ae ee Pretwnacs Stérilisation : L Introduction L1. Définitions 1. Stérilisation Est une opération pharmaceutique qui a pour but d’éliminer ou de détruire tous les microorganismes vivants portés par un médicament ou un objet parfaitement nettoyés. 2, Stérilité ~ Au sens général, la stérilité est définie comme l’absence de microorganismes vivants Pour les produits pharmaceutiques, la stérilité est définie comme I’absence d’entités capables de survivre et/ou de se multiplier (selon les BPF). Les méthodes utilisées et les précautions a prendre doivent étre employées de telle fagon qu’en fin de stérilisation la probabilité d’avoir une entité non stérile soit inférieure 4 10% = atteindre un niveau d’assurance de stérilité (NAS) 10° (cest-a-dire la probabilité de rencontrer une unité non stérile est inferieure a un million). La stérilité est un état éphémére : il convient chaque fois que possible, de choisir un procédé permettant Ia sterilisation du produit dans son récipient final (sterilisation terminale) 1.2. Objectifs de la stérilisation On stérlise afin 4’éviter I'introduction des microorganismes pathogénes ou non dans l'organisme, Ces microorganismes peuvent etre dangereux - Pour I’homme : si pathogéne = infection voire septicémie, - Pour les médicaments : déstabilisation (ex : antibiotiques). 1.3. Applications de Ia stérilisation La stérilisation s’applique : - Au matériel médico-chirurgical : ligatures, articles de pansement, article A usage unique, vétements des personnes travaillant en ambiance stérile. - Aux préparations médicamenteuses par voie oculaire ou parentérale ou appliquées sur peau lésée. - ATalimentation des personnes immunodéprimées (alimentation entérale), - A certaines enceintes de l'industrie pharmaceutique et des h6pitaux, aux blocs et hottes stériles. Il. Différentes méthodes de stérilisation ILL. Classification générale ; voireorganigramme 1 11.2, Classification selon les produits qui ou pas stérilisés dans leur conditionnement définitif 112.1. Pour les produits qui peuvent etre stérilisés a Vintérieur de leur conditionnement étanche définitif : procédés de destruction Stérilisation par la chaleur séche + Stérilisation par la chaleur humide, - _Stérilisation par les rayonnements. - _Stérilisation par les gaz. Page 1 sur 1811.2.2. pour les produits qui ne peuvent pas etre stérilisées a Pintérieur de leur conditionnement étanche définitif : procédés d’élimination - Stérilisation par filtration. - Conditionnement aseptique, enceintes stériles. Secne | [Humice 8 z 1 i Rayonnements |_ ionisants x ww Lquides Environnement Organigramme!. Les différentes méthodes de sterilisation. IL3. Stérilisation par la chaleur 113.1, Sensi it des microorganismes a la chaleur La sensibilité des microorganismes a la chaleur dépend ~ _ De'espace microbienne et la forme sous laquelle elle se trouve : sporulée ou végétative. - Durée du traitement. - Nombre initial de germes. = Température, = Milieu, 1. Lrespéce microbienne : tous les microorganismes n'ont pas la méme sensibilité a la chaleur: pour une espéce donnée, la forme sporulée est plus résistante a la chaleur (121°C ou plus) que la forme végétative 62°C 260°C). 2. Durée de traitement et le nombre de germes : le nombre de survie varie en sens inverse avec la durée du traitement selon une équation logarithmique (équation!). Tl s’agit d'une courbe exponentielle qui théoriquement tend vers 0 sans jamais I'atteindre. NE=Np. e™. (équation1) N: nombre initial de germes dans un volume donné, No: nombre de germes revivifiables dans le méme volume au temps t K : constante de vitesse, t : temps. Page 2 sur 18température nécessaire pour réduire de 10" a 10° ~ en théorie, la stérilité totale ne peut jamais etre atteinte, - Péquation 1 montre que pour augmenter les chances de parvenir a une stérilisation satisfaisante ; il faut partir une valeur de No Ia plus faible que possible, autrement dit : la charge bactérienne de la préparation avant stérilisation doit etre la plus faible possible ( en utilisant du matériel et verrerie trés propres, en partant de ‘matiéres premiéres trés pures et bien conservées, en employant de l'eau fraichement distillée pour les solutions aqueuses et en travaillant dans une atmosphere aussi pauvre en germes que possible). 3. température : le temps nécessaire a la destruction des spores d’une espéce microbienne en fonction de la ‘température donne une relation logarithmique 110 120 température Valeur stérilisatrice F pour une température donnée : le temps nécessaire pour réduire de 10° a 10° le nombre des spores par millilitre de préparation. ~ Le temps de réduction décimale DT : C’est le temps nécessaire, & une température donnée, pour diviser par 10 la population d’un germe donné .Ex : Spores Bacillus stearothermophilus D121°C = Imin30s. -Valeur d’inactivateur thermique Z : C’estI’élévation de température nécessaire pour réduire la valeur DT d’un facteur 10. Ex : Spores Bacillus stearothermophilus Z.= 10°C. Dy est spécifique pour chaque microorganisme - Temps équivalent FT : On détermine le temps de destruction thermique FT a la température T nécessaire pour obtenir le méme effet qu'un temps défini a la température de référence » Ex : 1 min & 121°C équivaut 42 min & 118°C. Page 3 sur 18» Détermination de la valeur stérilisatrice : Aprés avoir tracé la courbe de I’évolution de la température versus le temps, on peut déterminer la valeur stérilisatrice de la fagon suivante a- Calcul du taux de létalité L Le rapport d’efficacité entre un traitement d’une minute a la température enregistrée T dans un récipient et un ‘traitement de méme durée a la température de référence T’ est donné par la formule suivante : L: taux de létalité, T: température enregistrée dans le récipient, T’: température de référence,z: valeur inactivateur thermique. b- Détermination de Ia valeur stérilisatrice a une température T pour un seul cycle de stérilisation Fr Elle traduit lefficacité d’un traitement thermique pour un germe de valeur Dr connue. Elle peut etre calculée apres le nombre de germes vivants avant et aprés le traitement Fre Dy x log (N/No) c Détermination de la valeur stérilisatrice totale en pratique Fr est déduite du cycle de stérilisation : c’est la somme des taux de létalité calculés pour chaque minute du ‘traitement thermique Fre Ap SL > Intérét de la Détermination de la valeur stérilisatrice : Lorsque la température de référence T’ = 121°C et Z=10°C ; la valeur stérilisatrice est notée Fo. Le caloul de la valeur stérilisatrice permet de valider un procédé de stérilisation car Fy= Sminutes est considérée comme un minimum acceptable. Elle provoque une réduction d’un facteur 10° pour des spores trés résistants (Dj2,= Imin) et d’un facteur 10'° pour des spores de résistance moyenne (Di2;= 30se¢). 4. nature du miliew ~ humidité : les germes sont beaucoup plus résistants a 1a chaleur en milieu sec qu’en milieu humide. Il faut maintenir une température de 170°C pendant au moins une minute dans une atmosphére séche pour qu’il y ait destruction des germes bactériens Le mécanisme serait différent en chaleur séche et en chaleur humide ; en chaleur séche il s’agirait surtout oxydation et en chaleur humide de coagulation des protéines. = composition du milieu : certains PA possédent un pouvoir bactéricide qui ne se manifeste qu’é chaud ex : carbonate acide de Na. - pH: la destruction des microorganismes est pH dépendante, elle est plus aisée en milieu acide qu’en milieu alcalin. 113.2. procédés de stérilisation par la chaleur 113.2.1.Chaleur séche Page 4 sur 18Dans ce systéme, l'agent stérilisant est Poxygene de l’air filtré sur filtre HEPA et surchauffé électriquement dans une étuve & air chaud ou dans un four (type four Pasteur ou stérilisateur Poupinel), Le four Poupinel est constitué par une enceinte close bien isolée munie d'une ventilation renforcée. Il doit etre chargé de telle fagon qu’une distribution uniforme de la température soit réalisée dans toute l’enceinte. La pharmacopée européenne préconise un baréme de 180°C pendant 30min pour stériliser essenticllement du matériel métallique et les récipients en verre. Au-dela de 250°C, on dépyrogénise les contenants en verre pour préparations injectables, Stérilisateur Poupinel UL. Chaleur humide 1. principe Crest le mode de sterilisation le plus répandu pour les produits non thermolabiles car elle est efficace, rapide et peu couteuse, Elle consiste en une production de vapeur d’eau par chauffage sous pressions => vapeur saturante: gaz stérilisant. Ise produit une dénaturation des macromolécules bactériennes (noyau et paroi) sous action de Ja chaleur : hydrolyse partielle des chaines peptidiques. - Pour les récipients contenant des solutions a stérliser, l’effet stérlisant est réalisé par I’eau de la solution. - Pour la stérilisation terminale : le conditionnement doit etre perméable a la vapeur d’eau. 2. Appareils de stérilisation par Ia chaleur humide 2.1.Autoclaves 2.1.1. A Péchelle laboratoire L’autoclave est une enceinte cylindrique étanche en acier inoxydable ou en cuivre muni d’un couvercle. L’autoclave contient un panier grillagé pour recevoir les produits a stériliser. Le niveau de l'eau ne doit pas atteindre le fond du panier mais etre suffisant pour que la sterilisation se fasse en vapeur saturante. Le couvercle comporte différents systémes de sécurité a savoir Soupape de sureté pour éviter d’atteindre des surpressions dangereuses Page 5 sur 18Un robinet d’évacuation de lair Un manométre pour régler la température et la pression En général, le manométre est gradué en excés d’atmosphére sur la pression normale, Au moment de la fermeture du robinet d’échappement, le manométre est au zér0 ce qui correspond a 100°C. Ensuite, on a approximativement les correspondances suivantes pune 0,5 atmosphere + 110°C 1 atmosphére +121r°C 2 atmosphéres + 134°C 3 atmosphéres + 14aec oor - fonctionnement ~ Cycle de stérilisation au sein d’un autoclave : le cycle de sterilisation comporte les étapes suivantes ala purge d’air : elle est indispensable pour une bonne diffusion de la vapeur en tout point de I’enceinte. Le robinet d’ évacuation est maintenue en position ouverte, ensuite le chauffage est déclenchée jusqu'a ébultition de Peau, de telle facon la vapeur se propage dans l'ensemble de l’autoclave. b-pré-traitement ou chauffage de la charge : Le robinet de purge est fermé dés la sortie de la vapeur car I'air est un mauvais conducteur de la chaleur ensuite la température est augmentée graduetlement et progressivement de 100 a 120°C pendant 20 min. t f 1 Exemple de Giagramme de Sténiisation c-étape de la stérilisatio Page 6 sur 18Le palier de stérilisation est une étape ot Fon compense les pertes énergétiques liées aux diverses fuites du systéme afin de maintenir une température suffisante pour produire leet recherché Conditions de référence applicables aux préparations aqueuses : 121°C pendant 15 min: plateau de stérilisation 4- le refroidissement : La température est diminuée progressivement de 121 a 100°C, tout en maintenant le robinet de purge fermé Cette étape doit étre maitrisée en termes de vitesse de refroidissement ef de maintien de la pression dans enceinte : risque d’explosion des contenants de solutions 2.1.2. A Péchelle industrielle : autoclaves industrielles C’est une enceinte @ une ou deux portes Ganches par un joint dans laquelle on admettra de 1a vapeur ou de teau surchaufiée Ces autoclaves sont en général horizontaux et 4 ouverture latérale pour permettre un chargement et un ddéchargement par chariots & plateaux, et comportent des aménagements pour I’élimination de I’air par Ie vide et homogénéisation rapide de la température. Ils sont généralement équipés d’un enregistreur de pression et de température. Certains sont munis dune enveloppe chauffante recevant de la vapeur, ce qui permet au départ une mise en température plus rapide. 2.2.Stérilisateurs a la vapeur sous pression en continu Ils sont constitués de 2 colonnes d'eau A et C, et d'une chambre de stérlisation B. ils fonctionnent de la fagon suivante -Colonne A : entrée en continu des flacons & stériliser qui vont croiser l'eau chaude et s’échantfent. -Colonne C : sortie des flacons oi ils vont croiser I’eau froide. -Chambre de stérilisation B : séjour des flacons 20 4 30 min dans Ia vapeur a 121°C en effectuant des ‘mouvements de montée et de descente (injection de vapeur d’eau sous pression) Page 7 sur 18Stérilisateurs A la vapeur sous pression en continu > Contréle d’un procédé de stérilisation au sein d’un autoclave En cours de stérilisation, un contrdle est réalisé pour étre sir que la température a bien été atteinte a I'intérieur de T'autoclave. Dans la mesure du possible, des sondes sont convenablement placées. A défaut, on introduit avec les produits & stériliser des tubes témoins qui contiennent une substance chimique pure ayant un point de fusion précis et une trace de colorant (exemple : acide benzoique qui fond a 120°C). Lorsque cette température est atteinte, la substance fond et se colore par dissolution du colorant. Ces tubes sont places dans différentes parties de I’autoclave cet dans quelques flacons. Il existe aussi des peintures témoins qui changent de couleur en fonction de la température et du temps de chaufage. Ces peintures sont étalées sur des sparadraps ou des rubans adhésifs collés sur les objets & stériliser. Les indicateurs les plus efficaces sont des préparations de microorganismes sélectionnés en raison de leur forte résistance a la méthode de stérilisation choisie. Cette souche doit étre non pathogéne et se développer facilement. Des spores de Bacillus stearothermophilus sont recommandées comme microorganismes témoins lors de la stérilisation par la vapeur. Pour la stérilisation de produits préparés en grande quantité (exemple: flacons pour perfusion de chlorure de sodium 9 %o ou de glucose a 10 %), certains appareils permettent de stériliser en continu. Dans ces stérilisateurs, deux colonnes d’eau hautes de 10 métres maintiennent sous pression de 2 atmosphéres la pattie inférieure de Vappareil ob arrive la vapeur, & la température de 120°C, Deux systémes régulateurs commandent le niveau d’eau dans les colonnes et I’arrivée de la vapeur. Les flacons a stériliser amtivent en continu et se réchauffent progressivement dans la premiére colonne. Ils passent pendant un temps choisi de 25 a 30 minutes dans la vapeur & 120°C ot ils sont stérilisés avant de remonter dans la colonne d’eau froide. IL4. Stérilisation par irradiation -Stérilisation trés efficace du matériel médicochirurgical (seringue, aiguille, nécessaire pour perfusion, articles de pansement, sutures...) 4 usage unique, dans un emballage étanche définitif ~ Méthode eofiteuse et & risque pour P’étre humai ~ Elle est réalisée dans des centres spécialisés soumis a des dispositions législatives et réglementaires particuliéres ~ L’effet stérilisant nécessite une dose minimale de rayonnement ionisant, de ’ordre de 25 kGy : il dépend de létat de contamination initial et de la sensibilité des germes aux rayonnements. IL4.1. rayons UV (rayons électromagnétiques) = longueur d’onde 2 < 2000°A => les rayons UV présentent un pouvoir microbieide trés élevé mais sont ‘malheureusement absorbés par la matiéze. = 2000°A< 4 <3000°A = Ils sont microbicides mais ne traversent que l’eau pure. -4.> 3000°A = ils sont pénétrants mais ne sont pas microbicides. > Applications des rayons UV en pharmacie -Stérilisation des préparations aqueuses en ampoules ou flacons. - stérilisation de I'air des enceintes stériles : il ne faut pas qu'il y ait d’obstacles entre les lampes UV et les germes A détruire = loi de Beer ~ Lambert. > inconvénients des rayons UV - graves accidents oculaires doi la nécessité des opérateurs de porter des lunettes protectrices, 11.4.2. radiations ionisantes Page 8 sur 18Elles agissent de fagon plus sélective que la chaleur. Le principal effet permettant la sterilisation est a radiolyse de eau contenue dans les micro-organismes, I’excitation de molécules d'eau entrainant I’apparition de radicaux libres, trés instables, se recombinant en formes plus stables : les péroxydes. Les modifications au niveau de I’ ADN sont responsables dun fonctionnement cellulaire 11.4.2.1.les irradiateurs a rayonnement y = Source "Co - Capsule renfermant “Co — L’isotope 60Co se transforme en “Ni en émettant 2 rayonnements y et 1 rayonnement B ~ Rayonnement y pénétre la matiére, il ionise les atomes en formant des radicaux libres => activité germicide - Irradiateurs protégés par des murs épais en béton pour éviter les émissions en dehors 1L4.2.2.les irradiateurs utilisant les électrons accélérés B - Source = systéme de balayage par faisceau d’électrons=> émission de rayonnement B. - Le pouvoir pénétrant dépend de l’énergie de I'accélérateur : avec de grandes intensités: sterilisation en une fraction de secondes. ~ Rayonnement trés puissant & des prix intéressants ~ Rayonnement moins pénétrant que celui du y. Ex. Stérilisation d’un médicament contenu dans une seringue pré-remplie. > Contréle d’un procédé de stérilisation par irradiation Les matigres stériliser sont placées dans des conditionnements étanches, eux-mémes placés dans des conditionnements en carton. A I'intérieur de ces cartons sont placés des dosimétres qui mesurent la dose de rayonnements regue et des indicateurs biologiques pour contréler lefficacité bactériologique du traitement. ILS. Stérilisation par les gaz ILS.1. formaldehyde La stérilisation associe la vapeur d’ean a basse température au formaldéhyde, Celui-ci existe sous trois états possibles : phase gazeuse, dilution aqueuse, phase solide, ~ La phase gazeuse n’existe pas en tant que telle dans le commerce. Elle est obtenue par sublimation du paraformaldéhyde solide ou par évaporation du formol liquide. Para-formaldéhyde solide _______ga(formaldéhyde) ~ La solution aqueuse est le formol codex, stable jusqu’a 35 4.40 % P/V. Page 9 sur 18- La forme solide est constituée par des polyméres de formaldghyde : » Mode d’action et Propriétés germicides : la stérilisation vapeur d'eau-formaldéhyde utilise action synergique bactéricide de la vapeur d’eau et du formaldéhyde .La vapeur d'eau est un élément majeur pour la destruction des formes végétatives .Elle pourrait également —favoriser —la_—germination —des_— spores. «donc. = leur _fragilisation Te Formaldéhyde posstde une action bactéricide directe par dénaturation des _protéines toutes les bactéries et leur spores sont tuées par ce gaz.et il existe une relation linéaire entre la concentration en gaz et Ia vitesse d'action .L’accés aux micro-organismes doit ée favorisé par absence de matiéres protéiques diverses qui s’opposeraient au contact avec le formaldehyde. est efficace seulement en milieu humide => sterilisation en surface > Cycles de stérilisation : L‘appareil utilisé est généralement un autoclave avec programmateur permettant de réaliser : = _ soit des cycles classiques vapeur d’eau sous pression 121°C ou 134°C ; = _ soit des cycles sous vide avec vapeur d’eau et formaldehyde a la température de 55°C ou 80°C. Déroulement du cycle de stérilisation Généralement un cycle de stérilisation se déroule de la maniére suivante - préchauffage et évacuation de air résiduel (grand vide) : Le but est d’éviter 1a condensation de la vapeur d'eau ou d'eau chaude dans la double enveloppe de la chambre (parois et portes). Le maintien en température est assuré par des injections de vapeur d’eau saturée & basse température obtenue grace au fonctionnement en dépression. Toute baisse de température s'accompagne dune injection immédiate de vapeur d’ean ce qui évite la formation de Condensats et ~—diminue_—le_-—risque = de-_— polymerisation © du_—_formaldéhyde Les températures adoptées lors des cycles en dépression varient entre 50 et 80°C - phase de stérilisation :admission du mélange vapeur d’eau ,formaldéhyde par injections successives (alternées de vide —partiel) dont Ie bre peut «etre tres variable selon les appareils - dégazage par alternance de vide et d’injection de vapeur d’eau puis d’air : L’élimination du formaldehyde est obtenue par des injections d’eau alternées de vide ,permettant de rouvrir les pores du papier d’emballage par ré humidification de la charge soit alors une phase de ringage alternant air et vide ayant pour but de soutirer le formol par aspiration et de sécher les emballages - retour a Ia pression atmosphérique : I’admission d’air filtré permet le retour a la pression atmosphérique et complete la résorption du matériel par balayage de la charge. > Avantages de la stérilisation par le formaldéhyde : Ce procédé présente, par rapport & l'oxyde d’éthyléne, les avantages suivants : ~ Pas de risque d’explosion. - Fuites de gaz détectables par l’odorat. ~ Briveté du temps de désorption. ~ Coiit faible de la sterilisation. 11.5.2. Oxyde d’éthyléne OE Page 10 sur 18La stérilisation par I’OE est un procédé de 2éme intention sil a stérilisation par la chaleur est indispensable (pour le matériel médico-chirurgical qui ne supporte pas l’autoclavage) Elle est utilisée pour stériliser les dispositifs médicaux thermosensibles a savoir PVC, polyéthylénes, certains ccaoutchoucs ...etc. Les produits & stériliser sont conditionnés dans des protecteurs individuels de st > Mode d’action et Propriétés germicides : Valkylation des groupements fonctionnels sulfhydriles, hydroxyles, amines et carboxyles des micromolécules des microorganismes. Certains germes sont plus difficiles & éliminer que d'autres: Staphylococcus aureus, Mycobacterium tuberculosis, spores de Bacillus subtilis. > Paramitres de la stérilisation par oxyde d’éthyléne : ket N= Ny-e> Na nombre final de germes aprés le temps t, No: nombre initial de germes, ¢ : concentration de l’oxyde d’éthyléne, ts durée de stérilisation, k : facteur relatif aux paramétres température et humidité relative, La contamination initiale doit étre la plus faible possible. La meilleure efficacité est obtenue une température comprise entre 50°C et 60°C. Le taux d’humidité optimal est fixé entre 30 et 60%. Un maximum d’eau est un catalyseur indispensable & la réaction d’ alkylation bactéricide, un excés d’eau conduit la formation d’éthyléne glycol beaucoup moins actif. Le conditionnement doit étre perméable au gaz, assurant le maintien de la stérilité et permettant I’extraction aseptique du matériel au moment de l'emploi. Le conditionnement est le plus souvent réalisé dans un emballage pliable, une face complexe plastique transparente imperméable permettant la visualisation du contenu et une face de papier perméable au gaz. Les deux faces sont thermosoudées > Conduite d'une opération de stérilisation par l’oxyde d’éthylene : Les procédés consistent & introduire oxyde d’éthyléne (pur ou en mélange) dans une enceinte hermétiquement close oit le vide a été fait préalablement. Ce vide a pour but d’extraire l’air de l’enceinte d’une part et des objets & stériliser d’autre part. Aprés un contact de plusieurs heures, une succession de plusieurs ringages élimine oxyde d'éthyléne de Venceinte, Un ringage consiste dans un premier temps A éliminer par dépression de l’oxyde @ éthyléne puis dans un deuxiéme temps 4 introduction d’air stérile dans l’enceinte. Aprés la stérilisation, la désorption sera plus ou moins longue selon la nature des polyméres : certains permettront une désorption rapide, d’autres une désorption lente. La désorption est accélérée par stockage du matériel stérilisé dans des chambres ou armoires de désorption chaufiées et ventilées ; la température est d’environ 50°C. Une période de dégazage a I’air libre & la température de 50°C dure de 15 jours a un mois. Le dosage de l’oxyde d’éthyléne résiduel doit afficher une teneur de 2 ppm. > Inconvénients de la stérilisation par le "OE : - Gaz trés inflammable, irritant et manque d’inertie : manipulation avec précaution par un personnel expérimenté. - lenteur et difficulté d’élimination du matériel. Page 11 sur 18~ L°OE peut provoquer une irritation des muqueuses respiratoires et oculaires. A fortes doses, il agit comme un dépresseur du systéme nerveux central. 11.5.3. Acide peracétique ~ Libére de 02 atomique qui est un agent trés puissant d’oxydation : action au niveau de la paroi cellulaire et des constituants cytoplasmiques ~ Activité maximale en présence d’un taux élevé d’humidité, 80 %. ~ Stérilisation des enceintes stériles ++ ~ Trés peu pénétrant (comme le formol) mais action stérilisante plus puissante ~ Commercialisé sous forme de solution concentrée a 35 % ~ Utilisé sous forme diluée au 1/10éme, porté 4 T° 40 a 47°C ~ Grande toxicité et provoque la corrosion des métaux. 115.4. Peroxyde d’hydrogéne en phase plasma : procédé Sterrad- - AVintérieur d’une enceinte => vide trés poussé => évaporation de HO, =>application d’un champ électrique intense =>ionisation du gaz => formation de la phase plasma. Phase plasma : renferme des radicaux libres O” + HO’ => Propriétés bactéricides et sporicides du plasma du Peroxpde dhydrogéne > Avantages Absence de trace d'eau Remplace I'oxyde d’éthyléne. # Veee Ne peut pas étre utilisé pour les objets creux et longs 11.6.Stér n par filtration : La filtration stérilisante est applicable & tous les fluides soit les liquides monophasiques (solutions) soit les gaz. Ce procédé s"applique aux produits qui ne supportent pas un traitement stérilisant final par I’un des autres procédés en raison de leur sensibilité a la chaleur, I'eau, aux gaz. ou aux radiations ionisantes. Exemples : vaccins, mélanges solutés pour alimentation parentérale, poudres lyophilisées, etc... Selon la taille des particules & retenir, on parle de : ~ Filtration : lorsque la taille des particules est > 10 yum - Microfiltration : lorsque la taille des particules est comprise entre 0,02 jum et 10 um - Ultrafiltration : lorsque la taille des particules est < 0,02 jm. La filtration stérilisante appartient au domaine de la microfiltration, La porosité de 0,22 um permet 'arréter toutes les bactéries pathogénes pour "homme, y compris les plus petites (Pseudomonas, Rickettsia). > Classification des microfiltres : deux catégories distinctes : A. Les filtres en profondeur : ils agissent par eriblage et adsorption : les particules arrivent & pénétrer dans la trame inférieure du filtre mais sont arrétées aprés un court chemin. Les faces du filtre sont dissymétriques : 'une est lisse, l'autre est rugueuse : Ia face doit étre déposée coté amont au sens de filtration. Inconvénients : il existe un relargage de fibres. 4 Les membranes filtrantes (filtres écrans) : Ils agissent par criblage a la fagon d’un tamis, La grande Page 12 sur 18porosité se traduit par un débit important. Les deux faces du filtre sont symétriques. Leur tendance a absorption ou A adsorption est trés faible. Inconvénients : il existe un colmatage rapide du filtre écran d’oil la nécessité de 1 »utilisation d'un pré-filtre généralement de type profondeur. > Conduite de la filtration stérilisante : -Stériliser 4 P'autoclave tout le matériel de filtration et de répartition. - Partir d’une solution aussi pauvre en germe que possible : biocharge minimale ~ Assurer un débit régulier, éviter toute surpression et ne pas prolonger la filtration. - Les filtres rigides réutilisables doivent étre contrélés périodiquement car leur porosité peut évotuer. = la durée maximale de l'emploi d’un filtre La filtration stérilisante doit étre réalisée dans le cadre des bonnes pratiques de fabrication : locaux atmosphere, ‘matériel, contamination initiale la plus faible possible. La manipulation devrait se dérouler de préférence sous un flux d’air laminaire horizontal ou vertical ou, selon la fréquence du recours a ce procédé, en salle blanche. Amuvonigeur \. CCuve de fabrication Cuve de stockage Fitre ‘stéritisant ‘Solution stérile Installation de filtration stérilisante > Contrdle de la filtration stérilisante : 4 Contréles pendant Popération de filtration - On mesure le débit, il prend en compte tous les paramétres de la filtration. S"il y a une variation importante, elle est témoin de l'altération du filtre, ga permet de voir si il y un colmatage - La mesure de la pression en amont et en aval du filtre est également un indicateur de colmatage. ~ Le point bulle, on I'a vu c'est la pression nécessaire pour faire passer de ’air travers un filtre humide, Ce n’est pas un test destructif c'est-d-dire qu’aprés on peut réutiliser Ie fire Le point de bulle permet de vérifier que le diamétre des pores est bien celui du départ. 4 Contréles aprés opération de filtration - Examen optique du fitrat, on vérifie la limpidité : absence de particules visibles en suspension. Page 13 sur 18- Point bulle, pour vérifier que le filtre n’a pas été altéré. = On doit faire un dosage du principe actif car il peut y avoir fixation du principe actif sur le filtre on parle @ adsorption. II faut que la teneur en principe actif soit d’au moins 95%=> Choix de la composition du filtre pour éviter cette adsorption. ~ Recherche des impuretés solubles pouvant étre apportées par les filtres. Le solvant qui est filtré pourrait solubiliser des impuretés qui se sont relarguées dans le filtrat. 11.7. La préparation dans des conditions aseptiques : > Applications du conditionnement aseptique : te concitiomement aseptique ‘applique a ~ _ certaines préparations pour usage parentéral, notamment les poudres pour préparations injectables, = certains vaccins, ~ _ certaines ligatures résorbables, certains réactifs de laboratoire. Compt tenu de Pabsence de traitement final stéilisant dans Vembellage définii, ls risques de recontamination des produits ainsi préparés sont trés élevés. Aussi, des précantions spéciales sont nécessaires = enmatiére de locaux : faciles & décontaminer et & ventiler, - enmatiére de matériel : facilement stérilisable, - enmatiére d’hygiene : port de vétement de travail stérile, - en matigres dintrants: matiéres premiéres et articles de conditionnement propres et stérilisés avant répartition, = en matiére de procédé de fabrication : nécessite une étude préalable qualitative et quantitative des risques de contamination microbienne (et éventuellement particulaire) a chaque stade de la fabrication. 11.6.1.Filtration stérilisante de Pair : La stérilisation de lair au sein d’une industrie est assurée par des filtres stérilisants de type HEPA (Haute Efficacité pour les Particules de I’ Air) précédés de préfiltre qui évitent le colmatage. Ce sont des filtres de fibres de verre en plaques pliges en accordéon pour augmenter leur surface de contact et maintenues dans des cadres en bois ou en métal > Contréle de la filtration stérilisante de Pair : 4 Test DOP (Dioctylphtalate) mesure de l'efficacité d'un filtre en termes de rétention des particules présentes dans T'air, sur la base de la rétention des gouttelettes d'aérosol de dioctyl phthalate (DOP) calibrées & 0,3 um, selon la méthode ASTM D 2986-71 * . Elle est généralement exprimée en pourcentage. Une rétention de 99,97% de DOP caractérise un filtre HEPA 1L.6.2.Enceintes stériles 1L.6.2.1.les Enceintes stériles classiques (On distinguc les vitrines et les salles stériles > Les vitrines stériles : isolateurs ou bulles Un isolateur répond a deux notions essentielles Page 14 sur 18.- Le confinement (volume clos bactériologiquement étanche) - Le transfert par V'intermédiaire de communications avec extérieur soit pour introduire des produits dans les enceintes soit pour les sorti, soit pour les manipuler. Les manipulations au sein des isolateurs se font par I’intermédiaire de manchettes équipées de gants dans les formes tunnel ou par l’intermédiaire d’un ou de plusieurs hémiscaphandres couplés ou non a des manchettes. La position des manchettes permet d’accéder parfaitement a tout le volume de travail et de manipuler en position assise afin de faciliter la tache des préparateurs > Les salles ou blocs stériles : Dans ce cas, les manipulateurs se trouvent & ’intérieur et constituent une source de contamination importante. Des lampes U.V. sont placées un peu partout par précaution supplémentaire. La ventilation est réglée de telle sorte que la pression aille en décroissant de Vintéricur vers l'extérieur. Ceci pour que les mouvements d’air se fassent dans le sens dune enceinte moins contaminée vers une enceinte plus contaminée, en cas de non étanchéité. Le sas acces du personnel est différent du sas du matériel bulles ou Isolateurs Le personnel revét des vétements stériles : combinaison, masque, bottes, gants, lunettes de protection contre les UY. 1L6.2.2.les Enceintes stériles a flux d’air laminaire Ces enceintes sont traversées par un flux d’air qui se déplace 4 une vitesse uniforme le long de lignes paralléles verticales ou horizontales. Les enceintes stériles a flux laminaire comportent deux faces opposées poreuses dont Pune pour entrée de Pair est équipée de filtres stérilisants juxtaposés de type HEPA. On les appelle aussi salles Dlanches stériles. Les hottes & flux laminaire sont des enceintes permettant la protection du produit préparé, mais n’offrant aucune protection au préparateur Les hottes a flux Jaminaire sont généralement équipées d’une lampe UV-C a effet germicide pour stériliser le plan de travail et son contenu lorsqu’il n'est pas utilisé. Elles sont utilisées : Page 15 sur 18~ Dans les blocs opératoires ou ta protection du patient contre les infections est assurée par un flux généralement Vertical = Dans les salles blanches ou ta qualité et la sécurité des productions qu’elles soient alimentaires pharmaceutiques ou encore électroniques dépendent pour beaucoup du niveau d’efficacité des systémes de filtration de I’air et des Flux laminaires. > Enceintes & flux vertical : lair arrive du plafond =>(filtres HEPA) => sol (gaillage constitué d’une paroi poreuse = préfiltre) : meilleure installation pour le dépoussiérage, > Enceintes 4 flux horizontal : lair va de de mur 4 mur => installation moins satisfaisante mais moins chere, > Enceintes mixtes : de mur a sol ou de plafond & mur (les plus courantes) HOTTEA LOR OAR LAWNAIRE VERTICAL Pour MEDICAMENTS TOXIQUES: nos ap amu nyse oniy Principe d'une enceinte a flux vertical (avec recyclage) Principe d’une enceinte a flux horizontal (recyclage possible mais non représenté) Exemple d'une hotte a flux dair laminaire ~ Contréle des enceintes stériles : La manipulation et le remplissage doivent s'effectuer & un poste de travail de classe A dans un local de classe B. Page 16 sur 18Classe Nombre de particules par m° de taille égale | ou supérieure & Nombre maximal de micro- 05 um 3m organismes | ‘A: poste de travail sous flux | 3500 o Moins de T | air laminaire | B | 3500 o 3 | c | 350 000 2000 100 f D 3 500 000 20 000 T 500 L’essai microbiologique consiste 4 placer des milieux nutritifs, stériles en différents endroits de lenceinte & contréler. Aprés un séjour d’une durée déterminée, les miliewx sont placés dans des étuves 4 température convenable. On compte au bout d’un certain temps le nombre de colonies qui se seraient développés. Il. Contréle de stérilité - Précautions : l’essai de stérilité doit etre réalisé dans des conditions aseptiques par exemple sous hotte. ~ Milieux de culture : préparation de miliewx de cultures aérobies, anaérobies, pour les levures et moisissures 4 Filtration sur membrane 4 Ensemencement direct du milieu nutritif avec le produit & examiner 4 Enfin d’incubation, les miliewx ne doivent pas présenter de signes macroscopiques de prolifération microbienne TIL.1.Choix des milieux de culture : Le plus souvent, deux milieux de culture suffisent 4 germes aérobies et des bactéries anaérobies: milieu au thioglycolate — résazurine : agrobie par développement au voisinage ; anaérobie par développement au fond. C’est la non recoloration en rouge du liquide par la résazurine qui atteste d’une anaérobiose. 4 bactéries aérobies et des champignons: milieu @ Vhydrolysat de caséine et de soja (milieu de Sabouraud).. ‘NB : Le germe utilisé pour la préparation des indicateurs biologiques correspondant au germe de référence sont stérilisation par la chaleur séche : 0-1/0 5 stériisation par la chaleur humide = 00> + sterilisation par oxyde d’éthyléne : stérilisation par rayonnement : 90/0 TII.2.Méthodes : 11.2.1. Filtration sur membranes : fe R EE Chaque fois que la nature des produits le permet. Les membranes a utiliser sont en nitrate ou acétate de cellulose stériles. La membrane est mise & incuber dans les milieux de culture aprés filtration du liquide a tester. Incubation 7 jours au minimum. Page 17 sur 18= 30—35°C pour le milieu au thioglycolate. = 20-25°C pour le milieu 4 ’hydrolsat de caséine. IH1.2.2.Ensemencement direct du milieu de culture : Rapport préparation / milieu a respecter Liquide : 1/100 Solides : 1/100 Incubation : 14 jours au maximum, mémes conditions de température que précédemment. > Observation et interprétation des résultats : Observer les milieux a certains intervalles et a la fin de Ia période d’incubation. L’apparition d’un trouble ou de filaments dans Pun des deux milieux (ou les deux) est provoquée par une prolifération microbienne, signe de non stérilité du produit, "il n’y a aucune manifestation de croissance, le produit examiné satisfait a l’essai de stérilité, Limites de essai : Un lot est stérile lorsqu’il contient moins d'une unité de conditionnement sur un million qui ne soit pas stérile, Cest-i-dire contenant au moins un microorganisme revivifiable, La probabilité de trouver une unité non stérile serait done inférieure a 10°. Un résultat favorable signifie seulement qu’aucun microorganisme contaminant n’a pu @tre décelé dans 1'échantillon examiné dans les conditions de l’essai. L’extension de ce résultat a tout un lot de produit nécessite Ia certitude que toutes les unités qui le composent ont été préparées de fagon que chacun ait également satisfait & l'essai avec une grande probabilité (ce qui dépend des conditions prises au cours de la fabrication). Néanmoins, essai de stérilité permet, - _ demettre en évidence une recontamination aprés sterilisation, = de mettre en évidence un lot qui aurait échappé a la stérilisation. Crest la seule méthode analytique dont puissent disposer les différentes instances chargées de contréler la stérilité d'un produit. TEL3.Bonnes pratiques de stérilisation -L Définition d’un eahier des charges rigoureux lors du choix de l'appareillage et de ses annexes + Qualification du matériel (examen de conformité aux spécifications et qualification opérationnelles) + Validation des procédés de stérilisation : travailler avec un niveau d’ Assurance Qualité. maximal, Page 18 sur 18,