LU6 e H37, extrados em butanol, apresentaram maiores absores nos comprimentos de onda entre 340-420 nm. A Figura 3 apresenta o espectro do visvel dos pigmentos produzidos em meio slido pelo isolado H37, extrados em butanol, apresentaram maiores absores nos comprimentos de onda entre 340-530 nm. Trabalhos anteriores apresentam pigmentos vermelhos que possuem absortividade mxima a 500 nm e amarelos a 400 nm. No entanto, a trabalhos que demonstram pigmentos vermelhos com mxima absortividade em comprimentos de onda prximos a 400 nm (Carvalho et al. 2005).
0 ,4 0 0 ,3 5 0 ,3 0 0 ,2 5 0 ,2 0 Abs 0 ,1 5 0 ,1 0 0 ,0 5 0 ,0 0 -0 ,0 5 300 LU 6 H 37

350

400

450

500 nm

550

600

650

700

750

Figura 2 Espectro do visvel dos pigmentos produzidos em meio lquido pelos isolados LU6 e H37
0 ,2 6 0 ,2 4 0 ,2 2 0 ,2 0 0 ,1 8 0 ,1 6 Absorbncia H37 0 ,1 4 0 ,1 2 0 ,1 0 0 ,0 8 0 ,0 6 0 ,0 4 0 ,0 2 0 ,0 0 -0 ,0 2 300 350 400 450 500 nm 550 600 650 700 750

Figura 3 Espectro do visvel dos pigmentos produzidos em meio slido pelo isolado H37

CONCLUSO

Os isolados LU6 (Caesalpinia ferrea) e H37 (Himatanthus sucuuba), pertencentes ao gnero Fusarium foram selecionados como mais adequados produtores de pigmentos.O bioprocesso em meio lquido utilizando Glicose como fonte de carbono e Glutamato como fonte de nitrognio foi adequado para produo de pigmentos.

REFERNCIAS

Azevedo, J.L.; Maccheroni Jr., W.; Pereira, J.O.; Arajo, W.L. 2000. Endophytic microorganisms: a review on insect control and recent advances on tropical plants. EJB: Electronic Journal of Biotechnology, p.40-65. Babitha, S.; Soccol, C.R.; Pandey, A. 2007. Solid-state fermentation for the production of Monascus pigments from jackfruit seed. Bioresource Technology. 98, p. 15541560. Carvalho, F. A. 2005. Efeitos da fragmentao florestal na florstica e estrutura de fragmentos de Mata Atlntica submontana na regio de Imba, municpio de Silva Jardim, RJ. 124f. Dissertao (Mestrado em Biocincias e Biotecnologia) Universidade Estadual do Norte Fluminense, Campos dos Goytacazes. Fabre, C.E.; Santerre, A.L.; Loret, M.O.; Baberian, R.; Pareilleux, A.; Goma, G.; Blanc, P.J. 1993. Production and food applications of the red pigments of Monascus ruber. J. Food Sci. 58, p. 10991102. Fenice, M.; Federici, F.; Selbmann,L.; Petruccioli, M. 2000. Repeated-batch production of pigments by immobilised Monascus purpureus. Journal of Biotechnology, v.80, p. 271276. Hajjaj, H.; Blanc, P.; Groussac, E.; Uribelarrea, J-L.; Goma, G.; Loubiere, P. 2000. Kinetic analysis of red pigment and citrinin production by Monascus ruber as a function of organic acid accumulation. Enzyme and Microbial Technology, v.27, p. 619625.

Hamdi, M.; Blanc,x P.J.; Goma, G. 1996. Effect of aeration conditions on the production of red pigments by Monascus purpureus growth on prickly pear juice. Process Biochemistry, 31: ( 6), p. 543-547. Johns, M.R.; Stuart, D.M.1991. Production of pigments by Monascus purpureus in solid culture. Journal of Industrial Microbiology, v.8, p. 23-28. Lacaz, C.S.; Porto, E.; Martins, J.E.C. 2001. Microbiologia mdica: fungos, actinomicetos e algas de interesse mdico. 8. d. So Paulo: Sarvier. Lima, M.R.F.; Ximenes C.P.A.; Luna, J.S. 2007. The antibiotic activity of some Brazilian medicinal plants. Rev Bras Farmacogn 16: 300-306. Mapari, S.A.S.; Nielsen, K.F.; Larsen, T.O.; Frisvad, J.C.; Meyer, A.S.; Thrane, U. 2005. Exploring fungal biodiversity for the production of water-soluble pigments as potential natural food colorants. Current Opinion in Biotechnology, v.16, p.231238.

Pattanagul, P.; Pinthong, R.; Phianmongkhol, A.; Taratha, S. 2008. Mevinolin, citrinin and pigments of adlay angkak fermented by Monascus sp. International Journal of Food Microbiology, v.126, p.2023. Petrini, O. 1991. Fungal Endophytes of tree leaves. In: Andrews J, Hirano SS, eds. Microbial Ecology of leaves. New York: Springer Verlag, p.179-197. Pontn, J; Moragues, M; Gen, J; Garro, J; Quinds, G. 2002. Fusarium culmorun. Revista Ibero Americana de Micologia. P. 31-32. Spears, K. 1988. Developments in food colourings: the natural alternatives. Trends in Biotechnology, v.6, p. 283-288. Strobel, G.; Hess, W.M.; Baird, G.; Ford, E.; Li, J.Y.; Sidhu, R.S.2003. Stegolerium kukenani gen, et sp nov na endophytic taxol producing fungus from the Roraima and Kukenan tepuis of Venezuela. Mycotaxon, 78: 353-361. Stierle, A.; Strobel, G.; Stierle, D. 1995. Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae an endophytic fungus of Pacific yew. Science, 260: 214-216. Stamford, T.L.M. 2001. Isolamento e identificao de microrganismos endofticos, seleo e caracterizao de actinomicetos produtores de enzimas amilolticas. Recife, UFPe, 110 p., Tese de Doutorado. Suto, S.; Kanda, A.; Kawai, H.; Kitajima, S.; Sato, S.; Takata, T.; Tatsuka, M. 2002. AuroraB/AIM-1 kinase activity is involved in Ras-mediated cell transformation. Oncogene, 24. p.72667272.

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