Escherichia coli verocitotoxignico (VTEC) en el medio ambiente. Introduccin.

El sndrome urmico hemoltico (SUH) es una enfermedad a nios con sntomas ya descriptos desde 1955 por Gasser y cols. 1 Los sntomas son la anemia hemoltica, trombocitopenia y dao renal, precedido por un cuadro diarrico muchas veces con deposiciones sanguinolentas. El agente infeccioso fue identificado por Dr. Karmali: Escherichia coli productoras de citotoxinas.2 (Karmali y cols., 1983). En Argentina, el Dr. Gianantonio comenz el estudio de esta enfermedad en la dcada de 1960 y el Ministerio de Salud de la Nacin la declar como enfermedad de denuncia obligatoria en el ao 2000. A nivel mundial, Argentina es el pas con mayor nmero de denuncias anuales, registrndose entre 400 y 500 casos nuevos anuales (Repetto, 2009 3). Cuando los casos de SUH son diagnosticados y tratados en forma temprana con hidratacin intravenosa y dilisis peritoneal (si es necesario) esta enfermedad tiene solo un 3 a 5% de mortalidad. Sin embargo, el 95% de los pacientes se recuperan con alto riesgo de presentar secuelas renales crnica. El SUH ha siendo identificada como la segunda causa de insuficiencia renal crnica y de transplante en edad peditrica en nuestro pas (Amoreo, 2008 )4. Normalmente el SUH se presenta en nios entre los 6 meses a 5 aos de vida (Rivero y cols., 2004) 5, aunque en los ltimos aos se han presentado en nuestro pas casos de nios de 9 a 14 aos (Amoreo, 2008 4y Alconcher, 20096). Las toxinas Stx1 y Stx2 que producen determinados serotipos del gnero Escherichia coli ejercen un efecto mortal para clulas VERO similar al provocado por la toxina de Shigella dysenteriae (shiga toxina), por lo que a estos serotipos se los llama Escherichia coli verocitotoxignica o shigatoxignicos (VTEC o STEC). Sin embargo, solo un grupo reducido de serogrupos productores de verotoxinas se han aislado de heces de pacientes con SUH o diarrea con sangre, denominado Escherichia coli enterohemorrgica (EHEC) (Karmali y col., 2003)7. La serotipificacin es un importante forma de diferenciar VTEC y es a menudo el punto inicial de la caracterizacin (Gyles, 2007)8. El serotipo VTEC ms comnmente aislado en casos de

SUH es el O157:H7 (Rivas, 2009 9 y Griffin, 2009 10), aunque tambin se han aislado el serotipo O157:H- (clon germano) (Ammon y col. 1999)11 e identificado serogrupos O26, O113, O111 O121, O45, O145; O55, O103 y O128, siendo O145 el segundo serogrupo ms aislado de humanos (INOPSU,2003 12 y Griffin, 2009 10). En general, las VTEC/EHEC se clasifican como: O157 y noO157. En 2003, nuevamente el Dr. Karmali hizo un muy til aporte a la investigacin de estas bacterias, al clasificarlas en seropatotipos segn la frecuencia de deteccin de cada serogrupo en casos de SUH y diarreas humanas (Karmali y col., 2003) 7. Factores de virulencia de EHEC/VTEC El factor de virulencia ms importante de EHEC se debe a la produccin y liberacin en el intestino humano de verocitotoxinas (Stx1 VT1 y Stx2 VT2). Las toxinas son transportadas por el flujo sanguneo hasta los rganos blanco (rin, hgado, pncreas y sistema nervioso central) cuyas clulas poseen el receptor Gb3 al que se adhieren las bacterias (Blazer, 2004 Kaper, 1998
14 13

; Nataro y

). Por su conformacin estructural y efecto sobre la lnea celular VERO, ambas

pertenecen a la familia de las shiga toxinas, siendo VT2 la ms similar a la shiga toxina (Nataro y Kaper, 199814). Dada esta peculiaridad y al hecho que ambas se encuentran codificadas en fagos insertados en el cromosoma bacteriano, se especula que esta informacin puede transmitirse horizontalmente entre escherichias no patgenas transformndolas en VTEC (Blazer, 200413), as como que su sntesis es inducida por el ciclo ltico del profago (Patrick y cols., 2000 15). Se han identificado distintas variantes de las toxinas (VT1, VT1c y VT1d as como VT2, VT2c, VT2d, VT2e, VT2f y VT2g) (Karch y cols., 2005
16

) las cuales se relacionan con distintos grado de

patogenicidad (Gyles, 2007) 8. VT1 y VT2 son protenas dimricas con una subunidad A de actividad enzimtica y una subunidad pentamrica, B. Esta ltima subunidad interacta con el receptor Gb3 de las clulas de los capilares glomerulares y de otros rganos blanco, anclando la molcula de la toxina y permitiendo que la subunidad A ingrese y cribe la fraccin 28S ribosomal, inhibiendo la sntesis proteica y desencadenando la muerte celular. (Goldwater, 2007 17).

Otro factor de virulencia es la intimina (protena codificada en el gen eae del cromosoma bacteriano) que es responsable de la lesin de adherencia y borrado del enterocito (A/E) (Jerse, 1990 18). Esta protena comparte la isla de patogenicidad LEE (Locus of enterocyte effacement) con otros genes que codifican para el receptor translocado de intimina (Tir) (Kenny y cols., 1997 19), los componenetes del sistema de secrecin Tipo III (EseC, EseN, EseF, EspA, EspB, EspC, EspD, EspE y EspF) (Jarvis y cols., 1995 20) y otras protenas iniciadoras de la polimerizacin de actina para la formacin del pedestal caracterstico de la lesin intestinal (EspG, EspH y EspJ) (Kenny y cols, 1996 21; Lai y cols., 1997 22). Se ha observado una estrecha asociacin entre la presencia del gen eae y el vt2 en cepas aisladas de casos de SUH (Werber et al., 2003 23). Sin embargo, aunque la mayora de los casos de SUH son causados por cepas portadoras del gen eae, este gen no sera esencial para la virulencia de VTEC (Paton y col., 1999 24) ya que Paton y cols. identificaron en 2001 25 una adhesina alternativa (Saa) presente en las cepas eae negativas virulentas para humanos. El ltimo de los factores de virulencia es el megaplsmido (Mp). Este plsmido de 60 MDa fue uno de los primeros factores de virulencia estudiados, estando presente en muchas cepas VTEC (Louie y cols., 1993 26). Contiene genes codificantes para la hemolisina enterohemorrgica (EhxA) y una serinproteasa (EspP) (Karch y cols., 1987 27; Levine y cols., 1987 28) y la Saa. Serotipos VTEC asociados a casos de SUH y fuentes de transmisin. Como se mencion anteriormente, el serotipo O157:H7 y el serogrupo O145 son las EHEC aisladas con mayor frecuencia de casos humanos alrededor del mundo y tambin en Argentina (INOPSU,2003 12; Griffin, 2009 10; Milliwebsky y col. 2009 29). Sin embargo, en nuestro pas se han asociado otros serotipos a SUH: O1:H-; O2:H-; O15:H-; O25:H-; O26:H-; O49:H10; O75:H-; O103:H2, O111:H (Lpez y cols.,1998 30; Milliwebsky y cols., 1999 31) y la lista se ampla cuando se consideran los serotipos no-O157 reportados alrededor del mundo (Johnson y col., 2006 32). Por lo anterior y sabiendo que una intervencin mdica temprana reduce a un 5% la probabilidad de muerte, hace imprescindible contar con mtodos de diagnstico rpidos y econmicamente convenientes (Jonhson y col.,2006
32

) que no sesgue la bsqueda hacia un serotipo particular

(Scheutz y cols., 2001 33). Actualmente, la mayor parte de los trabajos de investigacin se focalizan en la identificacin directa de caractersticas de la virulencia (toxinas o protenas de membrana) o la identificacin de los genes que las codifican por reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Desde el primer brote de SUH causado por el consumo de hamburguesas contaminadas con E. coli O157:H7 en EE.UU en 1982, los alimentos han estado asociados con este patgeno. Las infecciones humanas con VTEC se han producido por ingestin de alimentos (67%) y agua (10%) contaminados y tambin se ha informado la transmisin persona-persona, contacto directo con animales o bien por exposicin al medio ambiente contaminado (Amstrong y cols., 1996 34). En las ltimas dos dcadas ha aumentado la importancia relativa del medioambiente como fuente de transmisin, segn lo reflejan numerosos estudios realizados en EE.UU y Europa (Rangel y cols., 2005 35; Strachan y col., 2006 36). Los alimentos ms comnmente relacionados con VTEC son los de origen animal y los que estuvieron accidentalmente en contacto con materia fecal de animales infectados (carne picada, salame, leche no pasteurizada, brotes de alfalfa, lechuga, espinaca, jugo de manzana y sidra, mayonesa y yogurt) (Rangel y cols., 2005 35; Gyles, 2007 8; Feng, 2009 36). Segn el informe de FOOD-NET de 2005 37, en EE.UU. los casos relacionados con alimentos y agua se han reducido gracias a la implementacin de las Buenas Prcticas de Manufactura (BPM.) y el Anlisis de Riesgos y puntos crticos de Control (ARPCC o por sus siglas en ingls, HACCP). Mientras que desde 2007 la European Food Safety Authority ha incorporado a su sistema de control de alimentos de origen animal (carne y leche) el rastreo obligatorio de los serotipos ms comnmente asociados a enfermedad humana: O157, O111, O26, O103 y O145 (Duffy y col., 2009
38

). A pesar de todos los esfuerzos, la incidencia de la enfermedad no ha bajado (Rangel y cols.,

2005 35), quizs debido a los actuales hbitos alimenticios (Feng, 2009 36). Reservorios Animales El principal reservorio de VTEC es el bovino (Chinen y cols., 2003 39; Meichtri y cols., 2004 40; Mercado y cols., 2004
41

), aunque se han aislado VTEC de ovinos, porcinos, caprinos,

42

animales silvestres (Kudva y cols., 1998

), y de aves (Alonso y col., datos no publicados).

Especialmente en nuestro pas, Sanz y cols. (1998 43) han determinnado que la prevalencia de VTEC en bovinos en pastoreo y en las medias reses de matadero es cercana al 30% y que los terneros fueron portadores de los serotipos de mayor virulencia para el hombre. Algo muy destacable es que las cepas aisladas en bovinos adultos en pastoreo y en matadero compartieron serotipos con alimentos crnicos: O20:H19, O91:H21, O113:H21, O116:H21, O117:H7, O171:H2, O174:H21 (Parma y cols., 2000) 44. Por otro lado, se estudiaron los bovinos de feedlot, cuya la prevalencia de VTEC en 11 muestreos consecutivos fue del 62,7% (Padola y cols., 2004) 45. E. coli O157 se detect en el 28,54% del total de los establecimientos muestreados y se aisl del 6,7% de los animales muestreados en forma seriada y del 0,17% de los muestreados por nica vez, confirmando la liberacin intermitente de VTEC al ambiente, lo que nos permitira suponer que esta liberacin favorecera la reinfeccin y la transmisin de cepas VTEC a animales sanos (Padola y cols., 2004a) 46. Los estudios de Padola y cols. (2004) 45, Parma y cols. (2000) (1998)
43 44

y Sanz y cols.

utilizaron la tcnica de PCR para la deteccin de genes codificantes de factores de

virulencia de VTEC (vt1, vt2, hlyA y eae) y confirmaron que la tcnica de PCR se puede utilizar como mtodo de tamizaje para todos los serotipos de VTEC (O157 y no-O157) presentes en cultivos bacterianos en zona confluente y tambin para caracterizar los posteriores aislamientos, dependiendo de la estrategia utilizada para el aislamiento de las colonias individuales y/o los pooles de colonias (Padola y cols., 2004) 45. Adems de los sistemas de produccin de bovinos de carne, los tambos tambin pueden contribuir al riesgo de infeccin en humanos si se consumen leche cruda (Chapman y cols., 1993) 47 y productos lcteos contaminados (Deschnes y cols., 1996) 48. Sin desestimar que parte de la carne para consumo proviene de bovinos lecheros ya sea en forma de vacas de descarte o terneros. VTEC ha sido aislada de muestras de leche cruda ya sea de bovinos individuales (Mechie y cols, 1997) 49 o de leche del tanque (Padhye y Doyle, 1991)
50

y tambin se ha documentado la transmisin de la

51

enfermedad por esta va (Doyle, 1991). En Argentina, Fernndez y cols. (2007)

detectaron en 5

tambos una prevalencia del 37,5% y 43% en vacas y terneros, respectivamente, siendo la toxina

VT2 detectada con mayor frecuencia. Franz y cols. (2007)

52

encontraron una prevalencia del 79,5

% de VTEC en abonos provenientes de 25 tambos en Pases Bajos, mientras que LeJeune y cols. (2001) 53 observaron que el agua de bebederos con sedimentos contaminados con heces de vacunos excretores de E. coli O157 puede servir como reservorio del organismo por ms de 245 das y mantener su capacidad infectiva para terneros por 6 meses en ese microcosmos. Numerosos casos y brotes de SUH han identificado la fuente de la infeccin en aguas superficiales y suelo de campos de pastoreo de animales contaminados con VTEC no-O157 (Hoshina y col., 2001 54; Tani y col., 2007 55; Fremaux y col., 2008 56). Estos datos no hacen ms que confirmar el peligro de reinfeccin al que se hayan expuestos los animales en su hbitat natural y la capacidad de adaptacin que poseen estas bacterias a medios rigurosos. Por ello, hemos realizado un experimento para construir la curva de viabilidad de O157:H7 en agua estril de bebederos y logramos recuperarla hasta el da 107 pos-inoculacin (Polifroni y col., 2009)57. Actualmente estamos repitiendo el experimento con cepas de VTEC -no O157. Estrategias de supervivencia En medios exigentes como agua y suelo, y en superficies inertes como las instalaciones del tambo, muchos patgenos como E. coli O157 pueden formar biofilms (Ryu y cols., 2004)58. Los biofilms son comunidades bacterianas que viven adheridas a superficies (Dunne, 2002) 59. La adherencia y la formacin de biofilms en instalaciones dedicadas al procesamiento y elaboracin de alimentos es un riesgo a tener en cuenta para la inocuidad de los alimentos y en la definicin de puntos crticos de control en el sistema A.R.P.C.C (Ryu y Beuchat, 2005)60. La formacin de un biofilm implica la adhesin a una superficie mediante fimbrias y exopolisacridos producidos por las bacterias (Dunne, 2002
59

; PrB y cols., 2006)

61

. La formacin de este tipo de comunidad

bacteriana, posiblemente formada por bacterias de diferentes gneros y especies, implica una interaccin coordinada de muchas clulas al unsono, siguiendo una serie de etapas definidas dependientes de las condiciones ambientales (PrB y cols., 2006) 61. La primera etapa de formacin del biofilm, denominada docking, comprende el

reconocimiento de la superficie por parte de las clulas bacterianas y su adhesin reversible. En esta etapa las clulas requieren de estructuras que le permitan alcanzar la superficie de adhesin: los flagelos. En la segunda fase, el locking, se sintetizan los lpopolisacridos y las fimbrias (tipo I, tipo IV y curli) que adhieren irreversiblemente a las bacterias a la superficie y unas a otras. Ahora las bacterias dejan de expresar los flagelos y se convierten en clulas ssiles. Posteriormente, el biofilm comienza a crecer (maduracin del biofilm) por la multiplicacin de las clulas que liberan compuestos al medio, fimbrias, exopolisacrido, sustancias de desecho y clulas muertas, construyendo el glicoclix (Dunne, 2002 59; van Houdh y Michiels, 2005 62; PrB y cols., 2006 61). Este glicoclix es una verdadera barrera de fuerza que contiene, adhiere, alimenta y protege a los habitantes del biofilm. Esta comunidad llega a su punto mximo de crecimiento cuando el flujo de nutrientes que circula en los canales del biofilm se agota y/o los desechos se acumulan e intoxican a las clulas. Entonces, las clulas vivas ms alejadas de la superficie comienzan a generar clulas planctnicas que escapan del glicoclix y son capaces de formar nuevos biofilm (Dunne, 2002 59; van Houdh y Michiels, 2005 62; PrB y cols., 2006 61). La fimbria curli y la celulosa son los componentes mayoritarios de la matriz extracelular de aislamientos de Salmonella enterica serovar Typhimurium y E. coli (Robbe-Saule y cols., 2006) 63. La expresin de curli est regulada por genes que codifican las subunidades proteicas (csgA), su regulador transcripcional CsgD (csgD) y un regulador indirecto de la expresin de csgA (crl) (Dyer y cols., 2007 64; van Houdt y Michiels, 2005) 62. Se ha detectado fenotipos curli positivo en los grupos de E. coli enteropatgeno (EPEC), E. coli enterotoxignico (ETEC), E. coli uropatognico (UPEC) y en E. coli productor de verocitotoxina (VTEC) (Brokanz y cols., 2005) 65. En nuestro laboratorio hemos detectado los genes para la expresin de la fimbria curli en 14 aislamientos de VTEC medioambiantales, pero que han variado en su fenotipo en placas de Rojo Congo (RC) (Ryu y Beuchat, 2005
60

) dependiendo si fue aislado una superficie slida, agua o sedimentos de

bebederos de animales o suelo de los corrales (Polifroni y col, 2009a) 66.

Por otro lado, O157:H7 ha sido aislada de muestras ambientales y de leche con un prevalencia muy baja. Sin embargo, la contaminacin de las fuentes pudo haber sido significativa, si se recuerda que la dosis infectiva es muy baja (100 bacterias) (Trevana y cols., 1999) 67. Esto podra deberse a la presencia de bacterias que escapan a la deteccin de rutina utilizando mtodos de enriquecimiento (Douglas y cols., 1998 68; Oliver, 1993 69; 2005
70

; Xu y cols., 1982 71). Las

bacterias entran en una fase de crecimiento nulo o fase estacionaria por exposicin a distintas situaciones de estrs ambiental (Winfield y Groisman, 2003
72

; Asakura y cols., 2005

73

dificultando notablemente la deteccin y confirmacin del patgeno en agua y en superficies por mtodos microbiolgicos (Kolling y Matthews, 2001 74). Algunos investigadores definen a este estado en que las bacterias pierden su culturabilidad, como Viables No Cultivables (VNC) (Awais y cols., 2006 75; Oliver, 2005 70). Este estado se ha definido como un estado fisiolgico en el que las bacterias se encuentran metablicamente activas, pero son incapaces multiplicarse y formar colonias en los medios regularmente utilizados en laboratorio (Oliver, 2005 70). Para recuperarse de este estado requirien mayor cantidad de nutrientes y la presencia de metabolitos reparadores del stress oxidativo como el cido pirvico y catalasa (Sophia y col., 1996
77 76

y Mizunoe y cols., 1999

). Por esta razn, la utilizacin de mtodos de identificacin de VTEC basados en el cultivo de una

muestra pueden dar resultados falsos negativos (Liu y cols., 2008 78). En estas circunstancias se hace indispensable la bsqueda de VTEC por medio de tcnicas moleculares (Fode Vaughan y cols., 2003 79). Los mtodos basados en PCR pueden detectar especfica y sensiblemente E. coli O157, pero sin distinguir clulas vivas de muertas (Liu y cols., 2008
78

). La utilizacin del kit

Live/Dead BacLight permite diferenciar clulas viables de clulas muertas (Asakura y cols. 2005)
73

. Se ha comprobado que E. coli O157 preserva su capacidad de producir enfermedad aun en el

estado de VNC (Awais y cols., 2006) 75 y que fue el agente epidemiolgico de un brote causado por huevas de salmn ahumado en Japn en 1998 (Asari y cols., 1999
80

). Si bien se han realizado

varios estudios sobre VNC en E. coli O157:H7 (Rigsbee y cols., 1997 81; Wang y cols., 1998 82; Mizuone y cols., 1999 77), nada se sabe acerca de VTEC no-O157. La supervivencia de E. coli

O157:H7 frente a condiciones de estrs en medios cidos y diferentes temperaturas ha sido estudiada por muchos investigadores, pero poco se conoce sobre el efecto del stress en otros serotipos. Molina y cols. (2003)
83

estudiaron distintos serogrupos de VTEC (O157, O26, O111,

O145, O91 y O174) de los cuales el serotipo O91:H21 ensayado present la mayor resistencia al stress cido. Tcnicas moleculares y microbiolgicas para el anlisis la variabilidad gentica de las VTEC en el medioambiente La regulacin de los genes de virulencia es crtica para que la bacteria utilice los distintos factores en el lugar correcto, en el momento oportuno y bajo condiciones apropiadas (Gyles, 2007
8

). En concordancia con sto, Dyer y cols. (2007)

64

informan que la expresin de curli es variable

entre aislamientos, laboratorios y cepas patgenas. Dentro de VTEC existe una amplia diversidad gentica no slo entre serotipos, sino que es posible hallar variaciones en distintas regiones genmicas an dentro de cepas de un mismo serotipo. Estas variaciones se han estudiado sobre los genes que codifican para los diferentes factores de virulencia y se ve reflejado en diferentes patrones de RAPD y PFGE (Blanco y cols., 2004
84

; Lucchesi y cols., 2006

85

). A nivel

internacional, se ha trabajado principalmente en la tipificacin de O157 y la tcnica de PFGE ha sido elegida como el gold standard en investigaciones epidemiolgicas. Estos mtodos son altamente discriminatorios y detectan pequeas variaciones que se acumulan rpidamente en el genoma bacteriano. Sin embargo, esa misma capacidad de detectar la acumulacin de pequeas variaciones puede ser una gran desventaja para trazar la dispersin de lneas clonales, ya que se corre el riesgo de perder la capacidad de analizar el origen comn de esas variantes. Por otro lado, la facilidad de acceso a la secuenciacin del ADN en muchos laboratorios de Microbiologa permitieron el desarrollo de la tcnica de Multilocus Sequence Typing (MLST). En el MLST, las variaciones en los diferentes locus se detectan de forma directa por secuenciacin del ADN en fragmentos de genes housekeeping dentro de una misma especie bacteriana, permitiendo la identificacin de grupos de microorganismos con idnticos (clones) o altamente relacionados

(lneas clonales) genotipos (Maiden y cols.,1998 86 ; Feil y cols., 2003 87). Conclusin Teniendo en cuenta la alta prevalencia de VTEC en el ganado vacuno, la excrecin de grandes cantidades de bacterias en cada deposicin (entre 10 y 10 4 (Gyles, 2007) 8), su deteccin en las instalaciones donde se manipulan los animales, la muy buena capacidad de adaptacin y resistencia en medio ambiente de las cepas VTEC y la cantidad de casos de enfermedad de los cuales no se ha podido determinar la fuente de infeccin, nos permite suponer con mayor seguridad que el medio ambiente compartido entre animales y el hombre es un reservorio no animal muy importante para de dispersin y conservacin de estos agentes patgenos. Bibliografa: